DE2627133A1 - Dichtegradient-zentrifugation und zentrifuge - Google Patents

Description

E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY lOth and Market Streets, Wilmington, Del. I9898, V.St.A.

Dichtegradient-Zentrifugation und Zentrifuge

Die Erfindung betrifft Separierverfahren mittels Dichtegradient-Zentrifugation und insbesondere das Reorientieren des Dichtegradienten in vertikalen Röhren zur Erhöhung der Separiergeschwindigkeit und zur Erleichterung der Gewinnung der Separationszonen.

Das Gebiet des Zentrifugierens ist relativ alt. Es beruht auf der Anwendung der Zentrifugalkraft zum Separieren von Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind. Diese Kraft veranlaßt die Teilchen, sich vom Rotationszentrum des Rotors nach außen zu dessen Umfang zu bewegen. Dies wird Sedimentation genannt. Die Sedimentationsgeschwindigkeit hängt von verschiedenen Faktoren ab. Diese Faktoren · sind unter anderem die Rotationsgeschwindigkeit, die Dichte und die Viskosität des Mediums, in dem die Teilchen suspendiert sind, die Dichte des Teilchens und die Größe und die Form des Teilchens.

Dadurch, daß man diese verschiedenen Kriterien ausnutzt, werden die Teilchen räumlich durch die unterschiedlichen Entfernungen, die sie entlang des Vektors der Zentrifugal-

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kraft wandern, getrennt. Das Ausmaß der Trennung oder Separation entlang dieses Kraftvektors - häufig Separationsgradient genannt - bestimmt das Ausmaß der Auflösung, mit dem die Teilchen separiert werden können.

Bei einer Separationsart, die als Dichtegradient-Separation bekannt ist, wird eine Flüssigkeitssäule verwendet, in der sich die Dichte der Flüssigkeit in bekannter Weise vom einen Ende der Säule zum anderen ändert. Die zu trennenden Teilchen werden in die Flüssigkeit gegeben. Wenn dann ein Teilchen unter dem Einfluß der Zentrifugalkraft den Punkt isopyknischer Dichte erreicht, d. h. wenn die Dichte des Teilchens gleich der Dichte der umgebenden Flüssigkeit ist, hört es auf, entlang dem Kraftvektor in einer von beiden Richtungen zu wandern.

Zu diesem Zweck werden im allgemeinen Schwingbecher-Zentrifugen verwendet. Ein Nachteil dieser Separationsart besteht darin, daß, selbst wenn Ultrazentrifugen verwendet werden, die erforderlichen Separationszeiten wegen der relativ langen Weglängen, die die Teilchen zur Separation voneinander zurücklegen müssen, extrem lang sein können. Während sich die Behälterlänge auf die Separationszeit nachteilig auswirkt, ist sie für die Gewinnung der Separationszonen oder -bänder ein entscheidender Vorteil. Die lange Säule bewirkt eine relativ weite Separation der Teilchenbänder, was ein entscheidender Vorteil ist. Es wäre wünschenswert, kürzere Separationszeiten zu erreichen und dennoch die Vorteile der großen Weglänge bei der Gewinnung beizubehalten.

Außer Schwingbecher-Rotoren sind Zonal-Zentrifugalrotoren zur Dichtegradient-Separation gebaut worden, wie sie in US-PS 3 243 105 beschrieben sind. Nach dieser Veröffentlichung

ist ein schalenartiger Rotor vorgesehen, in dem ein Dichtegradient hergestellt wird. Die dabei auftretenden Probleme sind mannigfaltig und beruhen großenteils darauf, daß die Drehachse direkt durch die Schale verläuft» Dies bedeutet, daß Teile der Probe relativ große Flächenänderungen mit begleitender, übermäßiger Scherwirkung durchqueren müssen. Diese übermäßige Scherwirkung tendiert dazu, die Separation zu stören und dadurch die Auflösung und Reinheit der Separation zu verringern.

In US-PS 3 708 111 wird eine Weiterentwicklung beschrieben, bei der ein zonenförmiger Rotor mit Reorientierung des Gradienten vorgesehen ist, wobei der Rotor eine zylindrische Kammer ist, die in eine Mehrzahl sektorförmiger Abteile unterteilt ist. Der Boden bzw. die Abdeckung der Kammer begrenzt eine U-förmige Ringnut zur Vergrößerung der Weglänge und erhöht dadurch die Trennung der Bänder bei der Rückgewinnung. Die Separationsweglänge ist dabei jedoch relativ lang, was Nachteile bezüglich der Separationszeit zur Folge hat.

