DE2603069A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung des gesamtproteingehaltes oder einzelner aminosaeuren - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur bestimmung des gesamtproteingehaltes oder einzelner aminosaeurenInfo
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Description
GESELLSCHAFT FÜR STRAHLEN- Neuherberg, den 2*. 1. 1976
UND UMWELTFORSCHUNG MBH MÜNCHEN PLA 76 01 /Ga/jd
Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung des Gesamtproteingehaltes
oder einzelner Aminosäuren.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmmung des Gesamtproteingehaltes
oder einzelner Aminosäuren in Mehl, Getreidemehl und/oder Leguminosen mittels der Fluoreszenzanalyse, wobei die Proteine und/oder
die einzelnen Aminosäuren fluoreszenzwirksam angefärbt werden oder selbst fluoresenzfähig sind, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses
Verfahrens.
Im Rahmen der Pflanzenzüchtung, mit dem Ziel die Proteinquantität und
Qualität zu verbessern, ist es notwendig, schnelle und genaue Analysenmethoden zur Gesamtprotein- oder einzelner Aminosäurenbestimmung zu
entwickeln. Diese Notwendigkeit ergibt sich aus der schlechten Ernährungssituation in der Welt. Die bisher eingesetzten Methoden, im wesentlichen
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chemischer Art oder auch aktivierungsanalytisch, erweisen sich als zu
langsam, ungenau und werden mit einem erheblichen Arbeitsaufwand verbunden.
Bei der Gesamtproteinbestimmung wird im wesentlichen von einer chemischen oder aktivierungsanalytischen Stickstoffbestimmung ausgegangen
und der Gesamtproteingehalt über Zahlenfaktoren berechnet. Dabei wird aber auch Stickstoff erfaßt, der nicht proteingebunden ist.
Bei der Mehrzahl der in der Pflanzenzüchtung in größerem Maßstab Anwendung
findenden Bestimmungsmethoden, z. B. für Lysin, werden die Proteine hydrolisiert. Die Dye-Binding-Capacity-Methode (DBC), bildet hierbei
eine Ausnahme. Die Mehlproben werden in der Regel 24 Stunden in konstant siedender 6-n-Salzsäure aufgeschlossen. Auch alkalische und enzymatische
Hydrolyse werden angewandt. Neben dem hohen Zeit- und Kostenaufwand müssen durch den Schritt der Hydrolyse Fehler durch unvollständige Trennung
der Aminosäuren, Racemisierung und Zerstörung eines Teils der Aminosäuren in Kauf genommen werden. Das Hydrolysat kann nun durch eine Reihe
verschiedener Tests auf seinen Lysingehalt untersucht werden.
Die chromatographische und elektrophor etische Methoden erfordern einen
hohen Aufwand und praktische Erfahrung. Da sie aber die Gesamtzusammensetzung der Proteine liefern, sind sie für den Züchter von Vorteil, der auch
über andere essentielle Aminosäuren Aufschluß haben will. Die Trennung des Hydrolysats kann durch Papier Chromatographie, Säulenchromatographie
oder Elektrophorese erfolgen. Die quantitative Bestimmung der einzelnen
Aminosäuren erfolgt meisten kolorimetrisch, nach Färbung mit Ninhydrin (Blackburn, S., "Amino Acid Determination" Marcel Dekker, Inc. , New York
(1968)).
Die FDNB-Methode basiert auf der Reaktion des Fluoro-2, 4-Dinitrobenzols
(FDNB) mit freien Aminogruppen von Proteinen und Peptiden in alkalischer Lösung. Nach der Hydrolyse wird Dinitrophenyl-Aminosäure, einschließlich
£ -DNP-Lysin, erhalten. Die quantitative Bestimmung des letzteren
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erfolgt kolorimetrisch (Carpenter, K.J., Biochem. J., 77(1960)604).
Es sind für die enzymatisch^ Bestimmung Bakterien gezüchtet worden, die
spezifische Decarboxylasen des Ly sins und anderer Aminosäuren produzieren.
