DE2819645A1 - Mittel und verfahren zur durchfuehrung kolorimetrischer oder photometrischer bestimmungen - Google Patents

Mittel und verfahren zur durchfuehrung kolorimetrischer oder photometrischer bestimmungen

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DE2819645A1
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Description

Merck Patent Gesellschaft 2. Mai 1978
mit beschränkter Haftung
Darmstadt
Mittel und Verfahren zur Durchführung kolorimetrischer oder photometrischer Bestimmungen
Die Erfindung betrifft ein neues Mittel sowie ein neues Verfahren zur Durchführung kolorimetrischer oder photometrischer Bestimmungen.
In der analytischen Chemie und besonders in der medizinischen Labordiagnostik wird häufig von kolorimetrisehen oder photometrischen Bestimmungen Gebrauch gemacht. Das gilt insbesondere für Reihenuntersuchungen, bei denen es auf eine praktische und schnelle Handhabung auch durch ungeschultes Personal und auf eine schnelle Auswertung ankommt.
Es hat nicht an Versuchen gefehlt, diese Methodik, der ja teilweise komplizierte chemische Reaktionen zugrundeliegen, zu vereinfachen. So sind Einweg-Tests und insbesondere auch Einweg-Meßküvetten entwickelt worden. Einweg-Küvetten enthalten alle notwendigen Reagenzien, Enzyme z.B. in gefriergetrockneter Form. Es muß nur noch die Testlösung (z.B. eine Körperflüssigkeit wie Serum oder Harn) zugefügt und anschließend die kolorimetrische oder photometrische Messung vorgenommen werden.
909845/0502
Indessen zeigen auch die Einwog-Küvetten noch erhebliche Nachteile. So ergibt sich z.B. ofu die Schwierigkeit, einen dichten Verschluß herzustellen, was sich besonders bei empfindlichen Reagenzien unangenehm bemerkbar macht Außerdem ist die Herstellung der Einweg-Küvetten teuer.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die praktische Durchführung kolorimetrischer und photometrischer Methoden weiter zu vereinfachen und de.bei die Nachteile vorbekannter Ausführungsformen, insbesondere die angegebenen Nachteile der Einweg-Küvetten zu vermeiden* Diese Aufgabe wurde durch die Bereitstellung des neuen Mittels nach der Erfindung gelöst.
Es wurde gefunden, daß Reagenzien für die kolorjmetrischen oder photometrischen Bestimmungen mit vorteil auf Träger in Ϊ5 Gestalt von Formkörpern aufgetragen werden können, die aus nicht saugfähigem, wasser-unlöslichem Material bestehen. Dabei werden die Reagenzien auf dem Träger in feste oder wachsartige organische Polymere eingebettet, die mit Wasser eine optisch klare Lösung bilden.
Durch die Einbettung sind die Reagenzien vor Einwirkungen der Atmosphäre und vor Feuchtigkeit geschützt und zeigen eine bessere Haltbarkeit als in gefriergetrockneter Form.
Das. erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt, indem man den beschichteten Formkörper in die zu untersuchende wäßrige Lösung taucht, wobei die Polymeren aufgelöst und die Reagenzien in Freiheit gesetzt und zur Reaktion gebracht werden. Dabei kann sich die zu untersuchende Lösung in einem besonderen Reaktionsgefäß befinden, in dem die Umsetzung mit dem Reagenz stattfindet; aus dem Reaktionsgefäß kann ein aliquoter Teil des Gemisches in das Meßgefäß (z.B. eine Küvette) übergeführt werden, das der eigentlichen Messung dient. Man kann aber auch die zu untersuchende Lösung in dem Meßgefäß vorlegen;
ORIGINÄR INSPECTED
9098^/05 02
der beschichtete Formkörper wird eingetaucht, und nach dem Ende der Reaktion erfolgt die Messung in dem gleichen Gefäß.
Falls ungelöste Stoffe untersucht werden sollen (z.B. in der Histologie), wird die durch Ablösen der Reagenzien entstandene Mischung auf den Stoff eufgetropft, oder es wird (nach dem Anfeuchten des zu untersuchenden Schnitts) eine Reagenzfolie aufgelegt. Das Lösungsmittel löst dann die Reagenzien auf und führt sie den nachzuweisenden Substanzen zu. Nach Abwarten der Reaktionszeit werden diese durch eine Verfärbung deutlich erkennbar. Die Intensität der Färbung ist von der Menge bzw. der Aktivität der Substanzen abhängig. Die Auswertung erfolgt hierbei im allgemeinen unter dem Mikroskop.
Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Durchführung kolorimetrischer oder photometrischer Bestimmungen in wässeriger Lösung, im wesentlichen bestehend aus mit Reagenzien beschichteten Formkörpern aus nicht saugfähigem, wasserunlöslichem Material, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien auf dem Formkörper in festen oder wachsartigen organischen Polymeren eingebettet sind, die mit Wasser eine optisch klare Lösung bilden.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Durchführung kolorimetrischer oder photometrischer Bestimmungen in wässeriger Lösung mit Hilfe von mit Reagenzien beschichteten Formkörpern aus nicht saugfähigem, wasserunlöslichem Material, dadurch gekennzeichnet, daß die auf dem Formkörper in festen und wachsartigen organischen Polymeren, die mit Wasser eine optisch klare Lösung bilden, eingebetteten Reagenzien vor der eigentlichen Bestimmung durch Auflösung der Polymeren in Freiheit gesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung des genannten Mittels zur Durchführung kolorimetrischer oder photometrischer Bestimmungen in Lösungen.
S G 9 8 4 5 / 0 5 0 2 * original inspected
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Der Ausdruck "optisch klar wasserlöslich" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Lösungen der verwendeten Polymeren im Messungsbereich keinen störenden Einfluß auf die optischen Eigenschaften der zu messenden Lösung (z.B. keine Eigenabsorption) zeigen.
Art und Größe der Formkörper können beliebig sein. Bevorzugt verwendet man Folien oder Stäbe; grundsätzlich sind alle beliebigen Formkörper brauchbar, sofern sie für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind. So können z.B.
Röhrchen, Platten, Kugeln, Schläuche und schließlich die Küvetten selbst als Formkörper verwendet werden. Von den Stäben sind solche mit rundem, quadratischem oder rechteckigem Querschnitt bevorzugt, da sie sich am leichtesten beschichten, verpacken und auch verwenden lassen.
Die Größe der Formkörper wird zweckmäßigerweise auf den jeweiligen Verwendungszweck, z.B. auf Form und Größe der bei der Bestimmung verwendeten Küvetten abgestimmt.
Bei Verwendung von Küvetten der Größe 1Ox 1Ox 50 mm werden z.B. zweckmäßig Folienstücke oder Stäbe der Größe 9 χ 80 χ 0,2 mm eingesetzt. Andererseits eignen sich für den gleichen Zweck z.B. auch Rundstäbe von etwa 75 mm Länge und 3 mm Durchmesser. Bei größeren Küvetten oder Reaktionsgefäßen sind die Ausmaße der Formkörper entsprechend größer, bei kleineren entsprechend kleiner. Bei diesen Abmessungen können die Folien bzw. Stäbe nach dem Ablösen der Reagenzbeschichtung auch zum Durchmischen der Reaktionslösung benutzt werden, z.B. durch Rühren oder durch Auf- und Abbewegen.
Das Material, aus dem die Formkörper bestehen, muß so beschaffen sein, daß keine Reagenzien darin absorbiert bzw.
S 0 98 U 5 / 0 5 0 2
inspected
daran festgehalten v/erden. Es kommen de her z.B. saugfähige Träger, wie sie üblicherweise für Reagenzpapiere oder Reagenzstäbchen verwendet werden, nicht in Betracht. Ferner soll das Material wasserunlöslich sein, damit es sauber wieder aus der Lösung entfernt werden kann. Im übrigen ist jedoch die Auswahl des Materials für die Formkörper nicht kritisch. Beispielsweise eignen sich wasserunlösliche Kunststoffe, z.B. Polymere und Polykondensate wie Polyvinylchlorid (PVC), Polyester (z.B. Polyäthylenterephthalat), Polyamide, Polycarbonate, Polystyrol, Polyurethane, Polyalkylene wie Polyäthylen oder Polypropylen, andere hochmolekulare organische Stoffe wie Celluloseacetat, ferner Metalle wie Stahl, Nickel oder Aluminium, Glas, Porzellan oder andere keramische Materialien.
Die Dicke der verwendeten Folien ist nicht kritisch; aus praktischen Gründen liegt sie zweckmäßig zwischen etwa 0,1 und etwa 1 mm.
Die Beschichtung der Formkörper kann z.B. durch Bestreichen, Tauchen, Sprühen oder Drucken und anschließendes Trocknen erfolgen.
