DE2661112C2

DE2661112C2 - Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen Trägers

Info

Publication number: DE2661112C2
Application number: DE19762661112
Authority: DE
Inventors: Gerard Quash; Jacques Grange
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1975-11-13
Filing date: 1976-11-12
Publication date: 1991-08-29
Anticipated expiration: 1996-11-13
Also published as: GB1571992A; SE8107631L; CH622269A5; SE7612482L; NL186656B; SE8107632L; JPS5929817B2; GB1571993A; US4217338A; US4419444A; NL186656C; DE2651680A1; JPS52104591A; NL7612680A; CA1083508A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen Trägers, der mindestens eine reaktive -NH-NH₂- Gruppe, Säurehydrazidgruppe oder eine Seitenkette mit einer -SH- und -NH₂-Gruppe enthält, durch Kondensation des Trägers mit einer Stickstoff enthaltenden Verbindung in Anwesenheit eines Kupplungsmittels. Der erfindungsgemäß hergestellte Träger ist für die Herstellung einer biologisch aktiven Verbindung, die ein Glykoprotein, ein Polysaccharid oder ein Glykolipid mit einem Zuckerrest und einen unlöslichen Träger enthält, geeignet.

Es ist bekannt, biologisch aktive Proteine, wie beispielsweise Hormone, Antigene und Enzyme, auf festen, unlöslichen Trägern zu fixieren, welche aus Latexkügelchen bestehen, die Seitenketten mit einer endständigen primären Aminogruppe tragen, durch Reaktion der aktiven Gruppen der Aminosäuren der Proteinkette mit den primären Aminogruppen des Trägers. Es wurde auch vorgeschlagen, in der soeben sehr kurz beschriebenen Weise fixierte Antigene als biologische Reaktionspartner zu verwenden, jedoch in Kombination mit Entwicklern.

Die soeben beschriebene Arbeitsweise ist insbesondere von R. S. Molday, W. J. Dreyer, A. Rembaum und S. P. S. Yen in "The Journal of Cell Biology", Bd. 64 (1975), 75-88, und von R. W. Lim, R. S. Molday, H. V. Huang und Shiado-Pin S. Yen in "Biochimica et Biophysica Acta" 394 (1975), 377-387, beschrieben; diese empfehlen die Fixierung von Antikörpern auf Latexkügelchen mittels Kupplung der Antikörper über ihre primären Aminogruppen mittels kovalenter Bindung an Latexkügelchen, auf denen zuvor Seitenketten mit endständigen primären Aminogruppen fixiert worden sind, die durch Einwirkung von Aktivatoren, wie Glutaraldehyd, Bromcyan und wasserlöslichem Carbodiimid, aktiviert worden sind.

Ein derartiges Verfahren zum Kuppeln von Proteinen mit Hilfe ihrer Aminosäuren hat jedoch den Nachteil, daß man für die Realisierung der Kupplung auf biologisch aktive Gruppen der Aminosäuren der Proteinkette zurückgreifen muß und deshalb in bestimmten Fällen die biologische Aktivität des fixierten Proteinmoleküls verringert wird. Außerdem führen die vor allem von R. S. Molday et al. empfohlenen Verfahren zu relativ wenig beständigen Kupplungen und zu relativ geringen Ausbeuten, wodurch ihre technische und wirtschaftliche Bedeutung weiter verringert wird.

In der Literaturstelle D. L. Robberson, N. Davidson: "Biochemistry", Bd. 11, Nr. 4, 1972, S. 533, wird die Kupplung von Ribonucleinsäure an Agarose beschrieben. Ribonucleinsäure enthält einen Zuckerrest, ist jedoch kein Glykoprotein, im Gegensatz zu den Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Anmeldung am Träger gekuppelt werden.

ε-Aminocapronsäuremethylester wird an Agarose gekuppelt, wobei die Kupplung über die Aminogruppe erfolgt. Es wird eine Iminbindung gebildet, da die Agarose zuerst mit Bromcyan umgesetzt wird. Man erhält einen Träger mit einer freien Estergruppe. Die Estergruppe wird durch Umsetzung mit Hydrazin in ein Hydrazid umgewandelt. Das Hydrazid wird mit der am 3′-Terminus oxidierten Ribonucleinsäure umgesetzt. Bei dieser Reaktion werden jedoch niedrige Ausbeuten erhalten.

In der Literaturstelle H. Grosjean et al.: "Biochemical and Biophysical Research Communication", Bd. 53, Nr. 3, 1973, Seite 882, 883, wird ein Verfahren beschrieben, bei dem eine Nucleinsäure an Biogel, welches zuvor mit Hydrazinhydrat umgesetzt wurde, gekuppelt wird. Das bei diesem Verfahren erhaltene Zwischenprodukt besitzt keine längeren Seitenketten, und das angekuppelte Material ist eine Nucleinsäure und nicht ein Glykoprotein.

