DE2801455C2 - Mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung von Amylase in Flüssigkeiten - Google Patents

Mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung von Amylase in Flüssigkeiten

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DE2801455C2
DE2801455C2 DE2801455A DE2801455A DE2801455C2 DE 2801455 C2 DE2801455 C2 DE 2801455C2 DE 2801455 A DE2801455 A DE 2801455A DE 2801455 A DE2801455 A DE 2801455A DE 2801455 C2 DE2801455 C2 DE 2801455C2
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    • Y10T436/144444—Glucose

Description

dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht als Stoff der mit der zu bestimmenden Substanz unter Bildung eines diffundier- und erfaßbaren Stoffes zu reagieren vermag, ein nlcht-dlffuslonsfahlges PoIysacchurld mit einer vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung enthalt, das In Gegenwart einer Flüssigkell mit einem Gehalt an Amylase eine diffusionsfähige Verbindung mit der vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung zu bilden vermag.
2. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nlcht-dlffuslonsfühlge Polysaccharld aus Starke besteht, und daß die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung chemisch an die Starke gebunden ist.
3. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung aus einem colorimetrisch bestimmbaren Farbstoffrest oder einem fluoreszierenden Rest besteht.
Die Erfindung betrifft ein mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung von Amylase In Flüssigkeiten mit
a) einer Reagensschlch: mit einem Stoff, der mit der zu bestimmenden Substanz unter Bildung eines diffundier- und erfaßbaren Stoffes zu reagieren vermag,
b) einer für Strahlung durchlässigen Registrierschicht, die den diffundier- und erfaßbaren Stoff aufzunehmen vermag, sowie gpgebenenfalls ferner
c) einem Schichtträger und/oder weiteren Schichten.
Es Ist bekannt, z.B. aus der DE-OS 19 01517, zur Bestimmung von Polysaccharide hydrolyslerenden Endohydrolasen, wie z. B. Amylase, ein Reagens zu verwenden, das aus einem wasserunlöslichen, aber hydrophilen, quellbaren, enzymatisch hydrolyslerbaren, dreidimensionalen Netzwerk von Molekülen eines Polysaccharide oder dessen enzymatisch hydrolyslerbaren Derivaten, bei dem die Moleküle durch Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt sind und In dem Netz kovalent gebundene, bestimmbare Gruppen oder Atome vorhanden sind, besteht. Das Polysaccharld kann dabei z. B. aus Stärke bestehen und die bestimmbaren Gruppen können Farbstoffreste sein. Die Bestimmung von Endohydrolasen mit diesem Reagens erfolgt In der Weiss, daß man eine Probe des zu untersuchenden Materials, z. B. eine Serum- oder Urtnprobe zu einer Aufschlämmung des Reagens in einer Pufferlösung gibt, so daß eine Umsetzung zwischen dem Enzym und dem Reagens unter Freisetzung von wasserlöslichen Fragmenten des Reagens, die die bestimmbaren Gruppen oder Atome, z. B. Farbstoffreste enthalten, stattfindet. Nach Einwirkung des Enzyms auf das Reagens innerhalb eines bestimmten Zeltraums wird der nicht angegriffene ungelöste Teil des Reagens von der die wasserlöslichen Fragmente des •Reagens enthaltenden Flüssigkeit abgetrennt, In der Regel durch Zentrifugieren, worauf die bestimmbaren uruppen oder Atome, z. B. die an den wasserlöslichen Fragmenten sitzenden Farbstoffreste als Maß der Enzymaktivität bestimmt werden.
Ein diesem Verfahren Im Prinzip ähnliches Verfahren zur Bestimmung der Amylaseaktlvltät von Amylase enthaltenden Proben Ist aus der US-PS 35 97 322 bekannt. Bei diesem Verfahren wird als Reagens ein In Wasser lösliches Reaktionsprodukt aus Stärke oder einer Stärkefraktion und einem reaktionsfähigen Farbstoff verwendet, das In Form einer wäßrigen Lösung mit der zu analysierenden "robe In Kontakt gebracht wird. Nach einer bestimmten Einwirkdauer werden das von der Amylase nicht angegriffene Reagens und gegebenenfalls in der zu untersuchenden Probe vorhandenes Protein durch Zusatz von Alkohol oder einer Lösung von Gerbsäure In Alkohol ausgefällt, worauf die optische Dichte der überstehenden wäßrigen Lösung, die die von der Amylase abgespaltenen, wasserlöslichen Farbstoffresie aufweisenden Stärkefragmente enthält, bestimmt wird.
Nachteilig an diesen »nassen« Bestimmungsverfahren Ist, daß sie zeit- und arbeitsaufwendig sind und zur Durchführung geschulte Arbeitskräfte benötigt werden.
Es ist ferner bekannt, z.B. aus der BE-PS 8 01 742 und der DE-OS 25 32918, zur chemischen Analyse von Flüssigkelten, Inbesondere biologischen Flüssigkelten, wie Körper-Flüssigkelten, z. B. Blut, Blutserum und Urin, analytische Elemente zu verwenden, die aus verschiedenen, gegebenenfalls auf einen Schichtträger aufgetragenen Schichten bestehen, von denen eine ein Reagens für die zu analysierende Substanz enthält, das bei Kontakt mit der Flüssigkeit mit der zu analysierenden Substanz unter Erzeugung einer farbigen Verbindung reagiert oder eine andere erfaßbare Veränderung aufgrund des Vorhandenseins der zu analysierenden Substanz herbeiführt.
Zur Durchführung analytischer Bestimmungsverfahren unter Verwendung der beschriebenen analytischen Elemente sind In der Regel nur Tropfen der zu analysierenden Flüssigkeit erforderlich, die auf das mehrschichtige Element aufgebracht werden. Die analytische Elemente des beschriebenen Typs verwendenden Bestlm-
;. f
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mungsverfahreii werden auch als trockene Analysenverfahren bezeichnet, im Gegensatz zu den sog. nassen Analyseverfahren.
Kennzeichnend für die bisher bekannt gewordenen mehrschichtigen analytischen Elemente Ist, daß in Ihnen die analytisch erfaßbare Verbindung erst durch eine Reaktion oder Reaktlonsfolge erzeugt werden muß. Diese Reaktionen sind oft schwierig zu steuern Außerdem könne« Nebenreaktionen ablaufen, die das analytische Bestimmungsverfahren stören. Schließlich müssen Reagens und Analyt nicht nur aufeinander abgestimmte Reaktionsgeschwindigkeiten haben, sondern die bei der Reaktion anfallenden oestlmmbaren Verbindungen, z. B. Farbstoffe, müssen auch die richtigen Absrvptlonsbanden aufweisen.
Mehrschichtige analytische Elemente des aufgezeigten Typs für die Durchführung quantitativer analytischer
Bestimmungsverfahren, die eine vorgebildete bestimmbare Verbindung enthalten, sind nicht bekannt geworden.
Auch sind keine mehrschichtigen analytischen Elemente für die Bestimmung von Amylase auf trockenem
Wege bekannt geworden. Aus der US-PS 3641 235 sind zwair bereits streifenförmige Testelemette mit einem
Gehalt an vorgebildeten bestimmbaren Verbindungen bekannt, doch Hegt In diesen Teststreifenelementen, die
In die zu analysierende Flüssigkeit gebracht werden, die bestimmbare, vorgebildete Verbindung, beispielsweise
ein Farbstoff, gebunden an ein Immunologisches Reagens vor, das In einer faserigen Schicht des Elementes
angeordnet Ist. Bei Kontakt des farbigen Immunologischen Fleagenzes mit der zu bestimmenden Substanz In
Gegenwart eines flüssigen Elulerungsmfitels, wird ein Teil des Farbstoffes freigesetzt und das Eluierungsmlttel
wäscht den Farbstoff In einen anderer. Bereich der gleichen faserigen Schicht. Derartige Elemente eignen sich
, lediglich fur die Durchführung von qualitativen Analysen. Im übrigen wird bei Verwendung eines solchen Test-
JJf^ Streifenelementes und eines flüssigen Elulemngsmtttels zum Zwecke der Überführung von Farbstoff von einem
,.-§&'Bezirk der Schicht In einen anderen Bezirk der Schicht eine Beendigung der Reaktion zwischen zu analysleren-2«~<Mer Substanz und Immunologischen Reagens hervorgerufen. Infolgedessen eignet sich ein solches faseriges Test-
,l^strelfenelement, wie auch die vorerwähnten nassen chemischen Bestimmungsverfahren nicht ftlr die Durch-
'fJ- führung kontinuierlicher Bestimmungsverfahren oder Schätzverfahren.
ji Aufgabe der Erfindung 1st es, ein mehrschichtiges analytisches Element mit den Merkmalen des Oberbegriffs - ' des Anspruchs 1 so auszubilden, daß trotz der Im trockenen Analyseverfahren einzusetzenden geringen Mengen ·' an zu analysierender Flüssigkeit eine quantitative Amylasebesttmmung möglich Ist. Das Element soll dabei ' auch eine kontinuierliche Bestimmung der Geschwindigkeit der Amylasereaktlon auf einfache Weise ermöglichen, die bisher In Lösung nicht durchführbar war.