Als organische Polymere für die Beschichtung, die mit Wasser eine optisch klare Lösung bilden, eignen sich bevorzugt feste oder wachsartige Polyvinylpyrrolidone (PVP), Polyvinylalkohole, Polyäthylenglykole und/oder Polyäthylenimine, ferner optisch klar wasserlösliche Copolymerisate, z.B.Vinylpyrrolidon-Vinylacetat-Copolymerisate. Diese Polymere besitzen vorzugsweise Molekulargewichte zwischen etwa 1 000 und etwa 1000 000. Bevorzugt ist z.B. PVP mit Molekulargewichten zwischen etwa 10 000 und etwa 1000 und K-Werten (in 1 %iger wäßriger Lösung, mit Ubbelohde-Viskosimeter bestimmt) zwischen etwa 20 und 100. Erfindungsgemäß gut verwendbar sind weiterhin z.B. Polyvinylalkohole mit Molekulargewichten zwischen etwa 10 000 und etwa 200 000· und
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Viskositäten zwischen etwa 3 und etwa 50 cP (in 4 %igsr wäßriger Lösung bei 20 0C). Von den Polyäthylenglykolen sind solche mit Molekulargewichten zwischen etwa 1000 und etwa 1000 000 gut geeignet; so ist z.B. handelsübliches PoIyäthylenglykcl mit einem mittleren Molekulargewicht von
3800-4800 (Erstarrungspunkt 53-58 0C; n^5 1,455; Viskosität bei 25 9O-1 20) verwendbar. Ein bevorzugtes handelsübliches Polyäthylenimin zeigt z.B. eine Dichte d„ von ca. 1/07, eine Viskosität von etwa TO 000 - 20 000 cP (nach Brookfield;
to bei 20 °C und 20 UpM) und einen pH-Wert von ca. 12. Von den Vinylpyrrolidon-Vinylacetat-Copolymerisaten sind z.B. solche geeignet, bei denen der Anteil an Vinylpyrrolidon 20-99 Molprozent, der Anteil an Vinylacetat dementsprechend 80-1 Molprozent beträgt; diese Polymerisate besitzen z.B.
K-Werte zwischen 15 und 40, insbesondere zwischen 19 und 34.
Die erfindungsgemäßen Mittel können auf vielen Gebieten eingesetzt werden, z.B. in der Metall- und Erzanalyse (vgl. z.B. O.G. Koch u. G.A. Koch-Dedic, Handbuch der Spurenanalyse, Springer-Verlag, Heidelberg, 1974), bei Trink-, Brauch- und Abwasseruntersuchungen (vgl. z.B. GdCh, Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlamm-Untersuchung", Verlag Chemie, Weinheim, 1975), in der Lebensmittelanalytik und Hygieneüberwachung (vgl. z.B. J. Schormüller, Handbuch der Lebensmittelchemie, Springer-Verlag, Heidelberg), in der chemischen Analyse in anderen Bereichen, in der medizinischen Diagnostik (vgl. z.B. H.H. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, 1974), in der Histo- oder Cytochemie (vgl. z.B. Chayen, Bitensky, Butcher, Histochemie, Verlag Chemie, Weinheim, 1975),
Im einzelnen können z. B. erfindungsgemäß bestimmt werden: anorganische Substanzen, Kationen und Anionen wie Aluminium (mit Alizarinsulfonsäure, Aurintricarbonsäure, Chromazurol S, Eriochromcyanin oder 8-Hydroxychinolin), Antimon /~mit Rhodamin B oder Silberdiäthyldithiocarbamxnat (Silber-DDC)7/
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Arsen (mit Silber-DDC), Beryllium (mit Aurintr!carbonsäure, Chromazurol S oder Eriochromcyanin), Blei (mit Dithizon oder Natrium-DDC), Bor (mit 1,1'-Dianthrimid), Cadmium (mit Dithizon), Calcium (mit Murexid), Cer (mit 8-Hydroxychinolin), Chlor (mit N,N-Diäthyl~p-phenylendiammoniuiisulfat) , Chrom (mit Diphenylcarbazid), Eisen (mit Bathophenanthrolin, }iathophenanthrolindisulfonsäure, Dimethylglyoxim, 2,2'-Bipyridin, Nitroso-R-Salz, 1,TO-Phenanthroliniumchlorid, Sulfosalicylsäure oder Thioglykolsäure), Gold (mit Pyoktanin, Rhodamin B oder o-Tolidin), Indium (mit Dithizon), Jod (mit o-Tolidin), Kobalt (mit 1-Nitroso-2-naphtholf 2-Nitroso-1-naphthol, Nitroso-R-Salz oder Rubeanwasserstoff), Kupfer (mit 2,2'-BiChXnOUn, Neocuproin, Bathocuproin, Blei-DDC, Diäthylammonium-DDC, Natrium-DDC, Oxalyldihydrazid, Oxalsäure-bis(cyclohexylidenhydrazid) oder Rubeanwasserstoff), Magnesium (mit Eriochromschwarz T), Mangan (mit Formaldoxim oder Natrium-DDC), Molybdän (mit Phenylfluoron oder Toluol-3,3-dithiol), Nickel (mit Dimethylglyoxim oder Rubeanwasserstoff), Niob /"mit A-(2-Pyridyl-azo)-resorcin/» Nitrat /mit N-(1-Naphthyl)-äthylendiammoniumdichlorid/, Nitrit (mit Sulfanilsäure und 1-Naphthylamin oder mit anderen Azofarbstoff-Komponenten), Osmium (mit Diphenylcarbazid), Palladium (mit Bismuthiol I, Nitroso-R-Salz oder 2-Nitroso-1-naphthol), Platin (mit Dithizon), Quecksilber (mit Dithizon), Rhodium /_ mit 1-(2-Pyridyl-azo)-2-naphthol7# Scandium (mit Alizarinsulfonsäure), Selen (mit 3,3'-Diaminobenzidiniumtetrachlorid), Sulfat (mit Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiammoniumdichlorid), Sulfid (mit Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiammoniumdichlorid), Thallium (mit Brillantgrün, Kristallviolett oder Rhodamin B), Titan (mit Brenzcatechin-3,5-disulfonsäure oder Chromotropsäure), Uran /"mit Glyoxal-bis(2-hydroxyanil) oder 1-(2-Pyridylazo)-2-naphthol7, Vanadium (mit Variaminblau, Natrium-DDC oder N-Benzoyl-N-pheny!hydroxylamin), Wismut (mit Bismuthiol I, Xylenolorange oder Dithizon), Zink /"mit Dithizon, 1-(2-Pyridyl-azo)-2-naphthol oder Zincon/, Zinn (mit Phenylfluoron) , Zirkon (mit Phenylfluoron oder Xylenolorange).
Θ098Α5/0Β02 ^original inspected
Weiterhin können erfindungsgemäß wichtige diagnostische und biochemische Bestimmungen vorgekommen werden, z.B., die folgenden: Alkalisehe PLosphatase (mit p-Nitrophenylphosphat), tf-Amylase (mit Amylose/Jcd), anorganisches Phosphat (mit Molybdat/Reduktionsmittel), Ascorbinsäure (mit 2,6-Dichlorphenolindophenol), Bilirubin (mit diazotierter SuIfanilsäure), Blutzucker (mit Glucoseoxidase/Peroxidase/ 4-Aminoantipyrin), Cholesterin (mit Cholesterin-Oxidase/ Jodid), Cholinesterase (mit 5-Butylt.hiocholinjodid/5,5 ·- Dithiobis-2-nitrobenzoesäure), Creatin-Kinase (CK; mit Creatinphosphat/ADP/Glucose/Hexokinase/NADP/Glucose-e-phosphat-Dehydrogenase), Creatin-Kinase-Isoenzym MB (CK-MB; wie Creatin-Kinase, aber unter Zusatz hemmender Antikörper), Creatinin (mit Pikrinsäure), Eisenbindungskapazität (EBK; Bestimmung des nicht gebundenen Eisens mit sulfoniertem Bathophenanthrolin), Gesamteiweiß (mit Kupfersulfat), Glutamat-Dehydrogenase (GLDH; mit 2-Ketoglutarat/ NADH/ADP), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT; mit 2-Ketoglutarat/ Aspartat/NADH/LDH/MDH), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT; mit 2-Ketoglutarat/L-Alanin/Lactat-Dehydrogenase/ NADH) , I'-Glutamyl-Transf erase { ^-GT; mit L-^'-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid/Glycylglycin), Hämoglobin (mit KCN/K3/~Fe(CN)6_7), Harnsäure (mit üricase/Katalase/Kupfersulfat/Bathocupreindisulfonsäure), Harnstoff (mit Urease/ Phenol/NaOCl oder mit Diacetylmonoxim/Thiosemicarbazid), 2-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (HBDH; mit 2-Oxobutyrat/ NADH), Lactat-Dehydrogenase (LDH; mit Pyruvat/NADH), Leucin-Arylamidase (mit L-Leucin-4-nitroanilid), Magnesium (mit Xylidylblau), saure Phosphatase (mit p-Nitrophenylphosphat), Triglyceride (mit Lipase/Esterase/Glycerokinase/Pyruvatkinase/ LDH/NADH/ Phosphoenolpyruvat/ATP).
In der Histo- oder Cytochemie lassen sich folgende Nachweise erfindungsgemäß durchführen: Nucleinsäuren (Peulgen-Eeaktion), Polysaccharide (PAS-Methode), Cytochromoxydase
ORIGINAL INSPECTED 80984 5/0502
(Nadi-Reaktion), Peroxydase (Benzidin/H^O,)/ Phosphatase (Naphthylphosphat/Diazoniurasalz), Esterase (Indoxylacetat-Methode oder Naphthylacetat/Diazoniumsalz), Succinat-Dehydrogenase (Succinat/Tetrazoliumsalz), Glutainat-Dehydrogenase (Glutamat/Tetrazoliunisalz), Lactat-Dehydrogenase (Lactat/ TetrazDliumsalz).