(Gale, E. F., Advances in Enzymology 6 (1946) 1). L-Lysindecarboxylasen
werden aus Bakt. cadaveris gewonnen. Eine manometrische Bestimmung des
CO„ ergibt den Lysingehalt des Flydrolates. Auch diese Methode ist Kosten-
und Zeitaufwendig.
Bei der biologischen Bestimmung mrd dem Nährboden einer Bakterienkultur
eine für sie essentielle Aminosäure entzogen, so daß das Wachstum zum Stillstand kommt. Nach. Hinzufügen eines Aminosäurehydrolysates ist
das Wachstum proportional dem Anteil der dem Nährboden fehlenden Aminosäure. Diese Methode ist zwar einfach und sehr spezifisch, erreicht aber
keine hohe Reproduzierbarkeit (Bolinder, A.E., Acta Pharm. Suec. 7, (1970)
125).
Zur routinemäßigen Ly sinbe Stimmung in Getreidemehlen hat die bereits
genannte Dye-Binding-Capacity-Methode (Udy, D. C., Cereal Chem. 33 (1956)
191) die weiteste Verbreitung gefunden. Die zu untersuchende Probe wird gemahlen und mit einer Färb stoff lösung orange G (7-Hydroxy-8-phenylazo-
naphtalindisuifonsäure-(l, 3)-Dinatriumsalz) bekannter Konzentration verreagiert
mit
setzt Er/den basischen Aminosäuren, Lysin, Histidin und Arginin. Nach Ablauf der Färbung wird die Konzentration des nicht gebundenen Farbstoffs im Filtrat bestimmt. Aus der Konzentrationsdifferenz wird auf die Menge an basischen Aminosäuren geschlossen. Es zeigt sich, daß die so erhaltenen Werte eine hohe Korrelation zum Gesamtproteingehalt der Mehlproben aufweisen. Der Gesamtproteingehalt muß durch eine Stickstoffbestimmung nach Kjeldahl ermittelt werden, wobei 16 g Stickstoff etwa 100 g Protein entsprechen. Der Vorteil dieser Methode besteht in der Umgehung der Hydrolyse. Sie ist daher einfach, schnell und liefert gut reproduzierbare Ergebnisse.
setzt Er/den basischen Aminosäuren, Lysin, Histidin und Arginin. Nach Ablauf der Färbung wird die Konzentration des nicht gebundenen Farbstoffs im Filtrat bestimmt. Aus der Konzentrationsdifferenz wird auf die Menge an basischen Aminosäuren geschlossen. Es zeigt sich, daß die so erhaltenen Werte eine hohe Korrelation zum Gesamtproteingehalt der Mehlproben aufweisen. Der Gesamtproteingehalt muß durch eine Stickstoffbestimmung nach Kjeldahl ermittelt werden, wobei 16 g Stickstoff etwa 100 g Protein entsprechen. Der Vorteil dieser Methode besteht in der Umgehung der Hydrolyse. Sie ist daher einfach, schnell und liefert gut reproduzierbare Ergebnisse.
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Ihr Nachteil liegt jedoch darin begründet, daß sie nicht spezifisch, z.B.
für Lysin,ist. Hohe DBC-Werte können auch durch hohen Arginin- und
Histldin-Anteil bei niedrigen! L·ysingehalt verursacht werden.
Es ist auch bereits eine fluorometrische Bestimmung von basischen und
gesamten Proteinen mittels Sulfoflavin bekannt (Leemann, U. und Ruch, F=
J. Histochem. Cytochem., 20, 659 - 671, 1972). Diese fluorometrische
Analysenmethode könnte zwar nach einigsn Veränderungen von dem Gebiet
der Histonchemie und Cytologie auf die Anwendung in der Pflanzenzüchtung übertragen werden, jedoch sind die bekannten Fluororaeter hierzu von der
technischen Seite her zu aufwendig.
