DE3007869C2

DE3007869C2 -

Info

Publication number: DE3007869C2
Application number: DE3007869A
Authority: DE
Inventors: Frederick E. Regnier; Andrew J. West Lafayette Ind. Us Alpert
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1979-02-28
Filing date: 1980-02-28
Publication date: 1990-02-01
Also published as: US4245005A; DE3007869A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Trägermaterials mit einem dünnen adsorbierten organischen polymeren Film nach dem Oberbegriff des Hauptanspruchs.

Bei der modernen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) herrschen oftmals Drücke von mehreren Tausend N/cm² in den Chromatographiesäulen. Dies setzt voraus, daß das Füllmaterial für die Säule fest und nicht zusammendrückbar ist. Für diesen Zweck wurden bisher poröse anorganische Stoffe, wie z. B. Siliziumdioxid und Aluminiumhydroxid, als Trägermaterial verwendet, dessen Oberfläche mit einem haftenden, organischen Überzug versehen wurde, so daß eine Vielfalt von Füllstoffen für Flüssigkeitschromatographiesäulen erhalten wurde.

Die bisherigen porösen chromatographischen Füllstoffe mit einer anhaftenden organischen Phase benutzten kovalente Bindungen, um die organische Phase an der Trägeroberfläche zu befestigen. Die Verbindung einer organischen Phase (P) mit der Oberfläche eines organischen Trägers wurde durch die Verwendung eines Silan-Zwischenbindemittels erzielt, wobei der Siliziumteil des Moleküls mit dem Träger verbunden ist, und der organische Teil des Organosilans entweder die organische Phase ist, oder mit dieser verbunden ist. Derartige anorganische Träger werden beispielsweise in den US-PSen 39 83 299 und 40 29 583 beschrieben.

Die wesentliche Funktion des Bindemittels ist die Schaffung einer chemischen Bindung zwischen dem anorganischen Träger und der stationären organischen Phase (P), die der chromatographischen Trennung dient. Die allgemeine chemische Formel für dieses Kompositum lautet:

worin ≡Si darauf hindeutet, daß drei der Bindungen auf Siliziumdioxid direkt mit dem anorganischen Träger oder mit benachbarten Organosilanen, die ihrerseits mit dem Träger verbunden sind, verbunden sind; -(CH₂)_m- ist ein Bindungsarm, der den Rest der stationären Phase (P) mit dem Träger verbindet, und m eine Zahl zwischen 0 und 18.

Bei der Herstellung von chromatographischen Füllungen ist es notwendig, daß der organische Überzug jeweils exakt reproduziert werden kann. Es ist jedoch festgestellt worden, daß bei der Behandlung eines anorganischen Trägers mit einer Organosilanlösung die reproduzierbare Steuerung der abgelagerten Organosilanmenge auf der Oberfläche schwierig ist, insbesondere weil es viele Möglichkeiten gibt, um Organosilane auf anorganischen Oberflächen anhaften zu lassen. Aus der Sicht der Chromatographie ist es ziemlich wichtig, wie viel Organosilan auf der Oberfläche eines anorganischen Trägers abgelagert wird. Das chromatographische Verhalten eines Füllmaterials mit anhaftender Phase hängt vollständig davon ab, welche Menge von welchem organischen Stoff auf den Teilchen abgelagert worden ist.

Ein weiterer Nachteil der Organosilan-Bindungschemie ist es, daß die anhaftenden Phasen erodiert werden. Beim Betrieb der Säulen, wobei Hunderte von Säulenvolumina beweglicher Phase durch die Säule fließen, kann die folgende Organosilanhydrolyse eintreten:

Obgleich diese Reaktion ziemlich langsam verlaufen kann, kann sie in relativ kurzer Zeit, beispielsweise nach einem Monat ununterbrochenen Betriebs, zu einer beträchtlichen qualitativen Einbuße führen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Trägermaterials mit einem dünnen adsorbierten organischen polymeren Film für die Flüssigkeitschromatographie zu schaffen, das insbesondere hinsichtlich seiner Dicke und Gleichmäßigkeit reproduzierbar ist und das auch über lange Betriebszeiten in seiner Qualität und Wirkung stabil ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die kennzeichnenden Merkmale des Hauptanspruchs in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs gelöst.

