DE2639234C2

DE2639234C2 - Unlösliches zusammengesetztes System aus einem mikroporösen Körper, enthaltend ein Polymerisat-Bindemittel und eine proteinartige Substanz, ein Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung für enzymatische Umsetzungen

Info

Publication number: DE2639234C2
Application number: DE2639234A
Authority: DE
Inventors: Bruce S. Clifton N.J. Goldberg
Original assignee: Amerace Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 1975-08-29
Filing date: 1976-08-27
Publication date: 1984-04-12
Also published as: US4102746A; FR2322156A1; DK389376A; JPS5234978A; CA1073382A; DK149312B; FR2322156B1; BR7605647A; JPS6029474B2; DE2639234A1; GB1550128A; DK149312C; IT1075203B

Description

Die Erfindung betrifft ein unlösliches zusammengesetztes System aus einem mikroporösen Körper, das ein Bindemittel auf Polymtrisatbasis und eine proteinartige Substanz enthält, ein Verfahren zu dessen Herstellung und die Verwendung des Systems für enzymatische Umsetzungen.

Unter einem spezielleren Aspekt betrifft die Erfindung immobilisierte Enzymsysteme, bei denen Enzyme durch Koppeln oder Binden an einem Stütz- oder Trägermaterial immobilisiert worden sind. Außer den Enzymen können auch andere proteinartige Substanzen immobilisiert werden, wie z. B. Antikörper und Antigene.

»Immobilisierte« Enzyme sind an ein wasserunlösliches Trägermaterial gebundene oder in einem solchen Trägermaterial eingeschlossene Enzyme, die dadurch im wesentlichen unlöslich gemacht worden und aus Reaktionslosungen leicht entfernbar sind und erneut verwendet werden können, aber ihre Enzymaktivität beibehalten.
Die Technik macht seit langem von der Immobilisierung von Enzymen Gebrauch, weil die meisten Enzyme in Wasser löslich sind und nur unter Schwierigkeiten aus einer Lösung zurückgewonnen werden können. Außerdem ist es schwierig, die katalytische Wirksamkeit der Enzyme längere Zeiten zu erhalten. Rückgewinnung

ίο und Erzeugung von Enzymen in industriellem Maßstab sind jedoch teuer. Man hat versucht (US-PS 35 56 945), Enzyme auf porösen Glasperlen zu adsorbieren oder sie an solche porösen Perlen mit einem Kopplungsmittel wie einem Silan zu binden (US-PS 35 19 538). Auch poröse Keramikperlen sind zum Binden von Enzymen durch Adsorption verwendet worden (US-PS 38 50 751).

Poröse Glas- oder Keramikperlen haben eine sehr

geringe Teilchengröße, deshalb ist es erforderlich, daß das Substrat durch ein Füllkörperbett aus vielen derartigen einzelnen Teilchen fließt. Reaktionslagen mit einem Enzymfüllkörperbett sind teuer und anfällig für ein Verstopfen oder eine Bildung von Kanälen; sie stellen einen relativ hohen Widerstand für einen durchfließenden Strom dar und neigen zur Zurückhaltung des Substrats innerhalb der Poren aufgrund der relativ kleinen Porengröße, wodurch das Problem der Verunreinigung gegeben ist, wenn eine Reihe verschiedener Substrate oder Proben durch das Füllkörperbett geleitet wird und die Enzymreaktion relativ schnell stattfindet.

Nach der US-PS 38 24 150 sind Enzyme durch mechanisches Einschließen in einem halbdurchlässigen Trägermaterial, wie z. B. einer Membran, oder durch chemisches Binden durch ein Verbindungsmittel an natürliche oder synthetische Materialen, einschließlich Cellulosematerialien in Form von Filterpapier, inimobilisiert worden. In dem membranhaltigen Reaktionsgefäß oder dem Reaktionsgefäß zum mechanischen Einschließen kann die enzymatische Reaktion jedoch nur durch Diffusion der Substratlosung durch das Trägermaterial stattfinden. Außerdem erhält bei Verwendung solcher Trägermaterialien das Enzymsystem häufig keine besondere Stabilität. Die Verwendung von cellulosehaltigen! Filterpapier und ähnlichen organisehen Trägermaterialien mit daran gekoppelten oder auf andere Weise gebundenen Enzymen hat den weiteren Nachteil, daß die letzteren im allgemeinen zerbrechlich und chemischem und mikrobiellem Angriff ausgesetzt sind und ohne Beschädigung nicht ohne weiteres sterilisiert werden können.

Es ist bekannt, einen wasserunlöslichen Polymerisatüberzug mit Nitrilo-, sauren Amido- oder Ureidogruppen auf ein einphasiges makroporöses polymeres Trägermaterial aufzutragen und dann die Enzyme durch Adsorption an der überzogenen Oberfläche eines solchen Trägermaterials zu binden (US-PS 37 05 084). Die Herstellung von solchen mit Überzügen versehenen Reaktionszonen bzw. Reaktoren ist jedoch zeitraubend und kostspielig, und die Enzymmenge, die pro Volumeneinheit des erhaltenen Reaktors gebunden werden kann, ist wegen der makroporösen Natur des Trägernw.erinls begrenzt.

Der Erfindung liegt die Aulgabe zu (!runde, ein unlösliches zusammengeseztes System aus einem mikroporösen Körper, Polymerisatbindemiuel und proteinartiger Substanz bereitzustellen, mit dem eine wirksame Immobilisierung der proteinartigen Substanz, insbesondere von Enzymen, erreicht wird, das flüssig-

keitsdurchlässig ist und eine hohe Permeabilität aufweist, das biologisch nicht abgebaut wird und auch gegenüber der Einwirkung von Chemikalien beständig ist, das leicht sterilisiert werden kann und im übrigen gute Festigkeitseigenschaften aufweist Das System soll 5 zudem relativ billig herstellbar sein.

Die Schaffung eines geeigneten Verfahrens zur Herstellung des Systems unter Immobilisierung von Enzymen und die Verwendung dieses Systems zur enzymatischen Umwandlung von Substraten sind i< > zusätzliche Ziele der Erfindung.

Zur Lösung der gestellten Aufgabe stellt die Erfindung das in Anspruch 1 angegebene unlösliche zusammengesetzte System, dessen bevorzugte Ausgestaltungen Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 5 sind, sowie das Verfahren nach Anspruch 6 und 7 bereit. Die Verwendung des zusammengesetzten System zur enzymatischen Umsetzung eines Substrats ist Gegenstand des Anspruchs 8.

Der erfindungsgemäße unlösliche mikroporöse Kör- 2« per enthält eine Polymerisatmatrix oder ein Polymerisatbindemittel und vollständig in der Matrix verteilte Teilchen aus einem Füllstoffmaterial und ist in einer solchen Weise behandelt, daß er proteinartige Substanzen wie Enzyme an die Füllstoffmaterialien bindet bzw. mit diesen Teilchen koppelt

Erfindungsgemäß wird insbesondere ein verbessertes immobilisiertes Enzymsystem erreicht, bei dem durcn Koppeln oder Binden des Enzyms an ein unlösliches Stütz- oder Trägermaterial ein beständiger dreidimen- 3d sionaler flüssigkeitsdurchlässiger Systemkörper vorliegt, der feinteilige Füllstoffteilchen vollständiger unbeweglicher oder dimensionsbeständiger Verteilung in dem Bindemittel und ein den gesamten Körper durchziehendes Netzwerk aus im wesentlichen miteinander verbundenen Mikroporen enthält.

Derartige zusammengesetzte Systeme können beispielsweise als Enzym Glucoseoxidi<se, Aldose-i-epimerase, «-D-Fructofuranosidase, Alkoholdehydrogenase und/oder Glucoseisomerase enthalten.

Ein Beispiel für ein mikroporöses Material, das erfindungsgemäß besonders für eine Verwendung als unlösliches Enzymstütz- oder -trägermaterial geeignet ist, wird in der US-PS 38 62 030 beschrieben. Ein solches mikroporöses Material enthält eine normalerweise hydrophobe Polymerisatmatrix (z. B. Polyvinylchlorid), feinteilige normalerweise hydrophile Füllstoffteilchen (ζ. B. Kieselsäure), welche in der Harzmatrix vollständig dispergiert sind, und ein Netzwerk aus miteinander verbundenen Mikroporen, welches in dem gesamten Material vorliegt. Dieses Netzwerk aus miteinander verbundenen Mikroporen wiederum besteht aus Mikroporen, die zwischen angrenzenden oder benachbarten Teilchen aus dem dispergierten anorganischen Füllstoff, zwischen Teilchen aus dispergiertem Füllstoff und der Harzmatrix sowie in der Harzmatrix selbst vorliegen, wobei die Mikroporen eine Teilchengrößenverteilung aufweisen, die sich über einen relativ breiten Bereich von etwa 0,01 μιη bis etwa 100 μπι erstreckt. Der mittlere Porendurchmesser der Mikroporen liegt nach bO porosimetrischer Bestimmung mittels der Quecksilberintrusionsmethode in dem Bereich von etwa 0,1 μηι bis etwa 0,2 μπι. Die Gesamtporosität eines solchen Materials liegt in dem Bereich von etwa 50 bis 70%. Derartige mikroporöse Materialien sind bisher zur *>5 Herstellung von Batterieseparatoren (US-PS 36 96 061) und als Submikronfiltermittel (US-PS 38 62 030) verwendet worden. Als andere geeignete mikroporöse Materialien können anstelle des thermoplastischen Bindemittelbestandteils synthetische oder natürliche wärmehärtende Kautschukpolymerisate oder Copolymerisate davon verwenden.