So werden Messungen mit einem Spektralfluorometer Fluorispec der Firma
Baird-Atomic Modell SF 100 durchgeführt. Als Ausgangs- bzw. Erregerstrahlung
dient das Licht einer Xenonhochdrucklampe. Zur spektralen Zerlegung von Erreger und Fiuoreszenzstrahlung kommen zwei Doppelmonochromatoren
-vomCzerny-Turner-T^p mit Dispersionsbereichen von 220 nm
bis 700 nm zur Anwendung. Jeder enthält zwei plane Reflexionsgitter. Die blaze-Winkel sind auf der Erregerseite für 300 nm, auf der Emissionsseite
für 500 nm ausgelegt. Die Fiuoreszenzstrahlung wird im rechten Winkel zur
Einfallsrichtung der Erreger strahlung gemessen.
Die von diesem Fluoremeter aufgezeichneten Kurven stellen jedoch nicht die
wahren Fluoreszenzspektren der zu untersuchenden Substanz dar. Sie sind
vielmehr durch die weilenlängenabhängige Empfindlichkeit des verwendeten
Photo multipliers und die selektrive Wirkung des Emissionsmonochromators (blaze-Winkel) verfälscht. Analog dazu sind die Erregerspektren durch die
nicht konstante spektrale Intensitätsverteilung der Xenonhochdrucklampe
und durch die Selektivität des Excitationsmonochromators verzerrt. Zur Auswertung
müssen die gemessenen Spektren im allgemeinen korrigiert werden.
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Als Voraussetzung für den Züchterischen Erfolg ist es demnach notwendig,
z.B. den Lysingehalt oder Tryptophangehalt des Saatgutes während der
verschiedenen Stadien der Selektion schnell und genügend präzise zu ermitteln. Das oben genannte bekannte Fluorometer ist für diese Proteine- und/
oder Aminosäurebestimmung in Getreidemehlen unnötig aufwendig und teuer. Außerdem würde eine Sedimentation des Mehles einsetzen und zu beträchtlichen
Meßfehlern führen, bedingt durch den horizontalen Strahlengang des Gerätes.
Die Aufgabe der Erfindung besteht nunmehr darin, eine spezifische Fluorochromierung
von Proteinen und/oder Aminosäuren zu ermöglichen und dafür eine einfache, billige und schnelle Fluoreszenzbestimmungsmethode mit für
die Pi-axis ausreichender Genauigkeit sowie ein hierzu benötigtes Fluorometer
zu bieten. Das Fluorometer soll dabei so ausgelegt sein, daß absinkende Mehlpartikel nicht das Meßvolumen verlassen, das Intentitätsmaximum der
Lichtquelle im Bereich des Excitationsmaximums z.B. der dansylierten.,.
mit brilliant Sulfoflavin versetzten oder eigenfluoreszierenden Proben liegt und mit einer wirksamen Kompensationseinrichtung Intensitätsschwankungen
der Fluoreszenz infolge von Schwankungen der Lampenintensität ausgeglichen wird.
Die Lösung dieser Aufgabe sieht erfindungsgemäß ein Verfahren vor, bei
dem die Proteine und/oder die einzelnen Aminosäuren in ihrer Ausgangs form in Suspension gebracht werden, und daß die Suspension dann imvertikalen
Durchlichtverfahren fluorometrisch ausgemessen wird. Dabei kann zur Anfärbung der Proteine und/oder einzelner Aminosäuren Dansylchlorid
und/oder Sulfoflavin verwendet werden.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist ge-
die kennzeichnet durch eine Strahlenquelle für die/Fluoreszenz Strahlung erregende
Primär Strahlung, durch optische Elemente zur Ausrichtung der Primärstrahlung auf die Proteine und/oder Aminosäuren in Suspension, durch mindestens
einen Behälter für die Suspension, der vertikal von der Primärstrahlung
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durchstrahlbar ist, und durch Aufnahme- und Auswerte elemente für die
Fluoreszenz strahlung.
Eine vorteilhafte "Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung Ist dadurch
gekennzeichnet, daß die Strahlenquelle eine Quecksilberhochdrucklampe ist, und daß die optischen Elemente fest angeordnete Filter, Linsen
und Umlenkspiegel sind. Weiterhin kann in einer vorteilhaften Aus ge staltung sform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung der Behälter Ln einer Probenhalterung
auswechselbar gehaltert sein, wobei in der Probenhalterung eine Aussparung eingefügt ist, in der ein Photoelement bzw. -widerstand enthalten
ist, das mit den Auswerteelementen verbunden ist.