Der Erfindung liegt demzufolge die Aufgabe zugrunde, viele der Nachteile der bekannten Verfahren der Zentrifugalgradient-Separation zu überwinden.

Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren der Dichtegradient-Zentrifugation zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß wird teilchenförmiger Stoff in einer Probe infolge der physikalischen Eigenschaften des Stoffes dadurch getrennt, daß die Probe in eine längliche Flüssigkeitssäule eingeführt wird, die einen Dichtegradienten entlang der Längs-

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achse der Säule bilden oder besitzen kann, daß die Flüssigkeitssäule um eine andere Drehungsachse als die Längsachse der Säule derart gedreht wird, daß die Längsachse eine Normalebene zu der Drehungsachse unter einem Winkel zwischen etwa 80 bis 90° schneidet, wodurch sich der Dichtegradient quer zur Längsachse bildet oder reorientiert, und der Dichtegradient entlang der Längsachse reorientiert wird.

Die Separation kann von einem vorgegebenen Dxchtegradienten oder einem sich selbst bildenden Dxchtegradienten Gebrauch machen. Durch die Reorientierung des Gradienten aus der Vertikalen in die Horizontale und durch derartige Ausbildung der Zentrifugensäule, daß ihre Länge größer ist als ihr Durchmesser, wird jedenfalls die zur Separation erforderliche Zeit verringert. Durch Reorientieren des Gradienten in die Vertikale nach der Separation werden die Vorteile einer großen Weglänge zur Bandgewinnung erreicht. Eine bevorzugte Vorrichtung zur Durchführung des erfxndungsgemäßen Verfahrens macht von einer Zentrifuge Gebrauch, die einen Rotor mit einer vertikal orientierten Drehungsachse, eine Mehrzahl länglicher Probenbehälter und einem Gehäuse zur Befestigung der Behälter besitzt, wobei die Achse jedes Behälters im allgemeinen parallel zur Drehungsachse ist und jedes Gehäuse unabhängig von dem Behälter ist und eine starre Halterung für einen Behälter, insbesondere gegenüber vertikal gerichteten Fluxddruckkräften vollständig einschließt und bildet.

Auf diese Weise werden die Vorteile eines vertikal ausgerichteten Probenbehälters zur Gradient-Separation ermöglicht, indem eine geeignet konstruierte Halterung für den Behälter und die Kappe geschaffen wird, durch die eine ansonsten unvermeidliche Undichtheit vermieden wird. Bei einer Ausführungs-

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form der Erfindung ist die Kappe unmittelbar an dem Zentrifugenrotor befestigt. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Kappe an einem in den Rotor eingepaßten Zwischenstück befestigt, wobei das Zwischenstück eine zusätzliche Halterung für den Probenbehälter darstellt.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit der Zeichnung. Es zeigen:

Fig. 1 im Schnitt und teilweise schematisch einen Zentrifugenrotor für einen vertikal ausgerichteten Probenbehälter, wobei der Zentrifugenrotor entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung so gebaut ist, daß er Separationen mit Reorientierung des Gradienten zuläßt;

Fig. 2 in einer Teilansicht und im Schnitt einen Zentrifugenrotor entsprechend einer weiteren Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 3 in einer Teilansicht und im Schnitt einen Zentrifugenrotor mit einem Zwischenstück entsprechend einer weiteren Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 4 in einer Teilansicht und im Schnitt einen Zentrifugenrotor mit einem Zwischenstück entsprechend einer weiteren Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 5 in einer Teilansicht und im Schnitt einen Zentrifugenrotor, der zur Halterung eines Probenbehälters gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung geeignet ist, und

Fig. 6 bis 9 schematische Darstellungen verschiedener Stufen des Dichtegradienten-Separationsprozesses, der entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt ist.

Wie oben erwähnt, zeigt die Zentrifugationstheorxe, daß für eine gegebene Rotorgeschwindigkeit und einen maximalen Teilchenradius die Texlchensedimentationszeit dadurch verringert werden kann, daß die Weglänge verringert wird, die die zu trennenden Teilchen wandern müssen. Wenn die Separation einmal stattgefunden hat/ ist es schwierig, ohne einen gewissen Grad von Durchmischung die verschiedenen Regionen oder Bänder der getrennten Teilchen nach herkömmlichen Zentrifugationstechniken zu gewinnen.

