DE2603004A1 - Diagnoseeinrichtungen und verfahren zur durchfuehrung von quantitativen immunochemischen bestimmungen - Google Patents

Diagnoseeinrichtungen und verfahren zur durchfuehrung von quantitativen immunochemischen bestimmungen

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Description

DR. MÜLLER-BORE · DIPL.-ING. GROENING
DIPt.-CHEM. DR. DEUFEL · DIPL.-CHEM. DR. SCHÖN
DIPL.-PHTS. HERTEI.
PATENTANWÄLTE
Case MEBE/CHEM K/K 14-7
AKTIEBOLAGET KABI, Stockholm/Schweden
Diagnoseeinrichtungen und Verfahren zur Durchführung von quantitativen immunochemischen Bestimmungen.
Die Erfindung betrifft eine Diagnoseeinrichtung für quantitative immunochemische Bestimmungen, die vorzugsweise in Form eines Teststreifens vorliegt und ein poröses (im Sinne einer Kapillarität) Trägermaterial umfaßt, sowie ein Verfahren zur Durchführung von quantitativen immunochemischen Bestimmungen unter Verwendung dieser Diagnoseeinrichtung.
Die bislang angewandten quantitativen immunochemischen Bestimmungsmethoden beruhen auf der Immunodiffusion, wie beispielsweise die nach ihren Erfindern benannten Mancini- oder Ouchterlony-Methoden, oder der Immunoelektrophorese, wie im
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MÜNCHEN 80. SIEBERTSTH. 4, POSTFACH 860 7SO, KABEL·: RHEINPATENT» TEL·: (080) «Ί070'79 TELEX: 3-8S939 ORIGINAL INSPECTED
_ 2 —
Fall der Elektroimmunobestimmung nach Laurell. Diese Methoden als auch ihre Varianten bewirken die notwendige Wechselwirkung zwischen dem Antigen und dem Antikörper durch einen Diffusionsprozess und/oder einen elektrophoretischen Vorgang. Andererseits beruht das erfindungsgemäße Verfahren darauf, die Kapillarkräfte eines porösen Trägermaterial auszunützen, an das Antikörper gebunden sind.
Gegenstand der Erfindung ist daher eine Diagnose-Testeinrichtung für quantitative immunochemische Bestimmungen, die gekennzeichnet ist durch ein im wesentlichen streifenförmiges, poröses, Kapillarität aufweisendes Trägermaterial, an das Antikörper gebunden sind.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren für die Durchführung von quantitativen immunochemisehen Bestimmungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Kapillarität aufweisende, poröse Trägermaterial verwendet, an das Antikörper in an sich bekannter Weise gebunden sind, beispielsweise durch Adsorption, durch Absorption oder durch kovalente Bindung, beispielsweise durch die Verwendung eines Halogencyans, wie Bromcyan, oder von Glutaraldehyd.
Bei der Verwendung wird die Kapillarität aufweisende Diagnoseeinrichtung in die Probe eingetaucht, die das quantitativ zu bestimmende Antigen enthält. Es erfolgt dann eine Wanderung aufgrund der Einwirkung der Kapillarkräfte. Anschließend werden die antigenhaltigen Bereiche der Diagnoseeinrichtung durch die Zugabe von Antikörpern, die an einen geeigneten Farbindikator, wie eine fluoreszierende Verbindung, oder ein Enzym, das die Farbreaktion katalysiert, gebunden sind (zu der mit der Probe benetzten Einrichtung) sichtbar gemacht.
Die erfindungsgemäß geeigneten Antikörper erhält man durch an sich bekannte Verfahrensweisen durch Immunisieren eines Tieres der Art, das sich von den Tieren jener Art unterscheidet,
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deren Antigen untersucht werden soll. Beispielsweise erhält man Antikörper gegen Humanproteine (Albumin, y- -Globulin, Fibrinogen, Transferrin) ohne weiteres von Kaninchen, Ziegen, Schafen, Pferden und Meerschweinchen. Solche Antikörper sind in dem Blut der immunisierten Individuen enthalten, und insbesondere enthält die /"-Globulinfraktion (Immunoglobulin) die Antikörper.