Eine Ausgestaltungsform der Erfindung kann dadurch gekennzeichnet sein,
daß die Probenhalterung als Probenwechsler in Form eines Schiebers ausgebildet ist, in dem mindestens zwei Behälter gehalten sind. Außerdem kann
der Schieber unterhalb der Behälter bzw. KüvettenDurchtrittsöffnungen aufweisen,
die mit einer Öffnung zur Aussparung hin in Korrespondenz zu bringen sind, wobei unter der Öffnung das Aufnahme element und mindestens ein Zusatzfilter
angebracht sind. Auch ist es möglich, den Umlenkspiegel an der Probenhalterung selbst über der Öffnung anzuordnen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels für ein
Fluorometer und Ausführungsbeispielen für das Verfahren mittels der Figuren 1 bis 6 näher erläutert.
Das Fluorometer ist in einem geschlossenen Gehäuse 1 untergebracht und
im wesentlichen von einer Schottwand 2 in zwei Teile 3 und 4 unterteil bar (siehe Figur 1 und Figur 2). Im Teil 3 ist der Bogen der Quecksilberhochdrucklampe
5 mit ihrem Sockel 6 sowie ein Lüfter 7 und eine Drossel 8 untergebrachtl Im Teil 4 des Gehäuses 1 sind im wesentlichen optische
Elemente und die Probenhalterung angeordnet.
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Der Bogen der Quecksilberhochdrucklampe 5 wird durch die Linse 9 in
die Ebene der Linse 10 abgebildet. Diese Linse 10 bildet wiederum die
Linse 9 in die Küvette 11 ab, wobei der nicht näher dargestellte Strahlengang
von dem Umlenkspiegel 12von horizontaler Richtung in vertikale Richtung
umgelenkt wird. DLe Quecksilberhochdrucklampe 6, die Linsen 9 und 10,
sowie der Probenwechsler 13 mit Umlenkspiegel 12 und Küvette 11 sitzen
auf einer gemeinsamen optischen Bank 14. Mit dieser Optik wird eine
homogene Ausleuchtung des Küvetteninhalts erreicht. In der Schottwand 2
ist außerdem ein. Filter 15 in den Strahlengang eingeschaltet worden.
In der Küvette 11 befindet sich eine Suspension mit Mehl, welche von der
Primärstrahlung aus der Quecksilberhochdrucklampe 5, 6 zu Fluoreszenzstrahlung angeregt wird. Die relativen Fluoreszenz Intensitäten der gefärbten
Mehlproben werden mit einem Selenelement 16 (siehe Figur 3) gemessen.
Die Küvette 11 und eine weitere in Figur 2 dargestellte Küvette 17 sind
über Öffnungen 18 bzw. 19 in einem Schieber 20 gehaltert. Dieser Schieber
20 ist gegenüber dem Probenwechsler 13 bzw. dessen Gehäuse von außerhalb des Gehäuses 1 verschiebbar, so daß sowohl die Küvette 11 als auch die
Küvette 17, welche eine Eichprobe enthalten kann, in Meßposition zu bringen
sind. Der Probenwechsler 13 enthält in seinem Inneren eine Ausnehmung (siehe nunmehr Figur 3),welche eine obere Öffnung 22 besitzt, die mit den
Öffnungen 18 bzw. 19 im Schieber 20 in Korrespondenz gebracht werden kann. Am Boden dieser Ausnehmung 21 im Probenwechslergehäuse 13
befindet sich das Selenelement 16. Es ist mittels einer Gummidichtung 23 am Gehäuse befestigt. Über dem Selen- bzw. Photoelement 16 befindet sich
ebenfalls in der Ausnehmung 21 ein Emissionsfilter 24, einnichtfluoreszierendes
Kunststoffkantenfilter KV 418 von 3 mm Dicke der Fa. Schott, Mainz. Das Filter 15 (siehe Figur 1 und 2) ist das Excitationsfilter. Es handelt sich
hierbei um ein UG 1 von 2 mm Dicke in Verbindung mit einem BG 12 von 2 mm Dicke, die ebenfalls von der Fa. Schott, Mainz hergestellt werden.
