DE2744983A1 - Mehrwertiger antigen-protein-komplex - Google Patents
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Description
Mehrwertiger Antigen-Protein-Komplex
Die Erfindung betrifft einen mehrwertigen Antigen-Protein-Komplex,
der dazu geeignet ist, allergische Reaktionen abzublocken.
Bei bekannten Methoden zur Behandlung von Allergien und allergischen
Reaktionen ist man bislang so vorgegangen, daß man dem Individuum ein Antigen verabreicht hat, das die Bildung
von Antikörpern induziert, welche mit den Antikörpern konkurrieren, die durch das Allergen induziert werden.
Auf diese Weise wird die allergische Reaktion gebremst oder vermindert.
Bei der üblichen Behandlung von allergischen Patienten ist man so vorgegangen, daß man einen rohen Extrakt der Allergien
erzeugenden Substanz in einer wäßrigen gepufferten Lösung hergestellt hat. Die Patienten werden sodann mit zunächst
geringen und sodann ansteigenden Dosen des rohen Extrakts über einen langen Zeitraum behandelt. Häufig sind
drei oder mehrere Behandlungsjähre notwendig, bevor eine
signifikant lang andauernde Verbesserung beobachtet wird. Beim Fortschritt der Behandlung wird die Menge des rohen
Extrakts, die ein Patient erhält, allmählich gesteigert. Das Ausmaß der erhöhten Dosierung und Rate hängt von der individuellen
Empfindlichkeit des Patienten und dem Ausmaß der Reaktion auf die vorhergegangenen Dosen ab.
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-Z-
9 27U983
Die Injektion eines gesamten rohen Allergenextrakts über
lange Zeiträume induziert die Bildung von blockierenden oder konkurrierenden Antikörpern. Man nimmt theoretisch
an, daß die blockierenden Antikörper mit dem allergenen Antikörper für das Antigen konkurrieren und auf diese Weise dem allergischen Patienten einen Schutz verleihen.
Dieser teure und zeitraubende Prozeß der Desensibilisierung des allergischen Patienten hat zahlreiche und auf der
Hand liegende Nachteile. Sehr oft führt nämlich die Verabreichung des rohen Extrakts zu einer schweren allergischen
Reaktion, wenn die Dosen nicht sorgfältig überwacht und verabreicht werden. Dazu kommt noch, daß der Desensibilisierungsprozeß lang und zeitraubend ist und sehr oft ein
teures Vorgehen darstellt. Weiterhin führt die Bildung von konkurrierenden Antikörpern in dem allergischen Patienten
sehr oft zu Nebenwirkungen, die dem Patienten mehr schaden können, als die allergische Reaktion selbst.
Wichtiger ist jedoch, daß das bislang angewendete Desensibilisierungsverfahren nicht immer erfolgreich ist. In vielen Fällen führt das zeitraubende Desensibilisierungsverfahren nicht zu einem angemessenen Ausmaß des Schutzes des
allergischen Patienten, der immer noch an der Allergie leidet, wenn er dem Antigen ausgesetzt wird.
Aufgabe der Erfindung ist es, einen für die Verabreichung an den allergischen Patienten geeigneten Komplex zur Verfügung zu stellen, der existierende Antikörper neutralisiert
und die Bildung von Antikörpern - entweder durch Konkurrenz oder in spezifischer Welse gegenüber dem allergenen Antigen
vollständig blockiert.
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AO
Durch die Erfindung soll auch ein Verfahren zur Herstellung der Komplexe zur Verfugung gestellt werden, die die allergische
Reaktion blockieren.
Weiterhin soll durch die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines allergischen Individuums zur Blockierung der
allergischen Reaktion zur Verfügung gestellt werden.
Schließlich soll durch die Erfindung eine injizierbare Zusammensetzung
zur Verabreichung an einen allergischen Patienten zur Verfügung gestellt werden, damit die allergische
Reaktion blockiert wird.
Gegenstand der Erfindung ist ein mehrwertiger Antigen-Protein-Komplex,
der zur Blockierung von allergischen Reaktionen geeignet ist und der dadurch gekennzeichnet ist, daß
er (1) mindestens ein Timotheusgras-Antigen-D-Pragment mit
der antigendeterminierenden Struktur:
OH
OH
0-G-G-O-T
worin G für Glukose steht und T für Threonin oder ein Peptid, welches mit der Struktur durch ein Threoninmolekül
verbunden ist, steht, welches durch mindestens einen Glukose·
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-JC-
27AA983
teil an ein Peptid oder Protein gebunden ist, (2) ein Kon·
dugat mit der Struktur:
'S · Glutathion
oder (3) ein Konjugat, welches mindestens ein Konjugat der
Struktur:
OH
das durch eine Peptidbindung auf dem Wege über den Glutathionteil kovalent an ein Protein oder Peptid gebunden ist,
enthält,
enthält.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung des
Komplexes (1) zur Verfugung, bei dem man einen Glukoseteil des Timotheusgras-Antigen-D-Fragments aktiviert und sodann
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AZ
das auf diese Weise gebildete Zwischenprodukt mit einem Peptid oder Protein umsetzt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von Allergien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
einem Individuum eine genügende Menge von einem der obigen Komplexe injiziert, daß die antigeninduzierte Histaminfreisetzung
inhibiert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine injizierbare Zusammensetzung,
welche ein Medium, das für die Injektion geeignet ist, umfaßt, welches den obengenannten Komplex enthält und
das für die Verabreichung an allergische Patienten geeignet ist, damit allergische Reaktionen blockiert werden.
Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung der oben definierten Komplexe zur Behandlung von Allergien.
In neuerer Zeit sind verschiedene allergene Antigenfragmente von Timotheusgraspollen isoliert und charakterisiert
worden (vgl. z.B. Malley et al, "Imunochemistry", 1975,
Band 12, Seiten 551 bis 554). Ein bekanntes mehrwertiges Allergen, das in Timotheusgraspollen enthalten ist, ist als
Antigen B bekannt. Die einwertige Antigene determinierende Struktur des Antigens B, die üblicherweise als Antigen D
bezeichnet wird, ist wie folgt:
OH
0-G-G-O-T
OH
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Darin steht G für Glukose und T für Threonin oder ein Peptid, welches mit der Struktur durch ein ThreoninmolekUl
verbunden ist.
Fragmente von Antigen D, die gemäß dem Stand der Technik als Antigen D^, Antigen D2 und Antigen D, identifiziert worden
sind, unterscheiden sich in der Größe des Peptidschwanzes, der mit dem Glukoseteil der antlgenischen determinierenden
Struktur durch das ThreoninmolekUl verbunden ist (vgl. "J. Immunology" 99, 825, 1967; "Immunochemistry", 1, 237, 1964;
12, 551, 1975; "WHO Symposium on Allergen Standardization", herausgegeben von F.T. Perkins, Geneva, 1974; "Develop.
biol. standard" 29, 29, 1975). Antigen D1 hat ein Molekulargewicht von etwa 5000. Antigen D2 hat ein Molekulargewicht
von etwa 2500. Antigen D, ist das Fragment, bei dem das Molekül, das an den Glukoseteil gebunden ist, nur Threonin ist.
In manchen Fällen ist Serin, anstelle von Threonin, an den Glukoseteil aufgrund einer Fehlablesung des Codes angefügt,
der bei der Proteinsynthese für die Anfügung von spezifischen Aminosäuren verantwortlich ist.
Die Quercitinfraktionen der Antigen-Strukturformel sind
an die Glukoseteile mittels einer Ätherbindung durch OH-Gruppen auf den jeweiligen Molekülen angefügt. Die Threoninbindung an den Glukoseteil ist ebenfalls eine Ätherbindung
durch eine OH-Gruppe auf der Cellobiosefraktion und der OH-Gruppe des Threonine. Aufgrund stöchiometrischer Erwägungen
nimmt man an, daß die Aktivierung in erster Linie an dem Glukosemolekül stattfindet, welches an das Quercitinmolekül
angrenzt. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäßen Komplexe durch einen Glukoseaktivierungsmechanismus ungeachtet des genauen Orts der Aktivierung innerhalb
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der Cellobiosefraktion gebildet werden. Es ist nicht genau bekannt, welche OH-Gruppe in der Cellobiosefraktion die
Bindungsstelle umfaßt.
Wie aus der obigen Struktur ersichtlich wird, ist das Molekül an verschiedenen Stellen einer Konjugation mit einer
weiten Vielzahl von Reagentien zugänglich. Es können viele mehrwertige Konjugate hergestellt werden, von denen angenommen
werden kann, daß sie aufgrund ihrer Struktur allergische Reaktionen induzieren. Tatsächlich ist festgestellt
worden, daß die Anheftung von Proteinen oder Peptiden an das Molekül an anderen Stellen als den Glukose- oder Kohlenhydra
tteilen zu Konjugaten führt, die allergische Reaktionen
induzieren.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Bindung eines Peptids oder eines Proteins an das Antigen-D-Fragment
durch den Glukoseteil zu einem Komplex führt, der allergische Reaktionen nicht induziert, sondern vielmehr allergische
Antikörper vollständig neutralisiert und die Bildung von allergischen Antikörpern inhibiert oder blockiert.
Diese Komplexe oder Konjugate können daher allergischen Patienten
zur vollständigen Inhibierung der allergischen Reaktion verabreicht werden, ohne daß die Notwendigkeit eines
oben beschriebenen langwierigen und teuren Desensibilisierungsprozesses besteht. Oa die Verabreichung des Komplexes
die Bildung von allergischen Antikörpern miteinander hemmt, wird die allergische Reaktion selbst gehemmt und irgendwelche
Nebenwirkungen werden vermieden, die bei der herkömmlichen Desensibilisierungsmethode durch die Bildung von konkurrierenden
Antikörpern hervorgerufen werden.