Erfindungsgemäß geeignete poröse, Kapillarität aufweisende Materialien sind beispielsweise die verschiedenartigen Cellulosefaserh enthaltenden Materialien, wie Filterpapier, Chromatographiepapier, Ionenaustauscherpapxer, Celluloseacetatfolien, Celluloseacetatscheiben, Cellulose-Dünnschichtchromatographiescheiben sowie Folien aus Materialien wie Stärke, Sephadex (ein dreidimensionales Netzwerk oder eine dreidimensionale Matrix aus Dextranketten, die mit Epichlorhydrin vernetzt sind, ein Produkt der Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden und Piscatawny, New Jersey, USA), Folien aus Kunststoff material , wie Polyvinylchlorid, keramisches Material und Kombinationen, wie Polyvinylchlorid-Siliciumdioxid-Materialien.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Herstellung der Diagnoseeinrichtungen Beispiel 1
Binden der Antikörper an das Kapillarität aufweisende Material unter Verwendung von Bromcyan.
Man taucht 10 g Filterpapier als Cellulose enthaltendes Material während 5 Minuten in destilliertes Wasser ein. Anschließend gibt man eine Lösung von 8 g Bromcyan (CNBr) in 300 ml destilliertem Wasser zu, stellt den pH-Wert mit 1m NaOH-Lösung auf einen Wert von 10,5 ein und hält diesen Wert durch eine geeignete Zugabe der entsprechenden Mittel zur Einstellung
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des pH-Wertes aufrecht. Die Reaktion wird während 20 Minuten durchgeführt, wonach man die überstehende Lösung abdekantiert. Das mit Bromcyan behandelte Cellulosematerial wird über Nacht bei +40C in einer Lösung von 500 mg Kaninchen-V^-globulingegen-Human-V^-globulin (IgG Fc-Fragment) in 10 ml 0,1m Natrxumbxcarbonatlösung inkubiert und dann während 3 Stunden mit 100 ml einer 0,005m wässrigen Äthanolaminlösung inkubiert, wonach man mit 500 ml einer 0,5m Natrxumbxcarbonatlösung und dann mit 200 ml eines 0,1m Acetatpuffers mit einem pH-Wert von 4,0 und dann bei +40C mit 500 ml eines O,O75m Natriumbarbituratpuffers, der mit 0,3% Albumin versetzt ist, wäscht.
Beispiel 2
Binden der Antikörper an das Kapillarität aufweisende Material unter Verwendung von Glutaraldehyd
Man inkubiert 0,6 g eines Celluloseacetatfilms mit einer Lösung von100 mg Kaninchen-V--globulin-gegen-Human- ^-globulin (IgG Fc-Fragment) während 30 Minuten in 10 ml eines 0,1m Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,8. Nachdem man die Lösung abdekantiert hat, inkubiert man den Film während 30 Minuten in 10 ml einer wässrigen 1%igen Glutaraldehyd-Lösung, wonach man das Material während 15 Minuten in 10 ml einer 1,0m wässrigen Methylaminlösung inkubiert. Anschließend wäscht man den Film mit 100 ml eines OfO75m Natriumbarbiturat-Puffers und läßt das Material bei +40C in dem gleichen Puffer, der mit 0,3% Albumin versetzt worden ist.
Beispiel 3
Binden von Antikörpern an das Kapillarität aufweisende Trägermaterial durch Adsorption oder Absorption.
Man inkubiert 10 g Polyvinylchlorid-siliciumdioxid (mikroporöses Kunststoffblatt mit einem Siliciumdioxidgehalt von etwa 50%, ein Produkt der Amerace Esna Corporation, New York,
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N.Y., USA) über Nacht bei +40C mit einer Lösung von 500 mg Kaninchen- y—globulin-gegen-Human-^-globulin (IgG Fc-Pragment) in 100 ml eines 0,1m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,8. Nach dem vollständigen Inkubieren wäscht man das Material mit 1 1 einer phosphatgepufferten physiologischen NaCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0. Das erhaltene PoIyvinylchlorid-siliciumdioxid-Blatt mit dem daran adsorbierten V"--Globulin wird zwischen Filterpapier getrocknet.
