DE2733273B2

DE2733273B2 - Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2733273B2
Application number: DE2733273A
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Tokio Ando; Shukuko Ikawa; Tetsuo Tokio Kin; Takehiko Shibata; Saitama Wako
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1976-07-23
Filing date: 1977-07-22
Publication date: 1979-01-25
Also published as: DE2733273C3; JPS5622512B2; DK145951B; US4161424A; JPS5315491A; DK145951C; DK333977A; DE2733273A1

Description

Desoxyribonucleinsäure (DNA) spaltende Enzyme (DNasen) sind an wichtigen Lebensvorgängen beteiligt beispielsweise am Stoffwechsel, an der Spaltung, Synthese und Substitution von DNA. Sie werden je nach ihrer Funktion grob in Exonucleasen und Endonucleasen eingeteilt Enzyme der erstgenannten Art wirken auf das Ende der Polynucleotidkette des DNA-Moleküls ein und bewirken nach und nach eine Freisetzung von Nucleotiden. Enzyme der letztgenannten Art bilden DNA-Bruchstücke oder Oligonucleotide, indem sie die Phosphodiesterbindung im DNA-Molekül spalten.

In den letzten jähren wurden bei der Untersuchung von Endonucleasen große Fortschritte erzielt Neben zahlreichen Enzymen mit biologisch wichtigen Funktionen wurde einer speziellen Gruppe auf Grund ihrer enzymatisch-chemischen Eigenschaften besondere Aufmerksamkeit geschenkt. Diese Enzyme, sogenannte »Restriktionsnucleasen«, weisen eine hohe Spezifität für bestimmte Nucleotidfolgen in der DNA auf und sind in ihrer Wirksamkeit von natürlichen oder künstlichen strukturellen Veränderungen (Modifikationen) an der DNA abhängig. Die Restriktionsnucleasen spielen eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der Struktur und Funktion von DNA, wie auch beim molekularen Klonieren von DNA-Sequenzen unterschiedlicher Herkunft.

Aufgrund umfangreicher Untersuchungen wurden Verfahren zur Herstellung von Enzymen aus Kulturen von Aspergillus oryzae entwickelt. Diese Enzyme wirken nicht auf doppelstrangige DNA, sondern spalten spezifisch einstrangige DNA; vgl. JP-PS 5 93 368.

Aus der JP-PS 6 21205 ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen aus dem Pilz Aspergillus oryzae bekannt, die bevorzugt Purin-Purin-Bindungen spalten. Die JP-PS 7 64 919 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen, die eine begrenzte Anzahl von eir.strangigen Unterbrechiingsstellen in doppelstrangige DNA einführen. Diese Enzyme werden aus mit Bakteriophagen infizierten Escherichia coli erhalten. Ferner ist ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das RNA zu Nucleosid-23-cyclo-phosphat hydrolysiert, aus Escherichia coli, das durch Bakteriophagen infiziert oder induziert ist bekannt; vgl. japanische Patentanmeldung 78 869/1972 und JP-OS 35 577/1974. Aus der japanischen Patentanmeldung 1 14 131/1973 sowie der JP-OS 64 484/1975 und der DE-OS 24 48 343 ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen bekannt, die bevorzugt Guanin-Guanin-Bindungen im DNA-Molekül spalten. Diese Enzyme werden aus Kulturflüssigkeiten von alkalophilen Bakterien gewonnen. Schließlich ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen bekannt, die spezifisch die RNA-Anteile von DNA-RNA-Hybriden spalten. Diese Enzyme werden aus Zellen von Bacillus subtilis gewonnen; vgl. japanische Patentanmeldung 1 27 276/ 1974.