Die DE-OS 19 15 970 betrifft die Verwendung verschiedener Träger (vgl. Ansprüche 5 und 6) zur Fixierung von Proteinen. Die beschriebenen Träger können zwar Seitenketten enthalten; Zwischenprodukte mit aktiver -NH-Gruppe in der Seitenkette werden nicht beschrieben. Die an die Träger gebundenen aktiven Produkte werden nicht über ihren Zuckerrest an den Träger gebunden.

Die US-PS 35 19 538 betrifft Träger, an die ein Silan-Kupplungsmittel mit aktiver Gruppe gekuppelt wird. Im Gegensatz zu diesen bekannten Trägern enthalten die erfindungsgemäß verwendeten Zwischenprodukte kein Silan-Kupplungsmittel.

Bei den aus der US-PS 35 19 538 bekannten Trägern wird der Siliciumteil des Kupplungsmittels an den Träger gebunden, und der organische Teil des Kupplungsmittels wird an das Enzym über Hydroxyl- oder Oxidgruppen gebunden. Es kann folgende Bindung entstehen:

Die Bindung des Enzyms erfolgt nicht über seinen Zuckerteil.

Die US-PS 38 53 987 betrifft Träger, an die einerseits Tracermaterialien und andererseits ein biologisch aktiver Antikörper gebunden ist. Gemäß dieser Druckschrift erfolgt die Bindung mit den biologisch aktiven Antikörpern über eine Amidbindung.

Die US-PS 38 57 931 betrifft die Bindung inerter Latexteilchen an diagnostisch wertvolle Reagentien, wie beispielsweise Antikörper, Hormone, Enzyme etc. Diese Verbindungen werden kovalent unter Bildung einer Amidbindung an die Latexteilchen gebunden. Es findet somit eine Peptidbindung zwischen den -COOH- Gruppen des Latex und den -NH₂-Gruppen der biologisch aktiven Materialien statt. Die Bindung über Seitenketten mit reaktiven Aminogruppen wird in dieser Literaturstelle nicht beschrieben.

In der AT-PS 3 17 425 wird die Bindung von Protein oder Peptiden an Polystyrolteilchen beschrieben. Die Träger tragen jedoch keine Seitenketten, und die Kupplung erfolgt am Aminosäurerest der Proteine.

In Chemical Abstracts, Bd. 79, 1973, Seite 52, Ref. 49 543z, wird die Freisetzung von Sialinsäure aus normalen und cancerogenen Zellen mittels Neuraminidase von Vibrio cholerae oder Influenza-Virus beschrieben; sie stellt somit den Stand der Technik auf diesem Gebiet dar.

In der DE-OS 25 18 352 werden spezifische Sorbentien für die Affinitätschromatographie von Enzymen beschrieben. Die Sorbentien werden durch Umsetzung von Hydroxyalkylacrylat-, Hydroxyalkylmethacrylat-, Alkylamid- oder Methacrylamid-Gelen mit Verbindungen, welche carboxyterminale oder aminoterminale Funktionsgruppen enthalten, aus der Gruppe von Diaminen oder von Aminosäuren oder Dicarboxylsäuren erhalten. Die erhaltenen Reaktionsprodukte werden mit Aminsäuren oder Peptiden kondensiert. Die erhaltenen Produkte enthalten als Endgruppen primäre Amingruppen. Würden diese Verbindungen zum Kuppeln von oxidierten Glykoproteinen verwendet, wäre eine zusätzliche Reduktionsstufe erforderlich, um die gebildete Iminbindung zu stabilisieren.

Die Erfindung hat sich daher das Ziel gesetzt, ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit Seitenketten, die mindestens eine reaktive, d. h. reaktionsfähige -NH-NH₂-Gruppe oder eine Säurehydrazidgruppe oder eine Seitenkette mit einer -SH- und einer -NH₂-Gruppe tragen, bereitzustellen, wobei der Träger für die chemische Fixierung von biologisch aktiven Proteinen verwendet werden kann. Die Fixierung von Proteinen soll nicht über die biologisch aktiven Gruppen der Aminosäuren der Proteinkette erfolgen. Proteine, wie Antikörper, Antigene und eine gewisse Anzahl von Hormonen und Enzymen, deren Fixierung mittels chemischer Kupplung auf Trägern im Stand der Technik bereits beschrieben worden ist, sind nämlich Glykoproteine, deren prosthetische Gruppe, d. h. der Zucker- bzw. Kohlenhydrat-Rest, in keiner Weise zur biologischen Aktivität beiträgt.

