DE2919835A1

DE2919835A1 - Immuntest zur bestimmung eines analyten sowie reagens und testpackung zur durchfuehrung des tests

Info

Publication number: DE2919835A1
Application number: DE19792919835
Authority: DE
Inventors: John M Brinkley; Edwin F Ullman
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1978-05-16
Filing date: 1979-05-16
Publication date: 1979-11-22
Also published as: CA1111763A; JPS54151097A; US4193983A; GB2021262B; JPS6338666B2; FR2426261A1; GB2021262A

Description

γ -ι

Die Erfindung betrifft einen Immuntest zur Bestimmung eines Analyten sowie Eeagentien und Testpackungen zur Durchführung dieses Tests.

Proteinbindungstests sind für die Diagnose von Krankheiten, für die Überwachung von Arzneistoffen und für die Bestimmung von Spurenmengen organischer Verbindungen, die mit der menschlichen Gesundheit nicht in Zusammenhang stehen, von großer Bedeutung. Derartige Tests sind insbesondere zur Bestimmung von speziellen Verbindungen, die in Konzentrationen von 10 m oder

/darunter vorliegen, von Bedeutung, vor allem dann, wenn diese Verbindungen im Gemisch mit anderen Verbindungen, die ähnliche Eigenschaften aufweisen, vorhanden sind.

Proteinbindungstests beruhen darauf, dass ein zu bestimmender Bestandteil (Analyt) markiert wird, wobei der Marker ein nachweisbares Signal erzeugt und durch die Bindung des Rezeptors an den markierten Analyten eine Unterscheidung zwischen gebundenem und nicht gebundenem Marker ermöglicht wird. Die Anwesenheit des Rezeptors ermöglicht entweder eine mechanisehe Trennung von gebundenem und ungebundenem markierten Analyten oder kann den Marker so beeinflussen,dass das nachweisbare Signal verändert wird. Der erstgenannte Fall wird als heterogen und der letztgenannte als homogen bezeichnet, da

in letzterem Fall eine Trennungsstufe entfällt. 35

Bei der Entwicklung von Proteinbindungstests sind eine Reihe

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Γ Π

von Gesichtspunkten zu "berücksichtigen. Bei der Wahl des Markers werden beispielsweise die Testempfindlichkeit, dessen Herstellungsmöglichkeiten, dessen Stabilität und dessen Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen in der Umgebung in Betracht gezogen. Ferner werden bei der Herstellung der Reagentien und beim Test die für den Analyten und/oder Analytenrezeptor erforderliche Reinheit berücksichtigt. Ferner ist auf die Wirkung von Veränderungen im Analyten auf die synthetischen Verfahren, die Eigenschaften des Markers und die Testempfindlichkeit und Testgenauigkeit zu achten. Steht ein Testverfahren zur Verfugung, das allgemein auf eine Vielzahl von Analyten anwendbar ist und durch Änderungen im Analyten nicht signifikant beeinflusst wird, so können die Herstellung der Eeagentien und die Testdurchführung leicht auf neue und unterschiedliche Analyten eingestellt werden.

Zum Stand der Technik wird auf folgende Literaturstellen verwiesen: Badley, "Fluorescent Probing of Dynamic and Molecular Organization of Biological Membranes", Modern Fluorescence Spectroscopy, Bd. 2, Hrsg. E.L. Wehry, Plenum Press, New York 1976 und Kanaoka, Angewandte Chemie Int. Ed. Engl. Bd 16 (1977)? S. 137 diskutieren Fluoreszenzerscheinungen in biologischen Systemen. Vu und Mitarb., Biochemistry, Bd. 16 (1977), S. 3936, Harris, Chemistry and Physics of Lipids, Bd. 19 (1977), S. 243, Smolarsky und Mitarb. J. Imm. Meth.,

W 3 ET STOTlP I*

Bd. 15 (1977), S. 255 unS/und Stryer, Proc. Nat. Acad. Sei., Bd. 67 (1970), S. 579 beschreiben die Anwendung von Fluoreszenzerscheinungen an biologischen Membranen. Uemura und Mitarb. , Biochemistry, Bd. 13 (1974-), S. 1572, Alving und Richards, Immuno chemistry, Bd. 14- (1977), S- 373, Geiger und Smolarsky, J. Imm. Meth., Bd. 17 (1977), S. 7, Inoue und Nojima, Chem. Pharm. Bull., Bd. 16 (1968), S. 76 und Tamamura und Mitarb., Japan J. Exp. Metd., Bd. 41 (1971), S. 31

be schreiben Antikörper-Phospholipid-Wechselwirkungen. 35

In den US-PSen 3 850 578 und 3 887 698 und den darin aufge-

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Γ -]

führten Literaturstellen ist die Verwendung von Liposomen in Tests beschrieben, bei denen eine durch Komplement vermittelte Lysis von Liposomen als Ergebnis einer Antikörperbindung an ein an die Liposomen gebundenes Antigen zur Freisetzung von stabilen freien Radikalen, die in den Liposomen enthalten sind, führt.

Erfindungsgemäss werden Massen bzw. Reagentien zur Verfügung gestellt, die in homogenen Proteinbindungstests Anwendung finden. Bei diesen Reagentien handelt es sich um diskrete, kolloidale Teilchen, die mit mindestens einem Marker und mindestens einem Liganden substituiert sind. Die Teilchen sind unter Verwendung von kleinen lipophilen (unter Einschluss von amphiphilen) Molekülen gebildet. Marker und Ligand sind an die Teilchen nicht-kovalent, aber in einer im wesentlichen fixierten, durchschnittlichen räumlichen Beziehung gebunden. Bei den Teilchen kann es sich um Bläschen, Öltröpfchen oder dergleichen handeln, die eine geordnete Oberflächenschicht mit einer elektrostatischen Nettoladung aufweisen.

Die Teilchen werden gebildet, indem man in einem wässrigen Medium die die lipophilen Teilchen bildenden Moleküle (entweder einzeln oder als Teilchen), beliebige Hilfsbestandteile und die lipophilen Konjugate (unter Einschluss der Ligandenkonjugate) als den natürlich vorkommenden Liganden oder als ein Konjugat mit einer lipophilen Verbindung sowie das Markerkonjugat vereinigt.

Die Teilchen finden in Proteinbindungstests Anwendung, bei denen die Anwesenheit eines Rezeptors, der an einen Liganden in Nachbarschaft zum Marker gebunden ist, zur Modulation des durch den Marker erzeugten Signals verwendet werden kann. Entsprechende Beispiele sind Tests, bei denen die Anwesenheit des Rezeptors die Annäherung eines anderen Moleküls an den ³^ Marker hemmt oder der Rezeptor an ein

Molekül, das mit dem Marker unter Modulation des Signals reagiert, gebunden ist.

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γ -ι

Die erfindungsgemässen Reagentien werden zur Durchführung von Proteinbindungstests angewendet. In diesen Reagentien liegen kolloidale Teilchen als "hub" oder Kern zur Kontrolle einer räumlichen Beziehung zwischen einem Marker und einem Iiiganden vor, wobei der Marker und der Ligand nicht-kovalent an den zentralen Kern gebunden sind. Der zentrale Kern ist _#

sich ein stabiles, kolloidales Teilchen, das aus einer diskreten,/ vom wässrigen Lösungsmittel unterscheidenen Phase besteht und organische Moleküle enthält, die zumindest teilweise lipophil sind. Die Teilchen weisen eine hydrophile, normalerweise elektrostatisch geladene Oberflächenschicht auf, die eine hydrophobe Schicht bzw. Kern umgibt. Durch Verwendung von Liganden und Markern, die natürlicherweise lipophil sind oder durch Konjugation mit lipophilen Verbindungen lipophil gemacht sind, werden sowohl der Marker als auch der Ligand nicht-kovalent an die diskreten Teilchen gebunden. Stellt man entsprechende Mengen an Marker und Ligand zur Verfugung, so befindet sich ein wesentlicher Teil von Marker und Ligand in relativ enger räumlicher Nähe auf der Oberfläche der Teilchen.

Bei Proteinbindungs tests wird der in Erage stehende Ligand normalerweise markiert. Dabei ist eine Unterscheidung zwischen der Menge an markiertem, an den Rezeptor gebundenen Liganden und der Menge an markiertem, nicht gebundenen Liganden möglich. Bei heterogenen Tests ist eine derartige Unterscheidung aufgrund einer physikalischen Trennung möglich. Bei homogenen Tests ergibt sich eine Unterschexdungsmöglichkeit aufgrund der Modulation des durch den Marker erzeugten Signals.

Aufgrund der Tatsache, dass Marker und Ligand in relativ enger Nachbarschaft auf der Teilchenoberfläche vorliegen, kann die Nachbarschaft des Markers und des Rezeptors, der an den Liganden neben dem Marker gebunden ist, nach an sich üblichen Verfahren zur Modulation des vom Marker erzeugten Signals verwendet werden.

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Γ Π

Ein Vorteil des erfindungsgemassen Immuntests besteht darin, dass ein einfacher "hub"-Kern zur Verfugung steht, an den in relativ gleichmässiger Weise und in verschiedenen Verhältnissen leicht die verschiedensten Marker und Liganden gebunden werden können. Ein weiterer Vorteil "bestellt darin, dass bei grossen Liganden leicht die relativ kleine lipophile Verbindung an den grossen Liganden gebunden werden kann. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der Marker nicht direkt an den Liganden gebunden wird. Dies kann in den Fällen sehr wichtig sein, bei denen der Ligand nicht leicht in reiner ' Form erhalten werden kann. Wenn der Ligand vorwiegend als ein komplexes Gemisch, beispielsweise in Form von natürlich auftretenden Produkten, zur Verfügung steht _y so werden beim Markieren des Liganden auch Verunreinigungen markiert. Die markierten Verunreinigungen bilden daher einen "Hintergrund" der .die Testempfindlichkeit erheblich beeinträchtigen kann. Erfindungsgemäss wird der Ligand indirekt markiert, so dass keine markierten Verunreinigungen vorhanden sind, die den Test stören. Ferner kann man auch ein mit einem einzelnen Liganden hergestelltes lipophiles Konjugat mit den verschiedensten Markern verwenden. In ähnlicher V/eise kann man Marker herstellen _v und diese mit den verschiedensten Liganden einsetzen. Bei den Liganden, bei denen die Anwesenheit eines Liposoms erforderlich ist, wird beim erfindungsgemassen Test für die erforderliche Umgebung gesorgt.

Nachstehend werden kurze Definitionen für hier verwendete Ausdrücke gegeben:

Analy t;

Zu messende Verbindung oder Substanz. Es kann sich um einen mono— oder polyepitopen, antigenischen oder haptenischen Liganden, eine oder mehrere Verbindungen, die mindestens eine gemeinsame epitope Stelle ("epitopic site", nachstehend auch als epitopes Zentrum bezeichnet) aufweisen, oder einen Rezeptor handeln.

L 909847/0881 _j

Γ

Ligand:

Beliebige Verbindung, für die ein Eezeptor natürlich vorkommt oder hergestellt werden kann.

Ligandenanaloges:

Modifizierter Ligand, der mit dem analogen Liganden um.den Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation die Möglichkeit zur Bindung eines modifizierten Liganden an ein anderes Molekül bietet. Das Ligandenanaloge unterscheidet sich vom Liganden um mehr als durch den blossen Ersatz eines Wasserstoffatoms durch eine Bindung, die zur Verknüpfung des modifizierten Liganden an ein anderes Molekül dient.

Rezeptor:

^ Beliebige Verbindungen oder Zusammensetzungen, die in der Lage sind, eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, d. h. ein epitopes Zentrum, zu erkennen. Beispiele für Rezeptoren sind natürlich auftretende Rezeptoren, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente und Lectine. Der Rezeptor für einen spezifischen Liganden wird als Antiligand bezeichnet. Der Rezeptor für einen spezifischen Marker wird als Antimarker bezeichnet. Der Rezeptor-Antiligand oder -Antimarker und dessen homologer Ligand oder Marker bilden

ein spezifisches bindendes Paar.
25

Marker:

Eine Verbindung, die entweder direkt oder indirekt an der Bildung eines nachweisbaren Signals beteiligt ist und direkt an eines oder mehrere lipophile Moleküle gebunden ist. Beispiele für Marker sind Chromogene, wie Fluoreszenzerreger und Chemilumineszenzerreger, Katalysatoren (sowohl enzymatische als auch nicht-enzymatische), und Moleküle mit einer enzymatisch labilen Bindung, die nach enzymatischem Spaltung Verbindungen ergeben, die entweder direkt oder indirekt nachgewiesen werden können.

^L 90 9 847/0881

Unter Konjugat sind zwei kovalent aneinander gebundene Moleküle, die erfindungsgemäss verschiedene Funktionen wahrnehmen, zu verstehen. Im Marker-Lipophil-Konjugat ist der Marker an eine oder mehrere lipophile Verbindungen gebunden. IEm Konjugat aus lipophiler Verbindung und Ligand oder Ligandenanalogem, nachstehend als Ligand-Lipophil-Konjugat bezeichnet, ist der Ligand oder der modifizierte Ligand an eine oder mehrere lipophile Verbindungen gebunden. 10

■ In en Tilgen Fällen kann der Marker indirekt an das kolloidale Teilchen gebunden sein. Dies erreicht man durch Verwendung einer lipophilen Verbindung (einschließlich Konjugate von lipophilen Gruppen mit Haptenen und Antigenen) im kolloidalen.

