DE2607766C3 - Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven Substanzen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven SubstanzenInfo
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Classifications
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- C08F8/32—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups by reaction with amines
Description
Es ist bekannt, Proteine wie Enzyme, Antigene, Antikörper und Verbindungen, die mit biologisch
aktiven Substanzen eine Wechselwirkung einzugehen vermögen, an unlösliche polymere Substanzen zu
binden, doch zeigen die dabei eingesetzten polymeren Substanzen häufig selbst Wechselwirkungen mit den
biologisch aktiven Stoffen, indem sie an dem Trägerpolymeren unspezifisch adsorbiert werden. Eine derartige
Wechselwirkung ist unerwünscht. Es hat deshalb nicht an Versuchen gefehlt, immer wieder geeignete hinreichend
inerte Polymere als Träger für die biologisch wirksamen Stoffe zu finden.
In der DE-OS 24 21 789 ist Polyhydroxymethylen, das auch unter der Bezeichnung Poiyvinylenglykol bekannt
ist, als Träger für biologisch aktive Substanzen beschrieben. Die Verbindung zwischen dem biologisch
wirksamen Stoff und dem Poiyvinylenglykol wird durch Reaktion einerseits der Hydroxylgruppen des Polyvinylenglykols,
andererseits bestimmter Gruppierungen der damit zu verbindenden Substanzen herbeigeführt,
wonach eine kovalente Verbindung zwischen beiden entsteht. Vergleichbare Verfahren führen auch zu
biologisch aktiven Verbindungen aus einem Copolymeren des Vinylenglykols mit einer biologisch aktiven
Substanz entsprechend einem älteren Vorschlag.
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Prfinrli,
einfacheres Verfahren zur Herstellung einer Verbindung zwischen einer primäre Aminogruppe enthaltenden
biologisch wirksamen Substanz und einem synthetischen, vicinale Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren,
vorzugsweise dem Poiyvinylenglykol, zu finden.
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen
biologisch aktiven Substanzen, bei dem Derivate synthetischer, vicinale Hydroxylgruppen enthaltender
Polymerer entweder mit einer primäre Aminogruppen enthaltenden biologischen Substanz oder zunächst mit
einer bifunktionellen, eine primäre Aminogruppe enthaltenden organischen Verbindung, wonach über die
zweite funktionelle Gruppe die Umsetzung mit einer biologisch wirksamen Substanz durchgeführt wird,
umgesetzt werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als Derivat des synthetischen, vicinale
Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren ein solches eingesetzt wird, das mit einem mittelstarken Oxidationsmittel,
dessen Potentialbereich zwischen +1,0 und +1,5 V liegt, oder einem starken Oxidationsmittel mit
einem Potentialbereich >1,5 bis zur Bildung von ausreichenden Mengen an Aldehydgruppen behandelt
worden ist, und daß die gebildete Schiffsche Base gegebenenfalls durch Reduktion mit geeigneten Reduktionsmitteln
stabilisiert wird.
Als mittelstarke Oxidationsmittel im Sinne der Erfindung sind solche zu verstehen, deren Potentialbereich
zwischen +1,0 und +1,5VoIt liegt. Beispiele
hierfür sind Verbindungen des sechswertigen Chroms wie CrO4 2- oder Cr2Ov2-; ferner das MnO2 oder das Cl2.
Es können jedoch auch stärkere Oxidationsmittel mit einem Potential > +1,5 Volt wie MnOi7 O3 oder F2
verwendet werden.
Die Oxidation des Polymeren durch die genannten Oxidationsmittel ist selbstverständlich konzentrations-
und zeitabhängig. Das ist bei der Wahl der Reaktionsbedingungen zu beachten. So werden die Oxidationsmittel
allgemein in einem Konzentrationsbereich von 0,01 bis 1,OM eingesetzt Bei starken Oxidationsmitteln, deren
Potentialbereich > +1,5 Volt ist, wird das Oxidationsmittel bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 bis
0,1 M angewandt. Oxidationsmittel mit einem Potentialbereich von +1,0 bis etwa +1,5 Volt werden hingegen
vorzugsweise in einer Konzentration von 0,05 M bis 1,0 Meingesetzt.