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Es hat sich gezeigt, daß ähnliche Ergebnisse durch ein Kon-3ugat
mit folgender Struktur:
S - Glutathion
Il
OH
oder ein Konjugat, welches mindestens ein Quercitinglutathicn-Konjugat
enthält, welches kovalent an ein Protein oder Peptid durch eine Peptidbindung durch den Glutathionteil gebunden
ist, erhalten werden. Die Verabreichung dieser Komplexe oder KonJugate führt ebenfalls zu einer vollständigen Hemmung
von allergenen Antikörpern, die entweder dem Antigen oder konkurrierenden Antikörpern spezifisch sind, und zu einer
vollständigen Blockierung der allergischen Reaktion.
Das Timotheusgras-Antigen-D-Fragment kann durch mindestens
einen Glukoseteil an ein geeignetes Peptid oder Protein kovalent gebunden werden. Es wird darauf hingewiesen, daß
jedes Peptid oder Protein, das für die Verabreichung an einen allergischen Patienten geeignet ist, kovalent an das
Antigen-Fragment gebunden sein kann. Unter den Peptlden oder Proteinen werden Humanserumalbumin, ein d-Aminosäurecopolymeres
von Lysin und Glutaminsäure (d-GL), Human-IgG sowie andere Homologe und ähnliche Proteine oder d-Aminosäurecopolymere
bevorzugt.
Wie bereits oben ausgeführt, ist es wesentlich, daß das Peptid oder Protein an den Glukoseteil des Antigen-D-Frag-
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ments angefügt ist. Die Bindung des Proteins oder Peptids
an irgendeinen anderen Teil des Moleküls führt zu einem Komplex, der die allergische Reaktion indiziert anstelle
hemmt. Eine kovalente Bindung kann in der Weise erhalten werden, daß man das Antigen-D-Fragment mit einem Cyanogenhalogenid
aktiviert. Diese Methode wird genauer von Axen et al in "Nature", 214, 1302 bis 1304 (1967) und von Cuatrecasas
et al in «Proc. Natl. Acad. Sei.», U.S., 61, 636 bis 643,
(1968) beschrieben. Das Cyanogenhalogenid setzt sich mit der Hydroxylgruppe der Glukosegruppen unter Bildung von
Cyanatestern um. Die Reaktion findet sehr rasch bei einem pH-Wert zwischen 10 und 12 statt. Das Cyanat kann sich weiter
mit weiteren Hydroxylgruppen unter Bildung eines Imidocarbonat-Zwischenprodukts
umsetzen. Das cyclische Imidocarbonat, das als Hauptprodukt nach der Umsetzung des Cyanogenhalogenids
mit dem Glukoseteil gebildet wird, ist mit Aminen hoch reaktiv, wodurch N-Imidocarbonate, Isoharnstoffe
oder N-Carbamate gebildet werden. Die genaue Natur der Bindung zwischen dem Protein und dem durch das Cyanogenhalogenid
aktivierten Glukoseteil ist nicht bekannt. Ungeachtet des genauen Mechanismus ist jedoch das Zwischenprodukt,
das durch die Reaktion eines Cyanogenhalogenids mit dem Antigen-D-Fragment gebildet wird, mit Peptiden und Proteinen
hoch reaktiv, wodurch ein Komplex gebildet wird, indem das Peptid oder Protein kovalent durch den Glukoseteil
an das Antigen-D-Fragment gebunden ist.
Die Cellobiosefraktion der Antigen-D-Fragmente kann auch zur Bindung mit dem Protein oder Peptid nach der in
"Immunol.11 20, 1061 (1971) beschriebenen Methode aktiviert
werden:
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CH2OH
Oxidation NaIO4
27U983
CH2OH
protein
R-NH,
R-NH,
CH2OH
Reduktion, z.B. NaBH4
CH2OH
Als die Carboxylgruppen des Antigen-D-Fragments durch
Woodward's Reagens K aktiviert wurden, wobei der Quercitin-Glukose-Glukose-Teil nicht angegriffen blieb, induzierte
das resultierende Konjugat mit Humanserumalbumin, beispielsweise Antigen-induzierte Hlstaminfreisetzungsreak-
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- "Kf -
AS-
27ΛΑ983
tionen, wie durch direkte Hauttests gezeigt wurde. Es wird daher ersichtlich, daß die Inhibierungsfähigkeit der allergischen
Reaktion des Komplexes von der Konjugation des Peptids oder Proteins mit dem Antigen-D-Fragment durch
den Glukoseteil abhängt.
Die Quercitin-Glutathion- und Quercitin-Glutathion-Protein-Konjugate,
die oben beschrieben wurden, sind auch potente Blockierungsmittel für die allergische Reaktion.