Teilchen. Rezeptoren, beispielsweise Antikörper und Fab-Fragmente, die eine derartige lipophile Verbindung erkennen oder spezifisch eine Bindung mit ihr eingehen (unter Einschluss des haptenischen oder antigenen Teils dieser Verbindung) können mit dem Marker konjugiert sein. Der markierte Rezeptor kann dann eine Bindung mit der lipophilen Verbindung im kolloidalen Teilchen unter indirekter Markierung des Teilchens eingehen. Auf diese Weise lässt sich die Anzahl der an das Teilchen gebundenen Marker stark erhöhen.

Lipophil;

Grossenteils Kohlenwasserstoffe oder Lipide. Lipide sind amphiphile längliche Moleküle von wesentlich geringerem Gewicht und Grosse als Polymerisate, deren Grosse jedoch ausreicht, dass sie zwei verschiedene Bereiche von stark unterschiedlicher Polarität aufweisen können. An einem Ende des Moleküls befindet sich der polare (hydrophile) Bereich, der die Wechselwirkung mit Wasser begünstigt, während sich am anderen Ende der apolare (hydrophobe) Bereich befindet, der aus Kohlenwasserstoffketten besteht. Die amphiphile Natur des Moleküls ist für die molekularen Assoziations-

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er scheinungen, die für Lipide sowohl in kristalliner Form als auch in Lipid-Wasser-Systemen charakteristisch sind, verantwortlich; vgl. Water, Bd. 4-, Aqueous Solutions of Amphiphiles and Macromolecules, Kapitel 4, Lipids, S. 213, Plenum Press, Hew York, und Tute, Chem. Ind. (London), Bd. (1975), S. 100 Ms 105. . - ■

Amphiphil:

(Tgl. die vorstehende Definition für Lipide). Amphiphile können neutral oder geladen sein. Bei negativer Ladung besteht die anionische Gruppe im allgemeinen aus Phosphat, Carbo^qrlat, SuIfonat oder Sulfat, insbesondere Phosphat. Bei positiver Ladung liegt als kationische Gruppe im allgemeinen ein Ammoniumion, beispielsweise ein Pyridinium- oder Tetraalkylammoniumion, ein Phosphonium- oder Sulfoniumion und insbesondere ein Ammoniumion vor.

Kolloidale Teilchen:

Bei den kolloidalen Teilchen handelt es sich um kleine, diskrete Teilchen, die in wässriger Umgebung bestehen bleiben. Die Teilchen enthalten lipophile, im allgemeinen amphiphile, Moleküle. Diese Teilchen lassen sich unter die Assoziationskolloide einordnen, bei denen es sich um thermodynamisch stabile Systeme handelt, wobei die dispergierte Phase aus Aggregaten von Molekülen (oder Ionen) von relativ kleiner Grosse und Masse besteht; vgl. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15- Auflage, Mack Publishing Co., Eastin, PA, 1975, S. 300.

Meistens weisen die kolloidalen Teilchen eine regelmässige Porm, wie Kügelchen, Zylinder oder Plättchen, auf. Bei amphiphilen Molekülen besteht das Teilchen aus einer hydrophilen, normalerweise geladenen äusseren Schicht und einer hydrophoben inneren Schicht oder Kern. Die Schichten können mono- oder polylamellar sein. Zwischen den Schichten kann sich eine wässrige Phase befinden. Bei lipophilen Molekülen

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ist normalerweise eine Schicht von amphiphilen Molekülen (im allgemeinen geladen) auf der Oberfläche der Teilchen vorhanden.

In den meisten Fällen weisen die Moleküle ein Molekulargewicht von mindestens etwa I50 und höchstens etwa 2500 und vorzugsweise höchstens I5OO auf. Die Moleküle weisen mindestens 12 aliphatische Kohlenstoffatome (einschliesslich alicyclische Kohlenstoff atome) und im allgemeinen mindestens 18 und vorzugsweise mindestens 28 Kohlenstoffatome auf.

• Im allgemeinen beträgt die Anzahl der Kohlenstoffatome höchstens etwa 175· Eie amphiphilen Verbindungen weisen im allgemeinen eine aliphatische Kette von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 12 und im allgemeinen höchstens etwa 36 Kohlenstoffatomen auf. Sie weisen 0 bis 3 aliphatische ungesättigte Bindungen, im allgemeinen äthylenische Doppelbindungen, auf. Die Teilchengröße beträgt etwa 2 χ 10" bis 10* u , vorzugsweise 6 χ 10~ bis 1-⁵ vP und insbesondere etwa 8 χ 10" bis 10"^ 11 . Bei Liposomen beträgt die Mem-

' O

branstärke etwa 50 bis 100 A.

Teilchen, die aus lipophilen Verbindungen, bei denen es sich nicht um amphiphile Verbindungen handelt, hergestellt worden sind, werden als Tröpfchen bezeichnet. Aus amphiphilen Verbindungen hergestellte Teilchen werden als Bläschen oder Liposomen bezeichnet.

Kolloidales Teilchenreagens:

Beim kolloidalen Teilchenreagens handelt es sich um kolloidale Teilchen, die das Markerkonjugat und den Liganden oder das Ligandenkonjugat (unter Einschluss von Ligandenanalogem-Konjugat) als Teil der äusseren molekularen Schicht enthalten, so dass Ligand und Marker sich in grösserer Nähe zur Teilchenoberfläche befinden, als wenn sie willkürlich in der Lösung verteilt wären. Die beiden Konjugate oder das Markerkonjugat und der amphiphile Ligand sind aufgrund der

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Anwesenheit der lipophilen Gruppe nicht-kovalent an die Teilchen gebunden»

Testpackungg
Eine Kombination von Reagentien, im allgemeinen zusammen mit Hilfsreagentien, wie Puffer, Salze und Stabilisatoren. Die Reagentien sind dabei in solchen vorbestimmten Mengen vorhanden,, dass im wesentlichen eine optimale Testempfindlichkeit erreicht wird_o Handelt es sich bei dem Analyten um einen AntiligandQn₅ so enthält die Testpackung ein kolloi dales Teilchenreagens und je nach Bedarf Antimarker, modifiziert oder nicht-modifiziert« oder modifizierten Antiliganden. Handelt es sich beim Analyt um einen Liganden, so enthält die Testpackung kolloidales Teilchenreagens, Antiligand und je nach Bedarf Antimarker_? wobei die Rezeptoren modifiziert sind oder nicht«,

Modifizierter Rezeptor;

Ein Rezeptor, der an eine Verbindung gebunden ist, die mit dem Marker unter Modulation des nachweisbaren Signals in Wechselwirkung tritt. Beispiele für Verbindungen zur Modifikation des Rezeptors sind Chromogene, die als Quencher oder Energierezeptoren wirken, Enzyme oder nicht-enzymatisehe Katalysatoren.

Test;

Der erfindungsgemässe Test wird in einer wässrigen Zone bei einem massigen pH-Wert, im allgemeinen in der Nähe des Empfindlichkeitsoptimums durchgeführt, wobei im allgemeinen die Testbestandteile oder Produkte nicht getrennt werden» Die Testzone zur Bestimmung des Analyten wird unter Verwendung folgender Bestandteile hergestellt: Eine normalerweise gepufferte, entsprechende wässrige Lösung, die unbekannte Probe, die einer Vorbehandlung unterzogen worden dein kann, das kolloidale Teilchenreagens, beliebige Hilfsmaterialien, die mit der Bildung des nachweisbaren Signals

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in Zusammenhang stehen, sowie gegebenenfalls modifizierte oder nicht-modifizierte Rezeptoren.

Die Anwesenheit eines Liganden oder Antiliganden als Analyt in der unbekannten Probe beeinflusst das Ausmass, in dem der Antiligand eine Bindung mit dem kolloidalen Teilchenreagens eingeht und somit die Bildung des nachweisbaren Signals. In einigen Fällen wird der Antiligand durch daran gebundene Moleküle, die mit dem Marker in Wechselwirkung treten, modifiziert« Diese Wechselwirkung sorgt für eine . Modulation des nachweisbaren Signals. In anderen Fällen beeinflusst die Nähe des Antiliganden sum Marker das nachweisbare Signal ohne jegliche Modifikation des Antiliganden.

Zur Durchführung des Tests wird im allgemeinen ein wässriges Medium verwendet. Es können auch andere polare Lösungsmittel verwendet werden, im allgemeinen Sauerstoff enthaltende organische Lösungsmittel mit 1 bis 6 und insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele hierfür sind Alkohole und Ither. Im allgemeinen sind diese Kolösungsmittel in Mengen von höchstens etwa 40 Gewichtsprozent und insbesondere höchstens etwa 20 Gewichtsprozent vorhanden.

Der pH-Wert des Mediums liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 4 bis 11, vorzugsweise von etwa 5 ois 10 und insbesondere von etwa 6,5 "bis 9,5· Der pH-Wert wird so gewählt, dass ein signifikanter Grad der spezifischen Bindung durch den Rezeptor aufrechterhalten wird, während die Signalbildung einen optimalen Wert erreicht. In einigen Fällen wird ein Kompromiss zwischen diesen beiden Gesichtspunkten gemacht. Zur Einstellung 'des gewünschten pH-Werts und zu dessen Aufrechterhaltung während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Beispiele hierfür sind Borat-, Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Barbitalpuffer. Die Art des speziellen Puffers ist für den erfindungsgemässen Test nicht kritisch, jedoch können in bestimmten Tests bestimmte Puffer gegenüber anderen bevorzugt sein.

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Im allgemeinen werden zur Durchführung des Tests massige Temperaturen angewendet. Vorzugsweise werden während des gesamten Tests konstante Temperaturen eingehalten. Die Temperaturen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 50⁰C und vorzugsweise von etwa I5 ^is 40°C.

Die Analytenkonzentration, die einer Bestimmung zugänglich

—4- —15 ist, beträgt im allgemeinen etwa 10 bis 10 ^m und ins-

—6 —1-5
besondere etwa 10 bis 10 nn. Die Konzentration der übrigen Reagentien hängt von verschiedenen Gesichtspunkten ab, ■ beispielsweise davon, ob der Test qualitativ, halbquanti— tativ oder quantitativ durchgeführt werden soll, vom speziellen Machweisverfahren und von der Konzentration des In Präge stehenden Analyten.

Obgleich im allgemeinen zur Erzielung einer möglichst hohen Testempfindlichkeit innerhalb des in Frage stehenden Bereichs die Konzentrationen der verschiedenen Reagentien unter Berücksichtigung der Analytenkonzentration f estgelegt wird, werden die endgültigen Eeagentienkonzentrationen normalerweise empirisch festgelegt.

Die Anzahl der gesamten bindenden Stellen des Bestandteils des spezifischen bindenden Paars, das zum Analyten reziprok ist, beträgt mindestens etwa das Q, 1-fache der interessierenden Minimalkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen des Analyten, und höchstens das etwa 1000-fache der interessierenden Maximalkonzentration, bezogen • auf die bindenden Stellen des Analyten. Vorzugsweise beträgt die Konzentration etwa das 0,1- bis 100-fache und insbesondere etwa das 0,1- bis 10-fache der interessierenden Maximalkonzentration. Wenn es sich beim Rezeptor um den Analyten handelt und ein modifizierter Rezeptor als Reagens verwendet wird, beträgt die Menge des modifizierten Rezeptors, bezogen auf die bindenden Stellen, mindestens etwa das 0,01-fache der interessierenden Minimal— konzentration und im allgemeinen höchstens das 100-fache

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der interessierenden Maximalkonzentration des Rezeptors. Die zusammen mit dem Marker verwendeten Hilfsreagentien sind in ausreichenden Mengen vorhanden, so dass sie nicht geschwindigkeitsbestimmend sind oder das Ausmass des Signals als Funktion der Analytenkonzentration stören. Die Menge hängt von der Natur des Markers und der Hilfsreagentien ab.

Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Reagentien kann stark variieren und hängt vom speziellen Marker, der . Art des Analyten und den relativen Konzentrationen von Analyt und Reagentien ab. Ferner wird die Reihenfolge der Zugabe auch dadurch beeinflusst, ob eine Gleichgewichtsoder eine Geschwindigkeitsmessung vorgenommen wird. Bei der Bestimmung der speziellen Reihenfolge der Zugabe sind verschiedene grundlegende Gesichtspunkte zu berücksichtigen. Im allgemeinen ist die Assoziationsgeschwindigkeit von Rezeptor und Ligand wesentlich grosser als die entsprechende Dissoziationsgeschwindigkeitjwenngleich hierbei · nicht nur die Bindungskonstante sondern auch die relativen Konzentrationen der Bestandteile des spezifischen bindenden Paars einen Einfluss haben. Ferner ist zu berücksichtigen, ob der Hintergrund möglichst gering gehalten werden soll, so dass bei einer Geschwindigkeitsmessung die Bildung des Signals im allgemeinen nicht eintreten soll, bevor sämtliche Bestandteile vorhanden sind. Schliesslich darf die Reihenfolge der Zugabe nicht die Fähigkeit des Analyten zur Modulation des nachweisbaren

Signals stören.
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Wenn der Ligand der Anälyt ist, kann die unbekannte Probe mit dem Ligandenrezeptor und das erhaltene Gemisch mit dem kolloidalen Teilchenreagens und den Hilfsreagentien vereinigt werden. Wenn der Rezeptor der Analyt ist und ein modifizierter Rezeptor nicht als Reagens verwendet wird, kann der Rezeptor einfach zum kolloidalen Teilchen-

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reagens gegeben werden, worauf die Zugabe der Hilfsreagentien folgt. Bei Verwendung eines modifizierten Rezeptors können die unbekannte Probe und der modifizierte Rezeptor vereinigt und sodann zum flüssigen leilchenreagens gegeben werden, worauf wiederum die Zugabe der Hilfs-

reagentien erfolgt. Eine andere Möglichkeit besteht da-... ... gleichzeitig zuzusetzen, entweder,,

rxn, sämtliche primären Reagentien/zusammen mit den Hilfsreagentien oder vor der Zugabe der Hilfsreagentien.

.· Es können eine oder mehrere Inkubat ions stufen angewendet werden, die im allgemeinen etwa 0,1 Minuten bis 6 Stunden, vorzugsweise etwa 1 Minute bis 1 Stunde und insbesondere etwa 5 Minuten bis 30 Minuten dauern. Die Inkubationstemperaturen betragen im allgemeinen etwa 4 bis 50⁰C und vorzugsweise etwa 15 bis 37°C

Uach der Vereinigung der Reagentien wird das Signal bestimmt. Die Bestimmung kann aufgrund von elektromagnetischer Strahlung, insbesondere UV- und sichtbares Licht (entweder Absorption oder Emission)^ sowie durch thermische, volumetrische, elektrochemische oder ähnliche Messungen erfolgen. Vorzugsweise wird das Signal in Form einer elektromagnetischen Strahlung im UV- oder sichtbaren Bereich, insbesondere von etwa 250 bis 750 mn, abgelesen.

Die Temperatur, bei der das Signal beobachtet wird, beträgt im allgemeinen etwa 10 bis 50⁰C und vorzugsweise etwa 15 Ms 4O⁰G.

Eichtestmedien mit bekannten Analytenkonzentrationen lassen sich herstellen. Die bei diesen Eichmedien festgestellten Signale werden sodann aufgetragen, so dass eine Beziehung zwischen Konzentration und Signal hergestellt wird« Each Erstellung einer derartigen Eichkurve lässt sich aus einem Signal direkt die Analytenkonzentration ermitteln» as

Mach der Vereinigung sämtliclier Materialien kann die Afc=·

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lesung aufgrund einer Geschwindigkeits- oder einer' Gleichgewichtsmessung erfolgen. Die Ablesung kann normalerweise sofort oder innerhalb von 2 Sekunden nach Beendigung der Zugabe der verschiedenen Materialien erfolgen. Bei einer Geschwindigkeitsmessung kann eine zweite Ablesung nach 0,2 Minuten, im allgemeinen nach 0,5 Minuten oder mehr erfolgen. Im allgemeinen verstreicht bis zur zweiten Messung höchstens 1 Stunde und vorzugsweise höchstens 5 Minuten. Bei einer Gleichgewichtsmessung muss abgewartet werden, bis das Gemisch eine praktisch konstante Ablesung ergibt. Dies kann bereits nach 0,5 Minuten der Fall sein, kann aber auch 1 Stunde oder länger dauern.

Materialien:

Im erfindungsgemässen Test liegen folgende Materialien vor: Analyt (Ligand oder Antiligand), kolloidales Teilchenreagens (einschliesslich des Markerkonjugats und Konjugat von Ligandenanalogem oder Ligandem) gegebenenfalls Ligandenrezeptor oder modifizierter Rezeptor und gegebenenfalls Hilfsreagentien.

Analyt:

Die erfindungsgemäss bestimmten Lxgandenanalyten sind mono- oder polyepitop. Bei polyepxtopen Lxgandenanalyten handelt es sich normalerweise um Polyaminosäuren, d.h.

um Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und entsprechende Kombinationen.

In den meisten Fällen weisen die erfindungsgemäss bestimmten polyepxtopen Lxgandenanalyten ein Molekulargewicht von mindestens 5000 und im allgemeinen von mindestens etwa 10 000 auf. Bei Polyaminosäuren liegt das Molekulargewicht im Bereich von etwa 5000 bis 1 Million und vorzugsweise von etwa 20 000 bis 600 000. Bei den Hormonen liegt das .Molekulargewicht im allgemeinen im Bereich von etwa 5000 bis 60 000„'

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Die Proteine lassen sich, in verschiedene Gruppen einteilen, beispielsweise Gruppen mit ähnlichen Strukturmerkmalen, Gruppen mit besonderen biologischen Funktionnen und Gruppen, die mit speziellen Mikroorganismen im Zusammenhang stehen, insbesondere mit pathogenen Mikroorganismen.

Nachstehend sind strukturell verwandte Proteine aufgeführt Protamine, HLstone, Albumine, Globuline, Scleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nucleoproteine und Glycoproteine.

Beispiele für nicht klassifizierte Proteine sind Somato-^ tropin, Prolactin, Insulin und Pepsin. 15

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γ -ι

- 20 -

Eine Anzahl von Proteinen aus dem menschlichen Plasma

sind klinisch bedeutsam. Beispiele dafür sind: Präalbumin, Albumin, a.-Lipoprοtein, a^-Säureglycoprotein, a^-Antitrypsin, ou-Glycoprotein, Transcortin, 4-.6S-Postalbumin, tryptophanarmes a^-Glycoprotein, a^ jf-Glycoprotein, thyroxinbindendes Globulin, Inter-α-trypsin-inhibitor, Gc-Globulin, (Gc 1-1; Gc 2-1; Gc 2-2), Haptoglobin (Hp

1-1; Hp 2-1: Hp 2-2), Ceruloplasmin^ Cholinesterase, Myoglobin_v C-reaktives Protexn. _T_ _,_, , . a2-LipoproXexne ,/ap-HacrogloDulm, ap-HS-Glycoprotem, Zn-oCp-Glycoprotein, ap-Neuraminoglycoprotein, Erythropoietin, ß-Lipoprotein, Transferin, Hämopexin, Fibrinogen, Plasminogen, ß^-Glycoprotein I, ß^-Glycoprotein II, Immuno globulin G (IgG) oder ifG-Globulin der Formeln:

l^r2 /T2 oder i/^ \ ~ > Immunoglobulin A (IgA) oder ^A.-Globulin der Formeln: (ap/^2 )ⁿ oder (ap\p)ⁿi Immunogl obulin M (IgM) oder JTl-Globulin der Formeln: Qi₂ /T₂)^ oder Qi₂A₂) , Immunogl obulin D (IgD) oder KD- Gl obulin (^D) der Formeln: ((T₂Kp^ oder (J₂Ap)' Immunogl obulin E (IgE) oder j^E-Globulin-( ΚΈ) der Formeln: (^₂Ir₂) oder (£ ₂A2^» freie /fund A-Ketten des Immunoglobulins, Komplementfaktoren: C^f1 (C¹Iq; C'1r; C¹Is) C'2, C'3 (ß^A; C'4, C'5, C'6, C'7, C8, C'9·

_oc Nachstehend sind die wichtigsten Blutgerinnungsfaktoren aufgeführt:

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	— d. I —	2919835	Fibrinogen
	Bezeichnung	Name	Prothrombin
Internationale		Thrombin
I		Gewebsthrombopiastin
II		Proaccelerin, Accelerator-
Ha		globulin
III	VI	Proconvertin
V und		AntihämoOhiles Globulin

VII
VIII

(AHG) "

IX Christmas-Faktor, Plasma-

Thromboplastin-Component (PTC)

X Stuart-Prower-Faktor,

Autoprothrombin III

XI Plasma-Thromboplastin-

Antecedent (PTA)

XII Hagemann-Faktor

XIII Fibrinstabilisierender

Faktor

Beispiele für wichtige Proteinhormone sind: Peptid- und Proteinhormone

Parathyroides Hormon (Parathormon), Thyrocalcitonin, Insulin, Glucagon, Relaxin, Erythropoietin, Melanotropin (melanocytenstimulierendes Hormon, Intermedin), Somatotropin (Wachstumshormon), Corticptropin (adrenocorticotropes Hormon), Thyrotropin, follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon (interstitialzellenstimulierendes Hormon), luteomammotropes Hormon (Luteotropin, Prolactin) und Gonadotropin (chorionisehes Gonadotropin).

Gewebshormone

Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin und Lactogen aus Humanplacenta.

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Peptidhormone aus der Neurohypophyse

Oxytocin, Vasopressin, Beleasing-Factors (EP), wie CBS¹, LBP, TEF, Somatotropin-RF, GEI¹, FSH-EP, PIF und MIF.

5 Weitere polymere Materialien von Interesse sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.

Beispiele für antigene Polysaccharide, die sich von Mikroorganismen ableiten sind:
10

Mikro organi smen-Sp e ζ i e s

Streptococcus pyogenes Diplococcus pneumoniae

Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoe

Corynebacterium diphtheriae Actinobacillus mallei;

Actinobacillus whitemori Francisella tularensis

Pasteurella pestis Pasteurella pestis

Pasteurella multocida Brucella abortus Haemophilus influenzae Haemophilus pertussis Treponema reiteri Veillonella
Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium Mycobacterium tuberculosis Hämosensitin gefunden in

Polysaccharid Poly saccharic!

Polysaccharid. Polysaccharid

Polysaccharide Eohextrakt

Lipopolysaccharid 'Polysaccharid

Polysaccharid·

Kapsuläres Antigen Eohextrakt Polysaccharid roh

Poiysaccharid. Lipopolysaccharid Polysaccharid Polysaccharid ; Lipopolysaccharid· Kochsaizextrakt von mit 90% Phenol extrahierten Mykobakterien und PoIysaccharidfraktion von Zellen und Tuberkulin

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Γ ~Ι

Klebsieila aerogenes Polysaccharide

Klebsiella cloacae Polysaccharide

Salmonella typhosa Lxpopolysacchand. ,

Polysaccharxdv

Salmonella typhi-murium; Polysaccharid

Salmonella derby-Salmonella pullorum
Shigella dysenteriae Polysaccharid

Shigella flexneri roh, Polysaccharid

Shigella sonnei

Rickettsiae ■ Rohextrakt _

\ Candida albicans Polysaccharid.·

Entamoeba histolytica . itohextrakt -

Weitere interessierende Materialien sind die Allergene.

Das Molekulargewicht der monoepitopen Ligandenanalyten beträgt im allgemeinen etwa 100 bis 2000 und insbesondere 125 bis 1000. Beispiele für in Frage kommende Analyten sind Arzneistoffe, Metaboliten, Pestizide und umweltverschmutzende Substanzen. Bexspiele für Arzneistoffe sind Alkaloide, insbesondere Morphinalkaloide, wie Morphin, Codein, Heroin,Dextromethorphan sowie deren Derivate und Stoff Wechselprodukte, Kokainalkaloide, wie Kokain und Benzoylecgonin sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte, Ergotalkaloide, wie Lysergsäurediäthylamid, Steroid— alkaloide, Iminazoylalkaloide, Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide, Chinolinalkaloide, wie Chinin und Chinidin, und Diterpenalkaloide sowie deren Derivate und Stoff— Wechselprodukte-.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoff en sind die Steroide, zum Beispiel die Östrogene, Gestagene, Androgene, Neben.-* ■ nierenrindensteroide.,· Gallensäuren, cardiotone _r Glycoside und AgIycone, wie Digoxin und Digoxigenin, Saponin und Sapogenine, sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte. Hierzu gehören auch die mime tischen Steroidsubstanzen, wie Diäthylstilböstrol;

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Γ

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Lactame mit 5 oder 6 Ringatomen, beispielsweise die Barbiturate, wie Phenobarbital, Secobarbital, Diphenylhydantoin, Primidon und A'thoxysuccimid, sowie deren StoffWechselprodukte.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Aminoalkyl benzole mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten, wie die Amphetamine, Catecholamine, zum Beispiel Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin, sowie deren Stoff-Wechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Benzheterocyclen, wie Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, sowie deren Derivate und StoffWechselprodukte. Als heterocyclische Ringe liegen dabei Azepine, Diazepine und Phenothiazine vor.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Purine, wie Theophyllin, Coffein, sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind von Marihuana abgeleitete Verbindungen, wie Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
25

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Vitamine, beispielsweise die Vitamine A, B, wie B^i C, D, E und K sowie Folsäure und Thiamin.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Prostaglandine, die sich in bezug auf Anzahl und Stellung von Hydroxylgruppen und Mehrfachbindungen unterscheiden.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Antibiotika, _wie Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.