Vorteilhafte Weiterbildungen und Verbesserungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Figuren der beigefügten Zeichnungen dienen der Erläuterung der Erfindung und ihrer Ergebnisse, wobei

Fig. 1 eine Darstellung von Titrierkurven (pH-Wert über HCl);

Fig. 2 eine Darstellung der Auflösung von menschlichem Serumsprotein;

Fig. 3 eine Darstellung des Aktivitätsprofils von Laktat-Dehydrogenase-Isoenzymen aus Rattennierenhomogenat;

Fig. 4 eine Darstellung der isokratischen Auflösung von Karbonsäuren;

Fig. 5 eine Darstellung der isokratischen Auflösung von Phenolen;

Fig. 6 eine Darstellung der Auflösung von Mononukleotiden;

Fig. 7 eine Darstellung des Zurückbehaltens von adsorbiertem Polyäthylimin mittels HPLC-Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) nach dem Waschen mit Methanol; und

Fig. 8 eine Darstellung der Hämoglobin-IEC als Funktion der Pikrinsäure-IEC von Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser), wobei die vernetzten Überzüge unterschiedliche Mengen von Polyäthylenimin 6 enthalten, sind.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Erzielung einer adsorbaten Schicht auf einem Trägermaterial, das bezüglich Dicke und Gleichförmigkeit reproduzierbar ist, und auf die Erzielung von Betriebsstabilität für das derart erzeugte Träger- bzw. Packungsmaterial.

Auf dem Gebiet der physikalischen Chemie ist es bekannt, daß die Konzentration eines gelösten Stoffs an der Trennfläche zwischen flüssiger und fester Phase größer als die Konzentration inmitten der Lösung sein kann. Diese Adsorption auf Oberflächen kann mittels der folgenden Gleichung ausgedrückt werden:

worin S die überschüssige Konzentration des gelösten Stoffs/cm² der Oberfläche, dr/dc die Geschwindigkeit der Zunahme der Oberflächenspannung der Lösung mit der Konzentration des gelösten Stoffs, R die Gaskonstante, C die Konzentration des gelösten Stoffs in der Lösung und T die absolute Temperatur sind. Jeder Stoff, der die Oberflächenspannung an einer Trennfläche herabsetzt, konzentriert sich entlang der Trennfläche.

Falls die Adsorption aus der Lösung zu Bildung einer Schicht von Einzelmolekülen des gelösten Stoffs auf der Oberfläche des Feststoffs führt, dann stellt die Gleichung

a = kC ⁿ

eine ausreichende Beschreibung des Adsorptionsverfahrens über einen weiten Konzentrationsbereich dar, worin a die von einer Einheitsmasse des Adsorbens adsorbierte Menge des gelösten Stoffs, C die Konzentration des gelösten Stoffs in der Lösung und die Faktoren k und n vom Adsorbens und Adsorbat abhängige Konstanten sind.

Die Adsorption von polaren gelösten Stoffen auf Oberflächen kann durch Steuerung der Polarität des Lösungsmittels beeinflußt werden. Je weniger polar das Lösungsmittel, desto stärker ist die Adsorption. Bei einer polarisierten Oberfläche (mit P _s ^δ⁻ bezeichnet) und einem Lösungsmittel (mit P _m ^δ⁺ bezeichnet) gilt für die Adsorption des gelösten Stoffs (mit S ^δ⁺ bezeichnet) auf der Oberfläche die folgende Gleichung:

P _s ^δ⁻ + S ^δ⁺ ⇄ P _s ^δ⁻S ^δ⁺

während die Adsorption des polaren Lösungsmittels durch die folgende Gleichung ausgedrückt werden kann:

P _s ^δ⁻ + P _m ^δ⁺ ⇄ P _s ^δ⁻P _m ^δ⁺.

P _m ^δ⁺ und S ^δ⁺ stehen offensichtlich bezüglich der Oberfläche P _s ^δ⁻ miteinander in Konkurrenz. Die endgültige Zusammensetzung auf einer Oberfläche hängt ab von den relativen Affinitäten der verschiedenen Bestandteile für die Oberfläche und von ihren Konzentrationen.

Wenn die Affinität eines organischen gelösten Stoffs (mit R bezeichnet) genügend groß ist, wird die Oberfläche gesättigt mit einer Schicht der organischen Phase R, welche Schicht von einem bis zu wenigen Molekülen dick ist. Diese Technik stellt ein bequemes Verfahren dar, um Molekülfilme auf einer Oberfläche zu schaffen, wobei die Filme sehr dünn und gleichmäßig sind. Die Ansammlung der organischen Phase R auf der Oberfläche ist selbsthemmend; wenn alle aktiven Bereiche der Oberfläche bedeckt sind, hört die Adsorption auf. Solche dünnen, reproduzierbaren Filme sind sehr erwünscht bei der Herstellung und beim Gebrauch von Chromatographieträgern.

Es ist jedoch offensichtlich, daß eine adsorbierte organische Schicht eventuell nicht genügend Langzeitstabilität in einer chromatographischen Säule besitzt, wenn der Träger mit Tausenden von Säulenvolumina des gelösten Stoffs eluiert wird. Allmählich würden auch die am festesten adsorbierten Stoffe ausgelaugt werden.

