DE2818841A1 - Mikroskop zum ermitteln von fluoreszenzen - Google Patents

Description

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Anmelder: Olympus Optical Company Limited,

No. 43—2, 2-Chome, Hatagaya, 3 hibuya-Ku, Tokyo, Japan

Titel: "Mikroskop zum Ermitteln von Fluoreszenz"

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Mikroskop zum Ermitteln von Fluoreszenz BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein mit Laserlicht arbeitendes Mikroskop zum Ermitteln von Fluoreszenz.

Bei den bis jetzt gebräuchlichen Verfahren zur Feststellung, ob zu untersuchende Zellen von Krebs befallen sind, werden die Zellen unter einem Mikroskop beobachtet, und es wird eine allgemeine Bestimmung auf der Basis der Größe und der Form der Zellen und der Zellkerne durchgeführt« Einer solchen Bestimmung liegen keinerlei objektive Standardwerte zugrunde, und sie ist nur durch einen erfahrenen Fachmann durchführbar.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß die durch das Cytoplasma hervorgerufene Fluoreszenz eine Wellenlänge hat, die sich von der Wellenlänge der durch den Zellkern hervorgerufenen Fluoreszenz unterscheidet· Ia Hinblick hierauf ist durch die Erfindung ein zur Fluoreszenzbestiamng geeignetes Mikroskop geschaffen worden, bei dem mit Laserlicht gearbeitet wird, um Zellen abzutasten, und bei dea die auftretende Fluoreszenz in sich bezüglich ihrer Wellenlänge unterscheidende Komponenten unterteilt wird, die photometrisch ausgewertet werden, um es auf einfache Weise zu

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ermöglichen, objektiv festzustellen, ob die Zellen von Krebs befallen sind.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden anhand schematischer Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:

Fig« 1 den Aufbau eines erfindungsgemäßen Mikroskops zum Ermitteln von Fluoreszenz;

Fig. 2 eine Darstellung zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Abtasten einer Zelle; und

Fig. 3a und 3b jeweils eine graphische Darstellung des Ausmaßes, in dem im Verlauf des Abtastverfahrens nach Fig. 2 Fluoreszenz erzeugt wird.

Gemäß Fig· 1 wird kohärentes Licht, das durch einen Laser 1 erzeugt wird, durch Galvanometerspiegel 2a und 2b sowie durch einen dichroitischen Spiegel 3 reflektiert, um eine Probe 5 durch ein Objektiv 4 zu bestrahlen, das außerdem als Kondensorlinse zur Wirkung kommt. Da als Lichtquelle ein Laser verwendet wird, wird die Strahlung auf eine kleine Fläche der Probe konzentriert. Da das Licht eines Lasers gewöhnlich monochromatisch ist, kann es eine Wellenlänge haben, die der Wellenlänge eines erregenden Lichtstrahls entspricht. Erhält man kein monochromatisches Licht, kann man ein Erregungsfilter in der aus Fig. 1 ersichtlichen Weise anordnen. Obwohl die Probe durch das Erregungslicht nur punktweise beleuchtet wird, läßt sich eine Abtastung in der X- und der Y-Richtung gegenüber der Probe durchführen, indem man die Spiegel 2a und 2b in entsprechenden Richtungen schwenkt. Wird die Probe in der beschriebenen Weise bestrahlt, erzeugt sie eine Fluoreszenz, die den dichroitischen Spiegel 3 durchsetzt. Der dichroitisch^ Spiegel 3 hat bekanntlich eine solche Spektralempfindlichkeit, daß er das Erregungslicht reflektiert, jedoch die Fluoreszenz durchläßt. Nach dem Durchlaufen des dichroitischen Spiegels wird die durch das Cytoplasma erzeugte Fluoreszenz, deren Wellenlänge 630 mu beträgt, durch einen weiteren dichroiti-

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sehen Spiegel 6 reflektiert, während die durch den Zellkern erzeugte Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 530 au von dem Spiegel 6 durchgelassen wird. Auf diese Weise ist es möglich, die beiden Komponenten der Fluoreszenz mit Hilfe von zwei Lichtaufnahmeelementen 7a und 7b nachzuweisen, an die zugehörige Verstärker 8a und 8b angeschlossen sind· Die Ausgangssignale der beiden Verstärker werden einer arithmetischen Einrichtung 9 zugeführt, die unter Verwendung der Eingangsdaten eine bestimmte Berechnung durchführt und die Ergebnisse an eine Darstellungseinrichtung 10 abgibt.