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Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Nucleoside und Nucleotide, wie ATP, MD, FMN, Adenosin, Guanosin, . Thymidin und Cytidin mit den entsprechenden Zucker- und Pho sphat sub stituenten.

.

Beispiele für verschiedene einzelne Arzneistoffe sind Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin,

Valnroinsaure _T

Nortrip tylin, Lidocaini/Procainamid, Acetylprocamamid, Propranolol, Griseofulvin, Butyrophenone, Antihistaminika, anticholinerge Arzneistoffe, wie Atropin, sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind Aminosäuren und kleine Peptide, wie die Polyjodthyron'ine, zum Beispiel Thyroxin und Trijodthyronin, Oxytocin, ACTH, Angiotensin, · Met- und Leu-enkephalin sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.

Beispiele für pathogene Stoffwechselprodukte sind Spermin, Galactose, Pheny!brenztraubensäure und Porphyrin vom

Typ 1. -

In Frage kommende Pestizide sind polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide sowie deren Stoffwechselprodukte· und Derivate-

Das Molekulargewicht der Rezeptoranalyten beträgt im allgemeinen 10 000 bis 2 χ 10 und insbesondere 10 000 bis 10.. Bei den Immunoglobulinen IgA, IgG, IgE und IgM beträgt das Molekulargewicht im allgemeinen etwa 160 000 bis etwa 10 . Das Molekulargewicht von Enzymen liegt im allgemeinen bei etwa 10 000 bis 600 000. Das Molekulargewicht von natürlichen Rezeptoren schwankt -stark und beträgt im-allgemeinen mindestens etwa 25 000, kann aber 10 erreichen oder darüber hinaus gehen. Entsprechende Beispiele sind. Avidin, thyroxinbindendes Globulin, thyroxinbindendes Präalbumin und Transcortin.

^L 909847/0881 ^J

^Γ , 26 -

Konjugat aus Ligandenanalogem oder Ligand und lipophiler Verbindung

Das Konjugat hängt stark von der Art des Liganden und der lipophilen Verbindung ab. Entweder werden funktioneile Gruppen, die im Liganden vorhanden sind, zur Bindung verwendet oder der Ligand wird modifiziert und funktionelle Gruppen werden eingeführt, so dass ein Ligandenanaloges zur Konjugation mit der lipophilen Verbindung geschaffen wird.

In den meisten Fällen werden als funktionelle Gruppen Carbonylgruppen, sowohl Oxocarbonylgruppen, wie Aldehydgruppen, als auch Nicht-oxo-carbonylgruppen (unter Einschluss der Stickstoff- und Schwefelanalogen), wie Carboxy-, Imidoyl- und Thionocarboxygruppen, verwendet.

Beispiele für weitere funktionelle Gruppen sind Halogenatome, Diazogruppen, Mercaptogruppen, Olefingruppen, insbesondere aktivierte Olefingruppen, Aminogruppen und Phos— phorgruppen. Auf die Beschreibung von verknüpfenden Gruppen in der US-PS 3 817 837 wird hier Bezug genommen.

Die verknüpfenden Gruppen können von einer Bindung bis zu einer Kette mit 1 bis 10 und insbesondere etwa 1 bis 8 Atomen (im allgemeinen Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Stickstoff- und Phosphoratome) variieren. Die Anzahl der Heteroatome in der verknüpfenden Gruppe beträgt im allgemeinen etwa 0 bis 6 und vorzugsweise etwa 1 bis 4-,

In den meisten Fällen sind die verknüpfenden Gruppen aliphatischer ITatür, wenngleich auch bei Diazogruppen im allgemeinen aromatische Reste beteiligt sind.

Die Heteroatome liegen im allgemeinen in folgender Form vor: Sauerstoff als Oxo- oder Oxygruppen, gebunden an

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^Γ -27- ^Π

Kohlenstoff, Schwefel, Phosphor oder Wasserstoff, Stickstoff als Aminogruppen, im allgemeinen nur an Kohlenstoff, Schwefel oder Phosphor gebunden, Schwefel entsprechend wie Sauerstoff und Phosphor an Kohlenstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Stickstoff j im allgemeinen als Phosphonat- und Phosphat-mono- oder -diester.

Übliche funktioneile Gruppen zur Bildung von kovalenten Bindungen zwischen der verknüpfenden Gruppe und dem zu konjugierenden Molekül sind Alkylamin-, Amid-, Amidin-, Thio-amid-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Guanidin-, Diazo-, Thio-• äther-, Carboxy-, Phosphatester- und Thioestergruppen.

In den meisten Fällen weisen die lipophilen Verbindungen eine Hicht-oxo-carbonylgruppe, eine Phosphatgruppe, eine Aminogruppe, eine Oxygruppe (Hydroxyl- oder die schwefelanaloge Mercaptogruppe) oder Oxycarbonylgruppe (Aldehydgruppe)auf.Die se funktionellen Gruppen werden an Amingruppen, Carboxylgruppen, Olefingruppen und Gruppen mit aktiven Halogenatomen, wie die Bromacetylgruppe, gebunden. Wenn eine Amin-

oder Carbonsäuregruppe oder deren Stickstoffderivat oder ei-Phosphorsäuregruppe verknüpft werden, werden Amide, Amidine und Phosphoramide gebildet. Bei der Verknüpfung von Mercaptanen und aktivierten Olefinen entstehen Thioäther. Bei der Verknüpfung von Mercaptanen und Gruppen mit aktiven

Halogenatomen entstehen Thioester. Bei der Verknüpfung eines Aldehyds und eines Amins unter reduzierenden Bedingungen entsteht ein Alkylamin. Bei der Verknüpfung einer Carbonsäuregruppe oder einer Phosphor säure gruppe und einem Alkohol entstehen Ester.

Verschiedene amphiphile 'Verbindungen können als lipophile Quelle zur Konjugation mit dem Liganden verwendet werden. Diese Verbindungen weisen als polare Gruppen die vorstehend erläuterten funktionellen Gruppen auf.

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Γ "1

Zusätzlich zu den Verbindungen, die im Abschnitt über die amphiphilen Verbindungen zur Herstellung der kolloidalen Teilchen beschrieben werden, können verschiedene Verbindungen zur Konjugation mit dem Liganden verwendet werden. Beispiele dafür sind Derivate von Schwefelsäure, Phosphorsäure und Ameisensäure, wobei ein Wasserstoffatom oder·eine Hydroxylgruppe durch Gruppen ersetzt sein kann,die eine bis vier lipophile Ketten mit 10 bis 36 Kohlenstoffatomen aufweist, von denen mindestens 8 Kohlenstoffatome aliphatisch (auch alicyclisch) sind. Beispiele für entsprechende Verbindungen sind Alkylsulfate, Alkylbenzolsulfonate, Alkylphosphate, Alkylphoophonate, aliphatische Carbonsäuren und Alkylphosphonsäuren.

Die lipophilen Verbindungen, die zur Konjugation mit dem Liganden oder Marker verwendet werden, weisen in den meisten Fällen die nachstehenden allgemeinen Formeln auf:

(X)_nR(O)_nPO₂OY

(X)_nR(O)_nSO₂OM
(X)_nR¹SO₂OM

(XVRCOoM oder (XVRC(NH)Om'¹ 25

²⁵

RCHO
RSH

wobei die einzelnen Reste folgende Bedeutungen haben: R einen aliphatischen Rest mit 10 bis 150* vorzugsweise 12 bis 90 und insbesondere 16 bis 80 Kohlenstoffatomen; dabei kann R eine /einzige aliphatische Kette.mit 8 bis 36 und insbesondere 10 bis 2M- Kohlenstoffatomen oder eine Mehrzahl von an einen Alkylrest mit 2 bis 6 und insbe-

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sondere 2 bis 4- Kohlenstoffatomen gebundenen derartigen Ketten aufweisen, wobei 2 bis 6 und insbesondere 2 bis 4-von derartigen Ketten über eine Äther-, Thioäther-, Carboxyester-, Phosphateεter- oder Aminogruppe, insbesondere Ammoniumgruppe und vorzugsweise über eine Carboxyestergruppe gebunden sind; ferner kann R gesättigt oder ungesättigt sein und 0 bis 12 und insbesondere 0 bis 8 äthylenische Doppelbindungen als alleinige ungesättigte Gruppen aufweisen, insbesondere wenn sich die aliphatischen Reste von natürlich vorkommenden aliphatischen Carbonsäuren mit O bis 3 derartigen Stellen pro Kette ableiten, wobei diese Stellen jeweils durch mindestens 1 Kohlenstoffatom getrennt sind;

X einen Substituenten an R und zwar eine Amino- oder Hydrxylgruppe, oder einen Carboxamidorest mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen;

R einen Alkylbenzolrest mit 14 bis 30 Kohlenstoffatomen;

R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 10 bis 30 Kohlenstoffatomen und 0 bis 3 äthylenischen Gruppen;

Br einen Alkylenrest mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen; 25

M ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetallsalz (ein-

Sl

schliesslich Ammonium) und M einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;

Y die gleiche Bedeutung wie M oder einen monovalenten aliphatischen Rest mit 2 bis 10 und insbesondere 2 bis 6 Kohlenstoffatomen mit mindestens einer heterofunktionellen Gruppe, bei der es sich um eine Hydroxyl-, Amino-, Car-

handelt
boxy- oder Aldehydgruppe/,, wobei im allgemeinen höchstens 6, vorzugsweise höchstens 4· und insbesondere höchstens 2 derartiger funktioneller Gruppen vorhanden sind und

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1 bis 6 und vorzugsweise 1 bis 4 Heteroatome vorliegen, bei denen es sich um Sauerstoff- oder Stickstoffatome in Form von Oxy- oder Aminogruppen handelt, oder einen (X)_nR-ReSt;

Z einen Alkylenrest mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Oxygruppen;

η den Wert 0 bis 2 und vorzugsweise 0 bis 1, 10

m den Vert O oder 1;

ρ den Wert 1 bis 3 und
r den Wert p-3·

Das Ligandenkonjugat weist in den meisten Fällen die allgemeine Formel W-T-Ligand auf, wobei W-T einen Rest der folgenden allgemeinen Formeln bedeutet: 20

(X)_nR(O)_nPO₂O

(X)_nR(0)_mP0₂0Y¹
(X)_nR(O)_nSO₂O

(X)_nR¹SO₂O

(X)_nRCO
(X)_nRC(NH)

(R²)_pN(H)_rR³NH
_R

RS

und T eine Bindung bzw. das Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom, die eine Bindung mit dem Hapten eingehen, bedeutet und

Ύ die gleiche Bedeutung wie Y hat, wobei aber M ausgeschlossen ist.

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291983S Die lipophile Verbindung und der Ligand können nach herkömmlichen Verfahren miteinander konjugiert werden.

Von "besonderem Interesse sind !Conjugate von natürlich vorkommenden lipophilen Verbindungen mit einer fluoreszierenden Verbindung. Diese Verbindungen weisen in den meisten Fällen die nachstehende allgemeine Formel auf,

ACO₂CH₂CH(O₂GA)CH₂OPO₂ ^-OCH₂CHODFi M⁺ W

wobei ACO₂ gleiche oder verschiedene aliphatische Fettsäuren mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet, D eine verknüpfende Gruppe mit 2 bis 8 und vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls 1 bis 4 Heteroatome aufweist, bedeutet, wobei als Heteroatome Sauerstoff in Form einer Oxygruppe, Stickstoff in Form, einer Aminogruppe oder Schwefel in Form einer Sulfonamidogruppe vorliegen kann,

M die vorstehende Bedeutung hat,

Fl eine fluoreszierende Gruppe, vorzugsweise mit einem. Absorptionsmaximum über 400 nm und insbesondere über nm bedeutet und
¥ ein Wasserstoffatom oder einen Rest der allgemeinen Formel

(CH₂OPO₂OCH₂CH(O₂Ca)CH₂O₂CA

bedeutet.

Im Fall von Kardiolipin bedeutet ¥ einen Rest der allge-. ^₁ .
meinen Formel

-(CH₂OPO₂OCH₂CH(O₂CA)Ch₂O₂CA ,

wobei die Reste ACO₂ gleiche oder verschiedene Fettsäure— reste mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen und insbesondere Reste von Palmitin- und Stearinsäure bedeuten. Als fluoreszierende Gruppe wird ein Fluoresceinderivat bevorzugt, das

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ι ι

^r - 32 - '

in der 4- oder 5-Stellung der Phenylgruppe gebunden ist.

Marker-Lip ophil-Konnugat

Vie bereits erwähnt, können die verschiedensten Marker verwendet werden. Lediglich einige Hauptgesichtspunkte sind bei der Wahl des Markers zu berücksichtigen. Zunächst muss entweder direkt oder indirekt ein Signal erhalten werden können. · Ferner ist zu berücksichtigen, dass das Signal durch die Nähe eines Rezeptors moduliert werden kann, wobei der Rezeptor durch ein Molekül, das mit dem Marker unter Mo-. dulation des Signals in Wechselwirkung treten kann, modifiziert werden kann. Schliesslich ist zu berücksichtigen, dass der Marker aufgrund der Anwesenheit von lipophilen Gruppen, die entweder natürlicherweise vorhanden sind oder auf synthetischem Wege eingeführt worden sind, an die flüssigen Teilchen gebunden werden kann.