Es wurden nun überraschenderweise Träger gefunden, die zur chemischen Fixierung von organischen Verbindungen, die einen Zuckerrest enthalten, verwendet werden können, wobei keine der aktiven Gruppen der fixierten organischen Verbindung benötigt wird. Es wird eine sehr beständige Fixierung bewirkt mit zufriedenstellenden Ausbeuten, ohne daß die spezifische Aktivität der fixierten organischen Verbindung verringert, denaturiert oder inaktiviert wird. Die chemische Fixierung der Verbindung erfolgt über ihren Zuckerrest. Daher haben die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen einen breiteren Anwendungsbereich als die bisher in der Literatur beschriebenen Träger. Sie können zur Fixierung organischer Verbindungen, die biologisch aktiv oder von technischer Bedeutung sind, verwendet werden, vorausgesetzt, daß die organischen Verbindungen einen Zucker- bzw. Kohlenhydrat-Rest enthalten. Zu derartigen organischen Verbindungen, die einen Zucker- bzw. Kohlenhydrat-Rest enthalten, gehören die Glykoproteine, die Polysaccharide und die Glykolipide.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen Trägers, der mindestens eine reaktive -NH₂- Gruppe umfaßt, durch Kondensation des Trägers mit einer Stickstoff enthaltenden Verbindung in Anwesenheit eines Kupplungsmittels, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) in Anwesenheit eines geeigneten Kupplungsmittels einen unlöslichen Träger aus der Gruppe Latexkügelchen, Kügelchen aus Agarose- oder Dextrangel, aktivierte Glaskügelchen, carboxyliertes Polystyrol oder einem carboxylierten Copolymeren aus Styrol und Butadien, wobei der Träger Carboxylgruppen oder -NH₂-Gruppen enthält, mit einem Amin, Polyamin oder Cresylviolett oder basischem Fuchsin unter Bildung eines ersten Zwischenprodukts, welches mindestens eine reaktive -NH₂-Gruppe an einer Seitenkette enthält, umsetzt,
(b) das gemäß Stufe (a) erhaltene erste Zwischenprodukt an der reaktiven -NH₂-Gruppe mit einem Hydrazin oder einer Aminosäure in Anwesenheit eines geeigneten Kupplungsmittels unter Bildung eines zweiten Reaktionsproduktes umsetzt, welches mindestens eine reaktive -NH₂-Gruppe in einer Seitenkette enthält,

wobei

(i) als Amin bei der Stufe (a) Hexamethylendiamin oder Diaminopropan verwendet wird,
(ii) als Polyamin bei der Stufe (a) Spermidin, Spermin oder Diaminopropylamin verwendet wird,
(iii) als Hydrazin bei der Stufe (b) p-Hydrazinobenzoesäure oder Adipinsäuredihydrazid verwendet wird,
(iv) als Aminosäure bei der Stufe (b) eine Aminosäure, deren Carboxylgruppe mit einer N-Hydroxylsuccinimid-Gruppe verestert ist, oder eine Aminosäure, die gleichzeitig eine -SH- und eine -NH₂-Gruppe enthält, verwendet wird.

Der erfindungsgemäß hergestellte Träger ist zur chemischen Fixierung von organischen Verbindungen, die einen Zuckerrest enthalten, geeignet. Bei diesem Verfahren wird in einer ersten Stufe mindestens eine -CH₂OH-Gruppe des Zuckerrestes der organischen Verbindung durch Oxidation in eine -CHO-Gruppe überführt, und in der zweiten Stufe wird bzw. werden die erhaltene(n) -CHO-Gruppe(n) mit mindestens einer reaktiven -NH-NH₂-Gruppe, Säurehydrazidgruppe oder einer Seitenkette mit einer -SH- und -NH₂-Gruppe umgesetzt, wobei die chemische Fixierung der organischen Verbindung auf dem Träger bewirkt wird.

Erfindungsgemäß erhält man überraschend, wenn die Seitenketten mit einer -NH-NH₂-Gruppe enden, die mit der -CHO-Gruppe ein beständiges Hydrazon ausbilden, oder wenn die Seitenketten gleichzeitig eine -NH₂-Gruppe und eine -SH-Gruppe aufweisen, die mit der -CHO-Gruppe einen Heterocyclus ausbilden, der ein Thiazolidin-Ring ist, wenn sich die -SH-Gruppe in β-Stellung zur -NH₂-Gruppe befindet, stabile Verbindungen. Die erhaltenen stabilen Produkte müssen nicht reduziert werden, wie beispielsweise mit Borhydriden oder substituierten Borhydriden. Die Vermeidung der Reduktion ist von großem Vorteil, da dadurch die funktionelle Integrität von beispielsweise irgendwelchen -S-S-Bindungen, die im Glykoprotein vorhanden sein können, erhalten bleibt. Durch die Vermeidung der Reduktion wird die Gefahr der Denaturierung der Glykoproteine verhindert.

Die chemische Fixierung von Verbindungen mit einem Zuckerrest auf festen, unlöslichen, erfindungsgemäß hergestellten Trägern mit Seitenketten, die mindestens eine reaktive Gruppe enthalten, führt zu Kupplungsprodukten, die vor allem als biologische Reaktionspartner brauchbar sind oder als Katalysatoren bei zahlreichen biochemischen und biologischen Reaktionen verwendet werden können.

Es können zahlreiche biologische Reaktionspartner hergestellt werden, die sich durch ihre ausgezeichnete Stabilität bzw. Beständigkeit und ihre große Empfindlichkeit auszeichnen.