Die Zeiten für die Einwirkdauer des Oxidationsmittels auf das Polymere richten sich ebenfalls nach dessen
Stärke. Sie liegen für relativ schwache Oxidationsmittel, wie es das System Dimethylsulfoxid/Eisessig darstellt, in
der Größenordnung von 3—18 Stunden; für das System Dichromat/Schwefelsäure in der Größenordnung von
5—60 Minuten und für das System Perjodat/Wasser 1 — 15 Minuten. Für andere Oxidationsmittel gelten je
nach deren Stärke sinngemäße Einwirkungsdauern.
In einem Vorversuch lassen sich die Bedingungen für das erforderliche Maß der Oxidation ermitteln, welche
sowohl einen zu weitgehenden oxidativen Abbau des Polymeren vermeiden, als auch eine ausreichende
Menge an umsetzbaren Aldehydgruppen freisetzen.
Da die in Frage kommenden Polymeren, beispielsweise das Poiyvinylenglykol, chemisch sehr stabile Verbindungen
darstellen, ist das Dispersionsmittel, in dem die Umsetzung mit dem Oxidationsmittel vorgenommen
wird, nicht sehr kritisch. So haben sich beispielsweise Umsetzungen von Poiyvinylenglykol mit Perjodat in
Wasser, mit Dichromat in etwa O.lnormaler Schwefel-
üegt die
bewährt
Es wurde festgestellt, daß die Einwirkung von Oxidationsmitteln auf synthetische, vicinale Hydroxylgruppen
enthaltende Polymere wie das Polyvinylenglykol zur Ausbildung von Aldehydgruppen führt Mit
gängigen Nachweisreaktionen für die Aldehyd- bzw. Carbonylgruppe kann z. B. die Bildung von Phenylhydrazon,
Semicarbazon oder von Oxim gezeigt werden. Es ist demnach zweckmäßig, im Anschluß an die
Oxidation des Polymeren durch Oberprüfung der Aldehydbildung mit Hilfe von z. B. Phenylhydrazin in
Essigsäure oder einem zu einem Farbumschlag führenden Carbonylindikator nachzuweisen, daß eine für die
weitere Umsetzung ausreichende Anzahl von Aldehydgruppen gebildet wurde. Zudem wird die Konsistenz des
Oxidationsproduktes mit dem Ziel überprüft, festzustellen, daß kein Abbau des Produktes in einem
unerwünschten Maße durch die Oxidation erfolgt ist Dies geschieht z. B. durch vergleichende Trockengewichtsbestimmung
des Polymeren vor und nach der Einwirkung des Oxidationsmittels. Der Unterschied
sollte zweckmäßig nicht mehr als etwa 10% betragen.
Das Reaktionsprodukt der Oxidation kann mit primäre Aminogruppen enthaltenden Verbindungen
direkt umgesetzt werden. Bekanntlich stellt die Mehrzahl der biologisch wirksamen Stoffe Proteine dar,
welche primäre Aminogruppen enthalten. Mit derartigen Verbindungen ist eine direkte Umsetzung des
oxidierten Polymeren durchführbar. Statt einer biologisch aktiven Verbindung wie z. B. einem Enzym, m
Aktivator, Inhibitor, Antigen oder Antikörper, einem Plasmaprotein, einem Polypeptid, einem Peptid oder
einer Aminosäure können jedoch mit dem Oxidationsprodukt des Polymeren auch solche Aminogruppen
enthaltende Verbindungen umgesetzt werden, welche mit biologisch wirksamen Stoffen zu reagieren vermögen.
Häufig zeigen diese Stoffe keine direkte biologische Wirksamkeit Sie werden jedoch zumeist als deren
Inhibitoren oder Antagonisten anzusehen sein, als Substrate für Enzyme oder auch als Antikörper gegen w
Antigene oder Haptene. Neben Proteinen und Peptiden können allgemein alle organischen «-Aminogruppen
enthaltende Verbindungen mit den oxidierten Polymeren direkt umgesetzt werden.