Beispiel 4
Herstellung von fluoreszierenden Antikörper-Komplexen (Konjugaten)
a) Man löst 720 mg Kaninchen- Y--globulin-gegen-Human- V—globulin (IgG Fc-Fragment), 0,57 g NaCl, 0,259 g NaHCO3 und 0,049 g Na3CO3-IO H3O in 72 ml destilliertem Wasser. Man kühlt die erhaltene Reagenslösung in einem Eisbad und versetzt sie unter Rühren mit 36 mg Fluoreszeinisothiocyanat. Man läßt die Lösung während 18 Stunden in der Kälte unter Rühren stehen. Anschließend dialysiert man die Mischung gegen eine phosphatgepufferte physiologische Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von 7,0, bis die Dialyseflüssigkeit nicht mehr fluoresziert. Der erhaltene Antikörper-Komplex wird eingefroren.
b) Man löst 720 mg Kaninchen-VA--globulin-gegen-Human-j— globulin (IgG Fc-Fragment),0,57 g NaCl, 0,259 g NaHCO3 und 0,049 g Na2CO3-IO H3O in 72 ml destilliertem Wasser. Man kühlt die erhaltene Reagenslösung in einem Eisbad und gibt unter Rühren eine Lösung von 9 mg Rhodamin in 2 ml Aceton zu. Man rührt die Lösung in der Kälte während 18 Stunden. Anschließend dialysiert man die Mischung gegen eine phosphatgepufferte physiologische Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von 7,0, bis die Dialyseflüssigkeit nicht mehr fluoresziert. Der erhaltene Antikörper-Komplex wird eingefroren.
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c) Man löst 720 mg Kaninchen- j^—globulin-gegen-Human- γ— globulin (IgG Fc-Fragraent) , 0,57 g NaCl7: ΟΓ259 g NaHCO3 und 0,049 g Na2CO3-IO H3O in 72 ml destilliertem Wasser. Man kühlt die erhaltene Reagensmischung in einem Eisbad und gibt unter Rühren eine Lösung von 20 mg Dansylchlorid in 7 ml Aceton zu. Man rührt die Lösung dann während 18 Stunden in der Kälte. Anschließend dialysiert man die Mischung gegen eine phosphatgepufferte physiologische Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von 7,0, bis die Dialyseflüssigkeit nicht mehr fluoresziert. Der erhaltene Antikörper-Komplex wird dann gefroren.
Beispiel 5
Herstellung von Laktatdehydrogenase-isoenzym-H,-Antikörper-Komplex (Konjugat)
Man dialysiert eine Suspension von 4,5 mg Laktatdehydrogenaseisoenzym-H. in Ammoniumsulfat gegen einen 0,1m-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8. Unter Rühren gibt man 2,25 mg Kaninchen-γ- -globulin-gegen-Human- x/'-globulin (IgG Fc-Fragment) und einen Phosphatpuffer in einer solchen Menge zu, daß sich ein Gesamtvolumen von 1,35 ml ergibt. Nachdem sich das gesamte Kaninchen- γ--globulin gelöst hat, gibt man tropfenweise 45 μΐ 1%iger Glutaraldehydlosung zu und läßt die Reaktionsmischung während 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dann dialysiert man die Mischung gegen einen Natriumbarbiturat-Puffer und läßt den Komplex bei +40C stehen. Vor der Verwendung wird das Material mit 10 ml Barbituratpuffer, der mit 2% Albumin versetzt worden ist, verdünnt.