Die Art des nachweisbaren Signals kann stark variieren. Das Signal kann auf Absorption oder Emission elektromagnetischer Strahlung, vorzugsweise von Licht im Wellenlängenbereich von etwa 250 bis 750 nm_; zurückzuführen sein. Es kann sich aber auch um ein akustisch, thermometrisch, volumetrisch oder elektrochemisch nachzuweisendes Signal handeln. Obwohl die Erhöhung der Empfindlichkeit nicht erfindungswesentlich ist, ist es wünschenswert, dass der Marker anstelle eines Einzelereignisses eine Mehrzahl von Ereignissen pro Marker hervorruft. Deshalb werden Chromogene, die Licht absorbieren und liichtfluoreszieren trotz ihrer prinzipiellen Verwendbarkeit (dies trifft insbesondere für Chromogene mit einer Absorption bei Wellenlängen von mehr als 350 nm zu) in den meisten Fällen nicht verwendet. Vielmehr werden Chromogene bevorzugt, die Licht sowohl absorbieren als auch emittieren, d.h. Eluoreszenzerreger.

Es kommen eine Reihe von Fluoreszenzerregern mit bestimmten

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primären funktionellen Gruppen in Frage. Beispiele für derartige primäre funktioneile Gruppen sind 1- und 2-Aminonaphthalin, ρ,ρ'-Diaminostilbene, Pyrene, quaternäre Phenanthridinsalze, 9-Aminoacridine, ρ,ρ'-Diaminobenzophenonimine, Anthracene, Oxacarbocyanin, Merocyanin, 3-Aminoäquilenin, Perylen, Bisbenzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinol, Bis-3-aminopyridiniumsalze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol, Benzimidazolylphenyl, ^-Oxo-J-chromen, Indol, Xanthen, 7-Bydroxycumarin, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane und Elavin.

Beispiele für spezielle fluoreszierende Verbindungen, die funktionelle Gruppen zur Verknüpfung aufweisen oder in die derartige Gruppen eingeführt werden können sind Dansylchlorid, Pluoresceine, wie 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhy'-drol, Ehodaminisothiocyanat, N-Phenyl-i-amino-8-sulfonatonaphthalin, H-Phenyl-2-amino-6-sulfonatonaphthalin, ^-Acetamido-^-isothiocyanatostilben^,2-disulfonsäure, Pyren-3-sulfonsäure, 2-Toluidinonapththalin-6-sulfonat, H-Phenyl-lT-methyl-2-aminonaphthalin-6-sulfonat, Äthidiumbromid, Atebrin, Auromin-0, 2-(9'-Anthroyl)-palmitat, Dansylphosphatidyläthanolamin, N₁N¹ -Dioctadecyloxacarbocyanin, K^N'-Dihexyloxacarbocyanin, Merocyanin, 4-(3'-Pyrenyl)-butyrat, d-3-Amino-desoxyäquilenin, 12-(9'-Anthroyl)-stearat, 2-Methylanthracen, 9-Vinylanthracen, 2,2'-(Vinylen-p-phenylen)-bis-benzoxazol, p-Bis-/~2-(4-methyl-5-plienyloxazolyl)_7-benzol, 6-Dimethylamino-1,2-benzophenazin, Retinol, Bis-(3^l-aminopyridinium)-1,10-decandiyldijodid, Sulfonaphthylhydrazon von Hellebrigenin, ChIortetracyclin, U-(7-Dimethylamino-4~methyl-2-oxo-3-chromenyl)-male inimid, U-/~p-(2-Benzimidaz oyl)-phenyl_7*-maleinimid, N-(4-5¹IuQranthyl)-maleinimid, Bis-(homovanillinsäure), Reazarin, 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol, Merocyanin 5¹K), Resorufin, Bengalrosa und 2,4-Diphenyl-3(2H)-furanon.

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Das fluoreszierende Chromogen absorbiert vorzugsweise bei Wellenlängen über 350 mn, insbesondere über 400 nm und ganz besonders über 450 nm. Der Extinktionskoeffizient ■„ liegt vorzugsweise über 10 bei mehr als 400 nm, insbesondere über 10 bei mehr als 450 nm und ganz besonders über 10-⁷ bei mehr als 400 nm. Vorzugsweise emittiert der Fluoreszenzerreger Licht bei Wellenlängen über 400 nm und insbesondere über 450 nm. Es ist festzuhalten, dass die Absorptions- und Emissionseigenschaften eines Farbstoffs in Abhängigkeit davon, ob er frei in Lösung oder gebunden an ein kolloidales Teilchen vorliegt, variieren können. Deshalb beziehen sich die Angaben von verschiedenen Wellenlängenbereichen und Eigenschaften von Farbstoffen auf den tatsächlichen Zustand der Farbstoffe und nicht auf eine unkonjugierte Form des Farbstoffs oder.:auf ein willkürliches Lösungsmittel.

Eine alternative Lichtquelle als nachweisbares Signal ist eine chemulumineszierende Quelle. Die chemilumineszie-* rende Quelle umfasst eine Verbindung, die durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt wird und sodann Licht emittiert, das als nachweisbares Signal dient oder Energie auf einen Fluoreszenzakzeptor überträgt.

Die Chemilumineszenzquelle kann aus einem einzigen Bestandteil oder aus mehreren Bestandteilen, im allgemeinen 2 oder 3 Bestandteile^ bestehen. Es gibt zwei Gruppen von Chemilumineszenzquellen: Solche ohne Beteiligung einer enzymatischen Katalyse und solche unter Beteiligung von enzymatischer Katalyse.

Von Chemilumine szenzquellen ohne Beteiligung einer enzymatischen Katalyse kommen nur solche in Frage, die unter Bedingungen chemilumineszieren, die die anderen beim Test beteiligten Reaktionen oder Wechselwirkungen nicht beeinträchtigen. Obgleich im allgemeinen Chemilumineszenz-

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quellen, die von nicht-wässrigen Lösungsmitteln und stark

abhängen,

hasischen Bedingungen über exnem pH-Wert von 11/nxcht geeignet sind, können spezielle Verfahrensmassnahmen unter Anwendung von raschen Ingektions- oder Fliesstechniken angewendet werden, bei denen die modulierte Emission im wesentlichen beendet ist, bevor, das Protein denaturiert ist und eine signifikante Dissoziation auftritt. Nach Injektion einer Base lässt.sich ein messbarer Lichtsprung (burst) beobachten.
10

Verschiedene Verbindungsgruppen, die unter unterschiedlichen Bedingungen Chemilumineszenz hervorrufen, haben sich als geeignet erwiesen. Eine Gruppe davon sind die 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindione. Die bekannteste Verbin— dung hierunter ist Luminol, d.h. die 5-^iⁿ°verbindung. Weitere Mitglieder dieser Gruppe sind das 5-Amino-6,7?8-trimethoxy- und das Dirnethylamino/~ca_7benzanaloge. Diese Verbindungen können mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder mit Calciumhypochlorit und einer Base zum Lumineszieren gebracht werden. Eine weitere Gruppe von Verbindungen stellen die 2,4,5-Triphenylimidazole dar, deren Ausgangsprodukt den Trivialnamen Lophin trägt. Beispiele für entsprechende analoge chemilumineszierende Verbindungen sind die Verbindungen mit p-Dimethylamino- und -Methoxysubstituenten.

Eine weitere Gruppe von chemilumineszierenden Verbindungen sind die Indolen-3-yl-hydroperoxide, deren Vorläufer und Derivate.
30

Eine weitere Gruppe sind die Bis-9,9'-biacridiniumsalze, Lucigenin.

z.B./«,N^T-Dimethyl-9,9^l-biacridiniumdinitrat. Diese Verbindungen chemilumineszieren nach Zusatz von alkalischem Wasserstoffperoxid. Eine weitere Gruppe sind die in der 9-Stellung substituierten Acridiniumsalze. Beispiele für entsprechende Substituenten sind Carboxylester, insbe-

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- 56 -

sondere die Arylester, Acylsubstituenten, insbesondere

die Benzoylgruppe, und die Cyanogruppe. Zum Einleiten der Chemilumineszenz wird alkalisches Wasserstoffperoxid verwendet.
5

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind verschiedene Acylperoxyester und Hydroperoxide, die in situ gebildet werden können, in Kombination mit Verbindungen, wie 9,10-D iphenylanthrac en.

Eine weitere Chemilumineszenzquelle stellen die Hydroperoxide dar, wie Tetralinhydroperoxid, zusammen mit Metallkomplexen, insbesondere Porphyrine und Phthalocyanine, wobei Eisen und Zink als Metalle vorliegen.

Bevorzugt sind Systeme, die eine zufriedenstellende Quantenausbeute der Emission vom Chemilumineszenzerreger bei pH-Werten von 11 oder darunter, vorzugsweise 10 oder darunter) liefern und bei denen ferner ein Katalysator beteiligt ist, der an einen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars konjugiert sein kann oder die durch Bindung eines Antimarkers daran gehindert werden, eine Chemilumineszenzreaktion einzugehen.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen unterliegt der Chemilumineszenz unter enzymatischer Katalyse. Es gibt zwei Hauptgruppen von enzymatisch katalysierten Chemilumineszenzerregern. Bei der ersten Gruppe handelt es sich um Verbindungen, die in Kombination mit alkalischem Wasserstoffperoxid chemilumineszieren. Die Verwendung einer Peroxidase, wie Meerettichperoxidase, zusammen mit Wasserstoffperoxid und dem Chemilumineszenzerreger wird Chemilumineszenz hervorgerufen. Spezielle Beispiele sind 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindione.

Bei der zweiten Gruppe handelt es sich um die Luciferine

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^Γ - 5? - ^η

und deren Analoge und die Luciferasen. Besonders wichtig sind die bakteriellen Luciferasen.

Bei einer weiteren Gruppe von Markern handelt es sich um Katalysatoren, sowohl um enzymatische als auch um niehtenzymatische Katalysatoren. Eine Eeihe von nicht-enzymatischen Katalysatoren sind in der US-Patentanmeldung 815 beschrieben. Beispiele für Elektronenüberträger, die sowohl 1 als auch 2 Elektronen annehmen und abgeben können sind Alizarin, 1,2-Naphthochinon, Chloranil, 2,6-Dichlor- und 2,6-Dibromphenolindophenol, Flavin, Riboflavin, Galacto flavin, Lumiflavin, Pyocyanin, Neutralrot, Safranin, Phenazinmethosulfat, Methylviologen, Benzylviologen, Wurster-Blau, Metallkomplexe, wie Porphyrine, Phthalocyanine und Phenanthroline, Dihydropyridine, wie EADH, Hanztsch-Ester und Benzyl-1,4-dihydronicotinamid, Methylenblau und MeI-dolablau.

Als enzymatisch^ Katalysatoren kommen die verschiedensten Enzyme in Frage. Die Gesichtspunkte, die bei der Wahl eines Enzymmarkers zu berücksichtigen sind, sind in der US-PS 3 817 837 angegeben.

Von besonderem Interesse sind die nachstehend aufgeführten Enzyme, die entsprechend der I.U.B.-Klassifikation angegeben sind.

1. Oxidoreduktasen

1.1 Wirkung auf die CH-OH-Gruppe von Donor en 1.1.1 Mit NAD oder NADP als Akzeptor

1. Alkohol-dehydrogenase 6. Glycerin-dehydrogenase

26. Glyoxylat-reduktase

27. L-Lactat-dehydrogenase 37. Malat-dehydrogenase

4·9·. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 17· Mannit-1-phosphat-dehydrogenase

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-58-

1.1.2 Mit Cytochrom als Akzeptor

3. L-Lactat-dehydrogenase 1.1.3 Mit O₂ als Akzeptor

4. Glucose-oxidase

^ 9- Galactose—oxidase

1.2 Mit Wirkung auf die GH-MIL^-Gruppe von Donor en i.4.3 Mit O₂ als Akzeptor

2. L-Aminosäure-oxidase 3· D-Aminosäure-oxidase 1.6 Mit Wirkung auf reduziertes NAD oder KADP als Donor 1.6.99 Mit anderen Akzeptoren Diaphorase

1.10 Mit Wirkung auf Diphenole und verwandte Substanzen als Donoren

1.10.3 Mit O₂ als Akzeptor

1. Polyphenol-oxidase

3. Ascorbat-oxidase

1.11 Mit Wirkung auf H₂O₂ als Akzeptor 1.11.1

6. Katalase

7. Peroxidase 3. Hydrolasen

3.1 Mit Wirkung auf Esterbindungen 3.1·1 Carboxylester-hydrolasen 7· CJaoline st erase

3-1-3 Phosphorsäuremonoester-nydrolasen

1. alkalische Phosphatase 3.1.4- Phosphor säuredie ster-hydr olasen

3- Phospholipase C 3-2 Mit Wirkung auf Glycosylverbindungen 3-2.1 Glycosid-hydrolasen 1. oc-Amylase

4. Cellulase 17- Lysozym

23. ß-Galactosidase

909847/0881 J

27. Amyloglucosidase

31. ß-Glucuronidase

3.4 Mit Wirkung auf Peptidbindungen

3.4-, 2 Peptidyl-aminosäure-hydrolase 1. Carboxypeptidase A

3-4.4 Peptidyl-peptid-hydrolase

5- oo-Chymo trypsin 10. Papain

3.5 Mit Wirkung auf sich, von Peptidbindungen unter-■|0 scheidende C-N-Bindungen

3.5·1 In linearen Amiden 5. Urease

3.6 Mit Wirkung auf Säureanhydridbindungen

3.6.1 In phosphorylhaltigen Anhydriden 1. anorganische Pyrophosphatase

4. Lyasen

4.1 C-C-Lyasen

4.1.2 Aldehyd-lyasen 7. Aldolase 4.2 C-O-Lyasen

4.2.1 Hydrolasen

1. Carboanhydrase 4.3 C-N-Lyasen

4.3.1 Ammoniaklyasen 3· Histidase

Weitere Marker sind Verbindungen mit einer enzymatisch labilen Bindung. Durch Spaltung der Bindung, wird ein Produkt erhalten, das entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal liefert. Die Spaltung der .labilen Bindung kann zur Bildung einer Verbindung führen, die von der lipophilen Gruppe befreit ist oder an der lipophilen Gruppe festhält. In jedem Pail ist das erhaltene Produkt von einer inaktiven Verbindung, die nicht zur Bildung eines nachweisbaren Signals in der Lage ist, in eine aktive Verbindung,· die zur Bildung eines nachweisbaren

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γ -ι

Signals in der Lage ist, umgewandelt.