Viele dieser Nachteile werden durch das erfindungsgemäße Verfahren überwunden. Dieses Verfahren kann dadurch verwirklicht werden, daß eine Zentrifuge mit einem Rotor verwendet wird, bei dem die Probenröhrchen oder -behälter zur Rotation um eine vertikale Drehungsachse insgesamt vertikal orientiert sind. Durch die vertikale Orientierung werden sowohl die Vorteile der kurzen Weglängen (Durchmesser der Röhrchen) und infolgedessen eines relativ steilen Gradienten (Dichte, Geschwindigkeit oder dergleichen) während der Zentrifugation, äLs auch die Vorteile einer Bandgewinnung bei relativ großer Weglänge, d. h. bei relativ breiter Separation der Bänder, erreicht. Der Gradient reorientiert sich zwischen der Separation und der Gewinnung, wodurch die Erzielung großer Gewinnungsweglängen erleichtert wird.

Eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens ist in den verschiedenen Figuren dargestellt, von denen zunächst auf Fig. 1 Bezug genommen wird. In dieser Figur ist in Teil-

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ansieht ein Rotor 10 dargestellt, der ein Gehäuse und eine hüllenartige Halterung für eine Mehrzahl auf dem Umfang in Abstand voneinander angeordnete Probenbehälter 12 (aus Gründen der Übersichtlichkeit ist nur einer dargestellt) bildet. Jeder Probenbehälter oder jedes Probenröhrchen kann vertikal in einen Hohlraum 14 mit Schiebesitz eingesetzt werden. Der Hohlraum 14 besitzt vorzugsweise eine vertikale Achse 16, die insgesamt parallel zur vertikal ausgerichteten Drehungsachse 18 ist und bei Rotation des Rotors um diese dreht. Der Rotor wird durch einen Antriebsmotor 20 herkömmlicher Bauart angetrieben, der über ein herkömmliches Verbindungsgetriebe wirkt, das durch die unterbrochene Linie 22 dargestellt ist.

Erfindungsgemäß hat die Oberseite 24 des Rotors 10 einen nach oben abstehenden kreisförmigen Lippenbereich 26, der sich genauso weit erstreckt wie der Mund oder die Öffnung des Hohlraumes 14 und über die Oberseite 24 des Rotors absteht. Der Lippenbereich 26 ist mit einem Außengewinde versehen. Eine Kappe 30 weist einen sich nach unten erstrekkenden ringförmigen Randbereich 32 auf, dessen innere zum Eingriff mit dem Lippengewinde 28 ebenfalls mit einem Gewinde versehen ist. Der Innenteil der Rotorkappe 30 besitzt einen nach unten führenden Schaft oder Stöpsel 36, der eine enge Gleitpassung mit dem Inneren des Probenbehälters 12 bildet, wodurch eine Ringnut 40 innerhalb der Kappe gebildet wird, die über den Lippenbereich 26 paßt. In dem Bereich zwischen der Oberseite der Lippe 26 und dem Ring 40 ist eine geeignete Abdichtung vorgesehen, wie z. B. eine Unterlegscheibe oder ein O-Ring 42. Es ergibt sich somit, daß der vertikal orientierte Probenbehälter, der im allgemeinen aus einem geeigneten Kunststoff hergestellt sein kann, wie er z. B. für Zentrifugenröhrchen verwendet