Gelöst wird diese Aufgabe mit einem mehrschichtigen analytischen Element, wie es in den Ansprüchen gekennzeichnet Ist.
Die Tatsache, daß sich ein mehrschichtiges analytisches Element mit den in Anspruch 1 angegebenen Merkmalen zur Lösung der gestellten Aufgabe eignen würde, muß bei Kenntnis der den bekannten nassen Methoden zugrundeliegenden Prinzipien überraschen. So konnte nicht angenommen werden, daß die in einem auf das mehrschichtige analytische Element aufgebrachten Tropfen einer zu analysierenden Flüssigkeit vorhandene 'Flüssigkeitsmenge dazu ausreichen würde, das in der Reagensschicht vorhandene nicht diffusionsfähige Polysaccharid zu lyophilisleren, die durch gegebenenfalls vorhandene Amylase In der Reagensschicht abgespaitenen Polysaccharldfragmente von den nicht gespaltenen noch größeren Teilchen zu trennen und daß die abgetrennten Polysaccharidfragmenie In einer für die Durchführung einer quantitativen Analyse geeigneten Zeltspanne aus der Reagensschicht, gegebenenfalls durch weitere Schichten In die Registrierschicht wandern würden. Vielmehr mußte angenommen werden, daß die immer noch eine beträchtliche Molekülgröße aufweisenden Polysaccharldfragmente nach einer zeitaufwendigen Bildungsphase in der Reagensschicht verbleiben und nicht In die Registrierschicht diffundieren würden.
Ein erfindungsgemäßes mehrschichtiges analytisches Element eignet sich für die Bestimmung von Amylase in Flüssigkeiten, Insbesondere biologischen Flüssigkelten, wie beispielsweise Blut, Serum und Urin.
Ein erfindungsgemäßes Element weist mindestens zwei Schichten auf, die sich bei der Verwendung des ί Elements in »Flüssigkeitskontakt« miteinander befinden. Der Ausdruck »Flüssigkeitskontakt« besagt dabei, daß eine Flüssigkeit in dem Element von einer Schicht in eine andere Schicht, die übereinander angeordnet sind, übertreten kann, wobei die Möglichkeit zum Übertritt vorzugsweise gleichförmig längs der PContaktfläche zwischen den miteinander in Kontakt stehenden Schichten gegeben ist. Obgleich Schichten, die sich in Flüssigkeitskontakt miteinander befinden, einander benachbart sein können, können sie doch auch durch Zwischenschichten voneinander getrennt sein. Schichten des Elementes, die Schichten auf physikalischem Wege voneinander trennen, die In Flüssigkeitskontakt miteinander stehen, stehen mit diesen Schichten ebenfalls In Flüssigkeitskontakt. Obgleich sich die Schichten vor Aufbringung einer Probe auf das Element in Flüssigkeitskontakt miteinander befinden können, kann es gegebenenfalls auch zweckmäßig sein, daß sich die Schichten zunächst nicht im Flüssigkeitskontakt miteinander befinden, d. h. getrennt voneinander vorliegen und daß der Kontakt erst zum Zeitpunkt der Probenaufgabe erfolgt, beispielsweise durch Anwendung einer Druckkraft auf das Element.
Der Schichtträger eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes kann, sofern vorhanden, In vorteilhafter Weise für elektromagnetische Strahlung einer oder mehrerer Wellenlängen durchlässig sein. Die Verwendung eines sirahlungsdurchlässlgen Schichtträgers kann besonders vorteilhaft im Falle von Messungen von vergleichsweise geringem Strahlungsniveau oder Strahlungsstärke sein.
Die Zeichnungen dienen der näheren Erläuterung der Erfindung. Im einzelnen sind dargestellt in:
Flg. 1 . 2 und 3 vergrößerte schematische Darstellungen von erfindungsgemäßen analytischen Elementen;
FI g. 4 eine vergrößerte schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes Im Schnitt, bei ;em die Reagensschlchi von der Registrierschicht abstreifbar Ist;
Flg. 5 bis 3 Diagramme, die Daten veranschaulichen, die sich bei Verwendung erfindungsgemäßer analytischer Elemente erzielen lauen.
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Das In Flg. 1 dargestellte analytische Element nach der Erfindung besteht aus:
(a) der Reagensschicht 6 mit dem nlcht-diffuslonsfähigen Polysaccharld mit einer vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung, das In Gegenwart der zu analysierenden Flüssigkeit mit einem Gehalt an Amylase eine diffuslonsfählge Verbindung aus der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung zu bilden vermag,
(b) der Registrierschicht 4 für die Aufnahme der diffusionsfähigen Verbindung und
(c) dem Schichtträger 2.
Die Reagensschicht kann gegebenenfalls ein Trübungsmittel enthaften, um die vorgebildete, bestimmbare >o Gruppierung, die In der Reagensschicht verbleibt, abzudecken und um einen Hintergrund zu liefern, auf dem die In die Registrierschicht diffundierten Polysaccharidfragmente bestimmt werden können. Andererseits kann. ψ.
wie beispielsweise In Fl g. 2 dargestellt, auch eine besondere Strahlung blockierende Schicht angeordnet werden. Iv Alternativ ist es auch möglich, wie in Flg.4 dargestellt, die Reagensschicht von der Registrierschicht abzu- ·«(
streifen.
Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise 1st die Registrierschicht für Strahlung durchlässig. ■
Welsen die Schichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes eine ausreichende Festigkeit und Härte auf, so Ist die Verwendung eines Schichtträgers nicht erforderlich.
Bei dem In Flg. 2 dargestellten analytischen Element handelt es sich um ein besonders vorteilhaftes analytisches Element nach der Erfindung. Es besteht aus einem für Strahlung durchlässigen Schichtträger 2, auf den aufgetragen sind:
(a) die Reagensschicht 6, die für die zu bestimmende Amylase durchlässig Ist und das nlcht-dlffuslonsfählge , Poiysaccharid enthält;
(b) die Strahlung blockierende Schicht 7, die für die zu bestimmenden Polysaccharidfragmente durchlässig 1st und
(c) die für Strahlung durchlässige Registrierschicht 4, die für die zu bestimmenden Polysaccharidfragmente ebenfalls durchlässig Ist und In der die Polysaccharidfragmente bestimmt werden können.
Gegebenenfalls kann die Reglstrierschlcht des weiteren ein Beizmittel für die Polysaccharidfragmente enthalten.
Die Reglstrierschlcht 1st vorzugsweise zwischen Schichtträger und Strahlung blockierender Schicht angeordnet und die Strahlung blockierende Schicht Hegt vorzugsweise zwischen der Reglstrierschlcht und der Reagensschicht.
In vorteilhafter Weise kann die Reagensschicht isotrop porös sein und vorzugsweise weist sie eine praktisch gleichförmige Durchlässigkeit für die zu bestimmende Amylase und die diffusionsfähigen Polysaccharidfragemente auf. Die Strahlung blockierende Schicht weist In vorteilhafter Welse ebenfalls eine gleichförmige Durchlässigkeit für die Polysaccharidfragemente auf. Die Reglstrierschlcht weist eine entsprechende oder ähnliche Durchlässigkeit für die Polysaccharidfragemente auf. Besonders vorteilhafte. Strahlung blockierende Schichten enthalten ein Trübungsmittel, z. B. ein Pigment oder ein Polymer in geeigneter Form, beispielsweise ein sog. 4« Blush-Polymer, wie in der DE-PS 23 32 760 beschrieben, oder ein Pigment und ein solches Polymer.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind die Strahlung blockierende Schicht und die Registrierschicht nicht faserig und eine oder beide dieser Schichten sind für das nlcht-dlffuslonsfählge Polysaccharld in der Reagensschicht undurchlässig.