Es wurde überraschend gefunden, daß die Reaktionsfähigkeit und die Stabilität bzw. Beständigkeit der erfindungsgemäß erhaltenen Kupplungsprodukte um so größer sind, wenn die organische Verbindung über eine ausreichend lange Seitenkette mit dem Träger gekuppelt wird und die diagnostischen Reaktionspartner in Form der Kupplungsprodukte Empfindlichkeits- und Genauigkeitseigenschaften aufweisen, die die diagnostischen Reaktionspartner vom gleichen Typ nach dem Stand der Technik nicht aufweisen.

Als Aminosäure wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei der Stufe (b) eine Aminosäure verwendet, die gleichzeitig eine -SH- und eine -NH₂-Gruppe enthält. Cystein der folgenden Formel:

wird bevorzugt verwendet.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform hat der feste, unlösliche Träger Hexamethylendiamin-(HMD-)Ketten, die über ihre reaktive -NH₂-Gruppe mit Adipinsäure-dihydrazid oder p-Hydrazinobenzoesäure gekuppelt sind.

Gemäß einer anderen besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist der feste, unlösliche Träger Ketten aus Spermidin, Diaminopropylamin und Spermin auf, die über ihre reaktive -NH₂-Gruppe mit Adipinsäure-dihydrazid oder p-Hydrazinobenzoesäure gekuppelt sind.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trägers weist der feste, unlösliche Träger Seitenketten auf, die mit einer Aminosäure enden, die eine -SH-Gruppe trägt, wie beispielsweise Cystein.

Erfindungsgemäß verwendet man vorteilhafterweise als Kupplungsmittel Glutaraldehyd oder ein vollständig oder teilweise wasserlösliches Carbodiimid der allgemeinen Formel:

R-N=C=N-R

in der R für einen Alkylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen steht, insbesondere für einen Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, sek.-Butyl, tert.-Butyl-, Isobutyl-, Amyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl- oder Dodecylrest; oder für einen Cycloalkylrest mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen; für einen Monoaryl-substituierten niederen Alkylrest, wie beispielsweise einen Benzyl- oder α- oder β-Phenylethylrest; für einen Monoarylrest, wie beispielsweise einen Phenyl-, Morpholino- oder Piperidylrest; für einen durch einen Morpholinylrest substituierten niederen Alkylrest, wie beispielsweise einen Ethylmorpholinylrest; für einen durch einen Piperidylrest substituierten niederen Alkylrest, wie beispielsweise einen Ethylpiperidylrest; für einen niederen Dialkylaminorest; für einen durch einen Pyridylrest substituierten niederen Alkylrest, wie beispielsweise einen α-, β- oder γ-Methyl- oder Ethylpyridylrest; für deren Additionssalze mit Säuren und deren quaternären Ammoniumsalzen, steht, wobei die beiden Substituenten R gleich oder verschieden sein können.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Reaktion der kovalenten Fixierung der Seitenketten auf den Träger in einem Puffer durchgeführt, der keine -NH₂-Gruppen enthält und frei ist von agglutinierenden Eigenschaften, wobei der pH-Wert 6,0 bis 8,8 beträgt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens folgt auf die Reaktion der kovalenten Fixierung eine Dialyse gegen den gleichen Puffer, wie er für die Fixierungsreaktion verwendet worden ist.

Erfindungsgemäß können bei der Stufe (a) Cresylviolett oder basisches Fuchsin verwendet werden. Man erhält auf diese Weise gefärbte biologische Reaktionspartner, die die immunologischen Reaktionen - insbesondere mit Antigenen oder Antikörpern - durch direkte Reaktion sichtbar machen, vor allem bei den Agglutinationsreaktionen, ohne daß von nun an von den roten Blutkörperchen Gebrauch gemacht werden muß; die Ablesung der Ergebnisse der Agglutinationsreaktion wird auf diese Weise sehr erleichtert.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:

Polystyrol A = kugeliges und kalibriertes, carboxyliertes Polystyrol mit einem Durchmesser von 0,22 µm, das freie -COOH-Gruppen trägt,
HMD = Hexamethylendiamin,
Polystyrol-A-HMD = Träger aus Polystyrol A und Hexamethylendiamin,
Polystyrol-A-Spermin = Träger aus Polystyrol A und Spermin,
Polystyrol B = carboxyliertes Polystyrol, das von einem anderen Lieferanten als das Polystyrol A stammt,
Polystyrol-A-HMD-p- Hydrazinobenzoat = Träger aus Polystyrol A, HMD und p-Hydrazinobenzoesäure.