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wird, und durch das starre, durch den Rotor und die Kappe gebildete Hüllengehäuse gehalten wird, zur horizontalen Gradient-Separation fähig ist. Die bauliche Starrheit, die durch den Rotorkörper und die Rotorkappe geschaffen wird, widersteht den extremen vertikal nach oben gerichteten Druckkräften, die normalerweise während der Zentrifugation auftreten. Der Rotor und die Kappe sind aus herkömmlichen Stoffen hergestellt, die eine hohe Zugfestigkeit besitzen, wie z. B. Stahl, Aluminium oder dergleichen.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der längliche Probenbehälter 12 in stationärer Lage, nicht notwendigerweise während er sich in dem Rotor befindet, mit einem Fluid gefüllt, das in bekannter Weise zur Bildung eines Dichtegradienten oder eines Flüssigkeits-Dichtegradienten fähig ist. Der Dichtegradient kann z. B. aus Zucker gebildet sein, wobei sich der dichteste Anteil der Fluidlösung im unteren Bereich des Röhrchens befindet, so daß Bänder oder Zonen des Fluids gebildet werden und jedes Band immer weniger dicht wird, wenn man zu den oberen Bereichen der Fluidsäule in den Probenbehälter 12 fortschreitet. Wenn dies ausgeführt ist, wird ein kleiner Anteil eines Probenmaterials, das getrennt werden soll, auf die durch den Behälter gebildete Fluidsäule gegeben. Die Fluidsäule und die Probe, d. h. der Probenbehälter 12, wird dann in den Hohlraum 14 eingeführt. Der O-Ring 34 und die Kappe 24 werden zur Bildung einer Abdichtung über dem Hohlraum festgemacht. Der nun innerhalb des Probenbehälters 12 bestehende Zustand ist am deutlichsten in Fig. 6 zu sehen, in der die Fluidsäule 122 einen Dichtegradienten im unteren Teil aufweist, der durch das Fehlen einer Schraffur 139 dargestellt ist, während unterschiedlicher teilförmiger Stoff der Probe im oberen Bereich der Säule

/?^ /A A ->Λ f\ j Λ A A

υ a 8 es S / 0 2 9

durch die bildliche Darstellung 140 wiedergegeben ist.

Der Rotor wird nun mit hoher Geschwindigkeit um die vertikale Achse 18 geschleudert, wodurch eine Reorientierung der Fluidsäule 122 und der Probe 140 innerhalb des Behälters von dem vertikalen Gradienten der Fig. 6 zu dem horizontalen Gradienten der Fig. 7 verursacht wird. Die dichteren Bereiche, Zonen oder Bänder 142 des teilchenförmigen Stoffes bewegen sich infolge der Wirkung der Zentrifugalkraft, die durch den Vektor 144 dargestellt ist, in den in der Zeichnung rechts liegenden Teil. Die Bänder 146 auf der in Fig. 7 links liegenden Seite enthalten die weniger dichten Teilchen. Man erkennt, daß die Breite der Bänder relativ gering ist und dadurch einen relativ "steilen" Dichtegradienten hervorruft. Tatsächlich ist der Durchmesser der Säule 122 relativ klein, wodurch die Separationszeiten merklich gegenüber denen verringert werden, die bei Ausnutzung der Säulenlänge erforderlich sind, wie es bei der Schwingbecherbauart der Fall ist. Man erkennt auch, daß die Querschnittsfläche (definiert durch eine zum Kraftvektor 144 senkrechte Ebene) relativ groß ist, so daß nur sehr wenig Zusammenballung oder gegenseitige Störung zwischen benachbarten Teilchen stattfindet. Dies erhöht die Separationsgeschwindigkeit zusätzlich.

Nach vollendeter Separation wird die Zentrifuge verlangsamt und angehalten. Während der Verlangsamung sind die verschiedenen Bänder, insbesondere die in Fig. 8 mit den Bezugsziffern 142 und 146 bezeichneten, im Vorgang der Reorientierung zurück zu einem vertikalen Gradienten, _swie er in Fig. 9 gezeigt ist, zu sehen. Da der Boden der Säule 148 abgerundet ist, verringert sich die Querschnittsfläche eines gegebenen Bandes beim Fortschreiten zu der in Fig.

gezeigten Form, in der der vertikale Gradient mit den verschiedenen Bändern der nun separierten Teilchen wiederhergestellt ist, in einer mehr linearen Weise. Da diese Veränderung linearer Natur ist, wird die Tendenz der Scherkräfte zur Störung derSeparation verringert. Das Auflösungsvermögen der Separation wird folglich beibehalten.

Wenn die Zentrifuge schließlich zur Ruhe gekommen ist, ist der vertikale Gradient, wie er in Fig. 9 dargestellt ist, vollständig wiederhergestellt und können die verschiedenen zonenartigen Bänder der separierten Teilchen nach einer der bekannten, zur Verfügung stehenden Techniken entfernt werden, z. B. mittels Pipetten usw. Wenn der vertikale Gradient wiederhergestellt ist, dann ist der Gradient weniger steil als der von Fig. 7, so daß die Bänder eine größere Höhe oder Trennung zwischen sich aufweisen. Dies ermöglicht eine Separation ohne übermäßige Vermischung zwischen benachbarten Bändern. Infolge der Anordnung der Proben in einzelnen Säulen oder Röhrchen, die zentrifugiert werden, anstatt auf der Drehungsachse 18, werden die Scherkräfte erheblich verringert.