Das in Fig. 3 dargestellte, ebenfalls besonders vorteilhafte analytische Element nach der Erfindung besieht aus dem Schichtträger 2, der hierauf aufgetragenen Reagensschicht 6, der Reglstrierschlcht 4, der Strahlung blockierenden Schicht 7 und der nichtfaserigen Ausbreitschicht 8, bei der es sich vorzugsweise um eine Isotrop poröse Ausbreitschicht handelt. Durch die Ausbreitschicht wird erreicht, daß der Reagensschicht eine besonders gleichförmige Konzentration der zu analysierenden Probe zugeführt wird.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind sämtliche Schichten des Elementes nicht faserige Schichten. Der Ausdruck »nicht-faserig« besagt dabei, daß derartige Schichten frei oder praktisch frei von faserigen Stoffen oder Materialien sind, d. h. daß sie keine faserigen Komponenten in einer Menge oder Konzentration enthalten, die sich störend auf die Ausbreitung der zu analysierenden Probe oder störend auf die Bestimmung des analytischen Ergebnisses durch radiometrische Methoden auswirken würde.
Bei der In Fig. 4 dargestellten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes sind Reagensschicht 6 und die gegebenenfalls vorhandene Ausbreitschicht 8 von der Reglstrierschlcht 4 des Elementes abstreifbar. In diesem Falle kann die RegistrlerschJcht 4 auf einem strahlungsdurchlässigen oder opaken Schichtträger 2 angeordnet sein und die Polysaccharidfragmente, die in die Registrierschicht diffundiert sind, lassen sich auf radiometrischem Wege durch entsprechende optische Durchlässlgkelts- oder Reflexionsmessungen der Registrierschicht bestimmen, nachdem die Reagens- und gegebenenfalls auch die Ausbreitschicht von der Registrierschicht abgestreift worden sind.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung liegen einige oder sämtliche der einzelnen Schichten des Elementes zunächst voneinander getrennt vor und das Element wird bei oder nach Aufbringung der flüssigen Testprobe auf das Element der Einwirkung von Druckkräften ausgesetzt, wodurch die einzelnen Schichten In Flüssigkeitskontakt miteinander gelangen. Ein solcher Aufbau elr.es erfindungsgemäßen Elementes ist vorteilhaft, wenn es gilt, einen Kontakt zwischen einzelnen Schichten des Elementes zu vermelden, bis die Flüssigkeitsprobe aufgebracht wird.
Die Reagensschichten enthalten normalerweise eine Matrix oder einen Träger, in der bzw. dem das Reagens verteilt ist. Da das Reagens jedoch selbst zu einer diskreten Schicht verformt werden kann, Ist die Verwendung
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einer Matrix oder eines Trägers nicht unbedingt erforderlich. Die Auswahl der Im Einzelfalls vorteilhaftesten Matrix hängt zu einem gewissen Grade von dem beabsichtigten Verwendungszweck des Elementes ab, d. h, ob es zur Durchführung von qualitativen, halbquantitativen oder quantitativen Analysen verwendet werden soll. Die verschiedensten porösen, faserigen Materialien, wie Papiere, Vliese, Filze und Webwaren, gleichgültig ob aus natürlichen oder synthetischen Stoffen hergestellt, können verwendet werden. Die Verwendung derartiger !Materialien und ihre Verwendungsweise zur Herstellung analytischer Elemente 1st beispielsweise aus den US-PS |8 02-842, 38 09 605, 3814663 und 38 97 214 bekannt. Andere poröse, jedoch nichtfaserige Reagensträger, die sich zur Herstellung der Schichten eignen, sind beispielsweise mikroporöse Polymere, z. B. des aus der US-PS 35 52 929 bekannten Typs, plastische poröse oder schwammige Materialien und poröse keramische Produkte, beispielsweise des aus der US-PS 35 54 700 bekannten Typs sowie in granulierter Form vorliegende Stoffe, z. B. IQ des aus der US-PS 37 15 192 bekannten Typs und polymere, offenzelllge Schäume, beispielsweise des aus der iUS-PS 39 17 453 bekannten Typs.
In vorteilhafter Welse können zur Herstellung der Reagensschichten als Reagensträger auch Gelatineschichten verwendet werden, die für die aufgebrachten flüssigen Proben durchlässig sind.
. Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung 1st der filmbildende Stoff in der zu analysierenden ^Flüssigkeit quellbar. Durch Kontakt mit der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe quiilt der filmbildende Stoff vund erhöht seine Durchlässigkeit oder Permeabilität für die Flüssigkeit der zu analysierenden Probe. Auf diese ftWelse läßt sich die Durchdringung der Reagensschicht mit der Probe beschleunigen, wie auch der effektive !Kontakt zwischen Probenflüssigkelt und Reagens, das In der Reagensscblcht verteilt ist.
Gel-Bildner werden oftmals bevorzugt als Reagensträger in Elementen verwendet, die für eine quantitative Analyse bestimmt sind. Sie weisen normalerweise eine viel größere gleichförmige Durchlässigkeit oder Permeabilität für Flüssigkelten auf als faserige Stoffe.
Die Durchlässigkeit oder Permeabilität der Reagensschichten, die einen homogenen, ftlmbildenden Stoff als sReagens-Matrix aufweisen, kann sehr gleichförmig sein, so daß, wenn eine homogene Flüssigkeit gleichförmig |auf die Oberfläche der Schicht aufgebracht wird, entsprechende Messungen der Konzentration der Flüssigkeit •innerhalb der Schicht, jedoch an verschiedenen Stellen einer Oberfläche der Schicht, normalerweise zu gleichen 'oder praktisch gleichen Ergebnissen führen, d. h. beispielsweise Ergebnissen, die um weniger als etwa ± 10%, ;und vorzugsweise weniger als um etwa ± 3 bis 5% voneinander abweichen, wenn radiometrische Messungen (durch eine kleine Öffnung von beispielsweise 3 bis 10 μπι Breite und 50 bis 100 μπι Länge durchgeführt ^werden In vorteilhafter Weise können Reagensschichten, die eine praktisch gleichförmige Permeabilität für ;Probenflüsslgkelten aufweisen, auch Isotrop porös sein.
1st das Lßsungsmittelmedium der zu analysierenden Flüssigkeit bekannt, so ist die Auswahl eines geeigneten Filmbildners als Matrix fur die P^eagensschlcht einfach, wenn die Löslichkeltselgenschaften des Filmbildners bekannt sind. Beispielsweise eignen sich Celluloseacetate eines vergleichsweise geringen Acetyllerungsgrades ?;oder Cellulosenltrate eines vergleichsweise geringen Nitrlerungsgrades In den Fällen, in denen Flüssigkelten mit }i; ' kurzkettlgen Alkanolen als Lösungsmittelmedium analysiert werden.
In vielen Fällen ist das Lösungsmittelmedium vollständig oder teilweise wäßrig. Eine besonders wichtige Gruppe von wäßrigen Flüssigkelten, die mit erfindungsgemäßen Elementen analysiert werden können, sind biologische Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blutplasma, Serum und Urin. Für die Analysen von biologischen, biochemischen und anderen wäßrigen Flüssigkeiten, haben sich hydrophile (d. h. mit Wasser benetzbare) Filmfblidner als besonders vorteilhafte Reagensträger für die Herstellung von Reagensschichten erwiesen. Derartige !hydrophile Reagensträger können auch in Wasser oder anderen wäßrigen Medien einer zu analysierenden Flüssigkeit quellbar sein. Vorteilhafte hydrophile Stoffe bestehen aus natürlich vorkommenden hydrophilen Kolloiden wie beispielsweise Gelatine; Polysacchariden, wie beispielsweise Gümnüarabicufn, Agar-Agar und Agarose; Cellulose sowie Cellulosederivaten sowie synthetischen Stoffen, wie beispielsweise wasserlöslichen Polyvlnylverbindungen, beispielsweise Poly(vlnylalkohol) und Poly(vlnylpyrrolidon) und Acrylamldpolymeren.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung derart ausgeblidei, daß die erzeugte diffusionsfähige Verbindung mit der vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung direkt auf radlometrlschsm Wege bestimmbar Ist. Der Ausdruck »auf radiometrischem Wege« besagt, daß die Bestimmung mittels der verschiedensten üblichen bekannten analytischen Abtastverfahren erfolgen kann, bei denen eine Strahlung verwendet wird, um ein analytisches Ergebnis zu erhalten.
Typische, vorgebildete, bestimmbare Gruppierungen, die direkt auf radiometrischem Wege bestimmbar sind, sind (a) auf colorlmetrlschem Wege bestimmbare Gruppierungen, wie beispielsweise Farbstoffe, die Extinktionskoeffizienten oder Absorptionsspektren aufweisen, die zur Erkennung oder zur Bestimmung Ihrer Konzentration unter Anwendung üblicher bekannter colorimstrlscher Bestimmungsvorrichtungen verwendet werden können und (b) Strahlung emittierende Verbindungen, wie beispielsweise fluoreszierende Verbindungen.