Beispiele für entsprechende Fälle sind Chemilumineszenz- und Fluoreszenzerreger, die bei Substitution an einer funktionellen Gruppe, die die chromogenen Eigenschaften des Chromogens beeinflusst, so lange kein Licht emittieren, bis der Substituent enzymatisch entfernt wird. Bei Bindung eines Substituenten an den Marker über eine enzymatisch labile Bindung kann diese Bindung enzymatisch aufgebrochen werden, so dass das Chromogen in aktiver Form . entsteht. Gemäss einer Ausführungsform ist die Verbindung durch eine enzymatisch labile Bindung an die lipophile Gruppe gebunden. Hierbei handelt es sich um ein Koenzym, das anschliessend in aktiver Form in die Lösung freigesetzt wird. Bei entsprechender Enzymwahl kann dieser Vorgang mehrmals wiederholt werden, wobei eine ein nachweisbares Signal liefernde Verbindung gebildet wird, wie EAD oder MADP. Eine ausführliche Diskussion darüber findet sich in den DE-OSen 2 618 419 und 2 618 511.

Lipophile Gruppe

Die lipophile Gruppe weist normalerweise 1 bis 6 geradkettige oder verzweigte aliphatische Reste mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mindestens 10 Kohlenstoffatomen und insbesondere mindestens 12 Kohlenstoffatomen sowie mit höchstens 36 Kohlenstoffatomen und insbesondere höchstens 30 Kohlenstoffatomen auf. Der aliphatische Best liegt normalerweise endständig vor und kann an 5- oder 6-gliedrige alicyclische, heterocyclische oder aromatische Ringe gebunden sein. Bei den zur Konjugation verwendeten Verbindungen kann es sich um einfache aliphatische Verbindungen mit einer polaren Gruppe handeln, wobei die polare Gruppe eine einzelne funktioneile Gruppe oder ein Komplex von funktionellen Gruppen an einem Ende der Kohlenwasserstoffkette ist. Bei der polaren Gruppe kann es sich um einen Acylrest, insbesondere um Carboxy-

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und Phosphorylestergruppen, eine Hydroxylgruppe, die zur Bildung einer Äther- oder Esterbindung verwendet wird, eine Aminogruppe, die zur Bildung einer Alkylamino-, Amid-, Amidin- oder Harnstoffbindung verwendet wird, oder um ein Mercaptan handeln, das zur Bildung einer Thiοäthergruppe mit einem aktivierten Olefin dienen kann.

Von speziellem Interesse für die Konjugation sind die amphiphilen Verbindungen, insbesondere Phospholipide.

Die Phospholipide basieren auf aliphatischen Carbonsäureestern von aliphatischen Polyolen, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe mit einer Carbonsäureestergruppe mit etwa 8 bis 36 und insbesondere etwa 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, die 0 bis 3 und vorzugsweise 0 bis Λ äthylenische Doppelbindungen und mindestens eine und im allgemeinen nur eine mit Phosphat substituierte Hydroxylgruppe unter Bildung eines Phosphatesters aufweist, substituiert ist. Die Phosphat gruppe kann weiter mit kleinen aliphatischen Besten, die zwei oder mehr funktioneile Gruppen aufweisen, im allgemeinen Hydroxyl- oder Aminogruppen, substituiert sein.

Nachstehend sind amphiphile Verbindungen aufgeführt, die unter Bildung eines Konjugats an Marker oder Liganden gebunden sein können: Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Phosphatidylcholin aus Ei, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidinsäure, Kardiolipin, Lecithin, Galactocerebrosid, Sphingomyelin, Dicetylphosphat, Phosphatidylinosit, 2-Trihexadecylammoniummethylamin, 1,3-Bis-(octadecylphosphat)-2-propanol und Stearoyloxyäthylenphosphat.

Weitere Verbindungen sind Cholesterin, Sitosterin, Strophantidin und Ergosterin.

Es können auch weitere Verbindungen verwendet werden, die lipophile Gruppen aufweisen und die vorstehend er-

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läutert sind. Meistens handelt es sich bei diesen Verbindungen um Alkylbenzole mit Alkylresten mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, im allgemeinen mit Gemischen von Alkylresten, bei denen es sich um geradkettige oder verzweigte Reste handeln kann. Dabei sind Carboxylreste, Hydroxylgruppen, Polyoxyalkylenreste (mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkylenrest), Carboxylgruppen, SuIfonsäuregruppen oder Aminogruppen vorhanden. Aliphatische Fettsäuren können verwendet werden, die normalerweise etwa 10 bis 36 und insbesondere etwa 12 bis 20 Kohlenstoff atome aufweisen. Auch Fettalkohole mit der vorstehend für 'die Fettsäuren angegebenen Anzahl von Kohlenstoffatomen, Fettsäureamine mit einer ähnlichen Anzahl an Kohlenstoffatomen und verschiedene Steroide können ebenfalls verwendet werden.

Besonders wichtig ist, dass die lipophile Gruppe eine starke Bindung an das kolloidale Teilchen eingehen kann, so dass Marker und Ligand ganz oder zu wesentlichen Teilen an die kolloidalen Teilchen gebunden sind und sich nicht frei in Lösung befinden.

Rezeptor

Bei den Rezeptoren handelt es sich im allgemeinen um relativ grosse Moleküle, die in der Lage sind, spezifisch eine räumliche und polare Organisation zu erkennen und bevorzugt mit einer derartigen Organisation eine Bindung einzugehen. Die Rezeptoren können natürlich auftreten, können durch Induktion einer immunologischen Reaktion auf ein Antigen gebildet oder synthetisch hergestellt werden. In den meisten Fällen handelt es sich um natürlich auftretende oder durch Induktion einer immunologischen Reaktion unter Bildung von Antikörpern erhaltene Rezeptoren.

Die Rezeptoren umfassen Moleküle, wie Antikörper, Fab-Fragmente, Enzyme, natürlich auftretende Rezeptoren, wie

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Avidin, thyroxinbindendes Globulin und thyroxinbindendes Präalbumin. Da jedoch die natürlich -vorkommenden Rezeptoren in den meisten Fällen auf eine relativ enge Verbindungsgruppe beschränkt sind und selten zur Bindung von synthetisehen Verbindungen verwendet werden können, werden in den meisten Fällen Antikörper oder Fab-Fragmente verwendet. Je nach Art des Tests kann der Rezeptor (Antiligand) ohne Modifikation eingesetzt werden. Er kann aber auch an eine Verbindung gebunden werden, die mit dem Marker in Wechsel- .-•jo wirkung tritt, so dass sich eine Modulation des nachweisbaren Signals ergibt.

Sofern der Marker Licht erzeugt, entweder durch Fluoreszenz oder Chemilumineszenz, kann ein Chromogen an den Rezeptor konjugiert sein, der Licht in dem Wellenlängenbereich der Emission des Markers absorbiert. Dies kann das Ergebnis eines Kontakts sein, ist aber im allgemeinen auf .eine Dipol-Dipol-Wechselwirkung, die innerhalb eines Ab-

stands von etwa 70 A auftreten kann, zurückzuführen. Im allgemeinen weist der Rezeptor mindestens ein Chromogen und im allgemeinen nicht mehr als ein Chromogen pro 1000 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors auf. Insbesondere ist höchstens ein Chromogen pro 1500 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors vorhanden.

Nähere Ausführungen über die· Wechselwirkung der beiden Chromogene finden sich in der US-PS 3 996 34-5.

Eine weitere Modifikation des Rezeptors kann durch eine Konjugation mit Enzymen erfolgen. In diesem Fall bildet der Enzymmarker ein Produkt, bei dem es sich entweder um das Substrat des an den Rezeptor gebundenen Enzyms handelt oder das mit dem Produkt des an den Rezeptor gebundenen Enzyms in Wechselwirkung tritt. Eine ausführliche Diskussion der Verwendung der beiden Enzyme, die durch direkte oder indirekte Wechselwirkung ein nachweisbares

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Γ Π

— U-U- —

Signal bilden, findet sich in der US-Anmeldung 893 650.

Ferner können die vorgenannten Verfahren kombiniert angewendet werden, wobei das Enzym als Marker dient und ein Chromogen, das an den Rezeptor gebunden ist, verwendet wird. Insbesondere kann ein Enzym verwendet werden, das mit einer Verbindung unter Bildung eines chemilumineszierenden Produkts reagiert, das sodann mit dem an den Rezeptor gebundenen Chromogen unter Energieübertragung auf das Chromogen in Wechselwirkung tritt. Eine ausführliche Dis-• kussion dieses Verfahrens findet sich in der US-Anmeldung 893 650.

Kolloidale Teilchen

Die flüssigen Teilchen können entweder aus Verbindungen, die ausschliesslich lipophil sind, d.h. keine heterofunktionellen Gruppen oder nur einen untergeordneten Anteil davon aufweisen, was bedeutet, dass sie nur eine oder zwei Gruppen, die unter den Testbedingungen in neutraler Form vorliegen, auf weisen',beispielsweise Oxy-, Carboxyester-, Phosphatester- und Aminogruppen, oder aus amphiphilen Verbidnungen gebildet sein, wobei die Verbindungen mindestens eine polare Gruppe aufweisen, die unter den Testbedingungen in ionischer Form vorliegen, beispielsweise Carboxylat-, SuIfonat-, Phosphat-, Ammonium- oder Sulfoniumgruppen.

In den meisten Fällen handelt es sich bei den kolloidalen Teilchen um Bläschen oder Liposomen mit mindestens 16 Molprozent und vorzugsweise mindestens 60 Molprozent sowie höchstens 99»5 Prozent und insbesondere höchstens etwa 95 Molprozent eines Phospholipids. Verschiedene der vorstehend beschriebenen Phospholipidverbindungen können verwendet werden.

Die Bläschen oder Liposomen werden nach herkömmlichen Verfahren hergestellt; vgl. US-PS 3 850 578, Humphries'und

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McConnell, a.a.O., Uemura und Kinsky, Biochemistry, Bd. 11 (1972), S. 485 und Six und Mitarb., Biochemistry, Bd. 12 (1973), S. 403.

Die Ölteilchen können nach herkömmlichen Verfahren, durch Vereinigen der entsprechenden lipophilen Verbindungen mit einem anionischen, kationischen oder nicht-ionogenen grenzflächenaktiven Mittel hergestellt werden, wobei das grenzflächenaktive Mittel in einer Menge von etwa 0,1 bis 5 Gewichtsprozent und vorzugsweise von etwa %0,1 bis 2 Gewichtsprozent des Gemisches vorhanden ist. Anschliessend wird das Gemisch in einem wässrigen Medium bewegt, beispielsweise durch Ultraschallbehandlung oder durch sehr schnelles Rühren. Beispiele für lipophile Verbindungen sind Kohlenwasserstofföle, Phthalsäurealkylester und Trialkylphosphate.

Die Konjugate von Liganden und Markern an die lipophilen. Verbindungen können den flüssigen Teilchen entweder vor, während oder nach ihrer Herstellung einverleibt werden.