Die erfindungsgemäß verwendbaren Reagenzien dürfen natürlich weder mit dem Folienmaterial noch mit dem organischen Polymeren reagieren, unterliegen aber sonst keinen Beschränkungen. Bei den in Frage kommenden Reagenzien handelt es sich in der Regel um Substanzen, die im sichtbaren oder im ultravioletten Bereich charakteristische Absorptionsmaxima zeigen, oder um Vorprodukte zur Bildung solcher Substanzen. Weiterhin können als Reagenzien die verschiedensten Hilfsstoffe verwendet werden, z.B. Enzyme, Oxydations- oder Reduktionsmittel, Säuren, Basen oder Salze, die z.B. als Puffer eingesetzt werden können.
Als Lösungsmittel für die Herstellung der Einbettungen auf dem Träger (z.B. auf der Folie) eignen sich z.B. Wasser sowie organische Lösungsmittel, die jedoch das Formkörpermaterial nicht lösen dürfen, z.B. Alkohole wie Methanol, Äthanol oder Isopropanol, Ketone wie Aceton, Amide wie Dimethylformamid, Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid oder andere aprotische Lösungsmittel; die letztgenannten werden in der Regel beim Trocknen nicht vollständig entfernt, sondern in der Einbettung mindestens teilweise erhalten und können bei dem Ablösen der Einbettung eine Lösungsvermittler-Funktion ausüben.
Das Mengen- (Gewichts-) Verhältnis von Reagenzien zu PoIymeren kann sich in weiten Grenzen bewegen und ist nicht kritisch. Im allgemeinen liegt es zwischen 10:1 und 0,1:1.
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il -
Miteinander nicht verträgliche Reagenzien können auf getrennten Folien nacheinander zugegeben werden, aber auch auf einer Folie nebeneinander (räumlich getrennt) aufgetragen werden.
Die Küvetten können als "Einmal-Artikel" ausgebildet sein. So kcum z.B. zu jedem Test eine Küvette und eine Folie (oder ein Stab) gehören, wobei Form und Größe der Folie (oder des Stabes) der Küvette angepaßt sind. Nach Durchführung des Tests kann das Besteck weggeworfen werden.
Die erfindungsgemäßen Mittel (insbesondere Folien) können auch in Analysenautomaten eingesetzt werden.
Es kann zweckmäßig sein, im oberen Teil der Folie die Codierung (z.B. Art der Messung, Meßwellenlänge, Reaktionstemperatur und -zeit) Platz finden zu lassen.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung (vgl. Fig. 1) besteht darin, daß die Reagenz/Polymer-Lösung strichförmig auf die Folie (1) aufgetragen und anschließend eine zweite Folie (2) über die Reagenzzone so aufgesiegelt (geklebt oder geschweißt) wird, daß zwischen beiden Folien über der Reagenzzone (3) ein Hohlraum (4) definierter Dicke verbleibt, der an zwei Seiten offen ist. Beim Eintauchen in die zu untersuchende Lösung füllt diese den Hohlraum aus und löst die Reagenzien heraus. Die jetzt entstehende Farbreaktion kann kolorimetrisch oder photometrisch ausgewertet werden. So wird die für die Messung zu benutzende "Küvette" auf der Folie selbst gebildet und damit zu einem Bestandteil der Folie ("Küvetten-Folie"). "Reagenzfolie" und "Küvette" bilden so eine Einheit. Der Hohlraum hat vorzugsweise rechteckigen Querschnitt, wobei in ihm der Ab- stand zwischen den beiden Folien etwa 0,1 bis 10, bevorzugt 1-3 mm beträgt.
iNSPECTE0
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Mehrere Rcagenzzcmen (3) mit aufgeschweißten Folien (2) können übereinander auf der "Grundfolie" (1) angeordnet sein, wobei eine Reagenzfolie zur Mehrfachanalyse (gleichzeitigen Bestimmung verschiedener Bestandteile) ausgebildet wird (vgl. Fig. 2).
Für eine gleichmäßige Verteilung der Reagenzien kann es manchmal günstig sein (vgl. Fig. 3)r den Hohlraum (4) durch das Versiegeln zweier verformter Folien (1) und (2) zu bilden, nachdeiu jeweils vorher die Reagenzlösung (en) in den Vertiefungen der beiden Folien zur Trockne gebracht wurden.
Das in den nachstehenden Beispielen verwendete PVP ist ein
(R)
Handelspräparat (Luviskolv ' K SO) mit einem Molgewicht
von ca. 700 000 und einem K-Wert von 92 +_ 4. Beispiel 1: Reagenzfolie zur Bestimmung Von Glucose
Man bereitet eine Lösung, die sich aus folgenden 4 Einzellösungen zusammensetzt:
1) In 240 ml Wasser werden 100 g Polyäthylenimin
(R)
(Polyminv ' P) gelöst. Durch Zugabe von 32 %iger Salzsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 5,3
eingestellt (Verbrauch: etwa 65 ml).