Es können jedoch auch andere Typen von Strahlung aussenden Verbindungen mit vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierungen In der Reagensschicht verwendet werden. Beispielsweise kann das Polysacchand als bestimmbare Gruppierung auch eine phosphoreszierende Gruppierung oder eine radioaktiv markierte Gruppierung aufweisen, so daß bei Einwirkung der zu untersuchenden Flüssigkeit auf das Reagens eine bestimmte !> <> Menge einer radioaktiv markierten diffusionsfähigen Verbindung freigesetzt wird. Diese radioaktive Verbindung kann dann In die Registrierschicht des Elementes wandern, wo sie aufgrund Ihrer charakteristischen radioaktiven Emission bestimmt werden kann.
In typischer Welse enthält die Reagensschicht als Stoff, der mit der Amylase zu reagieren vermag, Stärke mit einer vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung, z. B. einem Farbstoffrest, der chemisch an einzelne wiederkehrende Glucoseelnhelten der Stärke gebunden Ist.
Die Amyiase bewirkt dann eine katalytische Hydrolyse der Stärke, was zu einem Aufbruch der Stärke In eine Reihe von Polysaccharfdelnhelten eines geringeren Molekulargewichtes führt. Diese Aufspaltung ist die Folge
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der Hydrolyse der a-l,4-Blndungen der Amylose- bzw. Amylopectlnfraktionen, wobei diese Fraktionen die !hauptsächlichsten Komponenten der Stärke ausmachen.
Es hat sich gezeigt, daß durch Einverleiben eines derartigen Stärkepräparates in die Reagensschicht ein Reagens erhalten wird, das in der Reagensschicht in Gegenwart einer a-amylasefrelen Flüssigkeitsprobe prak- s lisch nicht-dlffundierend 1st. In Gegenwart einer Probe jedoch, die a-Amylase enthält, erfolgt ein charakteristischer katalytlsch-hydrolytlscher Abbau des Stärkepräparates. Als Folge hiervon werden vergleichsweise niedrig - {molekulare Polysaccharldelnhelten freigesetzt, die aufgrund Ihres geringeren Molekulargewichtes diffusionsfähig sind und in Gegenwart der wäßrigen Probe durch die Reagensschicht In die Registrierschicht diffundieren. Da 'die vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierungen chemisch an die einzelnen, vergleichsweise niedrig molekularen ίο Polysaccharldelnhelten gebunden sind, ist es möglich, das Vorhandensein dieser Einheiten In der Registrierschicht festzustellen.
Zur Herstellung erfindungsgemäßer analytischer Elemente können die verschiedensten Stärkepräparate mit
vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierungen verwendet v/erden, einschließlich Stärkesubstrate mit radioaktiven Gruppierungen oder Markierungen, mit coiorimetrisch bestimmbaren Gruppierungen, beispielsweise Farbstoff-
is resten und fluoreszierenden Resten. Die speziellen vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierungen sind dabei -entweder durch physikalische oder durch chemische Bindung an die einzelnen wiederkehrenden Saccharid-
Einheitsn des Stärkemoleküls gebunden. |
Besonders vorteilhafte Ergebnisse Im Falle der Analyse von a-Amylase lassen sich dann erhalten, wenn als J
$ . inJcht-dlffusionsfählge Stoffe solche Stoffe verwendet werden, die coiorimetrisch bestimmbar sind, z. B. Stärken,
VdIe komplexgebundene, Übliche, coiorimetrisch bestimmbare Farbstoffe aufweisen, d. h. Farbstoffe, die dafür -' bekannt sind, daß sie mit Stärken Komplexe bilden, beispielsweise die verschiedensten halogenierten Farbstoffe sauf Cyanur-Basis, wie beispielsweise Chlortriazlnfarbstoffe. Die Herstellung derartiger Stärkekomplexe mit bestimmbaren Gruppierungen ist bekannt und braucht deshalb hler nicht näher erläutert zu werden. Verwiesen
A swlrd nur beispielsweise auf die US-PS 35 97322 und 36 94 318, aus denen die verschiedensten Komplexe aus ..;;.. 25 «Stärke und halogenierten Farbstoffen auf Cyanur-Säurebasls bekannt sind.
, Besonders vorteilhafte Ergebnisse lassen sich erfindungsgemäß auch durch Verwendung von nicht-diffusionsfähigen fluoreszierenden Stärkekomplexen erhalten, deren hydrolytische Spaltung durch a-Amy!ase katalysiert wird. Ein Beispiel für einen derartigen fluoreszierenden Stärkekomplex ist der Komplex, der bei der Umsetzung von Amylase mit N-Carboxyanihanlllnsäureanhydrld, einer bekannten fluoreszierenden Verbindung anfällt. .30 Erfolgt diese Umsetzung unter geeigneten Bedingungen, z. B. unter Verwendung eines Pyrldlnkatalysators sowie In Gegenwart von Dlmethylsulfoxld als Lösungsmittel, so läßt sich ein stark fluoreszierendes Stärke-Reaktionsprodukt erhalten, indem eine vergleichsweise große Anzahl einzelner wiederkehrender Glucose-Elnheiien des Stärkepolymeren verestert und in Anthranllat-Elnhelten überführt worden ist. Die Herstellung derartiger Stärkekomplexe läßt sich durch die folgende Reaktionsgleichung wiedergeben:
Stärkegerüst
Dimethylsulfoxid H
Die auf diese Welse herstellbaren fluoreszierenden Stärken weisen aufgrund der vergleichsweise großen
5« Anzahl von Glucose-Elnhelten, die In Anthranilat-Elnheiten überführt worden sind, einen hohen Fluoreszenzgrad auf. Nach dem beschriebenen Verfahren lassen sich insbesondere Stärken herstellen, die im optimalen Falle eine Anthranllat-Elnhelt auf 6 Glucose-Elnhelten aufweisen.
Die im Einzelfalle verwendete spezielle vorgebildete bestimmbare Gruppierung für die Bestimmung von a-Amylase hängt zum großen Teil von den speziellen Eisenschaften des anfallenden Komplexes ab, der als Reagens verwendet werden soll. Beispielsweise läßt sich ein löslicher cder unlöslicher vorgebildeter Komplex verwenden, der in einem wäßrigen Medium bei 22° C and einem pH-Wert von 7,0 loslich ist. Ein In Wasser unlöslicher vorgebildeter Komplex, der erfindungsgemäß als Reagens verwendet werden kann, 1st beispielsweise aus der US-PS 36 94 318 bekannt. Weitere Beispiele von verschiedenen In Wasser löslichen Komplexen, die sich erfindungsgemäß verwenden lassen, sind aus den US-PS 35 97 32.2, 37 05 149 und 36 79 661 bekannt.
Zur Herstellung der Stärkekomplexe können In Wasser lösliche als auch In Wasser unlösliche Stärken verwendet werden. Das Herausdiffundieren der Stärkekomplexe aus der Reagensschicht der analytischen Elemente ;kann beispielsweise dadurch verhindert werden, daß die Stärkekomplexe In einer Reagensschichl untergebracht werden, die eine Porengröße aufweist, die verhindert, daß die nlcht-hydrollslerten Stärkekomplexe aus der Schicht diffundieren, wobei die Porengröße der Schicht jedoch groß genug 1st, daß die abhydroHslerten Stärke-
<?5 fragmente von vergleichsweise geringem Molekulargewicht durch die Schicht diffundieren können. Alternativ ist es auch möglich, dls nlcht-hydrolyslerten Stärkekomplexe In einer Reagensschicht unterzubringen, die auf eine gegebenenfalls Strahlung blockierende Schicht und eine Registrierschicht aufgetragen wird (verwiesen wird auf Flg. 2). Bei dieser Ausgestaltung der Erfindung Ist die Porengröße der Registrierschicht und der gegebenen-
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fails vorhandenen Strahlung blockierenden Schicht derart, daß diese Schichten für die nlcht-hydiolyslerten Stärkekomplexe praktisch undurchlässig sind, jedoch durchlässig für die abhydrolysierten Stärkefragmente von geringerem Molekulargewicht. Dies bedeutet, daß die Porengrößs der Reagensschicht, der Strahlung blockierenden Schicht und/oder der Registrierschicht eines erfindungsgemäßen Elementes für die Bestimmung von ■Amylase von der Molekülgröße der nlcht-hydrolyslerten Stärkeprodukte und der Hydrolyseprodukte abhängt. S
Die Registrierschicht kann von der Reagensschicht oder Reagensschichten, sofern mehrere vorhanden sind, durch eine Strahlung blockierende Schicht getrennt sein, z. B. eine reflektierende und/oder opake Schicht, um das analytische Bestimmungsverfahren zu erleichtern. Die Registrierschicht, die In vorteilhafter Weise ebenfalls in der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar 1st, kann unter Verwendung von hydrophilen Kolloiden hergestellt werden, wie sie auch zur Herstellung der Reagensschicht verwendet werden können.