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Das Selenelement 16 1st nicht unmittelbar unter der Küvette 11 angeordnet,
sondern in ca. 3 cm Abstand. Absinkende Mehlpartikel erzeugen auf dem Photoempfänger 16 daher nahezu gleichbleibende Bestahlungsstärken. Durch
die beschriebene Auslegung des Strahlenganges wird eine Reproduzierbarkeit der Meßwerte innerhalb t 1 % erreicht, auch wenn das Mehl jeweils ungleichförmig
verteilt in der Küvette ist. Eine Quarzoptik ist bei der Erregerwellenlänge von λ = 365 nm nicht erforderlich. Die Linsen 9 und 10 bestehen
aus Glas. Das Küvettenmaterial ist Duran. Der Schieber 20 ist in
dem Probenwechsler 13 mittels einer Feststellschraube 25, einer Feder 26
und einer Kugel 27 in jeder Position arretierbar. Als Führung für den Schieber 20 dienen die beiden parallel zueinander angeordneten Leisten 28.
Ebenfalls an den Probenwechsler 13 ist die Halterung 29 für den Umlenkspiegel
12 über der Küvette 11 bzw. der Öffnung 18 und 22 mittels der Schrauben 30
festgeschraubt. Der Umlenkspiegel ist ein Oberflächen-Spiegel der Größe 100 χ 65 mit einer Dicke von 2, 5 mm.
Zwischen dem Spiegel 12 bzw. dessen Halterung 29 und dem Gehäuse 1 ist
(siehe Figur 1) eine Meßkonsole 31 mit dem Digitalvoltmeter 32 angeordnet. Hier sind die Fluoreszenzintensitäten direkt ablesbar.
Infolge der großen Wellenlängendifferenz zwischen Erreger - and Fluoreszenzstrahlung
können beide, trotz des in dieser Hinsicht oft kritischen Durchlichtverfahrens, leicht voneinander getrennt werden. Die Auswahl der Filter
15 bzw. 24 bereitet keine Schwierigkeiten. Die Fluoreszenz Intensitäten der Proben in der Küvette 11 bzw. in der Eichküvette 17 sind so hoch, daß als
Empfänger ein Halbleiterelement, wie z. B. das Selenelement 16 ausreicht. Die Beleuchtungsstärke in 3 cm Abstand beträgt 2 bis 5 Lux je nach Probe.
Es ist ein Selenelement 16 ausgewählt, welches im Bereich von 530 nm noch nahezu maximale Empfindlichkeit besitzt .
Das Fluorometer nach Figur 1, 2 und 3 wird durch einen Meßverstärker
(siehe Figur 4) und eine Vor schaltdrossel 8 (siehe Figur 2) für die Lampe 5,
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6 vervollständigt. Auf eine Stabilisierung des Lampenstromes kann verzichtet
werden. Zu den IntensitätsSchwankungen infolge von Netzspannungsänderungen
kommen noch Schwankungen, die durch Änderungen in der Umgebungstemperatur der Lampe 5, 6 verursacht werden. Eine Verfälschung
der Meßergebnisse durch beide Effekte wird verhindert, in dem der Verstärkungsfaktor
des Meßverstärkers durch die Lampenintensität gegensinnig
gesteuert wird. Dazu wurde ein Operationsverstärker 33 (SN 7Z741 ITT) eingesetzt. An ihn ist über einen Widerstand 34 von 1 kg Ohm das Selenelement
16 angekoppelt, welches mit seinem anderen Pol an Null liegt. Als variable Gegenkopplung fungiert ein Photowiderstand 35 (LDR 07 , light
dependend resistance). Steigt die Lampenintensität (die Lampe ist in Figur 4 nicht dargestellt) z.B. an, so verringert sich der Widerstandswert des
Widerstandes 35 und damit die Verstärkung. Intensitäts Schwankungen der
Lampe haben damit eine um den Faktor 10 verringerte Änderung des Meßsignals zur Folge. Die Anordnung verbindet hiermit die einfache Handhabung
der Ausschlagsmethode mit der Genauigkeit einer Kompensationsmethode.