Beispiel 6
überprüfung der Bindung des Antikörpers an das Trägermaterial
Für die Untersuchung werden jeweils zwei Streifen der gemäß den Beispielen 1 bis 3 mit Antikörpern behandelten porösen Materialien und zwei unbehandelta Streifen aus dem gleichen
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porösen Material eingesetzt. Ein Streifen einer jeden Art (das heißt ein unbehandelter Streifen und ein behandelter Streifen) wird in einer Lösung von 1 mg Human-γ—globulin (IgG) in 1 ml Natriumbarbituratpuffer inkubiert- Dann werden sämtliche Streifen insgesamt zehnmal mit 20 ml Natriumbarbituratpuf f er, der 0,15m NaCl enthält, gewaschen, wonach die Streifen während 10 Minuten in einer Lösung des Fluoreszeinisothiocyanat-Antikörper-Ebnplexes inkubiert werden. Nach wiederholten Waschvorgängen entsprechend der zuvor durchgeführten Stufe werden die Streifen getrocknet und im Ultraviolett-Licht mit einer Wellenlänge von 340 nm untersucht,wobei sich zeigt, daß Fluoreszenz nur bei jenen Streifen auftritt, die die gebundenen Antikörper enthalten und in der IgG-Lösung inkubiert worden sind. Bei der Untersuchung der nach der Verfahrensweise des Beispiels 3 hergestellten Streifen werden als Kontrollmaterialien Streifen verwendet, die mit Rinderalbumin behandelt worden sind.
Quantitative immunochemische Bestimmung
Beispiel A
Die erfindungsgemäßen Diagnoseeinrichtungen werden wie folgt für diagnostische Zwecke zur immunochemisehen Bestimmung eingesetzt:
Das zu untersuchende (zu bestimmende) Material wird - in bekannter Menge, die vorzugsweise zwischen 1 μΐ und 3 μΐ liegt - auf eine ausgewählte Form des erfindungsgemäßen, Kapillarität aufweisenden Trägermaterials zusammen mit einem gleichen Volumen einer Standardlösung aufgebracht, die einen bekannten Gehalt des zu untersuchenden Antigens aufweist, wobei man neben der Testlösung verschiedene Verdünnungen bereitet.
Als mobile Phase zur Erleichterung der Wanderung unter Einwirkung der Kapillarkräfte wird beispielsweise ein O,O75m-Natriumbarbituratpuffer, der mit 0,3% Albumin versetzt ist, eingesetzt.
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Die Kapillarwanderung kann sowohl in offenen als auch geschlossenen Testbehältern durchgeführt werden. Weiterhin kann man die mobile Phase sich aufwärts oder abwärts bewegen lassen. Günstigerweise sollte man einen geschlossenen Behälter anwenden und die mobile Phase aufsteigen lassen. Nach einer beliebigen Zeit nach Beginn der Wanderung unter Einwirkung der Kapillarkräfte, die sich von etwa 10 bis etwa 45 Minuten erstreckt, wird das feuchte Trägermaterial in eine Antikörperlösung überführt, die entweder an Fluoreszeinisothiocyanat oder'an Laktatdehydrogenase gebundene Antikörper enthält. Die bevorzugte Inkubationszeit für diese beiden Indikatorlösungen beträgt 10 Minuten. Nach dem Inkubieren wird das Trägermaterial während 5 Minuten unter laufendem Wasser mit einer Temperatur von +370C gewaschen, wonach man vorzugsweise zweimal während 5 Minuten in 20 ml eines Natrxumbarbxturatpuffers inkubiert, der 0,2% Albumin und 0,15m NaCl enthält.