2) In 400 ml Wasser werden 14,4 g Glucoseoxidase (12 ü/mg) und 0,4 g Peroxidase (60 U/mg) gelöst.
3) In 400 ml Äthanol werden 4,8 g Tetramethylbenzidii und 34 g PVP gelöst.
4) In 100 ml Wasser werden 0,2 g Ascorbinsäure gelöst,
^ ÜfttjiNAL INSPECTED
• 503845/0502
Diese Lösung wird mit Hilfe eines Schwamirtos gleichmäßig auf eine 7 cm hohe und 0,2 mm dicke durchsichtige PVC-Folie aufgestrichen, so daß am unteren Ende der Folie eine 10 mm hohe beschichtete Zone entsteht. Nach dem Trocknen bei 6O-8O °C (10 Minuten) wird die Folie in 9 mm breite Streifen zerschnitten.
Zur Analyse wird ein solcher Streifen, der sich am oberen Ende anfassen läßt, mit der Reagenzzone in die Küvette gestellt, die bis zu einer Markierung mit der zu untersuchenden Flüssigkeit gefüllt ist. Zur Beschleunigung des Lösovorgangs wird die Folie mehrmals hin- und herbewegt. Nach einer Wartezeit von 10 Minuten wird die kolorimetrische Bestimmung wie üblich bei 640 nm vorgenommen.
Beispiel 2: Reagenzfolie zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid
Eine durchsichtige PVC-Folie (7 cm hoch, 0,2 mm dick) wird mit einem Gemisch folgender 4 Einzellösungen beschichtet:
1) In 56 ml Wasser werden 30 g Polyäthylenimin
fR)
(Polymin1 P) gelöst. Durch Zugabe von 32 %iger Salzsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 5,5 eingestellt (Verbrauch: etwa 19 ml).
2) In 120 ml Äthanol werden 1,2 g Tetramethylbenzidin und 12 g PVP gelöst .
3) In 35ml Wasser werden 3,5 mg Peroxydase (100 U/mg) gelöst.
4) In 10 ml Wasser werden 10 mg Ascorbinsäure gelöst.
Iis übrigen verfährt man analog Beispiel 1 (Messung bei €40 nm).
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Beispiel 3: Reagenzfolie zur Bestimmung von Ascorbinsäure
Es v/erden die folgenden beiden Reagenzlösungen hergestellt und übereinander (räumlich getrennt) auf die Folie (durchsichtiges PVC, Höhe: 7 cm; Dicke: 0,2 mm) in je 15 mm breiten Streifen mit 5 mm Zwischenraum aufgesprüht.
(1) In 100 ml Äthanol werden 10 g Malonsäure und 5 g Vinylpyrrolidon-Vinylacetat-Copolymerisat (Luviskol^-VA 73 E; Verhältnis Vinylpyrrolidon: Vinylacetat 70:30; K-Wert 34 + 4) gelöst.
(2) In 100 ml Äthanol werden 1,5 g 2,6-Dichlorphenolindophenol (Natriumsalz) und 3 g Vinylpyrrolidon-Vinylacetat-Copolymerisat gelöst.
Im übrigen verfährt man analog Beispiel 1 (Messung bei 520 nm)
■ Beispiel 4: Reagenzfolie zur Bestimmung von Nitrit
in einem Gemisch von 200 ml Wasser und 500 ml Methanol werden nacheinander 30 g 2-Amino-4-(2-hydroxyäthylsulfonyl)-benzoesäure, 5,5 g N-Naphthyl-(1)-äthylendiammoniumoxalat, 78 g Weinsäure und 50 g Polyäthylenglykol ("PEG 4000" nach DAB 7) gelöst. Mit dieser Lösung wird eine PVC-Folie wie in Beispiel 1 beschichtet. Im übrigen verfährt man analog Beispiel 1 (Messung bei 525 nm).
Beispiel 6: Reagenzfolie zur Bestimmung von zweiwertigem Eisen
In einem Gemisch von 20 ml Wasser und 80 ml Äthanol werden nacheinander 10 g 1,10-Phenanthroliniumchlorid, 10 g Triäthanolamin und 5 g PVP gelöst. In diese Lösung werden
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Folienstücke aus Polyester (Polyäthylenterephthalat; Größe 9 χ 0,2 χ 80 mm) 30 min tief eingetaucht und anschließend bei 7O ° (10 Minuten) getrocknet.