Bei der Herstellung aus kautschukartigen Polymerisaten werden diese unter Zugabe von üblichen Zusätzen, wie Antiabbaurnitteln, Vernetzungsmitteln, inerten Füllstoffen oder dgl. mittels üblicher Methoden mit einem geeigneten Füllstoff, wie z. B. Kieselsäurehydrogel oder ausgefälltem Kieselsäurehydrat (d. h. Kieselsäure η SiC>2 · m H2O, worin π und m ganze Zahlen sind), innig vermischt Das erhaltene Gemisch wird dann zu einer Bahn geformt vorzugsweise durch Kalandrieren auf einem geeigneten Träger (d.h. Papier oder einem dünnen Metallblech oder -sieb), auf Spulen üblicher Größe aufgewickelt und dann unter hydrostatischen Bedingungen in einem Dampfautoklaven zu einem geeigneten Härtungszustand unter Verwendung von unter Druck stehendem Dampf als Wärmequelle vulkanisiert Die vulkanisierte Bahn wird dann in einem warmen trocknen Luftstrom, der auch zum Entwässern der Kieselsäure dient, getrocknet Ein solches Entwässern führt zur Bildung von Mikroporen in der Bahn aufgrund des Schrumpfens der Kieselsäure, wobei ein normalerweise hydrophiler mikroporöser Gegenstand gebildet wird.

Im fertigen Zustand enthält eine mikroporöse Bahn auf Basis eines wärmegehärteten kautschukartigen Polymerisats etwa 1 Gewichtsteil kautschukartiges Polymerisat je 0,5 Gewichtsteile Kieselsäure und hat eine Porosität von etwa 60 Volumenprozent. Die Porengrößenverteilung ist im allgemeinen ziemlich groß und reicht gemäß der Quecksilberintrusionsmethode von etwa 0,05 bis 10 μπι für den größten Teil, wobei die mittlere Porengröße im allgemeinen etwa 1,4 μηι beträgt. Solche wärmegehärteten kautschukartigen Polymerisatbahnen sind normalerweise hydrophil. Wasser sinkt schnell in ein solches Material ein und geht ohne Anwendung von Druck hindurch, was anzeigt, daß die Poren im wesentlichen miteinander verbunden sind.

Die feinteiligen Füllstoffteilchen,die indem Bindemittel oder der Matrix aus dem mikroporösen Material vollständig dispergiert sind, liefern aktive Stellen, an die Enzyme gebunden werden können. Aufgrund des porösen Aufbaus und der Verteilung der Füllstoffteilchen in der gesamten Bindemittelmatrix hat ein solches mikroporöses Material einen relativ großen Oberflächenbereich, im allgemeinen in der Größenordnung von etwa 80 m²/g, die Anzahl der zur Verfügung stehenden Enzym-Bindungsstellen ist deshalb relativ groß; daher ist der Beladungsfaktor oder der Anteil Enzym, der je Volumeneinheit von solchem mikroporösen Material gebunden werden kann, entsprechend groß. Weil jedes Füllstoffteilchen praktisch von dem miteinander verbundenen Netzwerk aus Mikroporen wechselnder Größe umgeben ist, kommt ein Substrat in Form eines flüssigen oder wäßrigen Stroms, der z. B. durch eine relativ dünne Bahn aus dem mikroporösen Material mit gebundenem Enzym fließt, unmittelbar mit sehr vielen Enzymstellen in Kontakt, wodurch schnelle enzymatische Reaktionen mit hohem Umwandlungsgraden erreichbar sind. Wenn der Wirkungsgrad des Enzyms relativ hoch ist, kann daher die Bahn sehr dünn sein; sofort beim Durchgang des Substrats durch die Bahn finden praktisch vollständige Umsetzungen statt. Aus dem gleichen Grunde erfordern Enzyme mit geringerer Reaktionsfähigkeit etwas dickere Bahnen und etwas längere Reaktionszeitspannen zur Erzielung vollständi-

ger Umwandlungen. Aufgrund des hohen Porositätsgrades und der hydrophilen Natur des dispergierten Füllstoffbestandteils wird das mikroporöse Material leicht benetzt und ist für durchfließende Flüssigkeit sehr durchlässig. Daher sind relativ niedrige hydraulische Drücke erforderlich, um ein Substrat durch das Material zu führen. Flüssigkeitsdurchsätze von etwa 1,5 l/min/ 93 dm² bis etwa 34,0 i/min/9,29 dm² durch Ba^nenmaterialien aus dem mikroporösen Material der US-PS 38 62 030 nvt einer Dicke von etwa 0,0.5 cm sind unter einem Druckgradienten von nur 0,7 bar und mit Füllstoff/Bindemittel-Verhältnissen im Bereich von etwa 1 :1 bis etwa 2 :1 erreicht worden. Eine Erhöhung des Füllstoff/Bindemittel-Verhältnisses führt im allgemeinen zu einer Zunahme der Porengröße und einer größeren Gesamtporosität, was eine Erhöhung der Permeabilität des Materials bewirkt Dementsprechend ist das immobilisiertes Enzym enthaltendes Trägermaterial der Erfindung besonders für eine Verwendung in Form eines sogenannten Durchflußreaktorkerns geeignet, d. h. eines Reaktorkerns, in dem die Substratlösung eine Oberfläche des enzymbeladenen Materials durchdringt, katalytisch an dem Enzym umgesetzt wird und das erhaltene Produkt sowie auch nicht-umgesetztes Substrat durch die gleiche oder eine andere Oberfläche des Materials die Reaktionszone verläßt.

Da die Mikroporen im wesentlichen miteinander verbunden sind, findet ein schneller Durchfluß des Substrats und/oder umgesetzten Produktes svatt und der Produktablauf geht daher sehr schnell vor sich und kann im wesentlichen gleichzeitig mit dem Strömungsendpunkt des Substrats durch das Trägermaterial beendet sein. Die mit dem erfindungsgemäßen Enzymträgermaterial durchgeführten katalytischen Reaktionen finden somit einen extrem scharfen Abschluß. Dementsprechend können viele unterschiedliche Substratproben in schneller Folge eingetragen werden, ohne daß eine Gefahr der Verunreinigung zwischen nachfolgenden Proben besteht, was ein großer Vorteil ist, wenn immobilisierte Enzyme verwendet werden, um ao nachfolgende katalytische Reaktionen mit einer Reihe verschiedener Substratproben, wie z. B. in medizinischen oder industriellen analytischen Instrumenten, durchzuführen.

Die vorstehend angegebenen Eigenschaften stellen einen erheblichen Vorteil der Erfindung dar, weil bei anderen bekannten immobilisierten Enzjmreaktoren, wie z. B. einem Füllbett aus porösen Glasperlen oder dem Membranreaktor, die Porengröße sehr gleichmäßig eingestellt ist und eine solche geringe Größe hat, daß der Materialtransport durch den Reaktor durch Diffusion stattfindet. Bei solchen auf Diffusion beschränkten Enzymreaktoren kann die GeLamtablaufdauer des Produkts wesentlich hinter dem Substratprobenendpunkt zurückbleiben, so daß das Problem einer Verunreinigung für eine nachfolgende Substratprobe gegeben ist, die zu schnell in den Reaktor eingetragen wird.

Außer den obigen Vorteilen hat das erfindungsgemäße mikroporöse Enzymträgermaterial ausgezeichnete Festigkeitseigenschaften, im allgemeinen eine Zugfestigkeit von 2,8 N/mm², eine prozentuale Dehnung unter 20% und kann daher sehr leicht während der verschiedenen Behandlungsstufen gehandhabt werden, die zum Koppeln oder Binden von Enzymen erforderlieh sind. Aufgrund seiner ausgezeichneten Größenkonstanz und Festigkeit widersteht es einem Verdichten unter hydraulischen Drücken und ist daher besonders für eine Verwendung in Behandlungsreaktoren im Großmaßstab geeignet, in denen große Enzymreaktionsbereiche vorhanden sind und starke dynamische Kräfte auf den Enzymträgerkörper ausgeübt werden, wie z. B. bei industriellen bzw. chemischen Prozessen unter Anwendung enzymatischer Reaktionen. Das mikroporöse Material ist außerdem gegenüber Chemikalien, wie Säuren und Alkoholen, beständig und kann erhöhten Temperaturen ausgesetzt werden, ohne daß die physikalischen Eigenschaften des mikroporösen Materials beeinträchtigt werden. Es ist möglich, das mikroporöse Material durch Einbringen in Wasserdampf von 1 bar mit einer Temperatur von 116⁰C 30 Min. ohne Beeinträchtigung der Dimensionskonstanz oder der physikalischen Eigenschaften des Materials zu sterilisieren.