Jedes der Konjugate ist im allgemeinen in einer Menge von etvra 0,05 bis 15» vorzugsweise 0,05 bis 10, insbesondere etwa 0,05 bis 5 und ganz besonders etwa 0,1 bis 5 Molprozent, bezogen auf die auf der Oberfläche der kolloidalen Teilchen anwesenden Moleküle,vorhanden. Die Bläschen oder Liposomen weisen im allgemeinen mindestens etwa ,je 0,5 Molprozent und vorzugsweise mindestens je etwa 1 Molprozent der !Conjugate auf. Je nach der Art des Markers sind in den Bläschen oder Liposomen etwa 0,05 bis 15 und insbesondere etwa 0,1 bis 5 Molprozent der gesamten zur Herstellung der Liposomen verwendeten amphiphilen Verbindungen Markerkon jugate .

Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von markierten Liposomen bekannt. Diese Verfahren können sich je nach Art des Liganden und/oder Markers der kovalenten oder

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nicht-kovalenten Bindung bedienen. Ferner werden je nach Art des Liganden und/oder Markers einzelne lipophile Verbindungen oder Kombinationen von lipophilen Verbindungen bevorzugt. In bestimmten Fällen kann eine amphiphile Verbindung, die eine positive oder eine negative Ladung aufweist oder die neutral reagiert, bevorzugt werden. Ferner können die speziellen Verbindungen vorzugsweise mit anderen lipophilen Verbindungen mit der gleichen oder mit einer unterschiedlichen Ladung kombiniert werden. Somit lassen sich keine Verallgemeinerungen treffen, sondern für jede Kombination von Ligand und Marker ist häufig die Verwendung einer lipophilen Verbindung oder einer Kombination von lipophilen Verbindungen erwünscht, um die Testempfindlichkeit zu erhöhen. Die spezielle Kombination kann zu ei— _ner stabileren Bläschenbildung führen, die Bindung des Rezeptors an den Liganden verstärken oder grössere Änderungen im Signal oder in der Reaktion bei Veränderung der Analytenkonzentration hervorrufen.

Vorzugsweise weisen die Bläschen etwa 1 bis 50 und insbesondere 2 bis 40 Molprozent eines Steroids, insbesondere eines Cholestanolderivats, wie Cholesterin, auf.

Te stpackungen

Um eine erhöhte Empfindlichkeit und Genauigkeit zu gewährleisten, können die im erfindungsgemässen Test verwendeten Materialien in Form von Testpackungen bereitgestellt werden. Dabei werden die Materialien in so vorbestimmten Mengenverhältnissen bereitgestellt, dass die Reaktion bei einer Veränderung der Analytenkonzentration innerhalb des interessierenden Bereichs möglichst gross ist.

Die Testpackungen enthalten normalerweise das in einem wässrigen Medium dispergierte kolloidale Teilchenreagens, im allgemeinen auf einen pH-Bereich von 5 bis 10 gepuffert.

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Die Teilclieiikonzentration "beträgt im allgemeinen, etwa 5x10" bis 5 Gewichtsprozent und vorzugsweise 5x10 bis 1 Gewichtsprozent. Handelt es sich beim Analyten um einen Liganden, enthält die Testpackung den Antiliganden. Wird ein modifizierter Antiligand verwendet, ist er unabhängig von der Art des Analyten enthalten. Im allgemeinen wird der Antiligand als lyophilisiertes Pulver, mit oder ohne Zusatz eines Schüttmittels (bulking agent), bereitgestellt.

Ferner können beliebige Hilfsreagentien, die zur Bestimmung des Signals erforderlich sind, enthalten sein. Ferner können auch andere Eeagentien, wie Puffer, Salze, Konservierungsmittel und Stabilisatoren, mit einem oder mehreren dieser Materialien kombiniert werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich sämtliche Prozent- und Teilangaben auf das Gewicht, mit der Ausnahme bei einer Vereinigung von 2 Flüssigkeiten, wo sich die Prozentangaben.

auf das Volumen beziehen. Die nachstehenden Abkürzungen werden verwendet: DEF = Dimethylformamid; PC = Phosphati— dylcholin; GL = Kardiolipin; PE = Phosphatidyläthanolamin; DPPE = Dipalmitoylphosphatidyläthanolamin.

Beispiel 1 Kardiolipin-hämisuccinat

In etwa 25 ml äthanolfreiem Chloroform werden 100 mg Kar-? diolipin gelöst. Die Lösung wird mit etwa 2 g Bernsteinsäureanhydrid gesättigt und 24 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluss erwärmt. Anschliessend wird das Gemisch abgekühlt und filtriert. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird in 20 ml Petroläther aufgenommen und filtriert. Sodann wird das Lösungsmittel abgedampft. Dieses Verfahren wird anschliessend mit 5 ml

Petroläther wiederholt. Das Produkt ergibt bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von 6,5,JiI CHCl^,

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Γ . Π

3» 5 ,ul Methanol und 6 Tropfen konzentrierter Ammoniaklösung einen einzigen Flecken mit einem R^-Wert von 0,64. Nach Reinigung dieses Materials an zwei präparativen Dünnschichtplatten erhält man einen sich bei der Dünnschicht-Chromatographie homogen verhaltenden, wachsähnlichen Rück-

—1 *

stand mit einer IR-Absorption bei 1590 cm , was die Anwesenheit eines Carboxylatanions anzeigt.

Beispiel 2

Konjugat aus Kardiolipin und Fluorescein In 20 ml wasserfreiem Benzol werden 100 pl Oxalylchlorid und 50 mg Kardiolipin-hämisuccinat vereinigt. Nach 30-minütigem Rühren unter Stickstoff bei Raumtemperatur ergibt die IR-Analyse die Anwesenheit von nicht-umgesetztem Ausgangsmaterial (das Säurechlorid absorbiert bei 1795 cm ). Weitere 100^uI Oxalylchlorid werden zugegeben. Die Reaktion wird 30 Minuten fortgesetzt. Das Molverhältnis von Säurechlorid zu freier Säure bleibt unverändert und wird auf etwa 3 : 1 geschätzt. Nach dem Abstreifen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck werden 20 ml Benzol zugesetzt. Das Lösungsmittel wird wiederum abgestreift und der Rückstand 1 Stunde unter vermindertem Druck getrocknet.

Der vorstehend erhaltene Rückstand wird mit einer Lösung von 50 mg Fluoresceinamin in einem 3 J 1-Gemisch aus Benzol und wasserfreiem DMF versetzt. Das Gemisch wird über das Wochenende bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand in etwa 5 ml Chloroform gelöst. Sodann wird das Reaktionsgemisch dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von 6,5 pi CHCl,, 3,5^1 Methanol und 6 Tropfen konzentrierter Ammoniaklösung als Elutionsmittel analysiert. Das Hauptprodukt ist stark fluoreszierend und weist einen Rf-Wert von 0,61 auf. Bei den weiteren identifizierbaren Bestandteilen handelt es sich um die Ausgangsprodukte,

nämlich. Kardiolipin-hämisuccinat (R--Wert = 0,64-) und Fluoreseeinamin (R^-Wert =0,3, Streifen). Das rohe Gemisch wird auf 8 präparative Dünnschichtplatten aufgesetzt und mit dem vorstehend genannten Lösungsmitteige— misch entwickelt. Die Bande mit einem Rx.-Wert von 0,6 wird abgetrennt und mit Methanol aus dem Siliciumdioxid extrahiert. Nach Trocknen unter vermindertem Druck erhält man ein fluoreszierendes, wachsähnliches Material. Bei der analytischen Dünnschichtchromatographie ergibt sich ein stark fluoreszierender Flecken mit einem R„-Wert von 0,6, gefolgt von einem schwach fluoreszierenden Flecken mit einem R^-Wert von 0,4-4. Der zweite Flecken ist auch dann noch vorhanden, wenn der Hauptflecken wiederholt isoliert und rechromatographiert wird. Es scheint sich um ein unter den Chromatographiebedingungen gebildetes Zersetzungsprodukt zu handeln. Das NMR-Spektrum bei 60 mHz ergibt die Anwesenheit von Fettsäure und aromatischen Protonen. Das IR-Spektrum zeigt eine Esterabsorption bei

—1 —Ρϊ

174-0 cm . Das UV-Spektrum einer etwa 1 ,6x10 m Lösung in einem Gemisch aus 50 Prozent Methanol und 50 Prozent 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8 zeigt ein f von 485 m.

Beispiel 3

Konjugat von Phenobarbital und Dipalmitoylphosphatidyläthanolamin (DPPE)

In 10 ml wasserfreiem Benzol werden 26,6 mg 5-!'henyl-5-(3'-carboxyallyl)-barbitursäure und 63,5 mg Oxalylchlorid vereinigt. Nach 2-stündigem Erwärmen unter Rückfluss werden weitere 10 ml Benzol zugegeben. Die Rückflussbehandlung wird 11/2 Stunden fortgesetzt. Sodann wird das Gemisch zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Benzol gewaschen. Anschliessend wird der Rückstand mit 20 ml wasserfreiem Chloroform und 88,9 mg DPPE versetzt.

Das Gemisch wird etwa 3 Stunden unter Rückfluss erwärmt, anschliessend zur Trockne eingedampft und wieder in ChIoro

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Γ "I

form gelöst. Das Material wird sodann dünnschichtchromatographisch unter Verwendung eines 65 : 25 : 4-Gemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter Ammoniaklösung als Elutionsmittel gereinigt.
5

Das NMR-Spektrum bei 6o mHz ergibt ein Verhältnis von aromatischen zu aliphatischen Protonen von 0,08 (zu erwarten 0,07). Das IR-Spektrum in Chloroform ergibt eine starke Esterabsorption bei 1740 cm und die Anwesenheit einer Amidab sorption bei 1680 cm . Die Dünnschicht Chromatographie ergibt einen ninhydrin-negativen einzigen Flecken.

Beispiel 4 Kon.jugat von Dipalmitoylphosphatidyläthanolamin und Fluorescein

Es wird das Verfahren von Uemura und Mitarb., Biochemistry (1974), S. 1972 angewendet. In 5 ml einer 100 millimolaren Lösung von Triäthanolamin in Methanol werden 34,7 mg DPPE und 38,8 mg Fluoresceinisothiocyanat gelöst. Das Gemisch wird mit Argon gespült. Anschliessend wird der Kolben verschlossen und das Gemisch über Nacht stehengelassen. Hierauf werden 20 bis 25 ml Chloroform zugegeben, um das gesamte Gemisch in Lösung zu bringen. Anschliessend wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wird das Ge-.

misch durch rasche Verdampfung auf ein Volumen von etwa 10 ml eingeengt. Das Produkt wird unter Verwendung eines 70 : 30 : 5-Gsmisches aus Chloroform, Methanol und Wasser als Elutionsmittel in gesinterten Glastrichtern unter Anwendung eines geringen Vakuums der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Nach dem Trocknen der Platte wird mit Methanol gewaschen. Das Produkt wird in einem 2 1 1-Gemisch aus Chloroform und Methanol gelöst. Man erhält ein sich bei der Dünnschichtchromatographie (R^-Wert =

0,76) homogen verhaltendes, ninhydrin-negatives Material. 35

Zur Erläuterung der Erfindung werden eine Reihe von Tests durchgeführt. Der erste Test betrifft die Bestimmung von Phenobarbital-Antikörpern. Anschliessend folgt ein ^L

Test zur Bestimmung von Phenobarbital.

Die Liposomen für diesen Test werden folgendermassen hergestellt: Folgende Lösungen werden vereinigt: 3,25 ;iMol PC in CHGl₅, 0,165,UMoI Phenobarbital-Konjugat mit Phosphatidyläthanolamin in Methanol und 0,0162 ^uMoI Kardiolipin-Fluorescein-Konjugat in Chloroform- Nach Abdampfen der Lösungsmittel werden 5 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8 zugegeben. Das Gemisch wird 3 Minuten mit einem Branson-Gerät mit Mikrospitze bei einer Einstellung von 2,5 lind 30⁰C einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Für den Einsatz im Test wird die Liposomenlösung 55-fach verdünnt.

Der Test auf Phenobarbital-Antikörper wird folgendermassen durchgeführt: 50 jul Liposomenlösungwerdenmit"100_xul Pufferlösung (0,1 m Tris-HCl, pH-Wert 8,0) versetzt. Anschliessend werden 50^uI Antiphenobarbitallösung, die mit 100^1 Puffer verdünnt ist, zugegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten inkubiert. Anschliessend werden 50 ^uI Antifluorescin, verdünnt mit 250 ^uI Puffer, zugegeben. Das erhaltene Testgemisch wird direkt in ein Fluorineter, an das ein HP Autograf Modell 7OOOA und ein HP9815A-Tisehrechner angeschlossen ist, gesaugt. Die Ergebnisse werden mit einer Verzögerung von 3 Sekunden und einer Ablesezeit von 30 Sekunden abgelesen. Wird die Antiphenobarbitallösung durch Puffer ersetzt, betragen die Fluoreszenzänderungen (Ap)₁ unter Zugrundelegung eines Programms der kleinsten Quadrate -9,99» -9,14-· Bei Verwendung von Antiphenobarbital sind die Ergebnisse -134·, 13; -14-2,20; -145,97. Somit ergibt die Anwesenheit von Antiphenobarbital eine wesentliche Veränderung in der Quenchgeschwindigkeit durch Anti-fluorescein.