Zur eigentlichen Bestimmung werden 3 ml der zu untersuchenden Lösung in Küvetten (10 χ 10 χ 5o mm) gefüllt, ein Folienstück wird eingetaucht, und durch mehrmaliges- Auf- und Niederbewegen der Folie werden PVP und Reagenz abgelöst. In Abhängigkeit von der Menge der vorliegenden Fe -Ionen erhält man eine rot bis braun gefärbte Lösung, deren Extinktion bei 510 nm nach 5 Minuten gemessen wird.
Beispiel 6t Reagenzfolie zur Chlor-Bestimmung
Es werden zwei Beschichtungslösungen hergestellt:
(1) Man mischt eine Lösung von 10 g Natriumacetat
in 80 ml Methanol mit einer Lösung von 3 g PoIy-T5 vinylalkohol (Mowiol^ N 50-88) in 20 ml Wasser.
(2) Man mischt eine Lösung von 3 g N,N-Diäthyl-pphenylendiammoniumsulfat in 10 ml Dimethylsulfoxid und 50 ml Äthanol mit einer Lösung von 5 g Polyvinylalkohol in 40 ml Wasser.
Die eine dieser Beschichtungslösungen wird auf die Vorderseite, die andere auf die Rückseite eines 90 mm breiten und 1000 ml langen Folienbandes (PVC, Dicke 0,2 mm) jeweils als 20 mm breite Schicht mit Hilfe einer Walze aufgetragen. Nach dem Trocknen (10 Minuten bei 60-80 ) zerschneidet man das Folienband in 10 mm breite Streifen und verfährt im übrigen analog Beispiel 1 (Messung bei 680 nm).
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Beispiel 7: Reagenzfolie zur Bestimmung von 2-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase
Man bereitet zwei Beschichi.ungslösungen:
1. Eine Lösung von 5 g PVP in 40 ml Wasser, 50 ml einer 10 %igen Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,5)
und eine Lösung von 3 g äthoxylieriem Nonylphenol (Marlophen^ ^ 812) in 10 ml Äthanol werden gemischt.
2. Eine Lösung von 5 g NADH und 2,5 g Natrium-2-oxobutyrat in 30 ml 0,2 %iger NaHCO3~Lösung wird
mit einer Lösung von 5 g PVP in 70 ml Äthanol
vermischt.
Die beiden Lösungen werden durch Siebdruck auf einen 80 mm breiten und 500 mm langen Folienstreifen (aus Celluloseacetat, Dicke 0,3 mm) in zwei jeweils 15 mm breiten Schichten (5 mm Abstand) aufgetragen. Im übrigen verfährt man analog Beispiel 1 (Messung der Extinktionsdifferenzen pro Minute bei 365 mm.
Beispiel 8: Reagenzfolie zur Bestimmung von Nitrit
Eine Polyesterfolie (200 χ 1000 mm) wird mittels einer Walze mit der Reagenzlösung gemäß Beispiel 4 am unteren Ende in der Längsrichtung auf einem 30 mm breiten Streifen gleichmäßig beschichtet. Nach dem Trocknen wird in 12 mm breite Streifen geschnitten. Eine Farbvergleichsskala wird hergestellt, indem man Reagenzgläser (Größe 15 χ 160 mm) mit je 10 ml wäßriger Natriumnitritlösung folgender Konzentration füllt: O,O1; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 3,0; 5,0; 10,0 mg/1. Man gibt jeweils eine Reagenzfolie zu und rührt gut um. Nach 3 Minuten haben sich beständige Reaktionsfarben
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ORiGWALlNSPECTED
ausgebildet, so deß die Farbskala für den Vergleich bereit ist. Von der zu untersuchenden Lösung werden 10 ml in ein Reagenzglas (Größe 15 χ 160 mm) gefüllt. Man taucht eine Reagenzfolie ein, rührt gut um und bestimmt nach 3 Minuten die Nitrit-Konzentration durch Farb\ergleich.
Beispiel 9: Reagenzstäbe zur Bestimmung von Ascorbinsäure
. (a) Herstellung der Stäbe
Glasstäbe (Größe 3 χ 75 mm) werden für 3 Sekunden in die Reagenzlösung (2) gemäß Beispiel 3 32 mm tief eingetaucht und in einem Luftstrom getrocknet. Das Reagenz wird vom unteren Ende wieder abgelöst, indem man die Stäbe anschließend für 5 Minuten 17 mm tief in 25 warmes Wasser taucht. Schließlich taucht man die Stäbe nach erneutem Trocknen 15 mm tief in die Reagenzlösung (1) gemäß Beispiel 3 und trocknet wieder in einem Luftstrom.