- Wird aus der Reagensschicht a\a Farbstoff oder eine andere beizbare Verbindung freigesetzt, so kann die Registrierschicht In vorteilhafter Weise ein Beizmittel enthalten, beispielsweise ein solches Beizmittel, wie es zum Beizen von Bildfarbstoffen zur Herstellung von farbphotographlschen Filmen und Papieren verwendel wird, \ Geeignete Beizmittel sind beispielsweise Polyvinylpyrldlnverblndungen, wie beispielsweise POfy-4-vlnyIpyrldln, die 2-Vlnylpyridlnpolymeren und ähnlichen Verbindungen des aus der US-PS 24 98430 bekannten Typs .ii sowie CetyltrJmethylammoniumbromld.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist ύ'^ Peg'^nerschlcht eines erfln- | 'dungsgemäßen Elementes ein polymeres Beizmittel des aus der GB-PS 12 61925 oui» utss au^ - . "«-PS 36 25 694. 37 09 690, 37 73 509, 38 59 096, 38 98 088 oder 39 58 995 t(;kannten Typs auf.
Welsen die erfindungsgemäßen analytischen Elemente eine Strahlung blockierende Schicht auf, so Ist diese 2" vorzugsweise zwischen der Reagensschicht und der Registrierschicht angeordnet. Die Strahlung blockierende Schicht ist für die aus den vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierungen gebildeten Verbindungen durchlässig und dient dazu, den Durchtritt von elektromagnetischer Strahlung, beispielsweise den Durchtritt von I-hi Jc- > Wellenlänge oder Wellenlängen, die bei der analytischen Bestimmung verwendet werden, zu ■verhindern, Bei '' Verwendung einer solchen Schicht kann die Farbe oder können andere potentielle Störfaktoren für die Bestlm- ">i mung des analytischen Ergebnisses gegenüber der Registrierschicht oder Reagensschicht maskiert werden. ^Derartige Schichten können ein Trübungsmittel enthalten, das aufgrund seiner Absorptionsfähigkeit oder Refiexionsfählgkeit einen Strahlung inhibierenden Effekt ausübt, wenn e3 in die Schicht eingearbeitet wird. So kann die Strahlung blockierende Schicht beispielsweise aus einer Matrix aufgebaut sein, die ein Trübungsmittel enthält, z. B. ein Pigment, wie Ruß oder ein anderes anorganisches Pigment, z. B. ein Metalloxid oder ein W Mfütallsalz, z. B. Titandioxid, Zinkoxid oder Barlumsulfat. '
; Auch können sog. »Blushw-Polymere, die Im allgemeinen von Natur aus reflektieren, als Trübungsmittel für ; .adle Herstellung von Strahlung blockierende Schichten verwendet werden.
< In vorteilhafter Welse weisen aus »Blush«-Palymeren aufgebaute Schichten des weiteren ein reflektierendes ^anorganisches Pigment auf. 3<
Die Plgmentmenge, die in einer Schicht gemeinsam mit einem »Blush«-Polymeren untergebracht werden (kann, kann sehr verschieden sein. Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, 5 bis 1000 Gew-%, insbesondere 10ö bis 600 Gew-% Pigment, bezogen auf das Gewicht des »BIush«-Polymeren zu verwenden.
Weist ein erfindungsgemäßes Element In vorteilhafter Weise des weiteren eine Ausbreltschlcfit auf, so kann Jdlese Schicht beispielsweise eine Schicht des aus der US-PS 39 92 158 bekannten Typs sein.
i. Die Ausbreilschicht bewirkt In vorteilhafter Welse eine gleichförmige Konzentrationsverteilung von ausgebreiteten Substanzen pro Flächeneinheit auf der Oberfläche, die der Reagensschicht gegenüberliegt und mit der sich 55 die Ausbreitschicht In Strömungskontakt befindet.
!n vorteühafter Weise kann es sich bei de? Ausbrelischichi um eine isotrop-poröse Schicht bündeln.
Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente können selbsttragende Elemente sein oder aber einen Schichtträger aufweisen. Als Schlchtträgermaterlallen eignen sich üblich« bekannte Schlchtträgermateilallen aus Polymeren, beispielsweise Celluloseacetat, Poly(äthylenterephthalat), Polycarbonate und Polyvlnylvertlndungen, wie !beispielsweise Polystyrole.
Besonders vorteilhafte Schichtträger sind strahlungsdurchlässige Schichtträger, die für elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder bestimmter Wellenlängen Innerhalb eines Bereiches von etwa 200 nm bis etwa #00 nm durchlässig sind, wie auch Schichtträger, die für radioaktive Strahlung durchlässig sind. Es kann des '^weiteren vorteilhaft sein, einen Schichtträger zu verwenden, der für eine oder mehrere enge Wellenlängenbanden du.chlSsslg und für benachbarte Wellenlängenbanden undurchlässig Ist. Dies läßt sich beispielsweise erreichen durch Imprägnieren oder Beschichten des Schichtträgers mit einem oder mehreren Farbstoffen mit entsprechenden Absorptlonscharakterlstlka. Weist ein Element einen Schichtträger auf, so befinden sich die Reagensschicht, die gegebenenfalls vorhandene Strahlung blockierende Schicht und die ReglstrlerschJcbt normalerweise übereinander angeordnet zwischen dem Träger und der gegebenenfalls vorhandenen Ausbreitschicht, die oftmals die äußerste Schicht des Elementes darstellt.
Die einzelnen Komponenten einer jeden Schicht und die Schichtenkonfiguration hängen von dem Verwendungszweck des Elementes ab. Die Porengröße der Ausbreitschicht kann derart ^awäult werden, daß die Schicht . ψ. unliebsame Probenkomponenten ausfiltern kann, die beispielsweise die analytische Reaktion stören könnten oder die Bestimmung des Testergebnisses, das innerhalb des Elementes erzeugt wird. Für die Analyse von Blut z. B. haben sich poröse Schichten mit einer Porengröße von 1 bis etwa 5 μίτι als besonders vorteilhaft zum Ausfiltern von Blutkörperchen erwiesen, die In typischer Welse eine Größe von etwa 7 bis etwa 30 pm haben.
Gegebenenfalls kann ein Element mehrere Ausbreitschichten aufweisen, von denen eine jede verschiedene Eigenschaften bezüglich Ausbreitung und Fllterwlrkung haben kann.
Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, zur Herstellung der einzelnen Schichten eines erfindungsgemflßen Elements ein oder mehrere oberflächenaktive Verbindungen, z. B. anionische oder nicht-ionische oberflächenak-
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tlve Verbindungen zu verwenden. Diese können beispielsweise die Beschlchtbarkelt und die Geschwindigkeit der Ausbreitung von Proben In Ausbreitschichten verbessern, die nicht leicht durch Flüssigkeitsproben benetzbar sind, sofern kein Hilfsmittel, wie beispielsweise eine oberflächenaktive Verbindung zur Herstellung der Ausbreitschicht verwendet wurde.
Des weiteren kann es zweckmäßig oder vorteilhaft sein, in einer oder mehreren der verschiedenen Schichten des Elementes, je nach der speziell zu analysierenden Substanz, eine oder mehrere Puffersubstanzen unterzubringen, um den geeigneten pH-Wert für das Bestimmungsverfahren einzustellen. In typischer Welse lassen sich derartige Puffersubstanzen In der Reagensschicht unterbringen. Jedoch können Puffersubstanzen auch In anderen Schichten beispielsweise der Ausbreitschicht, der Strahlung blockierenden Schicht oder der Registrierschicht
i" untergebracht werden. Beispielsweise hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Phosphat-Puffersubstanzen In der Reagensschicht des analytischen Elementes unterzubringen.
Im Falle der Analyse von Blut unter Verwendung eines analytischen Elementes nach der Erfindung können die Blutkörperchen zunächst vom Serum abgetrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, worauf das Serum auf das analytische Element aufgebracht wird. Eine solche Abtrennung der Blutkörperchen ist jedoch nicht erforderlich, beispielsweise dann nicht, wenn spektrophotometrischs Reflexions-Analyseverfahren angewandt werden, um die vorgebildeten, bestimmbaren Gruppleningen quantlatlv zu erfassen. So Ist es möglich, dem Element Blut zuzuführen, In welchem Falle die Blutkörperchen mittels einer Fllterschlcht abfiltriert und von der Registrierschicht ferngehalten werden, wobei die Filterschicht gleichzeitig eine Strahlung blockierende Schicht sein kann.