Beispiel 1 Herstellung eines Trägers, der Seitenketten aus Hexamethylendiaminen trägt

Zu 12 mg Polystyrol A, das in einem Borat-Puffer der Zusammensetzung 0,14 m NaCl-0,01 m Borat-HCl, pH 8,1 (BBS), suspendiert war, wurden 80 µmol Hexamethylendiamin (HMD) gegeben. Das Gemisch wurde bei 20°C während 3 Stunden in Gegenwart von 0,02 m 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) gerührt. Nach dieser Zeit wurde die Suspension gegen den Puffer BBS dialysiert, bis der Sauerstoffbedarf DO bei 230 nm 0 betrug. Man erhielt einen Träger aus carboxyliertem Polystyrol-Hexamethylendiamin (Polystyrol-A-HMD).

Beispiel 2 Herstellung eines Trägers mit Seitenketten aus Spermin

Es wurde wie im Beispiel 1 verfahren, mit der Abwandlung, daß HMD durch Spermin ersetzt wurde. Das erhaltene Produkt wurde als Polystyrol-A-Spermin bezeichnet.

Beispiel 3 Fixierung von Cresylviolett

Zu 10 mg Polystyrol A, suspendiert in 5 ml 0,14 m NaCl-0,01 m Borat-HCl, pH 8,1 (BBS), wurde eine Lösung von Cresylviolett gegeben, die durch Filtration einer mit Ultraschall behandelten Suspension von 20 mg Cresylviolett über ein Filter "Millipore" 0,22 µm erhalten worden war. Das Gemisch wurde 12 Stunden bei 20°C in Gegenwart von 0,05 m 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid-hydrochlorid (EDC) gerührt. Danach wurde erneut EDC zugegeben und weitere 12 Stunden gerührt.

Danach wurde die Suspension bei 20 000 g während 1 Stunde zentrifugiert und der Rückstand in einem 0,01 m Acetat-Puffer vom pH 5,5 aufgenommen und erneut zentrifugiert, um das überschüssige Cresylviolett zu entfernen. Diese Maßnahme wurde wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit klar war. Darauf wurde das Acetat durch Bildung des Hydrochlorids durch dreimal aufeinanderfolgendes Waschen mit 0,1 n HCl entfernt, worauf zweimal mit 0,1 n NaOH gewaschen wurde, um die Aminogruppen zu regenerieren, und schließlich zweimal mit BBS, pH 8,8, gewaschen wurde, um die überschüssige NaOH zu entfernen.

Das erhaltene Produkt wurde in einem 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 7, aufbewahrt.

Beispiel 4 Fixierung von basischem Fuchsin

Es wurde wie im Beispiel 3 verfahren, jedoch anstelle von 20 mg Cresylviolett wurden 2 ml einer gesättigten Lösung von basischem Fuchsin zugegeben.

Beispiel 5

Die in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Kupplungsreaktionen mit Polystyrol A wurden auch mit Kügelchen aus carboxyliertem Polystyrol B eines anderen Lieferanten ausgeführt, wobei die Modalitäten beim Kuppeln der Seitenketten auf diese Kügelchen unter Berücksichtigung der Anzahl verfügbarer -COOH-Gruppen bei diesen Kügelchen gegenüber den Polystyrol- A-Kügelchen entsprechend angepaßt wurden.

Zu 180 mg Polystyrol-B-Kügelchen wurden 560 mg Hexamethylendiamin (HMD) in 20 ml 0,14 m NaCl-0,01 m Borat-HCl, pH 8,1, gegeben. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) wurde in zwei aufeinanderfolgenden Zugaben bis zur Endkonzentration von 0,05 m zugegeben. Nach Rühren bei 4°C während 18 Stunden wurden die Kügelchen gewaschen durch dreimaliges aufeinanderfolgendes Zentrifugieren bei 20 000 g während 30 Minuten mit dem gleichen Puffer und schließlich in 13 ml Phosphat-Puffer, 0,1 m, pH 6, suspendiert.

Beispiel 6 Fixierung einer Seitenkette aus HMD auf Glaskügelchen

Zu 1 g Glaskügelchen mit freien -COOH-Gruppen (Porendurchmesser 55 nm, Durchmesser 177-840 µm) wurden 5 ml eines 0,1 m Phosphat-Puffers vom pH 7,0 gegeben und die Suspension im Vakuum entgast. Es wurden 50 µmol HMD, gelöst im gleichen Puffer, zugegeben und das Gemisch bei 4°C während 18 Stunden in Gegenwart von 0,05 m EDC leicht gerührt. Darauf wurden die Glaskügelchen mit dem Phosphat-Puffer gewaschen.

Die endständigen -NH₂-Gruppen der auf den Glaskügelchen fixierten Seitenketten aus HMD wurden mit einem Hydrazin gekuppelt unter Anwendung der im nachfolgenden Beispiel 11 beschriebenen Arbeitsweise im Falle eines aliphatischen Hydrazins oder der im nachfolgenden Beispiel 9 beschriebenen Arbeitsweise im Falle eines aromatischen Hydrazins.