Wenn fluoreszierende Antikörper für die Identifizierung verwendet werden, wird die Strecke, die der Antikörper gewandert ist, im Ultraviolettlicht mit einer Wellenlänge von 34Onm bestimmt. Wenn eine Laktatdehydrogenase-Antikörper-Lösung verwendet wird, wird das Trägermaterial in einem wie folgt zusammengesetzten Farbstoffbad behandelt:
Man löst 30 mg 2/2I-Di-p-nitrophenyl-5,5I-di-phenyl-3,3'-(3,3*-dimethoxy-4,4'-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid (Nitrobluetetrazolium) und 40 mg Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) in 56 ml 0,5m Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4. Die Mischung versetzt man mit 1,60 ml 3,6m Lithiumlaktatlösung, 5 ml 0,06m CaIciumcyanidlösung und einigen Körnchen Methylphenazoniummetasulfat, die man in 2ml destilliertem Wasser gelöst hat. Das Kapillarität aufweisende Material wird bei +370C in dem Farbstoffbad inkubiert, bis eine deutliche Färbung beobachtet werden kann. Die Farbentwicklung ist eine Folge der Tatsache, daß die Laktatdehydrogenase die Reaktion Laktat +-NAD Pyruvat + NADH2 katalysiert und daß das
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gebildete NADH- quantitativ den Nitroblue-Tetrazolium-Farbstoff zu einer unlöslichen, lila gefärbten, formaζanartigen Verbindung reduziert (siehe Fieser & Fieser, Organic Chemistry, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1956).
Die angefärbten, mit Antigen bedeckten Bereiche der Diagnoseeinrichtung nehmen mit zunehmendem Antigengehalt der untersuchten Proben zu. Die gebundenen Antikörper-Moleküle verzögern die Wanderung der Antigen-Moleküle durch Austauschreaktionen während der Wanderung unter Einwirkung der Kapillarkräfte. Je höher die Antigenkonzentratxon ist, umso geringer ist die Verzögerungswirkung, da die durchschnittliche Zeit, während der ein Antigenmolekül an einen Antikörper gebunden bleibt, mit zunehmender Antigenkonzentratxon abnimmt.
Beispiel B
Man taucht Streifen aus dem erfindungsgemäßen Antikörper enthaltenden, porösen (das heißt Kapillarität aufweisenden) Trägermaterial in bestimmter Tiefe, beispielsweise 3 mm, in ein geringes Volumen einer Lösung des zu untersuchenden Antigenmaterials ein. Man läßt die in dieser Weise in Gang gebrachte Wanderung aufgrund der Einwirkung der Kapillarkräfte während etwa 3 bis etwa 20 Minuten fortlaufen, wonach man die Wanderung unterbricht, indem man den Streifen aus der Lösung nimmt. Dann wird die Wanderungsstrecke des Antigens in der in Beispiel A beschriebenen Weise gemessen und das Ergebnis wird nach der dort angegebenen Methode bewertet.
Die erfindungsgemäße Diagnose-Testeinrichtung weist vorzugsweise die Form eines Teststreifens auf, der aus dem porösen (das heißt Kapillarität aufweisenden) Trägermaterial besteht. Der Ausdruck "Streifen" umfaßt ganz allgemein die Diagnoseeinrichtung, ob sie die Dicke von Filterpapier aufweist oder erforderlichenfalls etwas dicker ist" öder in Form eines Films (der auch eine Membran oder eine Schicht sein kann) oder in Form von Scheiben vorliegt, wie es auf der Seite 3,
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-ΙΟΙ. Absatz, beschrieben ist, obwohl die Diagnoseeinrichtung auch in Form eines relativ dünnen, flachen Stabes oder eines Rundstabes mit geringem Durchmesser vorliegen kann.
In dem Ausdruck "Trägermaterial" wird der Begriff "Träger" in dem Sinn verwendet, daß die Antikörper, wie es in dem Absatz 4 der Beschreibung angegeben ist, an das Trägermaterial gebunden sind, beispielsweise durch Adsorption oder durch eine sogenannte kovalente Bindung, wobei das Material in Form eines Teststreifens vorliegt, der das poröse, Kapillarität aufweisende Antikörper-Trägermaterial umfaßt, an das die Antikörper gebunden sind.
Das mikroporöse Kunststoffblatt aus Polyvinylchlorid, das mit feinteiligem, im wesentlichen gleichmäßig in der porösen Polymerisatmatrix verteiltem Siliciumdioxid modifiziert ist, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, kann aus einem ähnlichen Blatt aus einer in gleicher Weise durchlässigen oder porösen, ununterbrochenen Polymerisatmatrix aus den normalerweise leicht zugänglichen Vinylchlorid-Propylen-Mischpolymerisaten oder Vinylchlorid-Vinylacetat-Mischpolymerisaten bestehen, in die in allen Fällen fein verteiltes Siliciumdioxid in ähnlicher Weise eingebettet ist.