Im Verlauf der Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurde eine Reihe von durch verschiedene Mikroorganismen gebildeten neuen Enzymen untersucht. Dabei wurden Enzyme isoliert, die das DNA-Molekül an spezifischen Stellen erkennen und — in Abhängigkeit von der vorhandenen Modifikation —

spalten, sogenannte »Restriktionsnucleasen (Endonucleasen R)<c Diese Enzyme werden aus Zellen von aeroben. Sporen bildenden Stämmen der Gattung Bacillus gewonnen. Diese Enzyme sind in der Lage, DNA-Fragmente von bestimmter Größe zu bilden.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert

Bacillus pumillus ist bei der landwirtschaftlichen Fakultät der Universität Hokkaido (Nishi-9-chome, Kita-9-jo, Sapporo City, Hokkaido, Japan) unter der Hinterlegungsnummer AHUl 387 (vgl. J FCC-Ca talogue of Culture 1966) ohne Einschränkungen hinterlegt

Bei der American Type Culture Collection (ATCC; 12 301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20 852) sind unter den Hinterlegungsnummern ATCC 6051 und 6633 Stämme von Bacillus subtilis, ferner der Stamm Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23 350, der Stamm Bacillus cereus ATCC 14 579, der Stamm Bacillus cereus Rf sm st ATCC 31 293, der Stamm Bacillus sp. Nr. 170 ATCC 31 292 und der Stamm Bacillus megaterium B 205-3 ATCC 31 294 hinterlegt. Die drei letztgenannten Stämme sind ferner beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science und Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, unter den Nummern FERMP 3640, FERM-P 3221 und FERM-P 3641 hinterlegt.

Nachstehend sind die mikrobiologischen Eigenschaften der Stämme Bacillus sp. Nr. 170 ATCC 31292, Bacillus cereus RFsmst ATCC 31293 und Bacillus megaterium B 205-3 ATCC 31 294 beschrieben.

Die einzelnen Untersuchungen wurden gemäO R. E. Gordon, W. C. Haymes und CHN. Pang, »The Genus Bacillus«, U.S. Dept. Agr., 197 3 und »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 1974, durchgeführt.

(1) Mikrobiologische Eigenschaften von
Bacillus sp. Nr. 170

(A) Morphologie

Der Stamm weist eine stabartige Monokokken- oder Streptokokkengestalt der Abmessungen (1,0 bis 1,2) χ (3,0 bis 5,0) ιτιμ auf. Er hat peritriche Flagella und ist beweglich. Der Stamm ist grampositiv und säurestabil. Der Stamm weist keinen Pleomorphismus auf und bildet ovale Sporen. Zur Beobachtung der morphologischen Eigenschaften wird folgendes Nährmedium verwendet:

Pepton

Fleischextrakt

NaCi

Agar

pH-Wert

10 g/Liter
10 g/Liter

5 g/Liter
15g/Lit?r

7,2

(B) Wachstum auf verschiedenen Medien

1) Bouillon-Agar-Plattenkultur:

Die Kolonie ist kreisförmig und bildet eine flache Kammlinie. Die Randkante ist wellenförmig. Die Oberfläche der Kolonien ist glatt und weiß. Im Nährmedium bildet sich kein Pigment.

2) Bouillon-Agar-Ausstrichkultur:

Das Wachstum verläuft mittelmäßig unter Streuung. Die Oberfläche ist glatt und weiß. Im Nährmedium bildet sich kein Pigment.

3) Flüssiges Bouillon-Medium:

Die Oberfläche des Nährmediums ist membranartig. Es bildet sich ein Niederschlag.

4) Bouillon-Gelatine-Stichkultur:
> Gelatine wird verflüssigt.

5) Lackmus-Milch:

Die Lackmus-Farbe verschwindet und es tritt Peptonisierung ein.

(C) Biologische Eigenschaften

1) Nitratreduktion: positiv

2) Denitrifikation: negativ

3) M R-Test: positiv
4) VP-Test: positiv

5) Indolbildung: negativ

6) Schwefelwasserstoffbildung: negativ

7) Stärkehydrolyse: positiv

8) Verwertung von Citronensäure:

j(i Der Stamm wächst auf Christensen-Medium; zeigt

aber auf Koser-Medium kein Wachstum.

9) Verwertung von anorganischem Stickstoff:

Der Stamm wächst unter Verwertung von Ammoniumsalzen.
_.-, 10) Pigmentbildung: negativ

11) Urecse: negativ

12) Oxidase: positiv
1 i) Katalase: positiv

14) Wachstumsbedingungen:
in pH-Optimum: 7 bis IO

Temperaturoptimum: 30bis 37^aC
1 5) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob

16) O-F-Test:

Der Stamm bildet sowohl aerob als auch anaerob c, Säure.

17) Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Der Stamm bildet sowohl aerob als auch anaerob aus D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Glycerin und Stärke Säuren. in Eine Gasbildung wird bei keinem dieser Saccharide

beobachtet. Eine Bildung von Säure oder Gas tritt bei L-Arabinose, D-Xylose, D-Galactose, Lactose, Raffinose, D-Sorbit, D-Mannit und Inosit nicht auf.

18) Salzbeständigkeit:

Der Stamm wächst in Gegenwart von NaCl bis zu einer Konzentration von 7,5 Prozent.

19) Caseinhydrolyse: positiv

20) Phenylalanin-Desaminase: negativ

-,o Aufgrund der vorstehend geschilderten mikrobiologischen Eigenschaften läßt sich der Stamm Bacillus sp. Nr. 170 (nachstehend kurz als Stamm Nr. 170 bezeichnet) unter Berücksichtigung der vorstehenden Literaturstellen in die Gattung Bacillus einordnen. Ein Vergleich von

-,-, Stamm Nr. 170 mit anderen Stämmen der Gattung Bacillus ergibt, daß er Ähnlichkeiten mit Bacillus cereus aufweist, sich aber insoweit deutlich von Bacillus cereus unterscheidet, daß er unter alkalischen Bedingungen ein gutes Wachstum zeigt, während der bekannte Stamm

bo einen Wachstums-pH-Bereich von 5 bis 8 aufweist.

Wie nachstehend erläutert, weist der Stamm Nr. 170 in alkalischen Nährmedien eine maximale Penicillinase-Büdung auf, worin er sich offensichtlich von Bacillus cereus unterscheidet, da dieser Penicillinase in neutralen Nährmedien bildet.

Demzufolge läßt sich der Stamm Nr. 170 keinem der bekannten Stämme zuordnen und ist somit als neuer Stamm der Gattung Bacillus anzrsehen.

(2) Mikrobiologische Eigenschaften von

Bacillus cereus Rf sm st

(A) Morphologie

Der Stamm ist ein aerober Bacillus und bildet Endosporen. Er ist gramnegativ.

Die Sporen haben ovale oder zylindrische Gestalt. Der GC-Gehall in der DNA beträgt 32 bis 37 Prozent.

(B) Biologische Eigenschaften

1) Eidotter-Test: positiv

2) Wachstumsbedingungen:

Die höchsten Wachstumstemperaturen liegen bei 35 bis 45°C und die niedrigsten Temperaturen bei 0 bis 20⁰C.

3) Nitratreduktion: positiv

(C) Wachstum auf verschiedenen Nährmedien

Der Stamm wächst unter anaeroben Bedingungen auf einem Agar-Mcdium. Er wächst auf einem Medium mit einem Gehall an 0,001 Prozent Lysozym.

Durch Vergleich mit den vorgenannten Literaturstcllen ergibt sich, daß dieser Stamm im wesentlichen mit bekannten Stämmen von Bacillus cereus übereinstimmt. Der Stamm wird somit als Bacillus cereus eingestuft.

(3) Mikrobiologische Eigenschaften von

Bacillus megaterium B 205-3

(A) Morphologie

Der Stamm ist ein relativ großer aerober Bacillus, bildet Endosporen und ist grampositiv. Die Sporen haben eine ovaie oder zylindrische Gestalt. Der GC-Gehall in der DNA beträgt 36 bis 38 Prozent.

(B) Biologische Eigenschaften

1) Eidotter-Test: negativ

2) Wachstumsbedingungen:

Die höchsten Wachstumstemperaturen liegen bei 35 bis 45°C und die niedrigsten Wachstumstemperaturen bei 3 bis 20" C.

(C) Wachstum auf verschiedenen Nährmedien

Der Stamm wächst nicht unter anaeroben Bedingungen auf einem Agar-Medium. Auf einem Medium mit einem Gehalt an 0,001 Prozent Lysozym zeigt er kein Wachstum.