Es ist selbstverständlich nicht erforderlich, daß der biologisch wirksame Stoff ein Enzym, ein Aktivator, ein
Inhibitor, ein Antigen, ein Antikörper, ein Plasmaprotein, eine Blutgruppensubstanz, ein Peptidhormon, ein
Peptid oder eine Aminosäure ist, es kann auch ein natürlicher oder synthetischer Stoff sein, dessen so
Wechselwirkung mit einer der genannten Substanzen bekanntgeworden ist und der demnach gemäß einer in
Fachkreisen gängigen Ausdrucksweise als Effektor bezeichnet werden kann. Bekannte Effektoren sind z. B.
Aminobenzamidin, Chlorbenzylamin und 4-Aminophe- M
nyl-Quecksilber(l I)-acetat.
In den Fällen, in denen die mit dem Oxidationsprodukt des Polymeren umzusetzende biologisch wirksame
Verbindung selbst keine primären Aminogruppen trägt, kann die Verbindung über eine Zwischenstufe durchge- wi
führt werden, worin eine bifunktionelle, eine primäre Aminogruppe enthaltende Verbindung mit dem Oxidationsprodukt
zur Umsetzung kommt, wonach die zweite funktionelle Gruppe mit einer Gruppierung des
biologisch wirksamen Stoffes umgesetzt werden kann. "'> Verbindungen dieser Art sind beispielsweise die als
Spacer bezeichneten Verbindungen, welche den Ab-Siäiiu
uci biulugibi'h wirksamen Gruppierung vuni
Trägermolekül vergrößern. Dies kann z.B. durch Hexamethylendiamin erreicht werden, ferner mit
diazotierbare Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonderivaten
oder mit Schwefelsäureestern von 0-Hydroxyäthylsulfonen. Beispielsweise kann nach
einer Umsetzung des oxidierten Polymeren mit Glutathion und nachfolgender Umsetzung des Reaktionsproduktes
z. B. mit 2,2'-Dipyridyl-disulfid und einer Verbindung mit freien Sulfhydrilgruppen eine Verknüpfung
über eine DisuIFidbrücke erreicht werden. Glutathion
ist dabei der Spacer.
Über derartige Zwischenverbindungen ist es selbstverständlich
möglich, das Oxidationsprodukt des Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren vor Umsetzung
mit dem biologisch wirksamen Stoff, teilweise auch mit weiteren Polymeren umzusetzen. Bevorzugt werden
Verknüpfungen der Oxidationsprodukte der Polymeren untereinander vorgenommen. Damit ist auch eine
Beeinflussung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Trägers zu erreichen. Hierfür können beispielsweise
bifunktionelle Verbindungen, die sowohl mit den Hydroxylgruppen des einen Polymeren als auch mit
einer Gruppierung des zweiten Polymeren zu reagieren vermögen, verwendet worden sein. Auf die gleiche
Weise können Polyhydroxyverbindungen zunächst untereinander verknüpft und die Oxidation im Anschluß
daran vorgenommen worden sein. Dies hat Bedeutung bei wasserlöslichen Polyhydroxyverbindungen, die
nach diesen Verfahren in eine wasserunlösliche Form überführt worden sein können. Geeignete übliche
Verbindungen hierfür sind Diisocyanate wie Hexamethylendiisocyanat, Bisepoxide wie Hexamethylenbisepoxid
oder Vorstufen von Bisepoxiden wie Dibrompropanol und Epichlorhydrin.
Bei der Umsetzung zwischen den Aldehydgruppen des oxidierten Polymeren und den primären Aminogruppen
der Reaktionspartner entstehen Schiffsche Basen. Diese Verbindungen werden zweckmäßig durch
Reduktion stabilisiert. Man verwendet dazu in bekannter Weise als Reduktionsmittel komplexe Borhydride
wie Natriumborhydrid und Cyanborhydrid, komplexe Metallhydride wie Lithiumaluminiumhydrid sowie Raney-Nickel
als Beispiel für einen Katalysator für die Hydrierung mit Wasserstoff.