Der Photowiderstand 35 ist z.B. direkt oberhalb der Linse 10 angebracht,
und zwar derart, daß der Rand des Quarzkolbens der Quecksilberhochdrucklampe 5, 6 auf ihn abgebildet wird, nicht aber der Bogen selbst. Mit dieser
Anordnung ist keine nenneswerte Intensitätseinbuße der Erregerstrahlung verbunden, für den Regelvorgang reicht das Streulicht vom Quarzkolben
jedoch aus. Die Fassung 36 (siehe Figur 1) der Linse 10 ist zu einer Aperturblende
ausgebildet. Der Photowiderstand 35 wird also nicht in die Küvette 11 bzw. 17, welche ja homogen ausgeleuchtet werden muß, abgebildet.
Da die relative Intensität der Spektrallinien stark mit dem Druck in der Lampe 5, 6 schwanken kann, wurde der Excitationsfilter 15 vor dem Photowiderstand
35 angeordnet. Damit wird dieser - wie die Probe in der Küvette 11 - nur mit dem Licht der 365nm Linie bestrahlt. Durch mehr oder weniger
weites Einschieben des Photowider Standes 35 in Richtung Bogenachse der Lampe 5, kann der Verstärkungsfaktor und damit die Empfindlichkeit der
Schaltungsanordnung nach Figur 4 grob eingestellt werden. Die Feineinstellung, d.h. die Kalibrierung des Gerätes anhand eines Fluoreszenz-
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standards, erfolgt mit dem Potentiometer 37. Mit dem Potentiometer
erfolgt der elektrische Nullabgleich bei unbeleuchtetem Photo- bzw. Selenelement 16. Das Mikroampermeter 39 mit Spiegel gestattet eine Ab·-
lesegenauigkeit von besser Z 0, 5 % des Skalenendwertes. Eine Expanderschaltung
ist daher nicht notwendig.
Der niedrige E ingangswiderstand des Verstärkers 33 liegt mit 2 k -lierheblich
unter dem Innenwiderstand des Selenelementes 16 (größer 20 20kjl),das damit praktisch im Kurzschlußbetrieb arbeitet. Damit ist eine
strenge lineare Abhängigkeit zwischen Meßanzeige und Fluoreszenzintensität gegeben.
Die gute Reproduzierbarkeit der Messungen mit dem Filterfluorometer
gestattet es, auch geringe Unterschiede, z. B. im Lysingehalt, wie sie
innerhalb einer Getreideart zu erwarten sind, zu ermitteln. Das zu untersuchende
Saatgut wird durch gleichartige Lagerung auf festen Wassergehalt eingestellt. Vor dem Färben wird es fein und homogen vermählen. Für die
Messungen mit dem Filterfluorometer sind Probenmengen von etwa 20 mg
gewählt worden. Sie werden in Zentrifugierröhrchen abgewogen, in denen auch die Färbung erfolgt. Dazu wird das Mehl zunächst in
0, 5 n-NAH CO suspendiert. Nach Zugabe von 4 ml Äthanol absolut fällt das NAH CO aus. Nach Zentrifugieren wird der Überstand dekandiert.
Die Färb stoff lösung wird mit 1 mg Dancylchlorid auf 1 ml 95% igen Äthanol
vor jeder Meßreihe frisch angesetzt; jeder Probe werden 3 ml zugegeben. Das Dancylchlorid (5-DimethyIoamino-l-naphtalinsulfonylchlorid) findet
weite Anwendung als Endgruppenreagenz in der Sequenzanalyse von Peptiden und Proteinen, der Immunohistologie und für klinische Zwecke. Dans ylchlorid
reagiert mit den Aminoendgruppen der Proteine, sowie mit den Sulfhydryl-(Cystein), den Phenol-(Tyrosin), den Amino-(Lysin) und den
Imidazol-(Histidin) Gruppen der Seitenketten. Mit anderen Seitengruppen
reagiert der Farbstoff nicht.