In allen Fällen werden die einzelnen Kapseln getrennt innerhalb des Rotors mit einer vorzugsweise vertikalen Orientierung befestigt und um eine Drehungsachse geschleudert, die vorzugsweise vertikal ist. Der Hauptvorteil besteht dabei in der Verringerung der Scherkräfte innerhalb der Fluidsäulen. Die Scherkräfte werden durch die Abrundung des oberen und unteren Bereichs der Fluidsäule weiter verringert.

Das Verhältnis der Länge zum Durchmesser der Fluidsäule kann bis zu 10 : 1 betragen, wobei jedoch höhere Verhältnisse nicht besonders bevorzugt werden, weil sich dann die

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Scherungskräfte wieder zu zeigen beginnen. Ein Verhältnis der Länge zum Durchmesser von etwa 3 : 1 wird bevorzugt, wobei jedoch größere oder kleinere Verhältnisse verwendet werden können. Verhältnisse bis herab zu 1 : 1 können verwendet werden, obwohl bei Erreichen dieser unteren Grenze die Vorteile dieses Verfahrens verringert werden. Trotzdem ist das Verfahren wegen der verringerten Scherspannungen eine Verbesserung gegenüber der Schalenbauart.

Obwohl bei diesem Verfahren die länglichen Säulen des Fluids vorzugsweise um eine vertikale Drehungsachse geschleudert werden, kann jede Drehungsachse verwendet werden. Die Erfindung verlangt lediglich, daß die Säulenachse während der Zentrifugation im wesentlichen parallel zur Drehungsachse ist, so daß der in den Säulen hergestellte Separationsgradient im wesentlichen senkrecht zur Säulenlängsachse verläuft. Tatsächlich kann der Separationsgradient im Extremfall bis zu 80° gegenüber der Säulenachse variieren (die Längsachse der Säule schneidet eine zur Drehungsachse senkrechte Ebene unter einem Winkel von 80°), d. h. die Säulenachse bildet einen Winkel von t. 10° gegenüber der Drehungsachse, wobei Winkel von 88 oder 89° bevorzugt werden, d. h. die Säulenachse bildet einen Winkel von ί 1 oder 2° gegenüber der Drehungsachse, und meistens einen Winkel von 0° bevorzugt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren macht sich während der Zentrifugation die kurze Weglänge und den relativ steilen Gradienten und während der Bandgewinnung die Vorteile einer großen Weglänge zunutze. Es macht sich folglich eine breite Bandtrennung mit verringerter Möglichkeit der Vermischung und folglich verbessertem Auflösungsvermögen zunutze.

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Eine alternative erfindungsgemäße Vorrichtung ist in Fig. gezeigt, in der, abgesehen davon, daß der Probenbehälter eine öffnung oder einen Mund 54 mit verringertem Durchmesser besitzt, dessen Außenseite mit einem Gewinde 56 versehen ist, alle Teile im wesentlichen die gleichen wie bei der oben beschriebenen Ausführungsform von Fig. 1 sind. Dieses Gewinde nimmt eine Probenbehälterkappe 58 auf, dessen Innenwände mit einem Gewinde 60 versehen sind, so daß die Kappe auf den offenen Mund 54 geschraubt werden kann. Zur Verhinderung eines Fluidlecks ist eine geeignete Unterlegscheibendichtung 62 vorgesehen. Die Kappe kann aus dem gleichen Material hergestellt sein wie der Behälter.

Bei dieser Ausführungsform entfällt bei der Rotorkappe 50 der nach unten abstehende Schaft oder Stöpsel 36, so daß die Behälterkappe innerhalb des in der Kappe ausgebildeten Hohlraumes Platz finden kann. Ansonsten ist seine Funktion die gleiche, nämlich eine ausreichende bauliche Festigkeit für den Behälter und seine Kappe zum Widerstehen der vertikal nach oben gerichteten Kräfte zu schaffen, die während der Zentrifugation bei vertikal orientiertem Behälter existieren.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 3 gezeigt, bei der ein Rotorkörper 70 mittels der Antriebseinrichtungen 20/ die über eine Verbindung -22 wirken, um eine vertikale Achse "!8 spinnt. In diesem Fall ist der Rotorkörper 70 jedoch mit einer Bohrung 72 versehen, die von der Oberseite zur Unterseite durch den Rotor führt und eine vertikale Achse 74 besitzt. Ein rohrförmiges Zwischenstück 76 wird vorzugsweise mit Gleitsitz in die Bohrung 72 eingeführt. Das Zwischenstück kann aus Aluminium oder aus einem anderen geeigneten leichten Metall hergestellt sein,