Bei einem Vergleich mit den vorgenannten Literaturstellen ergibt sich, daß dieser Stamm im wesentlichen mit Bacillus megaterium übereinstimmt. Er wird deshalb als Bacillus megaterium bezeichnet.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen lassen sich nach allgemein üblichen Verfahren züchten, beispielsweise durch Überimpfen der Stämme auf ein Nährmedium mit einem Gehalt an Aminosäuren, Caseinhydrolysat, Glucose, Phosphat, Sulfat und dergl. Die Züchtung kann bei etwa 30 bis 37° C unter Belüften und Rühren durchgeführt werden.

Ein Typisches Nährmedium weist folgende Zusammensetzung auf:

(NH₄J₂SO₄

Arginin

Casaminsäure

Glucose

MgSO₄

Tryptophan

(2) Nährmedium

Rindfleischextrakt

Hefeextrakt

Pepton

Dextrose

Natriumchlorid

Dikaliumphosphat

Monokaliumphosphat

20 g

2g

2g
50 g

2g
0,25 g

1,5 g
1,5 g
5g
Ig
3.5 g
3,68 g
1,32 g

Zur Herstellung des Nährmediums werden 17,5 g de: Gemisches in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst.

Das Wachstum der Mikroorganismen wird gemessen indem man die Gärflüssigkeit in eine Küvette bringt unc die Durchlässigkeit bei 660 nm ermitteil.

Erfindungsgemäß werden die Mikroorganismenzel len gesammelt, vorzugsweise während ihrer logarithm! sehen Phase und zu Beginn der stationären Phase. Dk Zellen selbst oder der durch Behandeln der Zellen mi Lysozym erhaltene Protoplast wird mit Ultraschal zerkleinert. Durch Zentrifugieren wird ein zellfreiei Extrakt gewonnen. Der erhaltene zellfreie Extrakt wire mit Streptomacinsulfat und zur Fällung mit Ammonium sulfat behandelt, der Gelfiltration unter Verwendung von Ultragel ACA 44 oder Sephadex G-100, dei lonenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEA Ε-Cellulose oder Phosphorcellulose unterwor fen oder nach einem kombinierten Verfahren behandelt Man erhält schließlich die neuen Endonucieasen R.

Demgemäß lassen sich die erfindungsgemäßer Enzyme herstellen, indem man einen nach Züchtung dei Mikroorganismen während ihrer logarithmischen unc stationären Phase erhaltenen zellfreien Extrakt dei Behandlung mit Streptomycin, der Fällung mit Ammoni umsulfat, der lonenaustauschchromatographie, dei Gelfiltration bzw. einer Kombination dieser Verfahret unterwirft.

Die auf diese Weise erhaltener. Enzyme weisen di< folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:

(1) Aktivität und Substratspezifität

DNA von folgenden Phagen wird hergestellt und al: Substrat-DNA für enzymatische Reaktionen verwen det:

(1) CI-Medium

KH₂PO₄ K₂HPO₄ Na-citrat - 2 H₂O

in 10 Liter

60g

140 g

10 g

DNA Vermehrung in:

(Träger des Modifikationsmusters von):

Bakteriophagen

Φ 105 C. N. Bacillus amyloliquefaciens

(IAM 1522) Φ SPP 1. N Bacillus amyloliquefaciens

(IAM 1522) ^b0 Φ 105 C. 168 Bacillus subtilis Marburg 168

(ATCC 6051) Φ SPP 1.168 Bacillus subtilis Marburg 168

(ATCC 6051) λ Escherichia coil B

Nach der enzymatischen Reaktion werden die Größe der gespaltenen Substrat-DNA und die Anzahl dei

Spaltungsslellen durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt.

Die Fig. 1-1 bis 1-3 zeigen Photographicn mit den F.rgebnisscn von Agarosc-Gelelektrophoresen von DNA, die mit den erfindungsgemäßen Enzymen behandelt worden ist.