(b) Durchführung der Bestimmung
3,0 ml der zu untersuchenden Lösung wird in eine Küvette (10.x 10 χ 50 mm) gefüllt. Dazu wird einer der nach (a) hergestellten Stäbe gegeben. Durch Umrühren (eine Minute) werden die aufgetragenen Substanzen heruntergelöst und können nun mit der Ascorbinsäure reagieren. Die verbleibende Färbung wird bei 520 nm gemessen. Falls die auf dem Stab vorhandene Menge an 2,6-Dichlorphenolindophenol nicht ausreicht und die Lösung mithin völlig farblos bleibt, wird noch Reagenz von einem zweiten oder dritten Stab abgelöst, bis eine meßbare Färbung bestehen bleibt.
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Beispiel 10: Reagenzfolie zur Bestimmung von Peroxydase in Leukozyten
PVC-Folienstücke der Größe 24 χ 55 mm (Dicke 0,2 nun) werden mit folgender Lösung gleichmäßig beschichtet: 3,84 g 4-Chlor-1-naphthol und 1 g PVP in 130 ml Äthanol werden mit 20,5 ml einer 0,5 %igen Natriumperborat-Lösung in Wasser gemischt. Nach der Beschichtung werden die Folien getrocknet.
Anwendung:
Ein luftgetrockneter Blutausstrich wird durch Einstellen (30 Sek.) in eine Lösung von Formaldehyd/Äthanol (10 ml 30 %ige wässerige Formaidehyd-Lösung + 90 ml 95 %ig3s Äthanol) fixiert und mit Wasser abgespült. Auf den noch feuchten Ausstrich wird ein Tropfen Äthanol getropft und die Folie aufgelegt. Nach einer Reaktionszeit von 5 Min. nimmt man die Folie ab, spült den Ausstrich mit Wasser und färbt für 10 Sek. mit konz. Giemsa-Lösung nach. Es wird erneut mit Wasser gespült, getrocknet und schließlich unter dem Mikroskop ausgewertet: Peroxydasepositive Leukozyten zeigen im Plasma dunkelviolett gefärbte Granula.
Beispiel 11: "Küvetten-Folie" zur Bestimmung von Glucose
Eine durchsichtige und farblose PVC-Folie /"Größe 75 χ 100 mm; (vgl. Fig. 1 (12.7 wird in der Längsrichtung 5 mm vom unteren Rand entfernt in einer 10 mm breiten Zone analog Beispiel 1 beschichtet und getrocknet. Auf diese Folie wird eine vorher verformte zweite Folie (2) der Größe 20 χ 1OO mm aufgesiegelt (geklebt oder geschweißt). Durch die Verformung wird über der Reagenzzone (3) ein Hohlraum (4) ausgebildet, der später die zu untersuchende Lösung aufnimmt und als
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Reaktionsgefäß und Küvette zugleich dient. Im Hohlraum beträgt der Abstand zwischen den beiden Folien 2 mm. Anschließend wird die Folie in 10 mm breite Streifen geschnitten.
Zur eigentlichen Bestimmung wird ein Streifen am oberen Ende gefaßt und in die zu untersuchende Lösung getaucht, so daß die Lösung den Hohlraum ausfüllt. Die Reagenzien lösen sich auf und bilden bei Gegenwart von Glucose eine blaue Lösung. Nach 10 Minuten erfolgt die Auswertung visuell durch Vergleich mit einer Farbskala oder photometrisch durch Messung der Extinktion bei 640 nm.
°K>O>NAL 908845/0502
, to
Leerseife

Claims (4)

  1. Merck Patent Gesellschaft 2· i<lai
    mit besc hränkter Haftung
    Darmstadt
    ' 1.j Mittel zur Durchführung kolorimetrischer oder photometrischer v-"' Bestimmungen in wässeriger Lösung, im wesentlichen bestehend aus mit Reagenzien beschichteten Formkörperη aus nicht saugfähigem, wasser-unlöslichem Material, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien auf dem Formkörper in festen oder v/achsartigen organischen Polymeren eingebettet sind, die mit Wasser eine optisch klare Lösung bilden.
  2. 2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Formkörper Folien oder Stäbe verwendet werden.
  3. 3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymeres Polyvinylpyrrolidon verwendet wird.
  4. 4. Verfahren zur Durchführung kolorimetrischer oder photometrischer Bestimmungen in wässeriger Lösung mit Hilfe von mit Reagenzien beschichteten Formkörpern aus nicht saugfähigem, wasser-unlöslichem Material, dadurch gekennzeichnet, daß die auf dem Formkörper in festen oder wachsartigen organischen Polymeren, die mit Wasser eine optisch klare Lösung bilden, eingebetteten Reagenzien vor der eigentlichen Bestimmung durch Auflösung der Polymeren in Freiheit gesetzt werden.
    5« Verwendung des Mittels nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Durchführung kolorimetrischer oder photometrischer Bestimmungen in wässeriger Lösung.
    809845/0502
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