Das Quercitin-Glutathion-Konjugat wird durch eine Oxidations-Additions-Reaktion
unter Verwendung von AgO oder einem anderen geeigneten Oxidationsmittel gebildet.
+ Glutamyl-Cysteinyl-Glycin AgO (Glutathion) >
OH
OH
Il ι
O G lutamyl-C ystein--Glycin
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- γί -
274Α983
Das resultierende Konjugat kann sodann mit einem Peptid oder Protein durch Aktivierung der Carboxylgruppen des Glutathionteils
mit beispielsweise Woodward's Reagens, Carbodiimiden etc., und anschließende Konjugation mit dem Proteinoder
Peptidmolekül konjugiert werden. Das Quercitin-Glutathion ist mit dem Protein durch eine Peptidbindung durch
entweder den Glutaminsäure- oder Glycinteil des Glutathionteils verbunden.
Das Peptid oder Protein, das mit dem Quercitin-Glutathion-Konjugat
konjugiert ist, kann jedes beliebige Peptid oder Protein sein, das für die Verabreichung an einen allergischen
Patienten geeignet ist. Unter den Proteinen und Peptiden werden Humanserumalbumin, ein d-Aminosäurecopolymeres
von Lysin und Glutaminsäure (d-GL), Human-IgG oder andere homologe Proteine oder d-Aminosäurencopolymere bevorzugt.
Offensichtlich kann das Antigen-D-Fragment und das Quercitin-Glutathion-Molekül
an das Protein- oder Peptidmolekül an einer Vielzahl von Stellen des letzteren gebunden sein. Im
allgemeinen wird es bevorzugt, etwa 2,0 bis etwa 30 Mol, vorzugsweise 5 bis 20 Mol, des Antigen-D-Fragments oder
der Quercitin-Glutathion-Verbindung an 1 Mol Protein oder Peptid zu binden. Das Molverhältnis kann variiert werden,
indem man das Molverhältnis der Ausgangsstoffe beim Herstellungsverfahren variiert.
Die oben beschriebenen Antigen-Protein-Komplexe können in
beliebige geeignete Medien, beispielsweise gepufferte Kochsalzlösung, zur Verabreichung an den allergischen Patienten
eingearbeitet werden.
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-MS-
Herkömmliche Additive, Hilfsstoffe etc. können in die
Zusammensetzling für die Injektion eingegeben werden. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß diese Hilfsstoffe
nicht erforderlich sind.
Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen subkutan, intramuskulär
oder intravenös injiziert.
Im allgemeinen sind Dosen im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,25 mg, vorzugsweise 0,025 bis 0,1 mg, pro kg Körpergewicht
des Komplexes in der injizierten Zusammensetzung ausreichend, um ein annehmbares Ausmaß der die allergische
Reaktion blockierenden Fähigkeit zu erzielen.
Es wird darauf hingewiesen, daß die Parameter des Dosierungsbereiches
von der Dauer des Komplexes in der Zirkulation, dem Antikörpertiter des Patienten, der der Therapie
unterzogen wird, dem Immunzustand des Patienten und der Dauer der Unterdrückung der IgE-Antwort bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Komplexe sind für die Behandlung von grasempfindlichen Patienten geeignet, um allergische Symptome
zu verhindern. Die Komplexe unterdrücken die Bildung von allergischen Antikörpern gegen Graspollenantigene und
sie wirken weiterhin so, daß existierende Antikörper in dem System des Patienten neutralisiert werden. Es wird darauf
hingewiesen, daß die erfindungsgemäßen Komplexe nicht nur zur Blockierung von allergischen Reaktionen gegenüber Timotheusgras,
sondern auch gegenüber Glatthafer und anderen Graspollen geeignet sind, die eine Kreuzreaktion haben (d.h.
z.B. Junigras etc.).
In den Beispielen werden Herstellungsmethoden der erfindungsgemäßen
Komplexe beschrieben.
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Herstellung von Antigen-D-Protein-Komplex:
90 mg Antigen-D^-Fragment (Molekulargewicht etwa 5000) wurden
in ein Eisbad gegeben und der pH-Wert wurde mit NaOH-Lösung auf 10,5 eingestellt. Das Gemisch wurde mit einem
MotorrUhrer versehen und mit 2 g CNBr versetzt. Der pH
wurde bei 10,5 - 0,25 durch Zugabe von NaOH im Verlauf der nächsten 10 min gehalten. 15 ml eines 0,1M-NaHCOyPUf fers
(pH 9), enthaltend 0,15 M-NaCl, wurden zugesetzt. Hierauf
wurden 45 mg Humanserumalbumin (HSA) zugesetzt und das Gemisch wurde 24 h bei 4°C gerührt. Das Gemisch wurde unter
Unterdruck konzentriert, wodurch ein Produkt erhalten wurde, das ein Antigen-D-j-Protein-Verhältnis von etwa 5 : 1
hatte. Nicht-umgesetztes Antigen-D^ wurde durch Dialyse
entfernt.