Die erfindungsgemaßen analytischen Elemente können in verschiedenen Formen vorliegen, beispielsweise endlosen oder länglichen Bändern, praktisch jeder Breite, In Form von Blättern oder in Form von kleineren Chips. Es 1st auch möglich, die Elemente so auszugestalten, daß sie für die Durchführung von einem oder mehreren Tests eines Typs verwendbar sind oder einer Vielzahl von Testen von verschiedenen Typen. Im letzteren Falle kann es zweckmäßig oder vorteilhaft sein, auf einen Schichtträger einen oder mehrere Streifen oder Bezirke zu erzeugen, und zwar gegebenenfalls aus Bsschlchtungsmassen unterschiedlicher Zusammensetzung unter Erzeugung eines zusammengesetzten Elementes, das für die Durchführung verschiedener Bestimmungen geeignet Ist.
In typischer Welse hat ein erfindungsgemäßes Element einen solchen Aufbau, daß eine auf das Element aufgebrachte, zu analysierende Probe zunächst auf eine Ausbreitschicht auftrifft, sofern eine solche vorhanden
w Ist, bevor die Probe auf eine nlcht-ausbreltende Reagensschicht auftrifft, wobei die Probe zunächst mit der Oberfläche der Ausbreitschicht in Kontakt gelangt, die von der Reagensschicht am weitesten entfernt Ist. Da die analytische Genauigkeit der erfindungsgemäßen Elemente nicht oder nicht wesentlich durch Veränderung des Volumens der aufgebrachten Proben beeinträchtigt wird, und zwar Insbesondere dann nicht, wenn eine Ausbreitschicht vorhanden Ist, kann das Aufbringen der Proben auf manuellem Wege oder maschinell erfolgen.
Aus Zwsckmäßigkeitsgründen jedoch kann es vorteilhaft sein, wenn gleiche oder praktisch gleiche Probenvolumina aufgebracht werden.
In typischer Weise wird bei Durchführung eines analytischen Verfahrens unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Elementes, das manuell oder automatisch durchgeführt werden kann, das Element von einer Vorratsrolle abgezogen oder einem Vorratsbehälter, beispielsweise einem Kipp-Vorratsbehälter entnommen und In eine solche Lage gebracht, daß ein freier Tropfen, Kontakt-Tüpfe! oder eine andere Form der zu analysierenden flüssigen Probe, z. B. aus einem geeigneten Zufuhrgerät oder Doslergerät aufgebracht v/erden kann. Nach Aufbringung der Probe und zweckmäßig nachdem die flüssige Probe von einer Ausbreitschicht aufgenommen worden 1st, kann das Element konditioniert werden, beispielsweise durch Erhitzen, durch Befeuchten oder dergleichen, wodurch gegebenenfalls der Erhalt eines Testergebnisses beschleunigt oder erleichtert werden kann. Im Falle eines automatisierten Verfahrens kann es des weiteren vorteilhaft sein, wenn die Ausbreitschicht Ihre Funktion Innerhalb von einigen Sekunden erfüllt, wenn jedoch genügend Zelt für eine Zumessung verbleibt. Im Gegensatz zu der praktisch plötzlichen und unregelmäßigen Diffusion, die Im Falle von absorbierenden faserigen Papieren zu beobachten 1st. Nachdem das analytische Ergebnis in Form einer bestimmbaren Veränderung vorliegt, kann das Element
5» durch eine Zone mit einer geeigneten Vorrichtung, eile sich für die Durchführung spektrophotometrischer Messungen eignet, geführt werden. Mit einer solchen Vorrichtung kann beispielsweise ein Energiestrahl, z. B. ein Lichtstrahl durch den Schichtträger und die Registrierschicht oder die Reagensschicht geführt werden. Das Licht wird dann reflektiert, beispielsweise von einer Strahlung blockierenden Schicht des Elementes, und zwar zurück zu der Bestimmungsvorrichtung oder gelangt durch das Element zu einem Detektor, sofern eine Durch-
s' lässigkeits- oder Transmissionsbestimmung erfolgt. Die Anwendung der Reflexlon.s-Spektrophotometrle kann In manchen Fällen besonders vorteilhaft sein, da bei Anwendung dieses Verfahrens Interferenzen oder Störungen von Rückständen, wie beispielsweise Blutkörperchen ausgeschaltet weiden können, weiche auf oder in den Schichten des Elementes noch vorhanden sein können. In vorteilhafter Welse werden übliche Methoden der Fluoreszenz-SpektrophotometrJe angewandt, wenn die bestimmbare Substanz oder Verbindung fluoresziert. Die
M> Bestimmung kann unter Anwendung von Energie erfolgen, die die fluoreszierende Substanz anregt und unter Verwendung slnes Detektors, der die Fluoreszenz-Emission ermittelt. Wird Blutserum analysiert oder werden Maßnahmen getroffen, um unerwünschte Blutrückstände zu eliminieren, so lassen sich Durchlässigkeitsmessungen oder Transmissionsmethoden anwenden, um das oder die anzeigenden Reaktionsprodukte zu bestimmen oder quantitativ zu erfassen. Indem man einen Strom von Strahlungsenergie, beispielsweise UV-Licht, sichtbares Licht oder Infrarot-Licht auf eine Oberfläche des Elementes richtet und den Austritt der Energie aus der gegenüberliegenden Oberfläche des Elementes mißt. Ganz allgemein hat sich eine elektromagnetische Strahlung eines Wellenlängenberelches von etwa 200 bis etwa 900 nm als vorteilhaft für derartige Messungen erwiesen. Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
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Beispiel 1
Es wurde ein Integrales analytisches Element für die Bestimmung von a-Amylase des In Flg. 2 dargestellten Aufbaues hergestellt, das In der Ausbrelt-Reagensschlcht 6 als nlcht-dlffuslonsfflhises Polysaceharld eine Im Handel erhältliche gefäri ie Starke enthielt. Die Stärke enthielt, chemisch gebunden, als vorgebildete, bestimmbare Gruppierung einen reaktionsfähigen Farbstoff auf Cyanurchlorldbasls (Clbachron Brllllantblau F3GA4, Hersteller Clba-Gelgy). Die Reagensschicht wies des weiteren als Matrix zur Unterstützung der Ausbreitung der aufgebrachten Flüssigkeitsprobe handelsübliche mikrokristalline Cellulosetellchen auf.
Die Strahlung blockierende Schicht 7 enthielt Tltandloxldtellchen, dlsperglert In ungehärteter Gelatine. Die Reglsirierschlcht 4 bestand aus ungehärteter Gelatine mit einem Beizmittel »A«. bestehend aus einem Mischpolymerisat aus Styrol, N-Vlnylbenzyl-N.N-dlmelhylbenzylammonlumchlorld und Dlvlnvylbenzol.
Das Element wurde wie folgt hergestellt:
A. Registrierschicht
Zur Herstellung der Schicht wurde eine Beschichtungsmasse verwendet, die bestand aus:
Wasser ungehärteter Gelatine (festgewordene Mischung aus Gelatine und
Wasser mit 10 Gew.-% Gelatine) Beizmittel »A«, 13 gew.-Klge flüssige Mischung des Beizmittels
»A« In Wasser p-Nonylphenoxylglycerin als oberflächenaktive Verbindung In Form
einer 10 gew.-%igen Lösung in Wasser
7,2 ml
10,6 g
8,2 ml
15 Tropfen
Die Gelatine wurde bei 40° C aufgeschmolzen. Daraufhin wurden der Schmelze Wasser, Beizmittel und%berflächenäktlve Verbindung zugesetzt, worauf die Schmelze auf einem transparenten Polycarbonat-SchlchUrBger ^aufgetragen und die aufgetragene Schicht an der Luft getrockne·. *~urde.
Beschichtungsstärken
Gelatine Beizmittel »A«
2,16 g/m2
2,16 g/m2
B. Strahlung blockierende Schicht Zunächst wurde eine TIO2-Disperslon hergestellt aus:
Wasser TlOz-Tellchen Octylphenoxypolyäthoxyäthanol als oberflächenaktive Verbindung
160 ml
40g
2g
Das Titandioxid wurde dem Wasser zugesetzt, worauf die Mischung In einer Kolloidmühle gründliche vermählen wurde. Dann wurde die oberflächenaktive Verbindung zugesetzt.
Die erhaltene Dispersion wurde dann zu einer Beschichtungsmasse aus:
Wasser " - . "n?0ml
TIOj-Dlsperslon (wie oben beschrieben) 29,9 ml
ungehärtete Gelatine (fest gewordene Mischung aus Gelatine und 9,0 g
Wasser mit 10 Gew.-% Gelatine)
welterverarbeltet.