Verbindungen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Derivaten von synthetischen, vicinale
Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren und biologisch aktiven Verbindungen mit primären Aminogruppen
hergestellt werden, finden Verwendung als spezifische Adsorbenzien oder als selektive Reaktionskatalysatoren. Hierzu gehören insbesondere die Anwendung
unlöslicher Enzyme zur Gewinnung von 6-Amino-Penicillansäure, für die Steroidumwandlungen,
die Stärkeverzuckerung sowie die Invertzuckergewinnung, aber auch für die synthetische Herstellung z. B.
von Polynukleotiden oder Trinukleotiden. Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet hierfür stellt sich in der
Affinitätschromatographie dar. Dabei werden an die durch das erfindungsgemäße Verfahren wasserunlöslich
gemachten Effektoren in spezifischen Affinitätsreaktionen andere Substanzen gebunden, wonach diese in
hoher Reinheit wieder eluiert werden können. Trägergebundene Enzyme bieten gegenüber gelösten Enzymen
den Vorteil, daß sie bei Stoffumwandlungen in analytischen und präparativen Prozessen die Reaktionsprodukte
nicht durch Enzyme verunreinigen.
Die Erfindung soll an nachstehend angeführten Beispielen näher eriäuieri werden.
1. Oxidative Aktivierung von Polyvinylenglykol (PVG)
Man suspendiert 1 g PVG in 50 ml einer 0,05-m Natrium-metaperjodat-Lösung und rührt 15 Minuten bei
Raumtemperatur. Danach wird die Suspension abgesaugt und mehrfach mit dest Wasser gewaschen.
2. Direkte Verbindung von IgG (Immunglobulin G) an
den oxidativ nach 1. aktivierten Träger (0
Der aktivierte Träger wird in 59 ml 0,67-m Phosphatpuffer, pH 7,5, in dem ca. 40 mg IgG gelöst sind,
suspendiert und 3 Stunden ijei Raumtemperatur gerührt Der Ansatz bleibt bei 4° C über Nacht stehen.
Nach der Umsetzung wird die Suspension abzentrifu- ι s
giert und mit 30 ml NaCl gewaschen. Auf diese Weise konnten ca. 18 mg IgG chemisch gebunden werden.
3. Verbindung von IgG über einen Spacer
2 g Hexamethylendiamin werden in 50 ml dest Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 2 n-HCI
auf 8,7 eingestellt In dieser Lösung wird 1 g aktiviertes PVG (siehe 1.) suspendiert und 24 Stunden bei
Raumtemperatur unter Rühren reagieren lassen.
Das Produkt wird abgesaugt und mit dest Wasser frei von überschüssigem Amin gewaschen.
Zur Stabilisierung der hydrolyseempfindlichen Schiffschen Base wird mit Natriumborhydrid reduziert
Hierzu suspendiert man das Produkt in 50 ml Methanol und tropft ca. 10 ml einer 10%igen Lösung von
Natriumborhydrid in Methanol zu. Der Ansät? wird 15 Minuten unter Rückfluß gekocht, abgesaugt und mit
Wasser gewaschen.
Anschließend suspendiert man das Reaktionsprodukt in 100 ml 0,5-m Natriumbicarbonat-Lösung pH 10 und «
gibt 2 g l-AminobenzoM-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester (Para-Baseester) zu. Der Ansatz reagiert
1 Stunde bei 50—6O0C unter Rühren. Danach wird das
Trägermaterial für biologisch aktive Stoffe abgesaugt und mit Aceton und Wasser gründlich gewaschen. Zur
Diszotierung wird das Trägermaterial in 40 ml 0,1 n-HCl suspendiert, auf 0° — +50C abgekühlt und ca. 1 ml
einer 0,1 n-NaNC>2-Lösung zugetropft Nach 30 Minuten
Rühren wird abgesaugt und neutral gewaschen.
An dieser Stelle kann mit Hilfe von /?-Naphthol überprüft werden, ob sich das Trägermaterial für die
Herstellung einer Verbindung mit einer biologisch aktiven Substanz eignet: Ein Teil von ca. 0,1 g des
diazotierten Trägermaterials wird in 2 ml 0,1 n-NaOH-Lösung suspendiert und mit 0,1 g /^-Naphthol versetzt.
Der Träger verfärbt sich augenblicklich orange. Eine intensive Färbung zeigt eine ausreichende Aktivierung
und Eignung für die Umsetzung mit einer kupplungsfähigen Substanz an.