Zur Herstellung des unlöslichen zusammengesetzten Systems unter Immobilisieren von proteinhaltigen Substanzen wird erfir ungsgemäß ein unlöslicher mikroporöser Trägerkörper hergestellt, der ein Bindemittel und in dem gesamten Bindemittel dispergierte feinteilige Füllstoffteilchen enthält, und eine proteinhaltige Substanz insbesondere ein katalytisch aktives Enzym, an wenigstens einen Teil der dispergierten Fülistoffteilchen gebunden.

Man bindet das katalytisch aktive Enzym zweckmäßigerweise chemisch an die Oberfläche der Füllstoffteilchen, indem man den Trägerkörper mit einem Brückenbildungs- oder Zwischenbindemittel unter Bildung organischer funktioneller Gruppen behandelt, die kovalent an die besagte Oberfläche gebunden sind, und den so behandelten Trägerkörper einer Lösung ausgesetzt, die das besagte Enzym enthält, um dadurch dieses Enzym an die organischen funktioneilen Gruppen an der Oberfläche der Füllstoffteilchen kovalent zu binden. Der behandelte Trägerkörper kann einem Vernetzungsmittel ausgesetzt werden, bevor man ihn der Enzymlösung aussetzt, oder gleichzeitig der Enzymlösung und einem Vernetzungsmittel ausgesetzt werden.

Eine Variante zur Enzymmobilisierung besteht darin, daß man das katalytisch aktive Enzym an die Oberfläche der FüHstofteilchen chemisch bindet durch Behandeln des Trägerkörpers mit einem Brückenbildungsmittel oder Zwischenbindemittel unter Bildung organisch funktioneller Gruppen, die an den besagten Oberflächen chemiadsorbiert sind, und Aussetzen des behandelten Trägerkörpers einer das Enzym enthaltenden Lösung, so daß das Enzym an die organischen funktioneilen Gruppen an der Oberfläche der Füllstoffteilchen kovalent gebunden wird. Auch hier kann man den behandelten Trägerkörper einem Vernetzungsmittel vor dem Aussetzen der Enzym lösung aussetzen oder gleichzeitig der Enzymlösung und einem Vernetzungsmittel aussetzen. Das hierbei verwendete Zwischenbindemittel ist bevorzugt ein Polyelektrolyt, z. B. ein Polyäthylenimin.

Das erfindungsgemäß bevorzugte mikroporöse Material kann durch Vermischen geeigneter Mengen eines feinteiligen anorganischen Füllstoffs, eines Lösungsmittels (z. B. Cyclohexanon) und eines Nichtlösungsmittels (z. B. Wasser) unter Bedingungen geringer Scherung unier Bildung eines beständigen, feuchten, freifließenden Pulvers hergestellt werden. Das Pulvergemisch kann dann extrudiert und kalandriert werden, vorzugsweise unter Bildung eines im wesentlichen ebenen Gebildes oder einer Bahn mit den gewünschten Abmessungen, das bzw. die dann durch ein wäßriges

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Bad geführt wird, um das Lösungsmittel auszulaugen, und dann durch einen erwärmten Luftofen geführt wird, in dem alle Feuchtigkeitsspuren entfernt werden. Der erhaltene mikroporöse, dimensionsbeständige, halbstarre, unlösliche, flüssigkeitsdurchlässige Körper wird dann so behandelt, daß Enzyme mit dem Körper gekoppelt oder an den Körper gebunden werden.

Das erfindungsgemäß bevorzugte mikroporöse Trägermaterial zeigt aufgrund der dispergierten Kieselsäurefüllstoffkomponente eine negative Selbstaufladung, wie durch erhebliche Adsorption von Proteinen daran bei pH-Werten unter dem isoelektrischen Punkt des adsorbierten Proteins nachgewiesen wird. Obwohl demnach eine direkte Adsorption von Enzymen an den dispergierten Füüstoffteüchen in dem Materia! möglich ist, reicht die (direkte) Adsorptionswirkung nicht aus, um eine relativ schnelle Desorption während des Gebrauchs und anschließend einen Verlust enzymatischer Wirksamkeit des zusammengesetzten Enzymsystems zu verhindern.

Erfindungsgemäß wird es daher bevorzugt, das mikroporöse Material in einer solchen Weise zu behandeln, daß eine chemische Bindung zwischen dem katalytisch aktiven Enzym und dem unlöslichen mikroporösen Trägermaterial erhalten wird. In dem unbehandelten Zustand fehlt dem mikroporösen Material die organische Funktionalität, die zur Bildung einer solchen chemischen Bindung gegenüber preoteinhaltigen Substanzen erforderlich ist.

Die meisten Enzyme können durch kovalentes Binden oder Vernetzen freier Aminoreste oder -gruppen an dem Enzymmolekül, die für die enzymatische Wirksamkeit des Enzyms nicht wesentlich sind, an einer Trägermaterialoberfläche, die aliphatische primäre oder sekundäre Amin- oder Hydroxylgruppen oder -reste enthält, immobilisiert werden. Andere Enzyme können in ähnlicher Weise kovalent gebunden oder vernetzt werden an einer Trägermaterialoberfläche, und zwar über andere funktioneile Gruppen, wie z. B. Carboxyl, Isonitril, Aldehyd oder Keton oder ein Anion. Unter dem hier benutzten Ausdruck »chemische Bindung« oder »chemisch gebunden« ist ganz allgemein eine chemische Bindung zwischen dem katalytisch aktiven Protein oder Enzym und den funktioneilen Gruppen oder Resten, die dem mikroporösen Ausgangsmaterial verliehen worden sind, zu verstehen.

Das Zwischenbindemittel wird erfindungsgemäß an die Füllstoffteilchen bevorzugt kovalent gebunden oder an der Oberfläche von mindestens einem Teil der dispergierten Füllstoffteilchen chemiadsorbiert; das so katalytisch aktive Enzym wird dann kovaient an das Zwischenbindemittel gebunden oder mit diesem vernetzt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erteilt man dem mikroporösen Ausgangsmaterial aliphatische primäre Aminfunktionalität durch direktes kovalentes Binden eines Brückenbildungsmittels (Zwischenbindemittel) in Form eines Organosilans, bevorzugt gamma-Aminopropyltriäthoxysilan, an den dispergierten Füllstoffteilchen oder durch direkte irreversible Chemisorption eines Brückenbildungsmittels, wie z. B. Polyäthylenimin (PEI), an den dispergierten Füllstoffteilchen. Enzyme können dann kovalent gebunden oder vernetzt werden an dem chemisch modifizierten mikroporösen Material und im spezielleren an den aliphatischen primären Amingruppen.

Wenn man ein Brückenbildungsmittel, wie z. B. gamma-Aminopropyltriäthoxysilan, verwendet, wird dieses vermutlich vorwiegend direkt kovalent an die hydrophilen anorganischen Füllstoffteilchen gebunden. Die Verwendung eines Silanbrückenbildungsmittels zum Binden von Enzymen an kieselsäurehaltigen Materialien ist an sich bekannt und wird z. B. in der US-PS 35 19 538 beschrieben.

Wenn man ein Brückenbildungsmittel, wie z. B. Polyäthylenimin, verwendet, wird dieses wahrscheinlich mit den dispergierten hydrophilen anorganischen Füllstoffbestandteilen des mikroporösen Materials über starke Chemisorptionskräfte verknüpft oder verbunden. Die Verwendung eines makromolekularen Polyelektrolyten oder Polyamine als Brückenbildungsmittel zum Binden oder Verknüpfen von Enzymen an die Oberfläche von kolloidalen Kieselsäureteüchen ist aus den US-PS 37 96 634 und 37 41 871 bekannt.

In beiden Fällen wird das Enzym vorzugsweise mit dem Brückenbildungsmittel durch ein bifunktionelles elektrophiles Reagens, wie z. B. Glutaraldehyd oder Bisimidatester, vernetzt, so daß die erwünschte kovalente Bindung des Enzyms an den funktioneilen Amingruppen erzielt wird.