Zur Erläuterung eines Tests auf Phenobarbital wird eine 10 millimolare Lösung von Phenobarbital in 0,1 m Tris-HCl-

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γ -ι

Puffer vom pH-Wert 8 verwendet. Die Durchführung des Tests erfolgt folgendermassen: 50 pl der Liposomenlösung werden mit 100^1 Puffer verdünnt. Anschliessend werden 10 ^uI Phenobarbitallösung zugesetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten inkubiert. Hierauf wird das Gemisch mit 50 ul „Antiphenobarbital, verdünnt mit 100 jil Puffer, versetzt. Nach 15-minütiger Inkubation werden 5O_xJiI Antifluorescein, verdünnt mit 250^uI Puffer, zugegeben. Hierauf wird die vorstehend beschriebene Verfahrensweise eingehalten. Bei Anwesenheit von Phenobarbital ergeben sich die Werte -10,51; -12,24. Bei Ersatz der Phenobarbitallösung durch eine Tris-Lösung erha±t man die Werte -128,69; -133,68. Somit ergibt die Anwesenheit von Phenobarbital eine wesentliche

Verringerung der beobachteten Z\F-Ablesungen. 15

Der Test beruht darauf, dass Antifluorescein die Fluoreszenz von Fluorescein quencht. Die Annäherung von Antifluorescein an Fluorescein wird durch die Anwesenheit von Antiphenobarbital, das an Phenobarbital gebunden ist, ge-

hemmt. Deshalb wird bei der ersten Untersuchung, bei der kein Antiphenobarbital zugesetzt ist, ein wesentliches Quenchen der Fluoreszenz beobachtet. Bei Anwesenheit von Antiphenobarbital wird eine wesentliche Verringerung der

Fluoreszenzquenchung beobachtet.
25

Beim zweiten Versuch (in Abwesenheit von Phenobarbital) ist das Antiphenobarbital in der Lage, eine Bindung mit dem Phenobarbital in den Liposomen einzugehen, wodurch das Antifluorescein an einer Bindung mit dem Fluorescein

in den Liposomen gehindert wird. Wenn jedoch Antiphenobarbital mit Phenobarbital vereinigt wird, geht das Antiphenobarbital eine Bindung mit dem Phenobarbital ein und steht somit nicht mehr für eine Bindung an das in den Liposomen vorhandene Phenobarbital zur Verfugung. Das

Ergebnis ist deshalb so, als ob kein Antiphenobarbital vorhanden wäre.

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Γ -1

Bei Verwendung von Lösungen mit bekannten Mengen an Antiphenobarbital oder Phenobarbital können AF/Konzentrations— kurven aufgestellt werden, die dann verwendet werden können, um einem speziellen Ergebnis eine Konzentration zuordnen zu können.

Der nächste Versuch betrifft die Bestimmung von Antikardiolipin, einem Diagnostikum für Syphilis.

Die Liposomen werden folgendermassen hergestellt: Eine Lösung von 3»25^uMoI Phosphatidylcholin in CHCl^ wird mit einer Lösung von 0,162_/uMol Kardiolipin-Fluorescein-BLongugat in Chloroform vereinigt. Der nach dem Abdampfen der Lösungsmittel erhaltene Rückstand wird mit 5 ml 0,1 m Tris-HCl-Lösung vom pH-Wert 8,0 versetzt. Das Gemisch wird 3 Minuten unter Verwendung eines Branson-Geräts mit einer Mikrospitze bei einer Einstellung von 2,5 und 30⁰C der Ultraschallbehandlung unterworfen. Sodann wird die Liposomenlosung mit 0,1 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,0 auf das 10-fache verdünnt.

Das Testverfahren wird folgendermassen durchgeführt: 50^il einer Serumprobe eines Patienten, bei dem Syphilis festgestellt worden ist, werden mit 10^uI der vorstehend beschriebenen Liposomenlosung versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten inkubiert und sodann mit 250 ^uI Puffer versetzt. Anschliessend wird das Gemisch mit 25^1 Antifluoreseein, mit 250^1 Puffer verdünnt, versetzt. Das Gemisch wird sofort in ein Fluorimeter, das mit einem X-Y-Plotter und einem Rechner, wie vorstehend erläutert, versehen ist, gesaugt. Nach einer Verzögerung von 15 Sekunden werden Ablesungen von 30 Sekunden vorgenommen. Unter Verwendung eines Programms der kleinsten Fehlerquadrate wird ΔΙ in Abwesenheit von Antikardiolipin zu -8,71» -8,62 bestimmt. In Abwesenheit von Proben mit Antikardiolipin ergeben sich die folgenden Werte: -76,56?

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Γ Π

-72,45; -84,49. Somit lässt sich die Anwesenheit von Antikardiolipin in einer Serumprobe leicht nachweisen, so dass Syphilis rasch und genau diagnostiziert werden kann.

Sodann folgt ein Test auf Antikardiolipin. Die Liposomen werden durch Vereinigung folgender Lösungen hergestellt: 24,4 ;ul (3,25^01) Phosphatidylcholin, 70^1 (0,162^uMoI) Kardiolipin und 2,5/il einer Lösung von 0,0162^uMoI Phosphatidyläthanolamin-IPluorescein-Konjugat. Das nach dem Abdampfen der Lösungsmittel erhaltene Gemisch wird mit 5 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8 versetzt. Die Lösung wird 3 Minuten mit einem Branson-Gerät mit einer Mikrospitze bei einer Einstellung von 2,5 und 30⁰C der Ultraschallbehandlung unterzogen. Menschliches Antikardiolipin wird isoliert. Als Puffer wird 0,1 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,0 verwendet. Das Verfahren zur Vereinigung der Materialien läuft folgendermassen ab: 50 ^uI Probe, 10^1 Liposomen, 10 Minuten inkubieren, 250^uI Puffer, 25 .ul Antifluorescein in 250 jil Puffer und Ansaugen des

Gemisches in das mit betätigtem Aufzeichnungsgerät versehene Fluorimeter. Bei direkter Messung von Al? aus den Diagrammen nach 74 und 220 Sekunden werden folgende Ergebnisse erhalten: Mit Antikardiolipin -10,0; -11,0;

-10,0; ohne Antikardiolipin -3,0; -1,2; -3,0. 25

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass sich nach dem erfindungsgemässen Verfahren Antikardiolipin leicht und einfach bestimmen lässt.

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, dass erfindungsgemäss ein präzises Bestimmungsverfahren für eine Reihe von Verbindung zur Verfügung gestellt wird. Der Test verwendet einen speziellen Kern, um einen Marker und einen Liganden in relativ enge räumliche Nachbarschaft

zueinander zu bringen. Bei diesem speziellen Kern handelt

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es sich um ein kolloidales Teilchen, das aus kleinen organischen Molekülen besteht, die eine Bindung des Markers und des Liganden durch nicht-kovalente Bindungen erlauben. Ferner können Liganden und Marker zweckmässigerweise nach dem gleichen oder nach ähnlichen synthetischen Ver-* fahren modifiziert werden, so dass lipophile Gruppen zur Bindung des Liganden oder Markers an die kolloidalen Teilchen entstehen. Bei den kolloidalen Teilchen kann es sich. um homogene Teilchen handeln, die vorwiegend aus lipophilen Verbindungen bestehen,, die von einer amphiphilen Oberflächenschicht umgeben /.£s kann sich auch um eine ein Lösungsvolumen einschliessende Membran handeln, wobei die Membran aus amphiphilen Verbindungen gebildet ist.

Ferner werden erfindungsgemäss neue Verbindungen zum Verknüpfen einer lxpophilen Gruppe an eine Reihe von synthetischen oder natürlich auftretenden Arzneistoffen oder anderen physiologisch aktiven Verbindungen, die von Haus aus keine lxpophilen Gruppen aufweisen oder die trotz ihrer lxpophilen Eigenschaften vorzugsweise, an eine.lipo-

Verfugung gestellt phile oder amphiphile Gruppe konjugiert werden,zur/.Durch entsprechende Konjugation kann das erhaltene Produkt durch den entsprechenden Antikörper in Konkurrenz mit dem Liganden erkannt werden. Es bleibt an das kolloidale Teilchen gebunden, während es auch an den Antiliganden gebunden ist.

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Claims

VOSSIUS · VOSSIUS · HILTL TAUCHNER · HEUNEMANN

PATENTANWÄLTE

SI E BE RTSTRASSE 4 · 8OOO MÖNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4-O75 CABLE: B EN Z O LPATENT MÜNCHEN · TELEX 5-29453 VOPAT D

2S19835 u.Z.: p O4o ΙΒ,-Mal 1979

Case: 3652-120 E

SYVA COMPANY

PaIo Alto, California, V.St.A.

"Immuntest zur Bestimmung eines Analyten sowie Reagens und Testpackung zur Durchführung des Tests"

Priorität: 16. Mai 1978, V.St.A., Nr. 906 15

P'atentansp rüche

■ 1. yimmuntest zur Bestimmung eines Analyten, der ein Bestand- -^ teil eines aus Ligand und Antiligand bestehenden spezifischen bindenden Paars ist, unter Verwendung eines Markers, der ein nachweisbares Signal liefert, dessen Wert 25

durch die Nähe des Antiliganden zum Marker aufgrund der Anwesenheit der Masse des Antiliganden oder einer an den Antiliganden gebundenen Verbindung, die mit dem Marker in Wechselwirkung tritt, beeinflusst wird, wobei folgende Bestandteile in einem wässrigen Medium ver-

exnxgt werden:

(1) eine Probe mit einem mutmasslichen Gehalt an dem Analyten,

(2·) ein Ligand oder Ligandenanaloges und Marker enthaltendes Reagens, wobei das Ligandenanaloge eine spe-35

zifische Bindung mit dem Antiliganden eingehen kann

und

L 909847/0881

(3) einen Antiliganden, wenn es sich bei dem Analyten tun den Liganden handelt oder der Antiligand an die Verbindung, die mit dem Marker in Wechselwirkung tritt, gebunden ist, und

der Wert des nachweisbaren Signals im Vergleich zu einer Probe mit bekannter Analytenmenge bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man als Reagens diskrete, feste, kolloidale Teilchen verwendet, die einen überwiegenden Anteil an lipophilen Verbindungen unter Einschluss von amphiphilen Verbindungen und einen untergeordneten Anteil an Marker und Ligand oder Ligandenanalogem enthalt en, wobei Marker, Ligand oder Ligandenanaloges lipophil sind oder durch Konjugation mit einer lipophilen Verbindung in einen lipophilen Zustand versetzt worden sind.
2. Immuntest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Liganden um Kardio-

lipin und beim Analyten um Antikardiolipin handelt. 20
3- Reagens zur Durchführung des Immuntests nach Anspruch 1, enthaltend ein Liposom mit 16 bis 99»5 Molprozent eines Phospholipids, bis zu 4-0 Molprozent eines Cholestanols, etwa 0,05 bis 15 Molprozent eines an ein Phospholipid gebundenen, fluoreszierenden Markers, wobei der fluoreszierende Marker einen Extinktionskoeffizienten von mindestens 10 bei oder oberhalb 350 nm aufweist und ein an mindestens ein Phospholipid gebundenes Hapten mit einem

Molekulargewicht von etwa 125 bis 2000. 30
4·. Reagens zur Durchführung des Immuntests nach Anspruch 1, enthaltend ein Liposom mit etwa 60 bis 99»5 Molprozent eines Phospholipids, etwa 0,05 bis 5 Molprozent Kardiolipin und etwa 0,1 bis 10 Molprozent eines'Phosphatidyl-Pluoreszenzerreger-Konjugats.

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Γ -1
5· Testpackung zur Bestimmung eines Antiliganden im Immuntest nach Anspruch 1, enthaltend Liposomen in einem wässrigen Medium, wobei die Liposomen mindestens 16 Molprozent eines Phospholipids, 0,05 bis 15 Molprozent eines an eine amphiphile Verbindung gebundenen Markers, der zur Bildung eines nachweisbaren Signals in der Lage ist, etwa 0,05 bis 15 Molprozent eines amphiphilen Liganden oder eines an mindestens eine amphiphile Verbindung gebundenen Liganden und bis zu 40 Molprozent Cholestanol auf weisen,und einen Antimarker, wobei das Verhältnis von Liposomen zu Antimarker so gewählt ist, dass sich der Test nach Anspruch 1 optimal durolif uhren lässt.
6. Testpackung nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ein Fluoreszenzerreger ist und der Antimarker an einen Quencher gebunden ist.

7· Testpackung zur Durchführung eines Immuntest zur Bestimmung von Antikardiolipin, enthaltend Liposomen in einem wässrigen Medium, wobei die Liposomen etwa 60 bis 99,5 Prozent Phospholipid, etwa 0,05 "bis 5 Molprozent Kardiolipin und etwa 0,1 bis 10 Molprozent eines Phosphatidyl-Eluoreszenzerreger-KonQugats aufweisen, und einen Antifluoreszenzerreger, wobei das Verhältnis von Liposomen zu Antifluoreszenzerreger so gewählt ist, dass sich der Test nach Anspruch 1 optimal durchführen lässt.

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