Die einzelnen Bczugszciehen in der Figur haben folgende Bedeutung:

Φ 105 C. 168 Bacillus-Phage Φ 105 C

vermehrt in

Bacillus subtilis ATCC 6051 Φ SPP 1.168 Bacillus-PhageSPP 1

vermehrt in

Bacillus subtilis ATCC 6051 Φ 105 C. N Bacillus-Phage Φ !05 C

vermehrt in Bacillus

amyloliquefaciens IAM 1522 Φ SPP 1. R Bacillus-PhageSPP 1 vermehrt in

Bacillus subtilis R A DNA von E. coli-Phage λ

vermehrt in

F.schcrichia coli B AH DNA modifiziert durch

Bacillus amyloliquefacicns 11

ADNA

unbehandelte A-DNA vermehrt in

Escherichia coli B

Φ 105 C. 168 DNA unbehandelte* 105 C. 168 DNA
R. FcoRI DNA von E.coli-Phage A

behandelt mit EcoRI-Enzym von

Escherichia coli

Aus den Figuren ergibt sich, daß das Substrat-DNA-Molekül durch die erfindungsgemäßen Enzyme in Bruchstücke bestimmter Größe gespalten wird.

Folgende Substrate werden verwendet:

(1) DNA vonunbehandclterBacillus-Phage* 105 C.

(2) DNA von unbehandelter E. coli-Phage A.

(3) DNA von E. coli-Phage A, behandelt mit EcoRI Enzym von Escherichia coli (Kontrolle zum Vergleich mit (1) und (2)).

Die erfindungsgemäßen Enzyme werden folgendermaßen bezeichnet: R. Bsu M, R. Bsu 6633, R. Bam F, R. Bee 14 579, R. Bee R, R. Bee 170, R. Bme 205 und R. Bpul387.

Die Nomenklatur der Enzyme richtet sich nach dem allgemeinen System von H.O. Smith und D. Nathans, J.Mol. Biol., Bd.81 (1973),S.419.

Die Bezeichnungen »Bsu«, »Bam«, »Bee«, »Bme« und »Bpu« sind folgendermaßen abgeleitet:

Name

Spezies

Stamm

Nr.

1) Bsu M

2) Bsu (.633

3) Bam F

4) Bcc 14579

5) Bee R

6) Bcc 170

7) Bme 205

8) Bpu 1387

Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus

sublilis M

sublilis

amyloliquefacicns F

ccrcus

cereus R

ccrcus

mcgatcrium

pumillus

(»633
14579

170
205
1387

Die vorgenannten Abkürzungen werden durch Kombination der unterstrichenen Anfangsbuchstaben gebildet.

Das Symbol »R.« ist eine Abkürzung für »Endonuclease R«, während das Symbol »R« eine Abkürzung für »Restriktion« ist. Ferner leitet sich der Ausdruck »EcoRI« folgendermaßen ab:

(icnus	Spezies	Stamm	Nr.
Escherichia Tabelle Il	coli	R	I
Verwendeter	Mikroorganismus	Name des	Enzyms

1) Bacillus subtilis ATCC 6051 R. Bsu M

2) Bacillus subtilis ATCC 6633 R. Bsu 6633

3) Bacillus amyloliquefaciens R. Bam F ATCC 23350

4) Bacillus cereus ATCC 14579 R. Bee 14579

5) Bacillus cereus Rf sm st R. Bee R ATCC 31293

6) Bacillus sp. 170 ATCC 31292 R. Bee 170

7) Bacillus megaterium B 205-3 R. Bme 205 ATCC 31294

8) Bacillus pumillus AHU 1387 R. Bpu 1387

Aus dem Elektrophoresediagramm von Fig. 1-1 ergibt sich, daß das Enzym von Bacillus subtilis ATCC 6051 in charakteristischer Weise DNA der Bacillus-Phage Φ 105 C. 168 und DNA der Bacillus-Phage Φ 105 C. N spaltet.

Das Enzym von Bacillus subtilis ATCC 6633 fragmentiert die einzelnen DNA in relativ kleine Bruchstücke. Sie wirkt auch spezifisch auf DNA des SPP 1-Phagen, modifiziert mit dem Stamm R von Bacillus subtilis.

->» Die Substratspezifität des Enzyms von Bacillus amyloliquefaciens ATTC 23 350 ist so beschaffen, daß es keine Wirkung zeigt auf (I) mit dem Enzym Bam N I behandelte A-Phagen-DNA, (II) DNA des Phagen Φ 105 C. 168 oder (III) A-Phagen-DNA, modifiziert mit dem Stamm H von Bacillus amyloliquefaciens.