Wenn ein an der Trägeroberfläche adsorbierbares Brückenbildungsmittel, z. B. in Form des oben erwähnten Polyäthylenimins, oder ein Brückenbildungsmittel, das an die Trägeroberfläche kovalent gebunden ist, wie z. B. gamma Aminopropyltriäthoxysilan, verwendet wird, kann die kovalente Bindung zwischen dem Enzym und dem Trägerstoff in einem Einstufen- oder Zweistufenverfahrensschritt gebildet werden. Bei dem Einstufenverfahrensschritt kann das chemisch modifizierte Trägermaterial gleichzeitig mit dem bifunktionellen elektrophilen Reagens und dem Enzym behandelt werden, um gleichzeitig eine intermolekulare Vernetzung der reaktionsfähigen Trägermaterialoberfläche des Polymerisats und des Enzyms zu erreichen. Glutaraldehyd vom industriellen Reinheitsgrad, ein typisch bifunktionelles Reagens enthält erhebliche Mengen löslicher polymerer Verbindungen, die durch intermolekulare Aldolkondensationen des monomeren Dialdehyds gebildet worden sind, jede Kondensationsstelle führt daher zu einem hoch reaktionsfähigen alpha, beta-ungesättigten Aldehydteil, der sehr schnell Additionsreaktionen vom Michaeltyp mit nucleophilen Gruppen, wie z. B. aliphatischen Aminen oder anderen Gruppen, unterliegt, welche sich an der Oberfläche von Enzymen befinden. Außerdem können freie aliphatische Aldehydgruppen, die in dem Polymerisat mit reaktionsfähiger Trägermaterialoberfläche vorhanden sind, ebenfalls an den Vernetzungsreaktionen durch Vereinigung mit aliphatischen .Aminogruppen des Trägermaterials oder Enzyms unter Bildung Schiffscher Basen teilnehmen. Obwohl der Grad, mit dem die erwünschte kovalente Bindung des Enzyms mit solchen unerwünschten, unproduktiven Reaktionen konkurriert, welche zu einer einfachen Proteinmodifizierung und Vernetzung von reaktionsfähigen Gruppen an der Oberfläche des Trägerstoffs führen, durch Änderung der experimentellen Bedingungen, wie des pH-Werts, der Proteinkonzentration und der Konzentration des Vernetzungsmittels, empirisch bestimmt werden kann, ist es zuweilen schwierig, solche unerwünschten konkurrierenden Reaktionen selektiv zu steuern, weil das bifunktionelle Vernetzungsmittel immer in einem erheblichen molaren Überschuß während der Umsetzung vorhanden ist

In Fällen, in denen man beim Einstufenverfahren eine übermäßige Enzyminaktivierung durch chemische Mo-

difizierung erhält, wird das Zweistufenverfahren angewendet, bei dem das chemisch modifizierte Trägermaterial zunächst mit dem bifunktionellen Reaktionsmittel vernetzt und dann mit dem Enzym gekoppelt wird. Bei Anwendung einer geeignet hohen Konzentration des Vernetzungsmittels können bimolekulare Reaktionen der Oberflächenaminogruppen konkurrierend zu intramolekularen Umsetzungen, wie Vernetzungen, auftreten. Dieses führt zu einer hohen Oberflächendichte von Seitengruppen, die mit nucleophilen Seitenkettengruppen von Enzymen reagieren können. Nach Entfernung des überschüssigen nichiumgesetzten Vernetzungsmittels kann dann das Enzym mit dem modifizierten Trägermaterial umgesetzt werden, wobei eine kovalente Bindung zwischen Fnzym und Trägermaterial erzielt wird. Das vorstehende Zweistufenverfahren ergibt eine sehr geringe Modifizierung des Enzyms, weil nur Gruppen in der Nähe des Kontaktbereichs zwischen dem Enzym und der reaktionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials reagieren.

Zahlreiche andere chemische Vorgänge oder Chemikalien können zum kovalenten Binden von Enzymen an chemisch modifizierten Trägermaterial angewendet werden. Dazu gehören z. B. die Acylierung der aliphatischen Aminogruppe an der reaktionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials mit Bernsteinsäureanhydrid unter Bildung einer aliphatischen Carboxyseitengruppe, die anschließend mit nucleophilen Seitenkettengruppen von Enzymen in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids umgesetzt wird, die direkte Umsetzung der Aminogruppe an der reaktionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials mit Seitenkettencarboxylgruppen von Enzymen in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids, die Acylierung der Aminogruppe an der reaktionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials mit p-Nitrobenzoylchlorid, Reduktion der Arylnitrogruppe zu einer Arylaminogruppe mittels Natriumdithionit, Oxidation der Arylaminogruppe zu einem Aryldiazoniumsalz mittels salpetriger Säure und nachfolgende Umsetzung mit aromatischen Seitenketlenresten von Proteinen zu einer beständigen Azobindung, sowie die Acylierung der Aminogruppe an der reaktionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials mit Terephthaloylchlorid, Umsetzung der p-Benzoylsäurehalogenid-Seitengruppe mit Hydrazid zu einem Benzoylazid und schließlich Umsetzung mit nucleophilen Seitenkettengruppen von Enzymen.

Zur Umsetzung des Enzyms mit dem chemisch modifizierten Trägermaterial wird das Enzym vorzugsweise in eine Pufferlösung gebracht und die Umsetzung bei Temperaturen durchgeführt, die genügend niedrig sind, so daß eine Desaktivierung des Enzyms oder wesentliche Änderung in dem Konformationszustand des Enzyms vermieden werden. Im allgemeinen sind Temperaturen in dem Bereich von etwa 5 bis 50⁰C geeignet Gleichfalls können die Enzymkonzentration in der gepufferten Reaktionslösung und dementsprechend das Ausmaß, in dem das chemisch modifizierte Trägermaterial mit Enzymen beladen werden soll, je nach dem Umsetzungsgrad des Enzyms, der Konzentration des Substrats und der Fließgeschwindigkeit des Substrats durch den Reaktorkern gewählt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern das immobilisierte Enzymsystem der Erfindung in Form eines sogenannten Schichtscheiben- oder Durchflußreaktors. Viele andere Reaktorformen können jedoch angewendet werden. Zum Beispiel kann das mikroporöse Ausgangsmaterial in die Form eines hohlen Rohrs gebracht werden und

behandelt werden, um katalytisch aktive Enzyme daran zu binden. Ein Substrat kann dann an dem einen Ende in das Rohr einfließen und beim Durchfließen durch das Rohr und Kontaktieren mit der Innenwand des Rohrs enzymatisch umgesetzt werden, wonach dann das erhaltene Produkt am anderen Ende des Rohrs ausfließt. Wenn das Substrat eine relativ hohe Viskosität hat, oder es aus anderen Gründen erwünscht ist, einen Reaktor beispielsweise vom Füllbettyp, Wirbelbettyp oder Rührtanktyp anzuwenden, können Enzyme an Bahnen aus mikroporösem Ausgangsmaterial gebunden und immobilisiert werden und dann kann die erhaltene Bahn zerschnitten oder in kleine Stücke geeigneter Größe zerteilt werden (wie z. B. als Stücke, Körner, Perlen, Pulver). Die erhaltenen zerteilten immobilisierten Enzymteilchen können dann nach bekannten Anwendungstechniken, welche solche Formen von Trägermaterial mit immobilisiertem Enzym erfordern, eingesetzt werden.

' B e i s ρ i e Ί 1

(A) Herstellung eines unbehandelten mikroporösen
Körpers

Eine Bahn aus mikroporösem Material wurde hergestellt, indem zunächst 9,08 kg Polyvinylchlorid einer Teilchengröße von etwa 177 um und 18,16 kg präzipitiertes Kieselsäurehydrat in einem Mischer für Flüssigkeiten und festes Material geringer Scherkraft etwa 3 Min. gemischt wurden. Dann wurden unter fortwährendem Rühren 24,79 kg Cyclohexanon innerhalb von 20 Min. mittels einer Pumpe zugegeben. Dann wurden 26,79 kg Wasser unter Rühren innerhalb von 20 Min. zugegeben, so daß ein beständiges, feuchtes, freifließendes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde dann in einen Schneckenextruder mit einer Temperatur der Laufbuchse von etwa 49° C eingetragen, und das extrudierte Material wurde zwischen die Walzen eines Kalanders geführt, um so eine im wesentlichen ebene Bahn mit einer Dicke von 0,5 mm zu erhalten. Die Bahn wurde dann durch ein Extraktionswasserbad von 77°C geleitet und anschließend in einem Warmluftofen bei 107°C Min. getrocknet. Die fertige mikroporöse Bahn hatte eine relativ breite Porengrößenverteilung, die sich von etwa 0,01 bis etwa 100 m erstreckte, und einen mittleren Pdrendurchmesser in dem Bereich von etwa 0,15 bis etwa 0,25 μην bestimmt nach der Quecksilberintrusionsmethode. Außerdem betrug die Gesamtporosität dieses Materials etwa 65 Volumen-%: der Gehalt an dispergiertem Füllstoff (d. h. Kieselsäure) machte etwa 56 Gew.-% aus. Wasser drang schnell in das Material ohne Anwendung von Druck ein, was anzeigte, daß die Mikroporen im wesentlichen untereinander verbunden waren. Aus der im wesentlichen wölbungsfreien, halbstarren, mikroporösen Bahn wurden mehrere unbehandelte Trägerkörper in einer Größe von 5 χ 5 cm geschnitten und durch Eintauchen in ein Dampfbad 1 Std. wärmesterilisiert und dann nach Abkühlen an der offenen Luft getrocknet

(B) Chemische Modifizierung durch kovalente
Bindung

Ein nach Beispiel IA hergestellter unbehandelter Trägerkörper wurde mit einer 10%igen (Vol/Vol) wäßrigen Lösung von gamma-Aminopropyltriäthoxysilan, die 1% (Vol/Vol) konzentrierte HCl enthielt, 24 Std. lang behandelt Der behandelte Trägerkörper wurde mit Wasser und 1 Mol/l NaCl gewaschen, um alle

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umgesetzten Chemikalien zu entfernen. Vorhandene aliphatische primäre Aminogruppen wurden dann qualitativ bestimmt, indem der behandelte Körper mit 0,5% (Gew.-/Vol) Trinitrobenzolsulfonsäure in 0,1 Mol Natriumtetraboratpuffer bei 21°C behandelt und ein intensiv orange gefärbtes Trinitrophenylaminderivat an der Oberfläche des behandelten Trägerkörpers festgestellt wurde. Die Elementaranalyse des behandelten Trägerkörpers ergab einen Stickstoffgehalt, der bezogen auf das Trockengewicht 0,5% über dem des unbehandelten Trägerkörpers lag. Die Beständigkeit der Aminofunktionalität an dem behandelten Trägerkörper ergab sich daraus, daß nach 12 Monaten Aufbewahren in Wasser praktisch kein Stickstoffverlust auftrat. Der behandelte Trägerkörper zeigte die is gleichen Fließfähigkeiten wie der unbehandelte Trägerkörper und war gegenüber Änderungen der Puffer oder der lonenstärke nicht empfindlich.