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E«as Mehl und der Farbstoff werden gündlich durchmischt, wobei Klumpenbildung
zu vermeiden ist. Die Färbung erfolgt bei 30 C für die Dauer einer Stunde. Danach wird der überschüssige Farbstoff durch dreimaliges
Waschen in Äthanol abgetrennt. Die fluorochromierten Mehle werden anschließend in 5 ml Wasser suspendiert und in die Meßküvette 11 bzw.
17 gegeben. Das Filterflxiorcmeter wird vor jeder Meßreihe mit einem
GIasstandard kalibriert.
Die Fluoreszenzintensität nimmt bis zu einem Wert von 25 mg Mehl pro
5 ml Wasser linear mit steigender Konzentration zu. Proben von etwa 20 mg pro 5 ml liegen also im Proportionalitätsbereich. Die relative
Fluoreszenz intensität ist proportional der in den Mehlproben befindlichen Menge an Lysin, gleichgültig wie sich diese zusammensetzt. Daher kann
der Züchter die vom Fluorometer gelieferten Meßwerte direkt zur Selektion heranziehen. Will er ein Maß für den Proteingehalt haben, so muß er eine
zusätzliche Bestimmung des Stickstoffgehaltes vornehmen. In Figur 5 ist die relative Fluoreszenzintensität danaylierter Weizenmehle in Abhängigkeit
ihres Ly sing ehalte s (mg/l, 6 g Mehl) aufgetragen. Die Intensitäten
sind Mittelwerte von jeweils zwei Messungen. Die Empfindlichkeit des Fluorometers ist derart eingestellt, daß der Standard einen Ausschlag
von 50 Skalenteilen ergibt.
Ein weiterer möglicher Farbstoff ist Sulfoflavin. Es ist ein saurer Farbstoff,
der im sauren Medium mit allen freien, positiv geladenen, proteingebundenen Aminosäuren reagiert. Als Nachweis für die Reaktion erfolgt
eine Verschiebung im Emissionspektrum um 10 nm und eine Erhöhung der
Quantenausbeute um das zehnfache. Eine weitere Eigenschaft des Farbstoffes besteht darin, die in der wäßrigen Pufferlösung löslichen Proteine auszufällen.
Die mit Sulfoflavin angefärbten Stoffe, z. B. Gerste mit 14, 5 % Protein, ausgewählte Zerealien und Leguminosen, können somit mit dem
erfindungsgemäßen Fluorometer ausgemessen werden. Eine weitere Möglichkeit der Ausnutzung des e rf indungs gemäßen Fluorometers sind
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Stoffe, welche eigenfluoreszieren. Hierbei Ist ζ. Β. Tryptophan verwendbar.
Das Tryohtophan wird chemisch zu einem Fluorochrom umgewandelt. Die Analyse im Spektralfluorometer ergibt für das Maximum der Excitation
410 nm und für die Emission 500 nm bei reinem Tryptophan und 490 nm
bei proteingebundenem Tryphtophan. Das Tryphtophan ist selbstverständlich
wieder als Mehl in den Küvettsn 11 bzw. 17 des Fluorometers enthalten.
Die Figur 6 gibt ein Bild der Eichkurve für gereinigte Proteine (γ-Globulin,
Pepsin, Albumin(im Ei) und Albumin(in der Kuh) sowie Gelatine) aufgetragen
über Tryphtophan in Gramm pro 100 g Protein an.
Vorteilhaft Ist das direkte Bilden eines Fluorochromes, das jegliche Weiterbehandlung
wie Auswaschung und Zentrlfugatlon erübrigt. Zum anderen ist es möglich, das erhaltene Fluorochrom ohne Verluste in der Quantenausbeute
so mit destilliertem Wasser zu verdünnen, daß die Messung im linearen Bereich der Empfindlichkeit liegt. Im Gegensatz zu den Anfärbemethoden
wird das Tryptophan hierbei chemisch zur Bildung von Fluoreszenzfarbstoffen angeregt. Dem Tryptophan . wird hierzu als Reagenz konzentriertes
CH COOH, 95 %iges H SO , Benedict's Lösung, FeCl sowie 6 H O hinzugefügt.
Nach Kondensation und Oxydation entsteht das Fluorochrom.