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um eine geeignete bauliche Festigkeit zur Halterung eines Probenbehälters 78 zu schaffen, der in dieses Zwischenstück 76 eingepaßt ist. Der obere Bereich des Zwischenstücks 76 ist mit einem Gewinde 80 versehen. Der untere Bereich des Gewindes verhindert, daß das Zwischenstück nach unten durch die Bohrung rutscht. Alternativ kann dazu ein Ringflansch (nicht gezeigt) verwendet werden. In diesem Fall ist die Kappe 30 im wesentlichen die gleiche wie die im Zusammenhang mit der Ausführungsform von Fig. 1 beschriebene. Die Kappe 30 weist innerhalb des nach unten führenden Randes 32 ein Gewinde 34 auf und hat einen nach unten führenden Stöpsel oder Schaft 36, der einen Gleitsitz innerhalb des Behälters schafft. Der Schaft 36 wirkt mit dem nach unten führenden Rand 32 zusammen und begrenzt eine Ringnut 40, deren oberer Bereich eine geeignete Abdichtung, wie z. B. einen O-Ring 42, hält, der am oberen Teil des Zwischenstückes 76 und des Probenbehälters 78 angreift und dadurch eine Undichtheit des Behälters verhindert.

Man erkennt, daß das Zwischenstück 76 zusammen mit der Zwischenstückkappe 30 eine ausreichende strukturelle Festigkeit für den Behälter und seine Kappe erzeugt, um den vertikal gerichteten, während der Zentrifugation, wie oben beschrieben, auftretenden Kräfte standzuhalten.

Eine weitere alternative Ausführungsform ist in Fig. 4 gezeigt. In diesem Fall ist jedoch der Probenbehälter 52 so abgeändert, daß er in Wirklichkeit mit einem Teil der in Fig. 2 gezeigten Ausführungsform übereinstimmt, wobei der Behälter und seine Kappe innerhalb eines Zwischenstückes eingeschlossen sind, anstatt unmittelbar innerhalb des Rotorhohlraumes. Der Probenbehälter 52 ist also mit einer

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Probenbehälterkappe 58 versehen, dessen Innengewinde 56 mit dem Gewinde 28 an der öffnung des Zwischenstückes angreift, wobei der Probenbehälter 52 eine öffnung oder einen Mund von verringertem Durchmesser 54 besitzt, wie es bei der Ausführungsform von Fig. 2 der Fall ist. Bei der Zwischenstückkappe 50 ist der Schaft weggelassen, wie es in Fig. 3 gezeigt ist. Eine geeignete Ringdichtung 62 verhindert eine Undichtheit der Behälterkappe. Die strukturelle Festigkeit, um den vertikal gerichteten Kräften während der Zentrifugation standhalten zu können, wird hier wiederum durch das Zwischenstück 76 und die Zwischenstückkappe 50 geschaffen, anstatt durch den Behälter allein, wie es beim Stand der Technik der Fall ist. Das Gewinde 80 verhindert, daß das Zwischenstück durch den Hohlraum 72 rutscht.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 5 gezeigt, bei der ein Rotor 80, der aus herkömmlichem Material gebaut ist, mit auf dem Umfang angeordneten Hohlräumen 62 versehen ist. Jeder Hohlraum ist so ausgebildet, daß er eine vertikale Achse 84 besitzt, die sich um und parallel zu der vertikal gerichteten Drehungsachse 18 des Rotors dreht, wie es oben beschrieben ist. Ebenfalls wie oben beschrieben wird der Rotor durch die Antriebseinrichtung 20 über eine geeignete Verbindung 22 angetrieben.