Die Gelatine wurde bei 400C aufgeschmolzen, worauf Wasser und die TlO2-Dispersion unter schwachem Rühren (zur Verhinderung von LufteinschiOssen) in die Gelatine eingerührt würden. Die auf diese Weise hergestellte Beschlchtungsmasse wurde dann auf die zunächst erzeugte Reglstrierscriichi aufgetragen und an der Luft /getrocknet.
Beschichtungsstärken
Gelatine TIO2
oberflächenaktive Verbindung
3,65 g2
24,30 g/m2
1,22 g/m2
C. Ausbreit-Reagensschicht
Zur Bereitung dieser Schicht wurde eine Beschichtungsmasse aus folgenden Bestandteilen hergestellt:
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Wasser 24 ">'
handelsübliche:. Farbstoff enthaltende Stärketabletten 233 mg Tabletten
(Amylochrome-Stärke) zehn
N-tris-Hydroxymethyl (Methyl-2-amlno-üthansulfonsäure) als 65.5 mg
Puffersubstanz
mikrokristalline Cellulosetellchen p-Nonylphenoxyglycerln als ober- 0,5 ml
flächenaktive Verbindung (10 gew.-%lge Lösung der oberflächenaktiven Verbindung In Wasser)
ίο Die Farbstoff enthaltenden StärketaWetten und die Puffersubstanz wurden In einem Mischgerät mit Wasser vorgemischt. Der pH-Wert wurde mit verdünnter Natrlumhydroxldlösung auf 7,0 eingestellt. Nunmehr wurden die mikrokristallinen Cellulosetellchen zugesetzt, worauf die Mischung In dem Mischgerät gründlicher vermischt wurde. Daraufhin wurde die oberflächenaktive Verbindung vorsichtig eingerührt, um den Einschluß von Luftbläschen zu vermelden. Die Mischung wurde dann auf die Strahlung blockierende Schicht aufgetragen.
worauf die erzeugte Schicht getrocknet wurde.
Beschlchtungsstärken Farbstoff enthaltende Stärketabletten 215 Tabletten/ m2
,20 ; mikrokristalline Cellulose 54,0 g/m2
Puffersubstanz .1,41 g/m2 Das In der beschriebenen Welse hergestellte analytische Element wurde dann auf sein Ansprechvermögen für
> Amylase In folgender Welse getestet.
Zunächst wurde ein Amylase-Standard durch eine 150fache Verdünnung von frischem menschlichen Speichel
mit einer l%lgen Albuminlösung hergestellt. Der Standard wurde unter Verwendung der Methode von Somogyl untersucht. Verwiesen wird auf N. W. Tietz, »Fundamentals of Clinical Chemistry«, Verlag W. B. Saunders
Company, Philadelphia, USA, Seite 412 (1970). Von dem Standard wurde durch weiteres Verdünnen mit einer lasigen Albuminlösung eine Reihe verdünnter
W Lösungen hergestellt. Die verdünnten Lösungen wurden dann auf Abschnitte des Elementes aufgebracht. Die Reaktionen liefen während der Messungen bei 42° C ab.
Für die analytischen Bestimmungen wurde ein Colorimeter verwendet, das für Reflexionsmessungen von 16 mm breiten Streifen eines analytischen Materials geeignet war. Das Colorimeter wurde In Verbindung mil einem ?620 nm Interferenz-Filter vor der Lichtquelle verwendet. Aufgezelchnet wurden Reflexlons-Zelt-Kurven, die fdann In Dlchte-Zelt-Kurven überführt wurden. Diese Dichte-Zelt-Kurven sind In Flg. 5 dargestellt. Jede Kurve ist durch Amylase-Konzentratlonen in Somogyl-Elnhelten (SU) gekennzeichnet. Bei hohen Amylase-Kcnzentra-
Honen weisen diese Kurven für mehrere Minuten einem ausgeprägten geraden Teil auf, an den sich ein
gekrümmter Bereich anschließt. Die Neigung des ersten Teiles der Dichte-Zeit-Kurve 1st ein Maß für die
Amylase-Aktivltät. In dem Diagramm der Flg. 6 sind die Anfangsneigungen in Abhängigkeit von der Amylase-
'*> Aktivität aufgetragen. Der Verlauf ist linear bis zu etwa 300 Somogyl-Elnhelten. Eine Amylasebestimmung mit dem analytischen Element dieses Beispieles ist bis zu etwa 500 Somogyl-Elnhelten möglich.
Beispiel 2
Es wurde ein weiteres analytisches Element für die Bestimmung von Amylase mit dem in Fig. 2 dargestellten Aufbau hergestellt. Im Falle dieses Elementes enthielt die Ausbreit-Reagensschlcht eine Stärke, an deren wiederkehrende Einheiten chemisch vorgebildete Gruppierungen gebunden waren, welche die Stärke fluoreszierend machten.
A. Herstellung der fluoreszierenden Stärke Kartoffelstärke 30 g N-Carboxyanthranlllnsäureanhydrld S g
Pyrldin 5 ml
Dimethylsulfoxid 130 ml
Die Stärke und das N-CaruoxyanthranilinsSureanhydrid wurden in Form trockener Pulver gründlich miteinander vermischt. Dann wurde Dimethylsulfoxid zugegeben, worauf die Mischung unter konstanter Bewegung auf 50° C erhitzt wurde. Dann wurde das Pyrldin zugegeben, worauf die Mischung auf einem Dampfbade, von
w> Feuchtigkeit geschützt, über Nacht erhitzt wurde. Die erhaltene sehr viskose Lösung wurde dann In einen Mischer überführt, worauf die Stärke durch Zusatz von Wasser ausgefällt und durch Bewegen In Lösungsmitteln und Absetzen und Dekantieren gewaschen wurde. Zum Waschen wurden als Lösungsmittel jeweils 500 ml Aceton, Methanol und nochmals Aceton verwendet. Die Stärke wurde dann abfiltriert und an der Luft getrocknet. Es wurden Insgesamt 33,1 g Reaktionsprodukt erhalten. Die Gewichtszunahme entsprach einer etwa
6' 25%lgen Bindung des N-Carboxyanthranlllnsäureanhydrldes. Eine Stickstoffanalyse nach Kjeldahl ergab 1,33% Stickstoff, entsprechend etwa einem Anthranllatrest auf 6 Clucosereste der Stärke.
In einem zweiten Versuch wurden 33,7 g Reaktionsprodukt erhalten, was einer 90%Igen Bindung des Säureanhydrldes entsprach. Die Stickstoffanalysen ergaben In diesem Falle Werte von 1,2 bis 1,3*.
JL —
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B. Herstellung der Registrierschicht Es wurde eine Beschlchtungsmasse aus folgenden Bestandteilen hergestellt:
Wasser Agarose
Beizmittel »Α« (vgl. Beispiel !) 13 gew.-%lge flüssige Mischung des
Beizmittel in Wasser p-Nonylphenoxyglycerln als oberflächenaktive Verbindung
(10 gew.-»lge Lösung der oberflächenaktiven Verbindung In
Wasser
200 ml - 8.85 R 13,6 ml
1,5 ml
Die Agarose wurde In heißem Wasser gelöst, worauf das Beizmittel und die oberflächenaktive Verbindung zugesetzt wurden. Die Beschlchtungsmasse wurde auf einen transparenten Polycarbonat-Schlchtträger aufgetragen und an der Luft getrocknet.
BeschlchtungsstSrken
Agarose Beizmittel »A«
5,40 g/mJ 1,08 g/m?
C. Strahlung blockierende Schicht Zunächst wurde eine Agaroselösung ausgehend von folgenden Bestandteilen hergestellt:
Wasser Agarose
Die Agarose und das Wasser wurden erhitzt, bis sich die Agarose gelöst hatte. Des weiteren wurde eine Mischung .aus folgenden Bestandteilen hergestellt:
50 ml 796 mg
Wasser " '
Dlnatrlumphosphat Ruß (15 gew.-%lge Dlsperlonsln Wasser)
p-Nonylphenoxyglycerln als oberflächenaktiver Verbindung (10 gew.-%lge Lösung der oberflächenaktiven Verbindung Wasser)
19 ml 398 mg 796 mg
5,3 ml
0,7 ml
Die Salze wurden im Wasser gelöst, worauf der pH-Wert durch Zusatz verdünnter HCl auf 7$ eingestellt wurde.
Dann wurden der Ruß und die oberflächenaktive Verbindung zugesetzt, worauf die Agaroselösung1 und die Ruß-Dlsperslon miteinander vermischt wurden.