Die Hauptmenge des Diazonmmsalzes wird in 59 ml
0,67-m Phosphatpuffer pH 7A in dem 200 mg IgG gelöst sind, suspendiert und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Nach der Kupplung wird das
Reakdonsprodukt abzentrifugiert und mit 1-m NaCl-Lösung frei von überschüssigem Protein gewaschen.
Die quantitative Untersuchung ergab eine Aufnahme von ca. 160 mg IgG.
Wird statt IgG Albumin in den Ansatz der
Diazoniumsalzlösung gebracht, werden etwa 120 mg Albumin pro Gramm PVG-Träger gebunden.
4. Quervernetzung von PVG mit Epichlorhydrin
3 g PVG werden in 250 ml 2 η-Natronlauge bei 70°—8O0C gelöst Man versetzt mit 0,6g Epichlorhydrin, rührt 4 Stunden bei 70° — 8O0C und über Nacht bei
Raumtemperatur. Danach wird die Mischung unter schnellem Rühren in 21 Wasser gegossen und mit
2 n-HCl neutralisiert Das Produkt wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen.
Die weiteren Umsetzungen können in der gleichen Weise wie für das PVG beschrieben durchgeführt
werden.
5. Oxidative Aktivierung von PVG mit Kaliumdichromat/Schwefelsäure
2 g PVG werden in 100 ml dest. Wasser suspendiert und eine Lösung von 0,74 g Kaliumdichromat (0,05 m)
und 7,5 ml 2 n-H2SO4 in 50 ml dest. Wasser unter Rühren
zugetropft Es wird 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt das Reaktionsprodukt abzentrifugiert und mit
dest Wasser gewaschen. Die weitere Umsetzung mit Hexamethylendiamin und l-AminobenzoI-4-/?-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester sowie die Diazotierung
und Kupplung von Protein erfolgt wie unter 3. beschrieben.
Bei der quantitativen Untersuchung wurde eine Aufnahme von ca. 100 mg IgG pro Gramm PVG-Träger
festgestellt.
6. Oxidative Aktivierung von PVG mit Dimethylsulfoxyd/Essigsäureanhydrid
2 g PVG werden in einer Mischung von 24 ml Dimethylsulfoxyd (DMSO) und 16 ml Eisessig suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt
Danach wird der Ansatz mit 400 ml dest Wasser versetzt abgesaugt und mit Aceton und dest. Wasser
gewaschen.
Anschließend erfolgt die Einführung des Spacers und die Kupplung des Proteins wie unter 3. beschrieben.
Es wurde eine Aufnahme von 30 mg IgG pro Gramm der Trägersubstanz gemessen.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven Substanzen durch Umsetzung s
von Derivaten synxhetischer, vicinale Hydroxylgruppen enthaltender Polymerer entweder mit einer
primäre Aminogruppen enthaltenden biologisch wirksamen Substanz
oder zunächst mit einer bifunktionellen, eine primäre ι ο
Aminogruppe enthaltenden organischen Verbindung, wonach über die zweite funktioneile Gruppe
die Umsetzung mit einer biologisch wirksamen Substanz durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet,
daß als Derivat des synthetischen, vicinale Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren
ein solches eingesetzt wird, das mit einem mittelstarken Oxidationsmittel, dessen Potentialbereich zwischen
+ 1,0 und +1,5V liegt, oder einem starken Oxidationsmittel mit einem Potentialbereich
>1,5 bis zur Bildung von ausreichenden Mengen an Aldehydgruppen behandelt worden ist, und daß die
gebildete Schiffsche Base gegebenenfalls durch Reduktion mit geeigneten Reduktionsmitteln stabilisiert
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als vicinale Hydroxylgruppen enthaltendes
Polymeres Poiyvinylenglykol eingesetzt worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß als vicinale Hydroxylgruppen enthaltendes Polymeres ein mittels bifunktionellen Verbindungen
vernetztes Poiyvinylenglykol eingesetzt worden ist.
4. Verwendung einer mit einem Reduktionsmittel J5
behandelten Verbindung gemäß Anspruch 1 als spezifisches Adsorbens oder als selektiver Reaktionskatalysator.
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