Beispiel 7 Fixierung eines Polyamins an eine Seitenkette mit endständiger N-Hydroxylsuccinimid-Gruppe auf Glaskügelchen

Es wurden 2 g Glaskügelchen verwendet, die im Handel unter der Bezeichnung "CPG/N-OH-Succinimid" erhältlich sind und durch die Formel:

wiedergegeben werden, suspendiert in 10 ml Puffer BBS, pH 8,2, und im Vakuum entgast und mit 40 µmol Spermin versetzt. Das Gemisch wurde während 18 Stunden bei 4°C leicht gerührt und dann mit Puffer BBS gewaschen, um die Reaktionsprodukte zu entfernen.

Die endständigen -NH₂-Gruppen der Polyaminreste wurden mit aliphatischen oder aromatischen Hydrazinen entsprechend den in den nachfolgenden Beispielen 11 und 9 beschriebenen Arbeitsweisen gekuppelt.

Beispiel 8 Herstellung eines Trägers aus "Polystyrol-A-HMD-p-Hydrazinobenzoat

4 mg Polystyrol-A-HMD mit einem Durchmesser von 0,22 µm wurden in 2 ml Borat-Puffer, enthaltend 0,14 m NaCl und 0,01 m Borat-HCl, pH 8,8, suspendiert. Die Suspension wurde mit 22 µmol p-Hydrazinobenzoesäure, gelöst in BBS, versetzt. Das Volumen wurde mit BBS auf 4 ml eingestellt. Nach Zugabe von 10 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid wurde das Reagensglas bei Raumtemperatur des Laboratoriums (20°C) während 2 Stunden geschüttelt. Sein Inhalt wurde dann in einen Dialysesack überführt und bei der Temperatur des Laboratoriums während 24 Stunden gegen 300 ml BBS (drei Wechsel) dialysiert. Man erhielt auf diese Weise einen Träger aus Polystyrol-A-HMD-p-Hydrazinobenzoat.

Beispiel 9

Zu 7 mg Polystyrol A-Spermin, hergestellt gemäß obigem Beispiel 2, der Formel:

suspendiert in 15 ml Puffer BBS, pH 8,1, wurden 100 µmol p-Hydrazinobenzoesäure in wäßriger Lösung gegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur (etwa 20°C) in Gegenwart von 0,05 m EDC gerührt. Anschließend wurde die Suspension gegen den Puffer BBS, pH 8,8, dialysiert, bis der DO bei 230 nm gleich 0 war.

Beispiel 10 Fixierung von aromatischem Hydrazin

Zu 10 mg Polystyrol-A-HMD, hergestellt gemäß Beispiel 1 oder 5, suspendiert in 10 ml 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 7, wurden 50 µmol p-Hydrazinobenzoesäure, gelöst in 0,1 m Borat-Puffer, pH 8, gegeben. Das Gemisch wurde bei 20°C während 12 Stunden in Gegenwart von 0,05 m EDC gerührt. Anschließend wurde erneut EDC zugegeben und weitere 12 Stunden gerührt. Darauf wurde die Suspension mit 20 000 g während einer Stunde zentrifugiert und der Rückstand in 0,1 m Borat-Puffer, pH 8,1, aufgenommen und erneut zentrifugiert, um die nichtgekuppelte p-Hydrazinobenzoesäure zu entfernen. Auf diese Wäsche folgten zwei weitere Wäschen mit Borat-Puffer 0,01 m, pH 8,1, und dann zwei Wäschen mit Phosphat-Puffer 0,1 m, pH 7. Das erhaltene Produkt wurde in diesem letzteren Puffer aufbewahrt.

Beispiel 11

6,0 mg Polystyrol-A-HMD, hergestellt gemäß Beispiel 1, der Formel:

suspendiert in 0,1 m Phosphat-Puffer vom pH 7, wurden bei 20°C während 1 Stunde in Gegenwart von Glutaraldehyd, Endkonzentration 1,25%, gerührt. Anschließend wurde die Suspension gegen 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 7,0, während 18 Stunden dialysiert. Die dialysierte Suspension wurde mit 20 µmol Adipinsäuredihydrazid in wäßriger Lösung versetzt. Das Gemisch wurde während 16 Stunden bei 20°C gerührt und dann dialysiert, um das überschüssige Adipinsäuredihydrazid zu entfernen.

Beispiel 12 Fixierung einer Aminosäure mit -SH-Gruppe auf einem unlöslichen Träger, der freie -NH₂-Gruppen aufweist

Zu 2 mg Polystyrol-A-HMD, hergestellt gemäß obigem Beispiel 1, suspendiert in Phosphat-Puffer, pH 6,5, wurden 6 µmol Cysteinhydrochlorid der Formel:

HSCH₂CHNH₂COOH · HCl

gelöst in Wasser gegeben. Das Gemisch wurde bei 20°C während 16 Stunden gerührt in Gegenwart von 0,05 m EDC. Dann wurden die Polystyrol-A-Kügelchen mit darauf fixiertem Cystein auf einem Filter Millipore 0,22 µm gewaschen, um das überschüssige Cystein und die Reaktions-Nebenprodukte zu entfernen. Die auf diese Weise modifizierten Kügelchen wurden erneut in 2 ml Phosphat-Puffer, pH 6,5, suspendiert.