Die Mischung wurde dann auf die Registrierschicht aufgetragen und an der Luft getrocknet. Beschlchtungsstärken
Agarose
Dlnatrlumphosphat
1,08 g/m2 1,08 g/m2 0,54 g/m2 0,54 g/m2
D. Ausbreit-Reagensschlcht Zunächst wurde eine Beschichtungsmasse aus folgenden Komponenten hergestellt;
Wasser fluoreszierende Kartoffelstärke mikrokristalline Cellulose p-Nonylphenoxyglycerln als oberflächenaktive Verbindung (10 gew.-%lge Lösung der oberflächenaktiven Verbindung In Wasser)
50 ml 2g 8g
Die Stärke wurde in dem angegebenen Volumen V/asser durch Ultraschallbehandlung dispergiert. Verwendet wurde ein übliches Beschallungsgerät, das mit voller Kraft 7 Minuten lang in Betrieb genommen wurde, wobei zur äußeren Kühlung ein Eisbad verwendet wurde. Die erhaltene Dispersion wurde dann durch ein Käsetuch nitriert, um nlcht-dlsperglerte, aufgequollene, jedoch ungelöste Polymerteilchen abzuflltrleren. Der pH-Wert des
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Filtrates wurde durch Zusatz von verdünnter Kallumhydroxldlösung auf 7 eingestellt. Nunmehr wurde die mikrokristalline Cellulose zugesetzt, worauf die Mischung In dem Ultraschallgerät 3 Minuten lang bei halber Laufkraft des Gerätes beschallt wurde. Daraufhin wurde die oberflächenaktive Verbindung vorsichtig eingerührt. Die Mischung wurde dann auf die Strahlung blockierende Schicht aufgetragen, worauf die aufgetragene Schicht an der Luft getrocknet wurde.
Beschlchtungsstärken
Fluoreszierende Kartoffelstarke mikrokristalline Cellulose
21,6 g/m2 86,4 g/m2
Das In der beschriebenen Welse hergestellte Element wurde auf sein Amylase-Ansprechvermögen getestet, wobei eine standardisierte Speichel-Amylase wie In Beispiel 1 beschrieben verwendet wurde. Mittels eines Fluoreszenzmeßgerätes, ausgerüstet mit einem Wratten Filter \%A über die Lichtquelle wurde die Veränderung der Fluoreszenz In Abhängigkeit von der Zelt festgestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Flg. 7 dargestellt. VEs wurden Versuche mit 5 verschiedenen Amylasekonzentratlonen und ein Null-Versuch durchgeführt. Wie sich aus FIg. 7 ergibt, wurden Kurven eines praktisch linearen Verlaufes erhalten. Gemessen wurden die Neigungen der Kurven Im Auslaufteil nach S Minuten. Die Abhängigkeit dieser Neigungen von der Amylasekonzentratlon ergibt sich aus Flg. 8. Wie ein Vergleich der Flg. 8 mit Flg. 7 zeigt, Ist die Gerade der Flg. 8 mit der Geraden der Flg. 6 Identisch. Das hergestellte fluoreszierende, In Form eines Bandes vorliegende analytische Element zeigte somit eine entsprechende Empfindlichkeit für die Messung von Amylase In üblichen Serumkonzentrationen.
Beispiel 3
Es wurde ein weiteres Integrales analytisches Element für die Bestimmung von a-Amylase hergestellt. Die Herstellung des Elementes erfolgte In der in Beispiel 1 beschriebenen Weise mit der Ausnahme, daß die farbige Stärke des Beispieles 1 durch eine In Wasser unlösliche farbige handelsübliche Stärke (Amylopectin Azure A. Hersteller: Calbiochem, Los Angeles, Kalifornien, USA) ersetzt wurde. Des weiteren wurde die oberflächenaktive Verbindung, die zur Herstellung der Strahlung blockierenden Schicht des Beispieles 1 verwendet wurde, durch die oberflächenaktive Verbindung p-Nonylphenoxyglycerln ersetzt. Schließlich wurde anstelle des In Beispiel 1 verwendeten Polycarbonatträgers ein transparenter Polyäthylenterephthalatschichtträger verwendet. Ansieile des zur Herstellung der Ausbrelt-Reagensschlcht des Elementes des Beispieles 1 verwendeten Puffers wurden ein Natrlumdlhydrogenphosphatpuffer In der Registrierschicht verwendet. Die Konzentrationen der verschiedenen Komponenten In den einzelnen Schichten des Elementes wurden zwecks Verbesserung der Beschichtbarkelt und des Ansprechvermögens des Elementes etwas modifiziert.
Die einzelnen Bestandteile und Konzentrationen der Registrierschicht, Strahlung blockierenden Schicht und Ausbrelt-Reagensschlcht ergeben sich aus der folgenden tabellarischen Übersicht:
Registrierschicht
ungehärtete Gelatine oberflächenaktive Verbindung Natriumdihydrogenphosphat, pH-Wert: 7,0 Beizmittel »A« (vgl. Beispiel 1)
Beschichtungsstärke (g/m2)
5,4 0,65 0,86 2,1
Strahlung blockierende Schicht
ungehärtete Gelatine oberflächenaktive Verbindung TiO2
5,4 0,3 13,0
Ausbreit-Reagensschicht
farbige Stärke mikrokristalline Cellulose
21,5 64,5
Das hergestellte analytische Element eignete sich zur quantitativenί Bestimmung des a-AmyiasegehaUes v;on unverdünnten menschlichen Serumproben bei ä-Ämylasegehalten von 0 bis etwa lÖOO Somogy!-Einheiten.
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Beispiel 4
Es wurde ein weiteres Integrales analytisches Element für die Bestimmung von a-Amylase hergestellt.
Zur Herstellung dieses analytischen Elementes wurde eine andere in Wasser lösliche farbige Stärke (Diamyl-L, Hersteller: Warner-Lambert, USA) anstelle, der unlöslichen farbigen Stärken der Beispiele 1 und 3 verwendet. Des weiteren wurde Im Falle dieses Beispieles das Aüsbrelt-Reagenssystem im Gegensatz zu den Beispielen 1 und 3 als Zwei-Schichtensystem ausgebildet, In welchem die in Wasser lösliche, farbige Stärke in Form einer separaten, wäßrigen Beschichtungsmasse eingesetzt wurde. Die Stärke wurde dabei von einer zunächst erzeugten Ausbreitschicht aus einem Blush-Polymer und Titandloxidteilchen aufsaugen gelassen. Auch wurde im Falle dieses Elementes Agarose anstelle von ungehärteter Gelatine verwendet, die zur Herstellung der Strahlung blockierende Schicht und der Registrierschicht der Elemente der Beispiele 1 und 3 verwendet wurde. Puffer, oberflächenaktive Verbindungen und transparenter ;bandifoirmi|efjrräger waren Identisch ''mit Puffer,- oberflächenaktiver Verbindung und Träger des Beispieles 3. Die einzelnen Bestandteile und Konzentrationen hiervon Mn den einzelnen Schichten des Elementes ergeben sich ausTfolgencieitabellarischer Übersicht:
Beizmittel »A« (vgl. Beispiel 1) Agarose
oberflächenaktive Verbindung Natriumdihydrogenphosphat, pH-Wert = 7,0
Beschichtungsstarke (g/m2)
1,0 2,0 0,54 0,86
Strahlung blockierende Schicht
Agarose
oberflächenaktive Verbindung
10,2 1,0 0,5
Ausbreit-Reagenssystem
A. BIuEh-PoIymer-Ausbreitschicht
Celluloseacetat (etwa 40%ige Acetylierucg) 7,0
TiO3 50,0
Po'yGxyäihyiefiüicyläihcr (öbernächeflakiive Verbindung) ö,9
Octylphenylpolyethoxyethanol (oberflächenaktive Verbindung) 1,4
Polyurethanelastomer 1,5
B. In Wasser lösliche farbige Stärke, von der Ausbreitschicht aufgesaugt
1,0
Das hergestellte Integrale analytische Element dieses Beispieles eignete sich zur quantitativen Bestimmung des üCTArnylasegehaltes von unverdünnten menschlichen Serumproben bei "är'Amylasegehälten von 0 bis etwa 1000 Somogyi-Einheiten.
Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung von Amylase In Flüssigkeiten mit
a) einer Reagensschicht mit einem Stoff, der mit der zu bestimmenden Substanz unter Bildung eines diffundier- und erfaßbaren Stoffes zu reagieren vermag,
b) einer for Strahlung durchlässigen Registrierschicht, die den diffundier- und erfaßbaren Stoff aufzunehmen vermag, sowie gegebenenfalls ferner
c) einem Schichtträger und/oder weiteren Schichten,
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