Komplexe mit Antigen-D2- und -D,-Fragmenten und anderen
Protein- oder Peptidträgern können in identischer Weise hergestellt werden.
Herstellung von Quercitin-Glutathion:
1,5 g AgCl wurden mit 10 ml 4N-NaOH 20 min lang vermischt.
Der AgO-Niederschlag wurde auf einem Büchner-Trichter filtriert.
0,2 g Glutathlon wurden in 4 ml 0,25N-NaOH aufgelöst und
In ein Eisbad gegeben. 0,2 g Quere!tin wurden in 8 ml 0,25N-NaOH
aufgelöst. 1,2 g frisch hergestelltes AgO wurden zu
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letzterem gegeben und das Gemisch wurde 15 bis 20 min lang auf einem Eisbad gerührt.
Die Glutathionlösung wurde zugesetzt und das Gemisch wurde
1 h in einem Eisbad gerührt. Überschüssiges AgO wurde abfiltriert. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde auf
1 bis 2,5 mit HCl eingestellt und die Lösung wurde 30 min lang gerührt.
Die Lösung wurde filtriert, um ungebundenes Quercitin zu entfernen, und der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7 eingestellt.
Freies Glutathion wurde nach der DNTB-Methode (Anal. Biochem. 48, 1557, 1972) bestimmt.
Herstellung von Quercitin-Glutathion-Protein-Konjugat:
40 mg Quercitin-Glutathion wurden zu 100 mg Woodward's Reagens gegeben und 10 min lang bei Raumtemperatur damit vermischt.
Der pH-Wert wurde auf 6,2 mit Q3M-Cocodylatpuffer (pH 6,8) eingestellt.
100 mg HSA wurden zugesetzt, während der pH-Wert oberhalb
6,2 gehalten wurde. Das Gemisch wurde 10 bis 15 min lang bei Raumtemperatur und sodann über Nacht bei 4°C gehalten.
Die Lösung wurde unter Unterdruck konzentriert. Durch Dialyse wurde ungebundenes Quercitin-Glutathion von dem Konjugat
mit dem Protein entfernt.
Das Konjugat mit anderen Proteinen und Peptiden kann in
identischer Weise hergestellt werden.
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~ " 27ΛΛ983
Das folgende Beispiel beschreibt die Fähigkeit für die Inhibierung von allergischen Reaktionen der Komplexe gemäß
der Erfindimg.
Die Histaminfreisetzung aus Affen-Lungengewebe, das passiv
mit dem Serum von allergischen Patienten sensibilisiert worden war, wird gemäß der Methode von Malley et al in "J.
Immunol." 100, 915 (1968) bestimmt. Die zur Sensibilisierung des Affen-Lungengewebes verwendeten Seren wurden aus
den gesammelten Seren von 20 Timotheusgras-empfindlichen Patienten genommen, wobei der durchschnittliche allergene
Antikörpertiter 1 : 750 betrug. Das Affen-Lungengewebe wurde sodann 2 h bei 37°C mit dem Serum inkubiert. Vor der
Provozierung mit dem Allergen wurde das sensibllisierte Gewebe 10 min lang bei 37°C mit dem Inhibierungsmittel inkubiert.
Die antigene Provozierung wurde durch Inkubierung mit der optimalen Konzentration von rohem Pollenextrakt
(WST) über einen Zeitraum von 15 min bei 37°C durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt. Die Abkürzungen
haben folgende Bedeutung:
WST bedeutet einen wäßrigen Extrakt von gesamten Timotheusgraspollen,
der dialysiert wurde, um niedermolekulare Fragmente zu entfernen;
D1 bedeutet die Timotheusgras-Antigen-D-Fragmente mit einem
Molekulargewicht von etwa 5000;
D2 bedeutet das Tlmotheusgras-Antigen-D-Fragment mit einem
Molekulargewicht von etwa 2500;
809815/0746
- yr -
al| 27ΑΛ983
D, bedeutet das Timotheusgras-Antigen-D-Fragment ait einem
Molekulargewicht von weniger als 1000 und es enthält den oben beschriebenen Komplex, bei dem T für Threonin steht;
HSA bedeutet Humanserumalbumin;
dGL bedeutet ein d-Aminosäurecopolymeres von Glutaminsäure
und Lysin mit einem Molekulargewicht von etwa 40000;
RhIg bedeutet Rhesus IgG.