Fig. 2 zeigt das Erregungslicht S, mittels dessen die Zelle in Richtung des Pfeils abgetastet wird. Hierbei wird jeweils durch den bestrahlten Teil der Zelle Fluoreszenz erzeugt. Da sich, wie erwähnt, die Wellenlänge der durch das Zytoplasma erzeugten Fluoreszenz von der Wellenlänge der durch den Zellkern erzeugten Fluoreszenz unterscheidet, ist es möglich, die beiden Komponenten mit Hilfe der Lichtaufnahmeelemente 7a und 7b getrennt nachzuweisen und den Gesamtbetrag gesondert zu ermitteln. Die jeweilige Größe ergibt sich aus dem Abstand zwischen dem Punkt, an dem die Fluoreszenz erstmalig nachgewiesen wird, und dem Punkt, an dem keine Fluoreszenz mehr erzeugt wird; hierbei ist angenommen, daß die Abtastung in der aus Fig. 2 ersichtlichen Weise erfolgt. Beispielsweise wird Fluoreszenz durch das Zytoplasma erzeugt, wenn das Erregungslicht S das Ende Al des Zytoplasmas A erreicht, so daß die durch das Element 7a nachgewiesene Lichtmenge allmählich von Null aus zunimmt, jedoch wieder auf Null zurückgeht, wenn gemäß Figo 3a das andere Ende A2 des Zytoplasmas erreicht wird. Auf entsprechende Weise dient das Element 7b zum Nachweisen der Fluoreszenz, wenn das Erregungslicht das Ende Bl des Zellkerns B erreicht, und gemäß Fig. 3b geht die Fluoreszenz wieder auf Null zurück, wenn der Punkt B2 nach Fig. 2 erreicht wird. Es ist möglich, die Länge der Strecken Ll und L2 in der Bewegungsrichtung des Abtastlichtpunktes zwischen den genannten Enden zu ermitteln. Gemäß Fig. 1 kann man ein Filter 12a, welches Licht durchläßt, dessen Wellenlänge der durch das

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Zytoplasma erzeugten Fluoreszenz entspricht, vor dem Element 7a anordnen, und auf entsprechende Weise kann man vor dem Element 7b ein Filter 12b anordnen, das Licht durchläßt, dessen Wellenlänge derjenigen der durch den Zellkern erzeugten Fluoreszenz entspricht. Es gilt als allgemein anerkannt, daß sich zwischen gutartigen und bösartigen Zellen bezüglich der Größe des Zytoplasmas kein größerer Unterschied ergibt, daß jedoch der Kern einer bösartigen Zelle größer ist als derjenige einer gutartigen Zelle und daß der Kern einer bösartigen Zelle zu einer stärkeren Fluoreszenz führt. Somit ist es möglich, mit Hilfe des Ausmaßes der Fluoreszenz «nd der Größe sowohl des Zytoplasmas als auch des Zellkerns zu erkennen, ob es sich um eine Krebszelle handelt oder nicht. Ferner ist es möglich, festzustellen, ob eine Zelle von Krebs befallen ist oder nicht; zu diesem Zweck wird das Verhältnis zwischen der Größe N des Kerns und der Größe des Zytoplasmas C ermittelt, denn dieses Verhältnis hat bei bösartigen Zellen nahezu den Wert 1. Oiese Nachweise lassen sich mit Hilfe der arithmetischen Einrichtung 9 auf zweckmäßige und einfache Weise durchführen.

Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop ist es möglich, die Abtastung mit einem Lichtstrahl von kleinem Querschnitt zur Erzeugung eines Lichtpunktes durchzuführen, wobei der Lichtstrahl jedoch eine hohe Helligkeit besitzt, und es ist eine Bestrahlung mit hochgradig monochromatischem Licht möglich. Außerdem wird die Durchführung der Ermittlung bezüglich der Zelle dadurch beschleunigt, daß gleichzeitig Lichtmengen bei zwei verschiedenen Wellenlängen gemessen werden, um die gesamte Lichtmenge, die vom Zytoplasma und vom Zellkern ausgesandt wird, sowie den Radius des Zytoplasmas und des Zellkerns zu bestimmen.

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Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Mit Laserlicht arbeitendes Mikroskop zum Ermitteln von Fluoreszenz, dadurch gekennzeichnet , daß die Oberfläche einer Probe (5) mit Laserlicht (S) abgetastet wird, daß die hierbei erzeugte Fluoreszenz durch einen dichroitischen Spiegel (6) in sich bezüglich ihrer Wellenlänge unterscheidende Komponenten unterteilt wird und daß die Fluoreszenz der Komponenten mit Hilfe von Lichtaufnahmeelementen (7a, 7b) getrennt gemessen wird.

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   ORIGINAL INSPECTED