Bei dieser Ausführungsform ist der Probenbehälter 86 aus einem relativ dünnen Kunststoffmaterial gebaut, das dem oben (Fig. 1) beschriebenen ähnlich ist. Die öffnung 88 des Hohlraumes ist nach außen erweitert und öffnet sich in eine Ringnut 90. Die Lippe 92 des Hohlraumes ist im Durchmesser etwas verringert und weist ein Innengewinde auf, um einen Stöpsel oder eine Kappe 94 mit Außengewinde aufnehmen zu können. Zur Erleichterung ihrer Entfernung sind in der Kappe Spannschlüs-

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sellöcher 96 vorgesehen. Eine mittige axiale Aussparung 98 ist in der Unterseite der Kappe 94 ausgebildet und nimmt den Gewindeschaft 100 eines sich verjüngenden Abdichtungsstöpsels 102 auf. Der Abdichtungsstöpsel 102 ist so gestaltet, daß er an dem oberen Ende der Innenwände des Probenröhrchens 86 angreift und gegen den sich erweiternden Bereich 88 des Hohlraumes drückt, wodurch eine Abdichtung des Röhrcheninhalts geschaffen wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Verjüngungswinkel gleich dem Winkel der Erweiterung, wobei beide Winkel relativ zu der Achse 84 gemessen werden, obwohl die Verjüngung bei Bedarf geringer sein kann als die Erweiterung. Ein Verjüngungswinkel von 15° wird bevorzugt, obwohl Winkel im Bereich von 0 bis 30° verwendet werden können, solange der Verjüngungswinkel kleiner oder gleich dem Erweiterungswinkel ist. Ein kleiner Seitenhohlraum 104 ist in Verbindung mit dem Hohlraum 82 im Bereich der Erweiterung entlang des Radius des Rotors in radialer Richtung innerhalb des Hohlraumradius, wie dargestellt, ausgebildet. Zur Entlüftung und leichteren Entfernung des Röhrchens wird dabei die Stetigkeit der Dichtung unterbrochen. Beim Füllen der Behälter hat der an der Spitze verbleibende Luftzwischenraum dadurch einen Raum zur Entlüftung beim Abdichten des Behälters. Bei Einstellung des horizontalen Gradienten besteht eine unmittelbare Ausrichtung des Hohlraumes 104 hierzu, wodurch kein Fluidleck auftritt. Der gleiche Hohlraum kann vorteilhafterweise auch bei den anderen Ausführungsformen verwendet werden.

Man erkennt aus der Zeichnung, daß all die verschiedenen Ausbildungen ein Gehäuse für die Behälter aufweisen, das unabhängig von dem Behälter ist und nicht z. B. durch Gewinde an dem Behälter befestigt sein muß. Das Gehäuse bildet dadurch eine starre Halterung für den Behälter in allen

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Richtungen.

Es wurden damit verschiedene Vorrichtungen beschrieben/ die zur Separation mit horizontaler Gradienten-Reorientierung geeignet sind und eine vertikale Ausrichtung der verschiedenen Behälter beim Herumwirbeln um eine Drehungsachse schaffen. Zusätzlich erzeugt der Rotor und/oder das Zwischenstück die zusätzliche bauliche Festigkeit/ die erforderlich ist, um ein Lecken des Fluidinhalts aus dem Probenbehälter zu verhindern.

Durch diese Vorrichtung werden die Vorteile einer kurzen Weglänge und eines relativ steilen Gradienten während der Zentrxfugation und dennoch die einer langen Weglänge während der Bandgewinnung verwirklicht. Die große Weglänge während der Gewinnung erzeugt, wie oben beschrieben, eine relativ weite Separation der Bänder und verringert deren Vermischung während der Gewinnung. Dies verbessert das erreichbare Auflösungsvermögen.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Ί J Verfahren zur Dichtegradient-Zentrifugation von zu trennendem teilchenförmigen! Stoff in einer Probe als Funktion der physikalischen Eigenschaften des Stoffes, dadurch gekennzeichnet,

   daß Probe in eine längliche Flüssigkeitssäule eingeführt wird, die zur Ausbildung eines Dichtegradienten in Längsrichtung der Säule geeignet ist oder einen solchen besitzt;

   daß die Flüssigkeitssäule um eine andere Drehungsachse als die Längsachse der Säule gedreht wird, wobei diese Längsachse eine zur Drehungsachse senkrechte Ebene unter einem Winkel zwischen etwa 80° bis 90° schneidet, wodurch der Dichtegradient quer zur Längsachse gebildet oder reorientieft wird; und

   daß der Dichtegradient entlang dieser Längsachse reorientiert wird.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeitssäule und die Drehungsachse im wesentlichen vertikal ausgerichtet sind.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel etwa 90° beträgt.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Säule ein Verhältnis der Höhe zur Breite von 3:1 besitzt.