(C) Chemische Modifizierung durch
Chemiadsorption

Ein anderer nach Beispiel IA hergestellter unbehandelter Trägerkörper wurde mit einer 5%igen (Gew./ VoI) wäßrigen Lösung von verzweigtkettigen Polyäthylenimin (PEI) mit einem Molekulargewicht von 50 000 bei Raumtemperatur 1 Std. behandelt. Das behandelte Trägermaterial wurde mit Wasser und 1 Mol NaCI zur Entfernung von etwa vorhandenem nichtadsorbiertem PEl gewaschen. Der gleiche Test wie in Beispiel 1B mit Trinitrobenzolsulfonsäure ergab ein intensiv orange gefärbtes Trinitrophenylaminderivat an der Oberfläche des behandelten Trägerkörpers, was eine aliphatische Aminfunktionalität anzeigt. Der Stickstoffgehalt des behandelten Trägerkörpers wurde durch Elementaranalyse quantitativ bestimmt und betrug 1,25% Stickstoff, bezogen auf das Trockengewicht, gegenüber 0,02% Stickstoff, bezogen auf das Trockengewicht eines unbehandelten Trägerkörpers. Die Chemiadsorption von PEI an dem unbehandelten Trägerkörper erschien praktisch irreversibel, weil das PEI nicht entfernt werden konnte, wenn der Trägerkörper Lösungen mit hoher Ionenkonzentration (z. B. 1 Mol NaCl oder 1 Mol K2HPO4/KH2PO4) bei pH-Werten zwischen 3 und 9 ausgesetzt wurde. Nur in dem Fall stark saurer Bedingungen (Eintragen in 1 Mol HCI für 2 Std.) fand eine teilweise Desorption statt, die etwa 50% des Stickstoffgehalts entsprach, wie durch Elementaranalyse festgestellt wurde. Der Oberflächenbereich des behandelten Trägermaterials betrug nach der Standard-BET-Methode 55,4 m²/g gegenüber 81,1 m²/g für die Kontrolle. Her mit PF.I behandelte Trägerkörper zeigte die gleichen Fließfähigkeiten wie ein unbehandelter Trägerkörper, unabhängig von dem verwendeten Puffer oder der angewendeten Ionenkonzentration.

(D) Enzymkopplungsreaktion
(Glukoseoxidase)

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Der nach Beispiel IC behandelte Trägerkörper wurde 1 Std. einer 10%igen (VoWoI) Lösung von Glutaraldehyd bei einem pH-Wert von 7 ausgesetzt Der Trägerkörper wurde dann mit Wasser gewaschen und 1 Std. in eine Lösung von Glucoseoxidase eingetragen, welche aus Aspergillus niger gewonnen und bis zur Homogenität aufgereinigt worden war. Die Bedingungen waren folgende: Glucoseoxidase-Konzentration von 20 mg/ml in 0,1 Mol K₂HPO4/KH₂PO4-Puffer mit einem pH-Wert von 6,0 bei Umgebungstemperatur. Ein direktes Pumpen der Enzymlösung durch den Trägerkörper unter einem positiven hydraulischen Druck verbesserte die Enzymaufnahme gegenüber einer einfachen Einwirkung der Lösung (durch Inkubation). Die Temperatur bei der Kopplungsreaktion ist nicht wesentlich, sie darf jedoch nicht den Wärmeaktivierungsbereich von 50⁰C für Glucoseoxidase überschreiten. Der Trägerkörper wurde dann ergiebig mit Wasser und 1 Mol NaCl gewaschen, um nicht-gebundenes Enzym zu entfernen. Elektrophile Rückstände auf der Oberfläche des Trägerkörpers wurden durch Behandeln des zusammengesetzten immobilisierten Enzym-Systems mit 0,1 Mol Äthonalamin bei einem pH-Wert von 7,0 mit einem Gehalt an 5OmMoI NaCNBH₃ erreicht. Das immobilisierte Enzym hatte eine unbegrenzte Haltbarkeit bei einer Lagerung bei 4°C in 0,1 Mol K₂HPO₄-Puffer und einem pH-W~ert von 6,0.

Beispiel 2
(2A) Einzelenzymreaktor

Die folgende Reaktion wurde unter Verwendung eines Scheibenpaars mit Durchmessern von 1,5 cm durchgeführt, die nach dem Beispiel 1D hergestellt und in Schichtanordnung in einem Durchflußreaktor angebracht worden waren, wobei der Strömungsvektor des Substrates im wesentlichen senkrecht zur Ebene einer jeden Scheibe verlief. Der Scheibenquerschnitt, der dem Flüssigkeitsstrom gegenüber ausgesetzt war, betrug 79 mm². Glucoseoxidase (E. C. 1.1.3.4.) katalysiert die aerobe Oxidation von Glucose

ß— D—Glucose + O₂ -► D-Gluconolacton + H₂O₂.

Die enzymatische Aktivität in dem Schichtscheibenreaktor wurde durch Ermittlung der Sauerstoffabnahme des Abstroms aus dem Reaktor mit einem biologischen Sauerstoff-Monitor gemessen. Eine Lösung von 0,15 mMol Glucose bei anomerischem Gleichgewicht in luftgesättigtem 0,1 Mol Na-Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 wurde durch den Reaktor mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min, gepumpt. Die Umwandlung des Meßsubstrats, jS-D-Glucose, verlief quantitativ gemäß der Sauerstofferschöpfung im Abstrom des Reaktors. Die Verweildauer des Probenstroms im Kontakt mit dem Reaktor betrug etwa 1,6 Sek. Die integrierte Form der Geschwindigkeitsgleichung für Glucoseoxidase unter diesen experimentellen Bedingungen ist genau bekannt, und es kann berechnet werden, daß die untere Grenze für die Konzentration von immobilisiertem Enzym 10 mg/ml ist. Die ungewönlich hohe Aktivität des Schichtscheibenreaktors wird dem Fehlen von inneren Massentransporteffekten zugeschrieben.

(2B)

Ein zweiter Satz von geschichteten Scheiben wurde nach dem Beispiel ID hergestellt und in einen Durchflußreaktor montiert; die Scheiben wurden jedoch mit einer um einen Faktor 10 geringeren Konzentration von immobilisiertem Enzym hergestellt Eine 1 mMol Glucoselösung in 0,1 Mol Na-Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 wurde dann durch den zweiten Scheibenreaktor mit Strömungsgeschwindigkeiten, die ausreichend hoch waren, so daß der Reaktor nach kinetischer Art arbeitete, gepumpt, wobei nur eine teilweise Umwandlung von Glucose in Gluconolacton stattfand. Es wurde festgestellt daß der unter dieser Bedingung bestehende Grad der Substratumwandlung durch den Reaktor hochempfindlich gegenüber der

Enzymkonzentration ist. Bei einer Beachtung im kontinuierlichen Betrieb für eine Zeitspanne von 4 Std. wurde keine Änderung in dem bestehenden Umwandlungsgrad festgestellt, was anzeigt, daß aus dem Reaktor keine enzymatische Aktivität verloren gegangen ist.

Beispiel 3

Enzymatische Kopplungsreaktion (Alkoholdehydrogenase)

Ein anderer nach Beispiel IC behandelter Trägerkörper wurde 1 Std. einer 10%igen (Vol/Vol) wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd mit einem pH-Wert von 7 ausgesetzt. Der Trägerkörper wurde dann mit Wasser gewaschen und 1 Std. in eine Lösung von Alkoholdehydrogenase gebracht. Die Bedingungen der Enzymkopplungsreaktion waren wie folgt: Alkoholdehydrogenasekonzentration 5 mg/ml in 0,1 Mol K₂HP(VKH₂PO₄-Puffer, pH 6,0, enthaltend 0,1 mMol EDTA und 10 μΜοΙ NADH (reduziertes Nicotinamidadenindincleotid) bei Umgebungstemperatur. Der Trägerkörper wurde dann ergiebig mit dem Puffer und 1 Mol NaCI gewaschen, um nicht-gebundenes Enzym zu entfernen. Elektrophile Rückstände auf dem Trägerkörper wurden durch Behandlung des zusammengesetzten immobilisierten Enzym-Systems mit 0,1 Mol Äthanolamin mit einem pH-Wert von 7,0, enthaltend 50 mMol NaCNBH₃, entfernt. Die Enzymbeladung betrug 11 mg/g des Trägermaterials und wurde durch Messen der Stickstoffzunahme auf dem Trägerkörper vor Entfernung der nicht-umgesetzten elektrophilen Rückstände ermittelt.

Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1.1) katalysiert die reversible Oxidation von primären Alkoholen gemäß der Gleichung

Alkohol + NAD®

Die enzymatische Aktivität in einem Schichtscheibenreaktor wurde durch spektrophotometrisches Messen der Bildung von NADH (340 nm) im Abstrom des

Aldehyd + NADH + H® Reaktors mit einem Durchfluß-Adsorptionsfähigkeits-Monitor ermittelt. Eine einzelne 1,5-cm-Scheibe mit dem immobilisierten Enzym wurde wie in Beispiel 2 in einen Durchflußreaktor montiert. Eine Lösung von 5OmMoI Äthanol und 0,5 mMol NAD⁺ in 0,1 Mol K₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH 7,4. enthaltend ΙΟμΜοΙ EDTA, wurde durch den Reaktor mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min gepumpt. Die berechnete Umwandlung (im Gleichgewicht) für die Umsetzung unter diesen Bedingungen beträgt 16% der Ausgangs-NAD + -Konzentration. Es wurde eine vollständige Gleichgewichtseinstellung beobachtet, was anzeigt, daß ein Kontakt von wenigen Millisekunden mit dem immobilisierten Enzym in dem Reaktor ausreicht, um die thermodynamische Grenze der Umsetzung zu erreichen. Um die Siabilitäl des immobilisierten Enzyms zu demonstrieren, wurden Bedingungen gewählt, unter denen der Reaktor 24 Std. auf kinetische Art betrieben wurde. Weil die Umwandlung der Substrate äußerst empfindlich auf eine Erhaltung des Katalysators unter diesen Bedingungen reagiert, zeigt eine Abnahme des Umsetzungsgrads eine Einbuße an Enzym oder eine Inaktivierung des Enzyms an. Die Bedingungen des Versuchs waren: 5 mMol Äthanol und 50 μΜοΙ NAD⁺ in 0,1 Mol K₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH 7,0 enthaltend 10 μΜοΙ EDTA. Diese Lösung wurde durch den Reaktor mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min für 24 Std. unter fortwährender Messung und Aufzeichnung des Substratumwandlungsgrades gepumpt. Es wurde festgestellt, daß die Umwandlung während dieser Dauer konstant blieb, was eine vollständige Erhaltung des immobilisierten Systems anzeigt.

Beispie! 4 »Tandem«-Enzymreaktor

Ein Scheibenreaktorsystem mit drei verschiedenen zusammengesetzten Systemen mit immobilisiertem Enzym wurde zur Katalysierung der nachfolgenden Reaktionsfolge zusammengestellt:

Saccharose + H₂O _a._D._{Glucose +} Fructose (EC 5.1.3.3.)

ff-D-Glucose

jS-D-Glucose + O₂

-» jS-D-Glucose

+ H₂O₂

Die Glucoseoxidase war homogen und wurde aus Aspergillus niger gewonnen, das Aldose-1-epimeraccfiZyui \L\ 5.1.3.3; w'üruc äUS oCi gemäß Messung der Sauerstoffabnahme im Ablauf des Reaktors 10% der theoretischen Umsetzung, bezogen

nen und hatte eine Reinheit von 20% (GewVGew.), und die ot-D-Fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) wurde in hoher Reinheit aus Candida utilis gewonnen. Jedes der oben genannten Enzyme wurde an einem Paar von 1,5-cm-Scheiben gemäß Beispiel ID mit einer Enzymkonzentration von 20 mg/ml kovalent immobilisiert Die Reaktion zur Entfernung von Aldehyd wurde nicht angewendet Die beiden Sätze aus drei Scheiben (von denen jede Scheibe in jedem Satz eines der\irei Enzyme nach. Kopplung und in der oben angegebenen Reihenfolge enthielt) wurden dann in dem Durchflußreaktor des Beispiels 2 schichtförmig angeordnet Eine mMol-Lösung aus ultrareiner Saccharose in 0,05 Mol K₂HPO₄, pH 6,0 mit Luft gesättigt bei 25°C, wurde dann durch den Reaktor mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,2 ml/min gepumpt Die Umwandlung betrug

crc gcWön- 3üi uic uctvSnntE otOCniOinCtnC uCr

Die maximale Umwandlung, die erzielt werden konnte, war jedoch 25%, weil gelöster Sauerstoff das begrenzende Substrat darstellt (250 μΜοΙ). Unter den in diesem Beispiel angewendeten Bedingungen ist die Aldose-1-epimerase das geschwindigkeitsbegrenzende Enzym. Bei langsameren Strömungsgeschwindigkeiten und dementsprechend längeren Verweilzeiten im Reaktor näherten sich die ermittelten Umwandlungen 25%.

Beispiel 5

Immobilisierung von Glucoseisomerase auf mikroporösem Trägermaterial

Glucoseisomerase katalysiert die reversible gegenseitige Umwandlung von /J-D-Fructose in «-D-Glucose gemäß der folgenden Gleichung:

26 3§

Ji-D-Fructose

(Glucoseisopaarase).

oD-Glucose

Vier Scheiben mit einem Durchmesser von 26 mm wurden aus einer Bahn aus mikroporösem Material (Beispiel IA) zugeschnitten und nach Beispiel iC behandelt und schachtförmig in einem Standardfilterhalter ohne Dichtung unter Bildung eines Durchflußreaktors angeordnet Die mit PEI beladenen Trägerscheiben wurden modifiziert, indem Glutaraldehyd [10% (Gew./ VoI) mit pH-Einstellung auf 8,0] für 1 Std. durch den Reaktor im Umlauf aus einem 100-ml-Reservoir gepumpt wurde. Der Trägerkörper wurde dann in-situ durch Pumpen (etwa '/2 Std.) von 500 ml entionisiertem Wasser und 200 ml Hepes-Puffer oder eines entsprechenden Puffers (d. h. 2 g/l MgSO₄ ■ 7 H₂O und 0,2 g/l CoSO₄ - 7 H₂O, pH 7,0—7,5 in entionisiertem Wasser) durch den Reaktor gewaschen. Eine Lösung von Glucoseisomerase mit einem pH-Wert von 7,5 (3OmI enthaltend 0,43 Einheiten/ml) wurde durch ein 0,65-μπι-Filter geleitet und durch den Scheibenreaktor 1 Std. bei Raumtemperatur zirkulieren gelassen. Der hier benutzte Ausdruck »Einheiten« bezieht sich auf Aktivitätseinheiten; darunter ist die Enzymmenge zu verstehen, die die Umwandlung von 1 Mikromol /?-D-Fructose in

10

15

20 Ä-D-Glucose je Min. bei 25° C katalysiert Der Reaktor wurde mit etwa 500 ml Hepes-Puffer gewaschen, bis kein Protein mehr im Abiauf gefunden werden könflte. Das in diesem Beispiel immobilisierte Glucoseisömeraseenzym wurde als lyophiiisiertes Ganzzelienhomögenisat aus Streptomyces albus gewonnen und durch Isolierung von löslichem Protein und Fraktionierung mit Ammoniumsulfat (AmSO₄) gereinigt. Obwohl die Fraktionierung zum Teil von der Anfangsproteinkonzentration der bei der Proteinisolierungsstufe erhaltene überstehenden Lösung abhängt, wird die Hauptglucoseaktivität im allgemeinen in dem 70—85% AmSO₄-Peliet gefunden. Die Proteinpellets, die den Hauptteil der Aktivität enthalten, werden in etwa 20—30 ml Hepes-Puffer gelöst und unter Verwendung von 4 I Puffer für 24 Std. bei 4° C unter Anwendung eines Standardcelluloseacetatdialyserohrs dialysierL Obwohl die enzymherstellung an diesem Punkt gewünschtenfalls für eine Verwendung bei der Immobilisierung geeignet ist, kann das obige Enzymkonzentrat noch weiter nach Standardgelpermeationstechniken gereinigt werden. Der Proteinversuch mit <3er ablaufenden Spüllösung wurde unter Anwendung der folgenden Reaktionsfolge durchgeführt:

25

a. jS-D-Fructose ^I

GI

^ a-D-Glucose

geschwindigkeitsbegrenzend

u ™ ^i Aldose-1-epimerase _ar, _,.

b. ff-D-Glucose - > jS-D-Glucose

schnell

c. >D-Glucose + 1/2 O₂ D-Gluconolacton + 1/2 H₂O₂

hll

schnell

2H₂O ₊ O₂

Giucoseisomerase katalysiert die reversible Umwandlung von j?-D-Fructose in α-D-Glucose. Bei 25⁰C hat die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion einen einheitlichen Mittelwert und führt annähernd zu einem 50—50 Gemisch von jS-D-Fructose und a-D-Glucose. Die spontane Epimerisierung der Zwischenverbindung Λ-D-Glucose in jJ-D-Glucose verläuft unter den Versuchsbedingungen nicht genügend schnell, um eiue Ansammlung dieser Zwischenverbindung verhindern zu können, und daher wird Aldose-1-epimerase der Versuchslösung zugegeben, um die Umsetzung dieser Zwischenverbindung zu erleichtern. Bei dieser Umsetzung wird die aerobe (Glucoseoxidase) Oxidation von /9-D-Glucose zu D-Gluconolacton in Gegenwart von Catalase ermittelt, wobei ein stöchiometrisches Gesamtverhältnis von zwei Molen 0-D-Fructose je Mol Sauerstoff (O₂) gegeben ist. Diese Endreaktion wird mit einem biologischen Sauerstoffmonitor aufgezeichnet.