809815/0746
- 18 -
WST
D1 - HSA
D1 - RhIgG
00 D1 - dGL
ο ι
cd Quercitin-00 Glutathion
cn
ο Quercitin-■^ Glutathin-S
HSA
Tabelle I |
Konju-
gie- rungs- ver- hältnis |
Konzentra
tion des Konjugats |
WST-Anti gen-Kon- zentra- tion (με) |
|
Konjugierungs-
methode |
- | 40 | ||
- | 6,2 : 1 | 0,260 mg | 40 | |
15 : 1 | 0,580 mg | 40 | ||
CNBr | 4 : 1 | 0,500 mg | 40 | |
1:1 |
1,5 mg
0,75 mg |
40
40 |
||
Oxidation und
Addition |
0,37 mg | 40 | ||
20 : 1 |
1,6 mg
0,80 mg 0,40 mg |
40
40 40 |
||
Oxidation und
Addition, sodann Woodwards1 Rea gens K |
direktes | % Inhibierung |
Provozierungs | |
antigen (ng) | |
2,7 | - |
1,27 | 53 |
0,14 | 95 |
0,35 | 87 |
0,32 | 88 |
0,86 | 68 |
1,2 | 55 *° |
0,37 | 90 |
0,70 | 74 |
1,13 | 58 |
CD OO
Aus den Ergebnissen der Tabelle I wird ersichtlich, daß
die erfindungsgemäßen Komplexe potente Inhibitoren für die allergische Reaktion sind.
Das folgende Beispiel zeigt weiterhin die Inhibierungsfähigkeit
der allergischen Reaktion der erfindungsgemäßen Komplexe.
Die passive Übertragungshautreaktivität der erfindungsgemäßen
Komplexe wird mit den Antigenen, die in Timotheusgraspollen vorhanden sind, sowie mit Komplexen, hergestellt
durch Konjugation des Peptids oder Proteins an die Antigenfragmente durch andere Teile als den Glukoseteil, verglichen.
0,1 ml von Seren, die allergene Antikörper enthalten (aus den gesammelten Seren von 20 timotheusgrasempfindlichen Patienten,
durchschnittlicher P-K-Titer 750), wurden intradermal in die Haut von nicht-allergischen freiwilligen Personen
injiziert. 48 h später wurde jede Stelle, die zuvor mit den Seren sensibilisiert worden war, mit einer Vielzahl
von Antigenen und Komplexen provoziert. Die allergischen Antikörper in den implantierten Seren reagierten mit den allergenen
Antigenmaterialien, wodurch eine lokalisierte allergene Reaktion bewirkt wurde. Wenn das antigene Material
keine allergischen Reaktionen induziert, dann wird keine lokalisierte Reaktion beobachtet.
Die Ergebnisse von verschiedenen Tests mit den erfindungsgemäßen Komplexen sowie dem Antigenmaterial in Timotheusgraspollen
sind in der Tabelle II zusammengestellt.
809815/0746
- 20 -
Konjugierungs- Konjugierungs«
methode verhältnis
Antigenkon- P-K-Reaktion zentration
WST
D1 | - HSA | |
D1 | - dGL | |
D1 | - RhIgG | |
D2 | - RhIgG | |
W O |
D2 | - dGL |
CD OO |
D3 | - HSA |
cn | D1 | - HSA |
O | D1 | - HSA |
cn | D3 | - HSA |
6,2 | 1 | |
CNBr | 4 : - | ! 1 |
Aktivate | 20 : | • 1 |
Zucker | 7,2 ι | ί 1 |
Teil | 2,8 : | • 1 |
5 ! | 1 | |
Woodward's
Reagens K |
2,6 j | 1 |
Aktivate | 4 ! | |
COOH | 11,3 ι | 1 |
Gruppen | 1 | |
Oxidation und
Addition |
1 j | 1 |
Woodwardf s
Reagens K |
12 : | |
Woodward's
Reagens K |
20 : | |
! 1 | ||
I |
1 /ig 500 ug
ug 580 /ig 500 ug 500 ug
500 ug
25 /ig
25 /ig
100 ug
1.5 mg 100 ug
1.6 mg
4+
negativ negativ negativ negativ negativ negativ
2+ 4+ 4+
negativ negativ negativ
27U983
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Komplexe keine allergischen Reaktionen induzieren. Es
sollte weiter beachtet werden, daß diejenigen Komplexe der Antigen-D-Fragmente, die mit dem Protein durch andere
Teile als dem Glukoseteil konjugiert sind, potente Initiatoren der allergischen Reaktionen sind, was anzeigt,
daß die Konjugation durch den Glukoseteil des Antigen-D-Fragments kritisch ist.
Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Komplexe, die Bildung von allergenen Antikörpern
zu unterdrücken.
Vorläufige Untersuchungen haben gezeigt, daß LAF1-Mäuse
gute IgE-(allergene Antikörper) Antworten gegen Timotheusgraspollen entwickelten.
Den Tieren wurden i.p. 10 ug WST in Alaun injiziert. 3 Wochen
später erhielten sie eine zweite i.p.-Injektion von
10 ug WST in Alaun. Die IgE-Titer nach der Anfangsimmunisierung stiegen auf Titer zwischen 1/100 bis 1/200, gemessen
durch PCA, an. IgE-Titer nach der zweiten Injektion
des Antigens stiegen auf Werte zwischen 1/600 und 1/800, gemessen durch PCA, an.