Die Bestimmung von Tryptophan war bisher nur möglich nach alkalischer
oder enzymatischer Hydrolyse, wobei die letztere nicht vollständig
1st. Nach diesem Aufbereitungsschritt hatte eine säulenchromatographische
Trennung mit einem Amlnosäureanalysator zu erfolgen.
Die besonderen Nachtelle dieses Verfahrens sind die immer unvollständige
Hydrolyse.
Außer diesen bereits erwähnten Stoffen kann auch Tetrahymena nachgewiesen
werden. Es wird mit 2, 3, 5, -Trlphenyltetrazollum-Chlorld (TPTZ) quantitativ
enzymatisch durch die Protozoen zu dem roten, wasserunlösllchen
Trlphenylformazan (TPF) reduziert. Da das TPF fluoresziert (Excitation
384 nm und Emission 442 nm) ist eine direkte Messung ohne vorherige Trennung von den Probenrestbestandteilen möglich.
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Auch verschiedene Algenarten zeigen spezifische Fluoreszenzeigenschaften.
Mit dem erfindungsgemäßen Filterfluorometer können diese auch in Suspensionen ausgemessen werden.
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Claims (8)
- GESELLSCHAFT FÜR STRAHLEN- UND Neuherberg, den 2 6. 1. 1975 UMYfELTFORSCHUNG MBH MÜNCHEN PLA 760! Ga/jdPatentansprüche:ι 1. !Verfahren zur Bestimmung des Gesamtproteingehaltes oder einzelner •y oder anderer StoffeAminosäuren in Mehl, Getreidemehl und/oder Legumino se r/mittels der Fluoreszenzanalyse, wobei die Proteine und/oder die einzelnen Aminosäuren fluoreszenzv/irksam angefärbte werden oder selbst fluoreszenzfähig sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine und/ oder die einzelnen Aminosäuren in ihrer Ausgangsform in Suspension gebracht werden,und daß die Suspension dann im vertikalen Durchlichtverfahren fluorometrisch ausgemessen wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anfärbung der Proteine und/oder einzelner Aminosäuren Dan sylchlorid und/oder SuIf of lavin verwendet wird.
- 3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch eine Strahlenquelle (5, 6) für die die Fluoreszenzstrahlung erregende Primär strahlung, durch optische Elemente (9, 10, 12, 15, 24) zur Ausrichtung der Primär Strahlung auf die Proteine und/ oder Aminosäuren in Suspension, durch mindestens einen Behälter (11 und/oder 17) für die Suspensionen, der vertikal von der Primär strahlung durchstrahlbar ist, und durch Aufnahme- und Auswertelemente (16, 33, 35, 39 bzw. 31, 32) für die Fluoreszenzstrahlung.
- 4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlenquelle (5, 6) eine Quecksilberhochdrucklampe ist, und daß die optischen Elemente (15,24, 9, 10, 12) fest angeordnete Filter, Linsen und Umlenkspiegel sind.- 14 -ORIGINAL INSPECTED709832/0783
- 5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (11, 17) in einer Probenhalterung (13, 20) auswechselbar gehaltert ist, und daß die Probenhalterung (13, 20) in einer Aussparung (21) ein Photoelement bzw, -väderstand (16) enthalten ist, das mit den Auswerteelementen (33, 34, 35S 37, 38, 39) verbunden ist.
- 6. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder einem der folgenden, dadurch, gekennzeichnet, daß die Probenhalterung (13, 20) als Probenwechsler in Form eines Schiebers (20) ausgebildet ist, in dem mindestens zwei Behälter (11. und 17) gehalten sind.
- 7. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß der Schieber (20) unterhalb der Behälter bzw. Kxivetten (11, 17) Durchtrittsöffnungen (18, 19) aufweist, die mit einer Öffnung (22) zur Aussparung (21) in Korrespondenz zu bringen sind, wobei unter der Öffnung (22) das Aufnahmeelement (16) und mindestens ein Zusatzfilte^r (24) angebracht sind.
- 8. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß der Umlenkspiegel (12) an der Probenhalterung (20) über der Öffnung (22) angeordnet ist.- 15 -709832/0783
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