   5. Zentrifuge mit einem Rotor mit vertikal ausgerichteter Drehungsachse zur Bewirkung von Separationen einer Probe mit-

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   tels eines horizontalen Gradienten und vertikaler Gradienten- Reorientierung der getrennten Probenkomponenten, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Merkmale:

   eine Mehrzahl länglicher Probenbehälter (12);

   einem Gehäuse zum Befestigen der Behälter um die Drehungsachse (18) des Rotors, wobei die Achse jedes Behälters im allgemeinen parallel zu der Drehungsachse verläuft; und dadurch,

   daß jedes Gehäuse unabhängig von dem Behälter ist und diesen vollständig einschließt und eine Halterung schafft, die für jeden der Behälter in allen Richtungen, insbesondere gegen vertikal gerichtete Fluiddruckkräfte starr ist.

   6, Zentrifuge nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse

   einen Rotor (10), der einen getrennten Hohlraum für jeden Behälter begrenzt,

   eine nach oben führende Lippe (26) an der Hohlraumöffnung, die einstückig mit dem Rotor ist, und

   eine Rotorkappe (30), die zum vollständigen Verschließen des Hohlraumes und Halten des Behälters an der Lippe befestigt ist, aufweist.

   7, Zentrifuge nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (12) eine getrennte Kappe aufweist, die den Behälter abdichtet und durch die Rotorkappe gehalten wird.

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   8. Zentrifuge nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Rotorkappe eine ringförmige Innennut aufweist und eine Innenabdichtung in dieser Nut, die an der Lippe angreift.

   9. Zentrifuge nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse auf dem Umfang in Abständen angeordnete, vertikal ausgerichtete Bohrungen in dem Rotor für jeweils einen Behälter begrenzt und ein starres Zwischenstück aufweist, von denen jeweils eines einen anderen Behälter, der in dieser Bohrung sitzt, vollständig einschließt und abdichtet.

   10. Zentrifuge nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter eine Behälterkappe (58) aufweist, die den Behälter abdichtet und durch das Zwischenstück gehalten wird.

   11. Zentrifuge nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Zwischenstück (76) eine durch ein Gewinde an ihm angreifende Kappe (50) aufweist, das den Behälter starr einschließt und trägt.

   12. Zentrifuge nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse

   den Rotor (10), der einen getrennten Hohlraum (14) mit einem offenen oberen Ende für jeden Behälter begrenzt;

   eine Innenlippe (26) am offenen Ende jedes Hohlraumes;

   einen Abdichtungsstöpsel in dem oberen Ende jedes Probenbehälters; und

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   einen starren Stöpsel, der an der Innenlippe jedes Hohlraumes befestigt ist und den Abdichtungsstöpsel in Abdichtung mit dem Behälter befestigt, aufweist.

   13. Zentrifugenrotor und -behälter zum Zentrifugieren des Behälters, gekennzeichnet durch die Kombination folgender' Merkmale:

   Rotor (10) mit vertikal ausgerichteter Rotationsachse, der in radialem Abstand angeordnete, längliche Hohlräume mit einer im allgemeinen parallel zur Rotationsachse verlaufenden Längsachse begrenzt;

   Hohlraum, der den Behälter starr trägt und ein offenes Ende besitzt;

   erste Kappe, die das offene Behälterende abdichtet;

   zweite Kappe, die an dem offenen Ende des Hohlraumes befestigt ist und die erste Kappe starr trägt.

   14. Zentrifugenrotor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kappen Stöpsel sind und die zweite Kappe in das offene Hohlraumende paßt.

   15. Zentrifugenrotor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil des offenen Endes des Hohlraumes sich erweitert und der erste Stöpsel sich verjüngt, wodurch das offene Ende des Behälters zwischen dem Stöpsel und der Erweiterung zusammengedrückt wird.

   16. Zentrifugenrotor mit einer Rotationsachse, wenigstens einem in radialem Abstand angeordnetem Hohlraum, der durch

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   eine an einem Ende geschlossene Bohrung und einer Lippe
   oder Gegenbohrung, die jeweils eine gemeinsame, im wesentlichen parallel zur Rotationsachse verlaufende Achse besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlraum zum starren Halten des offenendigen Behälters geeignet ist;

   daß der erste Stöpsel in das offene Ende der Bohrung paßt und das offene Ende des Behälters abdichtet; und

   daß ein zweiter Stöpsel in der Gegenbohrung befestigt ist und den ersten Stöpsel sowie einen Behälter gegen axiale
   Bewegung starr festhält.

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