Die passive kutane Anaphylaxie (PCA) wird durch Injektion von 0,025 ml der Serumverdünnung in die Stelle einer Maus
oder einer Ratte gemessen. 72 h (Maus) oder 3 h (Ratte) später werden die Tiere mit WST in Evans-Blaufarbstoff provoziert,
der intravenös injiziert wird. Die Reaktion des zirkulierenden Antigens mit dem gewebefixierten IgE führt
80981 5/0746
zu einer lokalisierten allergischen Reaktion. Die Stelle wird durch Aussickern des Blaufarbstoffs in die Reaktionsgegend sichtbar gemacht. Der IgE-Titer wird als die niedrigste Verdünnung definiert, die eine positive PCA-Reaktion ergibt.
Maus-IgE in diesen Tieren wird gegen die gleiche antigene
Determinante gemacht, wie sie auf den Antigen-D-Fragmenten ausgedrückt 1st.
Für die Tests wurden folgende zwei Komplexe gemäß der Erfindung ausgewählt:
1) Antigen-D2-dGL (D2-dGL): ein nicht-immunogenes Copolymeres aus d-Glutaminsäure und d-Lysin (MG 40000) mit
durchschnittlich 2,8 Antigen-D2-Gruppen/Mol angefügtes dGL.
Konjugation erfolgte durch Modifizierung des Zuckerteils mit CNBr vor der Addition an dGL.
2) Quercitin-Glutathion-dGL (Q-G-dGL): hergestellt durch
Konjugation von Quercitin-Glutathion an dGL mit durchschnitt· lieh 12 bis 20 Q-G-Gruppen/Mol dGL.
Verabreichung von Q-G-dGL oder D2-dGL auf i.p»-Weg wurde
3 Tage vor der sekundären Immunisierung von WST gegeben.
Tag: |
0
t |
18
t |
f | 28 f |
Injektion: | WST |
D2dGL
oaer |
WST | Ausbluten |
in | Q-G-dGL | in | ||
Alaun | Alaun |
Ergebnisse: Kontrolltiere, denen am Tag 18 Kochsalzlösung verabreicht wurde, haben den folgenden IgE-Titer-600; mittlere Antwort bei 18 Tieren.
809815/0746
- 23 30
Tiere, mit D2-(IGL behandelt:
niedrige Dosis (0,12 mg AgD2) mittlere Dosis (0,6 mg AgDp)
hohe Dosis (1,2 mg AgD2)
Tiere, mit Q-G-dGL behandelt:
27U983
PCA-Titer
350
300
<100
Tiergruppe
6 6 6
niedrige Dosis (0,24 mg Quercitin)
mittlere Dosis (1,8 mg Quercitin)
hohe Dosis (3,6 mg Quercitin)
PCA-Titer | Tiergruppe |
600 | 6 |
300 | 6 |
100 | 6 |
Die obigen Werte zeigen, daß beide Konjugate signifikant
den IgE-Wert vermindern, wenn sie 3 Tage vor der sekundären Antigen-Injektion verabreicht werden. Dies weist auf
eine Antikörper-Neutralisation and -Unterdrückung hin.
Ähnliche Tests haben gezeigt, daß Verabreichungen bis zu 7 Tage vor der sekundären Antigen-Injektion im wesentlichen die gleichen Ergebnisse liefern.
Ähnliche Tests haben gezeigt, daß Verabreichungen bis zu 7 Tage vor der sekundären Antigen-Injektion im wesentlichen die gleichen Ergebnisse liefern.
80981 5/0746
Claims (14)
1. Mehrwertiger Antigen-Protein-Komplex, der für die Blockierung von allergischen Reaktionen geeignet ist, dadurch
gekennzeichnet , daß er (1) mindestens ein Timotheusgras-Antigen-D-Fragment mit der antigendeterminierenden
Struktur:
0-G-G-O-T
OH
worin G für Glukose steht und T für Threonin oder ein Peptid, welches mit der Struktur durch ein Threoninmolekül
verbunden ist, steht, welches durch mindestens einen Glukoseteil an ein Peptid oder Protein gebunden ist, (2) ein Konjugat
mit der Struktur:
S - Glutathion
809815/0746
ORIGINAL INSPECTED
27U983
oder (3) ein Konjugat, welches mindestens ein Konjugat der
Struktur:
OH
S - Glutathion
OH
das durch eine Peptidbindung auf dem Wege über den Glutathionteil
kovalent an ein Protein oder Peptid gebunden ist, enthält,
enthält.
enthält.