Der Versuch wurde folgendermaßen durchgeführt:
In eine Reaktionszelle, die auf eine Temperatur von 25⁰C eingestellt worden war, wurden 3 ml von 0,01-molarem Phosphatpuffer (pH 8) zugegeben, und mit einem Rührer gerührt. Dann wurden 30 Mikroliter Sigma-Glucoseoxidase Typ V, welche lOfach konzentriert war, und 100 Mikroliter Aldose-1-epimerase (hergestellt nach Lepedes und Chase »Aldose-1-Epimerase from Hog Kidney: Isolation and Evidence of Purity, Chemical Studies and Inhibition Kinetics«, S. L. Lapedes und A. M. — Chase, Biochem. & Biophys. Res. Comm., 31, 967 [1968] oder auf entsprechende Weise) zugegeben. Anschließend wurden 10 Mikroliter Sigma-C-100 Catalase (mit einer Konzentration von 5 mg/ml) und 20 Mikroliter von 72%iger (4,0molarer) j3-D-^cructose in die Zelle eingetragen. Nach dem Rühren der erhaltenen Lösuqg für insgesamt 3 bis 5 min wurde die Elektrode

so eines biologischen Sauerstoffmonitors sorgfältig in die Zelle eingeführt, wobei sichergestellt wurde, daß keine Luftblasen zurückblieben, welche z. B. der Elektrode, den Zellenwandungen oder dem unteren Ende des Rührstabs anhaften könnten. Bei dem Schreiber des biologischen Sauerstoffmonitors, der mit einer Registrierstreifengeschwindigkeit von 1,27 cm/min arbeitete, wurde ein konstanter Kurvenverlauf ermöglicht, d. h. eine lineare Grundlinie erhalten. Nach Erhalt einer linearen Grundlinie wurden 100 Mikroliter der Pufferlösung in die Reaktionszelle eingetragen, und es wurde wiederum ermöglicht, daß der Kurvenverlauf linear war. Der Versuch verläuft linear bis 10 Mikromol O₂ je Minute, wenn auch im allgemeinen langsamere Geschwindigkeiten unter Benutzung einer gestreckten

b5 Skalenordnung an dem Sauerstoffmonitor angewendet werden. Keine Verschiebung in der Neigung der Kurve zeigt das Fehlen von aktivem Enzym in der Pufferspüllösung an. Eine Beladung von 0,7 Einheiten Glucoseiso-

merase je ml Reaktormatrix wurde berechnet unter Zugrundelegung des Aktivitätsverlustes der die Immobilisierung verwendeten Proteinlösung.

Beispiel 6

Vergleich mit mikroporösem Trägermaterial mit Glas von eingestellter Porengröße (CPG)

Glasteilchen mit einer Teilchengröße von 420 bis 177 μηι und eingestellter Porengröße wurde nach Standardmethoden (»Immobilized Enzymes: A Prototype Device for the Analysis of Glycose in Biologizal Fluids Employing Immobilized Glucose Oxidase«, M. K. Weibel u. a. Anal Biochem, 52, 502 [1973]) chemisch modifiziert, um kovalent gebundene, aliphatische Aminofunktionalität an den Außen- und Innenflächen einzuführen. 2 g des aminomodifizierten CPG wurden entgast und in 100 ml Hepes-Puffer 1/2 Std. suspendiert bzw. aufgeschlämmt. Die überstehende Lösung wurde von dem Bett abgesaugt, und die Teilchen wurden erneut in 100 ml einer 10%igen wäßrigen Glutaraldchydlösung 1 Std. suspendiert. Die CPG-Teilchen wurden ausgiebig durch Suspendieren und Dekantieren gewaschen, bis der Geruch von Gluts raldehyd verschwunden war. 10 ml Enzymlösung, enthaltend 0,43 Einheiten/ml, pH 7,5, wurden den Teilchen zugegeben und 1 Std. der Umsetzung überlassen. Ein 1,2-ml-Volumen von den Teilchen wurde in eine schmale Säule (mit einem Durchmesser von 0,6 cm) unter Bildung eines Füllbettreaktors eingetragen und mit Hepes-Puffer gespült, bis kein Protein in der überstehenden Lösung festgestellt wurde (nach Bestimmung gemäß Beispiel 5). Unter Zugrundelegung des Aktivitätsverlusts der Reaktionslösung entsprach die Beladung 0,66 Einheiten/ml (CPG hat ein Schüttgewicht von 0,36 g/ml), was im wesentlichen der des Trägermaterials mit immobilisiertem Enzym nach dem Beispiel 5 entsprach. Die relativen Volumen der Scheiben (Beispiel 5) und der Füllbettreaktoren lagen innerhalb von 20% und betrugen 1,0 und 1,2 ml. Die Reaktoren wurden empirisch bewertet, indem der Umwandlungsgrad einer 7,2%igen (Gew./ VoI) Fructoselösung (0,4 molar), pH 7,0, bei mehreren Strömungsgeschwindigkeiten in dem Hepes-Puffer gemessen wurde. Glucose wurde durch Verdünnen des Reaktorablaufs (lOOfach) mit 0,1 molarem Natriumacetat, pH 5,5, und Messen des Endpunkts des Sauerstoffverbrauchs in Gegenwart der betreffenden Enzyme gemessen. Die Analyse der Aktivität von immobilisiertem Fnzym wurde nach der gleichen Technik durchgeführt, wie sie für die Lösungen gemäß Beispiel 5 angewendet wurde, allerdings hatte die erste Umsetzung schon stattgefunden und man brauchte nur die a-D-Glucosemenge in dem ablaufenden Strom des Reaktors zu messen. Dementsprechend hat die Umsetzung

>D-Fructose

GI

a-D-Glucose Ben: In die Reaktionszeit, die in einen Gleichgewichtszustand bei 25° C gebracht worden war, wurden 3 ml Natriumacetatpuffer, pH 5,5, mit einer Pipette eingetragen und gerührt. Dann wurden 60 Mikroliter Glucose-5 oxidase, 200 Mikroliter Aldose-i-epimerase und 10 Mikroliter Catalase in die Zelle eingetragen. Nach dem Rühren der erhaltenen Lösung für insgesamt 3 bis 5 Min. wurde die Elektrode des Sauerstoffmonitors sorgfältig in die Zelle eingeführt, so daß keine Luftblasen an den Oberflächen der Elektrode, der Zelle oder in der Lösung selbst zurückblieben. Bei dem Schreiber des biologischen Sauerstoffmonitors, der mit einer Registriersireifengeschwindigkeit von 1,27 cm je Min. arbeitete, wurde eine Stabilisierung zu einer konstanten Grundlinie ermöglicht Nach Erhalt einer linearen Grundlinie wurden 30 Mikroliter Reaktorablauf in die Reaktionszelle eingetragen, und es wurde wiederum ermöglicht, daß die Kurve eine konstante Neigung erreichte. Die Ergebnisse der emoirischen Bewertung werden nachfolgend tabellenförmig angegeben. Die Immobilisations- und die Reaktorversuche wurden parallel am gleichen Tag durchgeführt, so daß ein direkter Vergleich gezogen werden konnte. Der Wirkungsgrad jedes Reaktors war über eine Zeitdauer von 6 Std. hinweg unverändert, wie durch die konstante gleichmäßige Umwandlung von Fructose in Glucose festgestellt wurde, wenn die beiden Reaktoren in kinetischer Art betrieben wurden.

Füllbettreaktor (Volumen 1,2 ml)

	Umwandlung	Verweildauer
Strömungsgeschwindigkeit
1,30 ml/min	0,38%	0,92 min
0,69 ml/min	0,56%	1,74 min
0,20 ml/min	1,50%	6,00 min
Scheibenreaktor
(Volumen 1,0 ml)
0,75 ml/min	0,81%	1,33 min
0,37 ml/min	1,30%	2,72 min
0,18 ml/min	2,45%	5,50 min

in dem Reaktor schon stattgefunden und wird mit einer 7,2°/oigen Fructoselösung in Hepes-Puffer durchgeführt. Die analytische Reihenfolge für den Reaktorablauf ist die gleiche, wie die Gleichungen b, c und d der Reaktionsfolge bei der in dem obigen Beispiel 5 angegebenen Versuchstechnik.