Das erfindungsgemäße Enzym aus Bacillus pumillus AHU 1387 (Bpu 1387) wird mit den Endonucleasen R Bam N I, Bam N II und Bam N III aus Bacillus amyloliquefaciens N (IAM 1522) (vergleiche DE-OS 26 45 548) verglichen. Die Ergebnisse eines entsprechenden Vergleichs der Substratspezifität in bezug auf verschiedene DNA-Substrate sind in Tabelle III zusammengestellt
Aus Tabelle III geht hervor, daß das Enzym Bpu 1387 sich von den Enzymen Bam NI und Bam NII + Bam N III nicht nur in bezug auf DNA der Bacillus-Phagen Φ 105, SPP 1 und der Coli-Phagen λ, sondern auch in bezug auf DNA von Plasmid

(intrazellulärer Faktor) A dv 1
DNA von CoIEI und DNA
unterscheidet.

Tabelle III

von
von

Escherichia coli, Simian-Virus 40

Substrat-DNA Anzahl tier Schnittstellen

Barn Bam N Il Bpu 1387 NI HJamNIII

Bacillus-Phage Φ 105 C 0 ~9 + ~7 5

Bacillus-Phage Φ 29 0 0

Bacillus-Phage M₂ 0 0

Bacillus-Phage SPP 1 0 3

Coli-PhageA 5 ~I5

/tdv 1*) 1 2 oder 3

T7 0 >14

CoIHI*) O 3

SV 40**) 1 >4

nicht
untersucht

6-7

nicht
untersucht

2 bis 3

*) dv 1, CoIIiI: l'lasmid (zellulärer »intrinsic factor« von

lischericliia coli). **) SV 40: Simian-Virus 40.

(2) pH-Optimum

Das pH-Optimum der erfindungsgemäßen Enzyme liegt jeweils im Bereich von 7,2 bis 8,3.

(3) Temperaturoptimum

Das Temperaturoptimum der erfindungsgemäßen Enzyme liegt jeweils im Bereich von 35 bis 37°C.

(4) Verfahren zur Messung der Enzymaktivität

Die enzymatische Aktivität wird gemessen, indem man die Enzymprobe zu einem Gemisch aus folgenden Bestandteilen in den angegebenen Konzentrationen gibt: 50 millimolar Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 7,5, 5 millimolar MgCl₂, 0,2 millimolar EDTA, 5 millimolar ß-Mercaptoäthanol und 0,1 mg DNA. Das Gemisch wird 50 Minuten bei 37°C inkubiert. Da die Bildung von säurelöslichen Nucleotiden nach der Umsetzung in der Flüssigkeit nicht beobachtet wird, wird das Reaktionsprodukt der Elektrophorese unter Verwendung von Agarosegel oder der Zentrifugation mit einem neutralen Saccharosegradienten unterworfen, um die Bruchstückbildung der Substrat-DNA zu untersuchen.

(5) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Die erfindungsgemäßen Enzyme werden durch 1 bis 20 millimolar Mg²⁺ aktiviert, wobei ATP oder S-Adenosylmethionin als Cofaktor nicht erforderlich ist Durch mehr als 20 millimolar Mg²+ oder mehr als 0,2 m NaCl wird die Enzymaktivität gehemmt Das Enzym (Bpu 1387) von Bacillus pumillus AHU 1387 wird durch 0,1 bis 0,2 m NaCl aktiviert

(6) Reinigungsverfahren

Die Reinigung der Enzyme von R. Bam F und R. Bpu 1387 wird nach folgendem Schema vorgenommen:

Zellen

Behandlung mit Lysozym

Ultraschallbehandlung

Zentrifugation (90 Minuten bei 2 C mit
80 000 g)
(Überstand)
1

Zugabe von '/t Volumteile einer 5prozentigen
Lösung von Streptomycmsulfat in Puller A
(Überstand)
1

Füllung des Materials
mit Ammoniumsuirat
bei 40 bis ftOprozcntigcr
Sättigung

Lösung in Puffer Λ
(Ammoniumsulfatfrnktion)