Um Wiederholungen zu vermeiden ist zu sagen, daß das Beispiel 3 in gleicher Weise durchgeführt wurde, wobei jedoch das mikroporöse Kunststoffblatt durch ein mikroporöses Kunststoffblatt aus einem mit Siliciumdioxid modifizierten Vinylchlorid-Propylen-Mischpolymerisat und im anderen Fall durch ein entsprechendes mikroporöses Kunststoffblatt aus einem siliciumdioxidmodifizierten Vinylchlorid-Vinylacetat-Mischpolymerisat ersetzt ist.
Die obengenannten mikroporösen Blätter sind mit einem mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis etwa 1 μια und mehr erhält-
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lieh, beispielsweise mit einem Porendurchmesser von 0,1, 0,2, 0,3 und 0,5 μπι, wobei diese Materialien eine Gesamtporosität (durch das Einführen von Quecksilber gemessen) von etwa 1,1 bis etwa 1,8 mm pro Gramm im Fall des siliciumdioxidmodifizierten mikroporösen Kunststoffmaterials aufweisen.
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Claims (10)

Patentansprüche
1.) Diagnose-Testeinrichtung für quantitative imraunochemische Bestimmungen, gekennzeichnet durch ein im wesentlichen streifenförmiges/ poröses, Kapillarität aufweisendes Trägermaterial, an das Antikörper gebunden sind.
2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch" gekennzei'chnet, daß die Antikörper durch Adsorption, Absorption oder durch kovalente Bindung an das Trägermaterial gebunden sind.
3. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial aus Cellulosefasern, Stärke, einem dreidimensionalen Netzwerk oder einer Matrix aus Dextranketten, die mit Epichlorhydrin versetzt sind, Polyvinylchlorid, Kapillarität aufweisendem keramischen Material oder einem mit Siliciumdioxid modifizierten mikroporösen Polymerisat besteht, in dem fein verteiltes Siliciumdioxid im wesentlichen gleichmäßig in einer durchlässigen, ununterbrochenen Polymerisatmatrix, die aus Polyvinylchlorid, Vinylchlorid-Propylen-Mischpolymerisaten und Vinylchlorid-Vinylacetat-Mischpolymerisaten ausgewählt ist, eingebettet ist,
4. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägermaterial um eine poröse Polyvinylchloridmatrix handelt, in die fein verteiltes Siliciumdioxid eingebettet ist.
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5. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennz eichnet/ daß die Antikörper durch Adsorption oder Absorption an das Trägermaterial gebunden sind.
6. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper unter Verwendung von Bromcyan oder Glutaraldehyd durch kovalente Bindungen an das Trägermaterial gebunden sind.
7. Verfahren zur Durchführung von quantitativen immunochemischen Bestimmungen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Diagnoseteststreifen nach Anspruch 1 mit einer wässrigen Probe benetzt, die das zu bestimmende Antigen enthält, die Wanderung unter Einwirkung der Kapillarkräfte ablaufen läßt und den Antigen enthaltenden Bereich des Diagnoseteststreifens bestimmt, indem man ihn mit Antikörpern benetzt, die in einem wässrigen Trägermaterial vorliegen und an eine wasserlösliche, fluoreszierende Farbindikatorverbindung oder ein Enzym gebunden sind, das eine Farbbildungsreaktion katalysiert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gek.ennzeichnet, daß man als Farbindikatorverbindung Fluoreszeinisothxocyanat, Rhodamin oder Dansylchlorid einsetzt..
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Diagnoseteststreifen aus einer Polyvinylchlorid-Siliciumdioxid-Kombination besteht, an die Antikörper gegen Human-y^-globulin adsorbiert sind.
10. Verfahren nach Anspruch 8,dadurch gekennzeichnet, daß man als an den Antikörper gebundenen Farbindikator Fluoreszeinisothxocyanat verwendet.
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