Beispiel 13 Fixierung von Cystein auf carboxyliertem Polystyrol-B-HMD

Zu der in Beispiel 5 erhaltenen Suspension von carboxyliertem Polystyrol-B-HMD wurden 18 mg Cystein-HCl, gelöst in 2 ml Phosphat-Puffer 0,1 m, pH 6, gegeben und dann EDC bis zu einer Endkonzentration von 0,05 m zugegeben. Nach 18 Stunden bei 4°C wurden die Kügelchen gewaschen, wie im Beispiel 5 beschrieben.

Beispiel 14 Nachweis der entscheidenden Rolle der freien -CHO-Gruppen von Globulinen bei deren Fixierung auf einem unlöslichen Träger

Gammaglobuline wurden, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, oxidiert, jedoch vorreduziert in Gegenwart von NaB³H₄, um mit Tritium markiert zu sein und keine freien -CHO-Gruppen zu enthalten. Gleiche Anteile von jeweils 0,3 ml dieser Gammaglobuline, enthaltend 8400 cpm, wurden mit den in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Proben in Gegenwart des 1,0 m Phosphat-Puffers, pH 6,0, in Berührung gebracht. Nach 16 Stunden bei 4°C wurden die Proben auf Millipore- Filter 0,22 µm abfiltriert und viermal mit 5 ml des folgenden Puffers gewaschen:

0,1% Rinderserumalbumin (SAB),
0,1% Triton X 100,
0,14m NaCl, 0,01m Borat-HCl, pH 8,8.

Aus den in der Tabelle zusammengestellten Resultaten ergibt sich, daß:

1) eine gewisse Menge Radioaktivität auf dem Filter zurückgehalten wird;
2) durch Waschen mit dem obigen Puffer die Adsorption auf den Filtern selbst beträchtlich verringert wird; in diesem Falle macht die auf Gammaglobuline + Puffer alleine zurückzuführende Adsorption auf den Filtern etwa 20% der Gesamtradioaktivität der auf den Filter aufgebrachten aliquoten Menge (1680 cpm) aus;
3) die auf dem Filter zurückgehaltene Menge an Radioaktivität wird in Gegenwart der Probe B), der Probe C) oder der Probe D) nicht wesentlich gesteigert. Die Werte sind nämlich gleich oder niedriger als die Ergebnisse, die mit dem Puffer alleine (319 cpm) erhalten werden. Es findet somit keine Adsorption von Gammaglobulinen auf den drei verwendeten Proben B), C) und D) statt. Außerdem muß - damit diese Filtrationstechnik signifikant ist - die an die unlöslichen Träger in Gegenwart der oxidierten Gammaglobuline gekuppelte Radioaktivität die 20% übersteigen, die bei den nichtoxidierten Gammaglobulinen gefunden wurden.

Vergleich der Radioaktivitätsmenge, kombiniert mit der Probe C), mit oxidierten und nichtoxidierten Gammaglobulinen nach Reduktion mit NaB³H₄

Nach einer Kontakt- bzw. Berührungszeit von 18 Stunden bei 4°C wurde jeder Sackinhalt während 5 Tagen gegen BBS, pH 8,8, dialysiert mit drei oder vier Wechseln pro Tag, bis die Dialyseflüssigkeit keine Radioaktivität mehr enthielt. Ein aliquoter Anteil jedes Präparats wurde dann über Millipore- Filter 0,22 µm filtriert und mit dem Puffer 0,1% SAB, 0,1% Triton X 100, BBS pH 8,8 gewaschen.

Bei einem anderen aliquoten Anteil wurde die optische Dichte bei 550 nm gemessen, um die Konzentration an Polystyrol A zu bestimmen.

Probe
cpm/mg
Probe C) -Gammaglobulin, oxidiert
62.466
Probe C) -Gammaglobulin, nichtoxidiert	11.135

Die mit der Probe C) in Gegenwart von nichtoxidierten Gammaglobulinen gefundene Radioaktivität macht lediglich 17,8% derjenigen aus, die kombiniert mit der Probe C) in Gegenwart von oxidierten Gammaglobulinen gefunden wurde. Dieser Wert ist von der gleichen Größenordnung wie derjenige bei der Adsorption von Gammaglobulinen auf dem Filter in Abwesenheit von Polystyrol A.

Demgegenüber nimmt bei den oxidierten Gammaglobulinen die mit der Probe C) kombinierte Radioaktivität um das 5fache zu.

Es folgen zwei Beispiele für die Oxidation einer -CH₂OH- Gruppe, einer Verbindung, die einen Zuckerrest enthält, zu einer -CHO-Gruppe.

Beispiel 15 Chemische Oxidation von Gammaglobulinen

Gammaglobuline von der Ziege, vom Kaninchen und vom Pferd wurden durch Ausfällung mittels (NH₄)₂SO₄ und anschließende Chromatographie über DEAE-Cellulose gereinigt.