St reptomyc insulin t-Fraklion von Bacillus
amyloliquclaciens
A FCC 23350

Saulenchromatographie an I)KAE-Cellulose (0,05 bis
0,16m NaCI-Fraktion)

R. Bam F

(Fraktion I)

(Fraktion II)

AmmoniumsulfiU-Fraktion von Bacillus pumillus AIII) 1387

Gelfiltration an AcA 34 (in Gegenwart von 0,3 m NaCI) (aktive Fraktion)

Säulenchromatographie an Phosphocellulose (0,4 bis 0,55 m NaCI-Fraktionen)

R. Bpul 1387

Das Enzym Bee 14 579 wird direkt aus der vorgenannten Fraktion I gewonnen. Die Enzyme Bsu M, Bsu 6633, Bee R, Bee 170 und Bme 205 werden direkt aus der vorgenannten Fraktion Π gewonnen.

Wie vorstehend erläutert, sind die erfindungsgemäßen Enzyme in der Lage, DNA von spezifischen Organismen, wie Bacillus-Stämmen und Bakteriophagen, zu erkennen und Bindungen an bestimmten Stellen unter Bildung von DNA-Bruchstücken bestimmter Größe zu spalten. Die Enzyme der Erfindung weisen eine hohe, bisher nicht bekannte Substratspezifitat auf.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Il

Beispiel 1

Bacillus pumillus AHU 1387 wird in 500 ml Hirn-Herz-Infusionsmedium 13 bis 15 Stunden bei 30"C unter Schütteln vorgezüchtet. Die erhaltene Vorkulturlösung wird in 10 Liter eines Nährmediums (CI-Medium) der folgenden Zusammensetzung übertragen:

K₂HPO₄	120 g
KH₂PO₄	280 g
Natriumeitrat	20 g
Ammoniumsulfat	40 g
Arginin-hydrochlorid	4g
Glucose	100 g
MgSO₄	4g
Tryptophan	0,5 g
Casaminosäure (vitaminfrei)	4g

Die Züchtung wird unter Schütteln 6 Stunden bei 37°C bis zum Anfangsstadium der stationären Phase durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Kulturbriihe wird in einer kontinuierlich arbeitenden Kühlzentrifuge zentrifugiert. Man erhalt 1 3 g Zellen. Diese Zellen werden in 20 ml Puffer A (20 mülimolarer Tris-HCI-Puffer vom pH-Wert 7,2, 0,1 millimolar EDTA, 2 millimolar MgCI₂ und 2 millimolar /J-Mercaptoäthanol) suspendiert. Die Suspension wird mit 1 3 m Hühnereiweiß-Lysozym versetzt. Die erhaltene Suspension wird 35 Minuten bei 37°C stehengelassen und anschließend der Ultraschallbehandlung unterworfen (2OkIIz, 15 see, 4mal). Anschließend wird 60 Minuten bei 75 00Og in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Sodann wird der Überstand unter Rühren mit 10 ml einer 5prozentigen Lösung von Streptomycinsulfat versetzt. Die flüssigkeit wird 20 Minuten gerührt und anschließend in der Kühlzentrifuge behandelt. Der Überstand wird gewonnen.

Anschließend wird der Überstand innerhalb von 30 Minuten unter Rühren bis zu einer 35prozentigen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird in der Kühlzentrifuge abgetrennt. Der Überstand wird innerhalb von 30 Minuten bis zu einer 65prozenti gen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. De-· Niederschlag wird in der Kühlzentrifuge abgetrennt und im vorstehenden Puffer A gelöst. Diese Fraktion wird über Nacht gegen den Puffer dialysiert.

Die dialysierte Fraktion wird auf eine mit Ultrogel AcA 34 beschickte Säule, die mit dem Puffer A unter Zusatz von 0,3 m NaCl und 10 Prozent Glycerin äquilibriert worden ist, aufgesetzt. Das mit dem gleichen Puffer erhaltene Eluat wird gegen den Puffer A, ergänzt mit 10 Prozent Glycerin, dialysiert.