2. Mehrwertiger Antigen-Protein-Komplex, der für die
Blockierung von allergischen Reaktionen geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens
ein Timotheusgras-Antigen-D-Fragment mit der antigenen
determinierenden Struktur:
0-G-G-O-T
809815/0746
- 26 -
3 27U983
worin G für Glukose steht und T für Threonin oder ein Peptid, das mit der Struktur durch ein Threoninmolekül verbunden
ist, steht, welches kovalent durch mindestens einen Glukoseteil an ein Peptid oder Protein gebunden ist, enthält.
3. Komplex nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Protein, das kovalent
an das Fragment gebunden ist, Humanserumalbumin, ein d-Aminosäurecopolymeres von Lysin und Glutaminsäure oder
Human-IgG ist.
4. Komplex nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß T für ein solches Threonin enthaltendes
Peptid steht, daß das Molekulargewicht des Fragments etwa 5000 beträgt.
5. Komplex nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Threonin enthaltende Peptid
so beschaffen ist, daß das Molekulargewicht des Fragments etwa 2500 beträgt.
6. Komplex nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß T für Threonin steht.
7. Komplex nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment kovalent an ein d-Aminosäurecopolymeres
von Lysin und Glutaminsäure gebunden ist.
8. Komplex nach Anspruch 4, dadurch g e k e η η -
ζ e i da η e t , daß das Fragment kovalent an Human-IgG gebunden ist.
80981 5/0746
- Vf -
9. Komplex nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Fragment kovalent an Humanserumalbumin gebunden ist.
10. Komplex nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment kovalent an ein d-Aminosäurecopolymeres
von Lysin und Glutaminsäure gebunden ist.
11. Komplex nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment kovalent an Human-IgG
gebunden ist.
12. Komplex nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment kovalent an Humanserumalbumin
gebunden ist.
13. Mehrwertiger Antigen-Protein-Komplex, der zur Blokkierung
von allergischen Reaktionen geeignet ist, dadurch gekennzeichnet , daß er ein Konjugat mit
der Struktur:
S - Glutathion
enthält.
8098 15/0746
14. Mehrwertiger Antigen-Protein-Komplex, der zur Blokkierung von allergischen Reaktionen geeignet ist, dadurch
gekennzeichnet, daß er mindestens ein Kon-Jugat mit der Struktur:
S - Glutathion
das kovalent an ein Protein oder Peptid durch eine Peptidbindung durch den Glutathionteil verbunden ist, enthält.
15. Komplex nach Anspruch 14, dadurch g e ke η η -zeichnet, daß das Protein oder Peptid Humanserumalbumin, ein d-Aminosäurecopolymeres von Lysin und
Glutaminsäure oder Human-IgG ist.
16. Komplex nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ein d-Aminosäurecopolymeres von Lysin und Glutaminsäure ist.
17. Komplex nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß das Protein Humanserumalbumin ist.
18. Komplex nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Human-IgG ist.
809815/0746
19. Verfahren zur Bildung des Komplexes nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die GIu-koseteile
darin durch Reaktion mit einem Aktivierungsmittel aktiviert und das auf diese Weise erhaltene Zwischenprodukt
mit einem Peptid oder Protein umsetzt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß man als Aktivierungsmittel ein Cyanogenhalogenid
verwendet.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Peptid Humanserumalbumin,
ein d-Aminosäurecopolymeres von Lysin und Glutaminsäure
oder Human-IgG ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß T für Threonin steht.
23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß T für ein solches Threonin enthaltendes
Peptid steht, daß das Molekulargewicht des Fragmentes etwa 5000 beträgt.
24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch g e k e η η zeichnet
, daß T für ein solches Threonin enthaltendes Peptid steht, daß das Molekulargewicht des Fragmentes
etwa 2500 beträgt.
25. Verwendung des Komplexes nach Anspruch 1 zur Inhibierung der durch Antigen induzierten Histaminfreisetzung.
26. Verwendung des Komp^xes nach Anspruch 2 zur Inhibierung
der durch Antigen Induzierten Histaminfreisetzung.
809815/0746
27. Verwendung des Komplexes nach Anspruch 13 zur Inhitferung der durch Antigen induzierten Histaminfreisetzung.
28. Verwendung des Komplexes nach Anspruch 14 zur Inhibierung der durch Antigen induzierten Histaminfreisetzung.
29. Injizierbare Zusammensetzung, die zur Blockierung von allergischen Reaktionen geeignet ist, dadurch gekennzeichnet , daß sie den Komplex nach Anspruch
1 enthält.
30. Injizierbare Zusammensetzung, die zur Blockierung von allergischen Reaktionen geeignet ist» dadurch gekennzeichnet , daß sie den Komplex nach Anspruch
3 enthält.
31. Injizierbare Zusammensetzung, die zur Blockierung von allergischen Reaktionen geeignet ist, dadurch gekennzeichnet , daß sie den Komplex nach Anspruch
13 enthält.
32. Injizierbare Zusammensetzung, die zur Blockierung von allergischen Reaktionen geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Komplex nach Anspruch
14 enthält.
809815/0746
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