Die Versuchsbedingungen zur Ermittlung des Wirkungsgrades der Umsetzung von jJ-D-Fructose in Λ-D-Glucose in dem Reaktorablauf sind folgenderma-

Wie den vorstehenden Werten zu entnehmen ist, beträgt der Wirkungsgrad des Füllbettreaktors gleichbleibend nur 60 bis 70% des Wirkungsgrads der Schichtscheibenanlage, wenn die Verweilzeitspannen normiert werden. Dieses ist sehr überraschend im Hinblick auf Berechnungen, welche ergeben, daß die »Massenkonzentration« des Enzyms aus praktischen Gründen bei beiden Reaktoren gleich ist. Der Scheibenreaktor verblieb bei Raumtemperatur in Gegenwart der Substratlösung 5 Tage. Die Transporteigenschaften des Reaktors waren danach unverändert, und die prozentuale Umwandlung betrug bei 0,37 ml/min etwas mehr als 1,50%.

Beispiel 7

Mikroporöses Trägermaterial mit wärmegehärteter ^b5 Matrix

Eine Bahn aus mikroporösem Material wurde durch gründliches Vermischen von 100 Gew.-Teilen Natur-

kautschuk, 165,5 Teilen Kieselsäurehydrogel, 3,1 Teilen inerten Füllstoffs (Kautschukstaub), 39,0 Teilen Schwefel, 0,8 Teilen Stearinsäure und 0,8 Teilen Diphenylguanidin in einem Banbury-Mischer unter Bildung eines homogenen Gemischs hergestellt Die kalandrierte Bahn wurde auf eine Spule aufgewickelt und in einem Autoklaven 35 Min. bei 172° C und einem Druck von 104 bar vernetzt Die vernetzte Bahn wurde dann unter Entfernung aller Feuchtigkeitsspuren luftgetrocknet Das erhaltene äußerst poröse Material enthält Mikroporen, deren Größe von etwa 0,5 μπι bis etwa 5 μπι variiert, mit einem mittleren Porendurchmesser von etwa 13 μιη, gemäß Bestimmung nach der QuecksilberintrusionsiTiethode. Die Gesamtporosität dieses Materials beträgt etwa 56 Vol.-% und der ciispergierte Füllstoff z. B. Kieselsäure) etwa 26 Gew.-%. Proben mit einem Durchmesser von 1,3 cm wurden aus der fertigen mikroporösen Bahn auf einer Presse ausgestanzt und zur Herstellung von Einscheibenreaktoren wie folgt verwendet:

1. Reaktor Nr. 1 — Inkubation nur von Enzym

2. Reaktor Nr. 2 — Inkubation von

Polyäthylenimin,
Glutaraldehyd und Enzym

Zum Vergleich wurde ein dritter Einscheibenreaktor (Reaktor Nr. 3) hergestellt, indem eine Scheibe aus dem Material des Beispiels IA mit einem Durchmesser von 1,3 cm gebildet wurde und Polyäthylenimin, Glutaraldehyd und Enzym inkubiert wurden.

Jede mikroporöse Reaktorscheibe (nur Reaktoren Nr. 2 und 3), die zu der geeigneten Größe zugeschnitten worden war, wurde 30 Min. in 20 cm³ 5%igem Polyäthylenimin unter häufigem Schütteln zur Entfer-

nung von Luftblasen eingetaucht Die Teile wurden dann 30 Min. in einer 1 molaren Lösung von Natriumchlorid gewaschen, um Polyäthylenimin zu fixieren, und anschließend gründlich mit destilliertem Wasser gewasehen, um das gesamte Natriumchlorid aus den Reaktorscheiben zu entfernen. Dafür waren 4 Waschvorgänge erforderlich, jeder 10 Min. mit 50 ml. Die Reaktorscheiben wurden dann in 50 cm³ einer 10%igen wäßrigen Glutaraldehydlösung mit einem pH-Wert von

ίο 9 unter häufigem Bewegen, um ein gleichmäßiges Eindringen des Glutaraldehyds in die Scheiben sicherzustellen, eingetaucht Nach Inkubation von Glutaraldehyd wurden die Scheiben gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, wobei viermal mit je 50 ml Waschwasser 10 Min. gewaschen wurde. Glucoseoxidase (1270 Einheiten/ml) wurde bis auf 50/50 mit Phosphatpuffer (0,1 molar, pH 6) verdünnt Die erhaltene Lösung (50 cm³) wurde mit verdünnter Natronlauge auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und die Scheiben der Reaktoren 1,2 und 3 wurden 30 Min. in diese Lösung eingetaucht Nach der Inkubationsdauer von 30 Min. wurden die Reaktorscheiben entfernt und gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, um freies Enzym aus dem porösen Material zu entfernen, so daß nur das immobilisierte Enzym zurückbleibt.

Jeder der obigen drei Reaktoren wurde auf seine Aktivität bezüglich der Umwandlung von ß-D-Glucose in D-Gluconolacton untersucht, und die Wasserstoffperoxidkonzentration in dem Reaktorablauf wurde aufgezeichnet. Die Substratlösung (Ji-D-Glucose, 0,15 10,15 millimolar in O.lmolarem Kaliumphosphatpuffer, pH 6) wurde durch die Reaktoren mit variierenden Strömungsgeschwindigkeiten gepumpt, der Ablauf wurde aufgefangen und auf Wasserstoffperoxid untersucht, das sich gemäß der Gleichung

1/2 O₂ + H₂O +jS-D-Glucose

Glucoseoxidase H₂O, + D-Gluconolacton

bildet.

In die Analysatorküvette werden 25 ml der Peroxidaselösung (10 mg/5 ml in Kaliumphosphatpuffer pH 6) und 50 Mikroliter reduziertes-O-Dianisidin-Lösung (2% in Methanol) eingetragen. Die Küvette wird mit dem Reaktorablauf gefüllt, bewegt und auf die optische Dichte mit einem Spektrometer bei 460 nm gegenüber einer Blindprobe untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse werden nachfolgend summarisch wiedergegeben.

Reaktor Nr. 1

Die kleinste Enzymaktivität wurde von diesem Reaktor gezeigt. Die vorhandene Aktivität wurde leicht durch Auswaschen entfernt, wenn die Glucoselösung durch den Reaktor gepumpt wurde, was anzeigt, daß das Enzym nicht an das Mittel gebunden, sondern in den Poren enthalten war.

Reaktor Nr. 2

Dieser Reaktor zeigte eine gute Aktivität am ersten Tag und war weitgehend so aktiv wie die Kontrolle (Reaktor 3), wenn der Kieselsäuregehalt des Materials normal war. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 cnvVmin durch einen Bereich mit einem Durchmesser von 1 cm zeigte die Scheibe eine Aktivität von 0,65 Einheiten/g Material. Die Aktivität schien am zweiten Tag geringfügig abzufallen, doch wurde dieses nicht quantitativ bestimmt.

Reaktor Nr. 3

Dieser Reaktor zeigte eine gute Aktivität und behielt eine konstante Reaktionsgeschwindigkeit für beide Tage. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 cmVmin durch einen Bereich mit einem Durchmesser von 1 cm zeigte die Scheibe eine Aktivität von 1,8 Einheiten/g Material.

Die Aktivität des Reaktors 2 war etwa halb so groß wie die des Reaktors 3. Das Material des Reaktors 2 enthielt rund die Hälfte des Kieselsäurefüllstoffs des Reaktors 2. Dieses zeigt, daß der Füllstoffbestandteil (Kieselsäure) in dem mikroporösen Material das Hauptbindemittel für das immobilisierte Enzym darstellt, und nicht die umgebende Matrix, Hartkautschuk oder Polyvinylchlorid.

Claims

Patentansprüche:

1. Unlösliches zusammengesetztes System aus einem mikroporösen Körper, enthaltend ein Bindemittel auf Polymerisatbasis und eine proteinartige Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß das System im gesamten Bindemittel dispergierte feinteilige anorganische Füllstoffteilchen in einer Menge von mindestens 25% des Gesamtgewichts des mikroporösen Körpers enthält und ein Netzwerk von im wesentlichen miteinander verbundenen Mikroporen mit einer Größenverteilung von etwa 0,01 μπι bis etwa 100 μίτ», gemäß porosimetrischer Bestimmung mittels der Quecksilberintrusionsmethode, aufweist, wobei die Poren innerhalb des Bindemittels, zwischen Füllstoffteilchen und Bindemittel und zwischen benachbarten Füllstoffteilchen vorliegen, und die proteinartige Substanz an mindestens einen Teil der Füllstoffteiichen gebunden ist.

2. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es kieselsäurehaltige Füllstoffteilchen enthält.

3. System nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polyvinylchlorid-Bindemittel enthält.

4. System nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Hartkautschuk-Bindemittel enthält.

5. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinartige Substanz ein katalytisch aktives Enzym ist.

6. Verfahren zur Herstellung des unlöslichen zusammengesetzten Systems nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das katalytisch aktive Enzym an mindestens einen Teil der dispergierten Füllstoffteilchen durch ein Brückenbildungsmittel chemisch gebunden wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Brückenbildungsmittel kovalent an die Füllstoffteilchen gebunden wird und das katalytisch aktive Enzym kovalent an das Brückenbildungsmittel gebunden oder mit ihm vernetzt wird.

8. Verwendung des zusammengesetzten Systems nach Anspruch 5 für die enzymatische Umsetzung eines Substrats.