Die dialysierte Fraktion wird an Phosphocellulose (p 11,1 χ 12 cm), die mit dem Puffer A äquilibriert worden ist, adsorbiert und anschließend mit dem Puffer A gewaschen. Sodann wird die Elution mit dem Puffer A mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,7 m vorgenommen. Das erfindungsgemäße Enzym (Bpu 1 387) wird bei 0,4 bis 0,55 m NaCI eluiert.

Beispiel 2

Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23 350 wird in 1000 ml des in Beispiel I angegebenen Cl-Mediums gezüchtet. Die Zellen (etwa 3 g) vom Anfangsstadium der stationären Phase werden auf die vorstehend beschriebene Weise mit Hühnereiweiß-Lysozym, Ultraschall und .Streptomycinsulfat behandelt. Der nach dem Abtrennen der Streptomacinsulfat-Fraktion erhaltene flüssige Überstand wird an einer mit DEAE-Cellulosc beschickten Säule (DH 52 : 1 χ 10 cm), dem Puffer A äquilibriert worden ist, adsorbiert. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer wird die Elution mit dem Puffer Λ mit einem linearen NaCI-Gradienten von 0 bis 1,0 m durchgeführt.

Das erfindiingsgemalie I ii/vm (Bam F) wird mit dem Puffer Λ bei 0,05 bis 0.1 b m NaCl eluiert.

Beispiel i

Anstelle der in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Mikroorganismen werden die in Tabelle 1 aufgeführten Stämme unter den Bedingungen von Beispiel 1 gezüchtet.

Aus der Fraktion I wird das erfindungsgemäße Enzym Bee 14 579 erhalten.

Die erfindungsgemäßen Enzyme Bsu M. Bsu 6633, Bee R, Bee 170 und Bme 205 werden jeweils aus der Fraktion Il erhalten.

jizu 2 WU\U /ci

Claims

Patentansprüche:

1. Endonuclease R. Bsu M, die Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Stellen erkennt und die ■> Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nucleinsäurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spaltet, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus subtilis ATCC 6051 erhalten worden ist ι ο

2. Endonuclease R. Bsu 6633, die Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Stellen erkennt und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nuclein· Säurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spaltet, dadurch gekennzeichnet, daß sie r, aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus subtilis ATCC 6633 erhalten worden ist

3. Endonuclease R. Bam F, die Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Stellen erkennt und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nuclein- m Säurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spaltet, dadurch gekennzeichnet daß sie aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23 350 erhalten worden ist.

4. Endonuclease R. Bee 14 579, die Desoxyribonu- r, cleinsäuren an spezifischen Stellen erkennt und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nucleinsäurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spaltet dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus cereus i» ATCC 14 579 erhalten worden ist.

5. Endonuclease R. Bee 170, die Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Stellen erkennt und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nucleinsäurebruchstücken mit einem bestimmten Moleku- π largewicht spaltet, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus sp. 170 FERM-P Nr. 3221 (ATCC 31 292) erhalten worden ist.

6. Endonuclease R. Bee R, die Desoxyribonuclein- to säuren an spezifischen Stellen erkennt und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nucleinsäurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spaltet, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus cereus -n RF sm st FERM-P Nr. 3640 (ATCC 31 293) erhalten worden ist.

7. Endonuclease R. Bme 205, die Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Stellen erkennt und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nuclein- ,» Säurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spaltet, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus megaterium B 205-3 FERM-P Nr. 3641 (ATCC 31 294) erhalten worden ist. -,-,

8. Endonuclease R. Bpu 1387, die Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Stellen erkennt und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nucleinsäurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spaltet, dadurch gekennzeichnet, daß sie wi aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus pumillus AHU 1387 erhalten worden ist.

9. Verfahren zur Herstellung der Endonucleasen nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus ATCC 6051, ATCC 6633, ATCC 14 579, <* ATCC 23 350, FERM-P Nr. 3221, FERM-P Nr. 3640, FERM-P Nr. 3641 oder AHU 1387 in einem Nährmedium züchtet, die Zellen gewinnt, daraus einen zellfreien Extrakt herstellt diesen Extrakt fraktioniert und den fraktionierten Extrakt reinigt