Zu 60 mg Immuno-Gammaglobulinen vom Pferd, die Antikörper enthielten, gelöst in 2 ml 0,1m Phosphat-Puffer, pH 6, wurden 0,2 ml 0,15m NaIO₄, gelöst in Wasser, gegeben.

Das Gemisch wurde bei 4°C unter Lichtausschluß während 3 Stunden stehengelassen und dann gegen den Puffer 0,14m NaCl-0,1m PO₄, pH 6, während 1 Stunde mit drei Wechseln dialysiert. Bei diesem pH-Wert ist das Risiko der Ausbildung von Schiffschen Brücken zwischen den reaktiven Aldehydgruppen, erhalten durch Oxidation mit NaIO₄, und den -NH₂-Gruppen des Lysins oder der endständigen Gruppen der Proteine verringert.

Beispiel 16 Chemische Oxidation von Anti-Gammaglobulin-Antikörpern

Zu 450 µg Gammaglobulinen der Ziege gegen Kaninchen in 0,1 ml BBS wurden 0,1 ml NaIO₄, 0,03m, gegeben. Das Gemisch wurde bei 4°C während 3 Stunden unter Lichtausschluß gehalten und dann gegen BBS während 2 Stunden mit drei Wechseln des Puffers dialysiert.

Beispiel 17 Beispiel einer Kupplung auf einem Hydrazin Herstellung eines Reaktionspartners Polystyrol-A-HMD-p- Hydrazinobenzoat-Antikörper-anti-IgG

Es wurde Polystyrol-A-Antikörper-anti-IgG vom Kaninchen hergestellt, der ein Modell für die Verwendung von freien Antikörpern in Lösung darstellt. Das endgültige Präparat besitzt ein sehr großes Verwendungsspektrum, weil es auf indirektem Wege den Nachweis aller immunologischen Reaktionen ermöglicht, bei denen Kaninchen-IgG verwendet wird, im Hinblick auf ihre Sichtbarmachung durch die indirekte Methode.

0,1 ml der im Beispiel 15 erhaltenen Lösung von oxidierten Gammaglobulinen (260 µg) wurden anschließend zu 1,7 mg Polystyrol- A-HMD-p-Hydrazinobenzoat, hergestellt gemäß Beispiel 8, gegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 4°C gerührt.

Zur Herstellung eines Reaktionspartners unter Verwendung der Antipolyamin-Antikörper, die sonst zur Auffindung und Analyse von Polyaminen im Blut von Kranken verwendet werden, wurden diese Antikörper mittels Substrat-Affinitätschromatographie auf Spermin enthaltende Glasträger fixiert und dann mit einer 0,06m Lösung von NaIO₄ oxidiert. Nach 30 Minuten bei 4°C im Dunkeln wurden die Antikörper in BBS, pH 8,8, gewaschen, um überschüssiges NaIO₄ zu entfernen.

Nach der beschriebenen Behandlung wurden die Polystyrol-A-Kügelchen, die die Antikörper enthalten, gewaschen und mittels Sedimentation auf eine 60%ige Saccharoseschicht durch eine 10%ige Saccharose-Lösung (100 000 g, 1 Stunde bei 4°C) konzentriert. Das an der Interphase konzentrierte Polystyrol A wurde dialysiert, um überschüssige Saccharose zu entfernen.

Beispiel 18 Beispiel für eine Kupplung an eine endständige -SH-Gruppe Kupplung eines unlöslichen Trägers mit freien endständigen -SH-Gruppen an -CHO-Gruppen von oxidierten Gammaglobulinen

Zu 2 mg Polystyrol-A-SH, hergestellt gemäß Beispiel 12, wurden 1 mg oxidierte Gammaglobuline, wie im Beispiel 15 erhalten, gegeben. Nach 30 Minuten Kontakt bei 4°C wurde die Ausflockung von Polystyrol-A-SH-Teilchen durch Bildung von Thiazolidinen beobachtet. Diese Ausflockung erfolgte weder bei Polystyrol-A-HMD noch bei Polystyrol-A-SH mit daran fixierten, nichtoxidierten Gammaglobulinen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen Trägers, der mindestens eine reaktive -NH₂-Gruppe umfaßt, durch Kondensation des Trägers mit einer Stickstoff enthaltenden Verbindung in Anwesenheit eines Kupplungsmittels, dadurch gekennzeichnet, daß man

wobei

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäure, die gleichzeitig eine -SH- und eine -NH₂-Gruppe enthält, Cystein oder eines seiner Homologen verwendet wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalente Fixierung der Seitenketten auf dem Träger in einem Puffer vom pH-Wert 6,0 bis 8,8 bewirkt wird, der frei ist von agglutinierenden Eigenschaften und keine freien -NH₂-Gruppen enthält.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in Form von Kügelchen oder Mikrokügelchen vorliegt.