Erfindungsgemäß wird Adsorption dazu verwendet, Filme organischer Moleküle auf Oberflächen zu schaffen, wonach dieser Film durch kovalente Vernetzung von benachbarten Molekülen zu einer kontinuierlichen Oberflächenschicht stabilisiert wird. Mittels dieses Vernetzungsverfahrens wird die Löslichkeit der organischen Phase R wesentlich herabgesetzt, und die Anzahl der Adsorptionsstellen, an denen Desorption gleichzeitig stattfinden müßte, um den Überzug zu eluieren, wird wesentlich vergrößert.

Die Herstellung von adsorbierten organischen Trägern wird auf synthetische Weise erreicht, indem die organische Phase direkt auf die Oberfläche von eigenständigen inorganischen Trägerstoffen adsorbiert wird. Die Adsorption kann mittels ionischer Kräfte, van-der-Waals-Kräfte bzw. Wasserstoffbrücken zwischen organischen Funktionsgruppen und der Oberfläche erreicht werden. Um das Eluieren dieser adsorbierten Schicht zu verhindern, werden benachbarte organische Gruppen miteinander vernetzt. Derartige Träger werden als einfach adsorbierte und vernetzte Phasen bezeichnet.

Bei einfach adsorbierten und vernetzten Phasen kann die Adsorption einer Oberflächenmonoschicht einer organischen Verbindung schematisch wie folgt dargestellt werden:

worin A eine Stelle auf der Substratoberfläche mit Affinität für ein organisches Adsorbat, Y eine Funktionsgruppe auf dem organischen Adsorbat, die mit A reagiert und somit die Adsorption des gesamten organischen Anteils auf der Oberfläche bewirkt, R wie oben beschrieben eine organische Verbindung, und X eine Funktionsgruppe auf R, die zur Vernetzung benachbarter adsorbierter Stoffe dient, darstellen.

Es ist wichtig, daß jedes Adsorbat an mindestens zwei Vernetzungsreaktionen teilnehmen kann, um Filmschichten mit hohem Molekulargewicht zu erzeugen. In einem allgemeinen Modell kann das Adsorbat dargestellt werden als:

(Y) _m - R - (X) _m

worin Y und X die gleichen oder verschiedene Funktionsgruppen sein können und m und n zwischen 1 und mehreren Tausend variieren können.

Die Vernetzung von benachbarten Adsorbatmolekülen wurde mittels eines Vernetzungsmittels erreicht, das mittels der folgenden allgemeinen Formel beschrieben werden kann:

A und B sind Funktionsgruppen auf dem Vernetzungsmolekül G, die mit X auf dem Adsorbat reagieren, um chemische Bindungen zu erzeugen, welche die Adsorbatmoleküle auf der Oberfläche miteinander verbinden. A und B können gleiche oder unterschiedliche Funktionsgruppen sein, während m und n zwischen 1 und mehreren Hundert variieren können. Im Bedarfsfall kan es erwünscht sein, die Eigenschaften der organischen, unbeweglichen Phase weiter zu modifizieren, um ihre Verwendbarkeit in der Chromatographie zu steigern.

Durch die Vernetzung eines Vernetzungsmittels G, das zusätzliche organische Anteile C und D aufweist, die kovalent gebunden sind, können die chromatographischen Eigenschaften einer Packung verändert werden, ohne daß die gesamte Vernetzungschemie geändert wird. Die Anzahl von C- und D-Bindungen, die durch o und p dargestellt sind, kann zwischen Null und mehreren Hundert bei einem Vernetzungsmolekül variieren.

Beispiel 1 Herstellung eines Polyäthyleniminüberzugs auf porösem Siliziumdioxid

4 g Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) wurden in einer Lösung von 1,5 g Polyäthylenimin 6 (durchschnittliches Molekulargewicht=600) in 15 ml Methanol geschwenkt. Mittels eines leichten Vakuums wurde Luft aus den Poren des Trägers entfernt. Das Siliziumdioxid wurde mittels Filtrieren gesammelt und 40 Minuten lang auf einem Trichter mit reduziertem Druck luftgetrocknet. Das überzogene Siliziumdioxid wurde nochmals in einer Vernetzungslösung aus 1,25 g Pentaerythritol-Tetraglycidyläther in 12,5 ml Dioxan geschwenkt und entgast. Die Mischung wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen und dann auf einem Dampfbad 40 Minuten lang erhitzt, wobei in 10-Minuten-Intervallen geschwenkt wurde. Das Produkt wurde mittels Filtrieren gesammelt und dann je mehrmals mit Azeton, Wasser und wieder Azeton gewaschen und anschließend luftgetrocknet.

Das so entstandene überzogene Siliziumdioxid wurde bezüglich seiner Eigenschaft untersucht, sowohl kleine Moleküle (Pikrinsäure) als auch Makromoleküle (Hämoglobin) zu binden und in Lösung zu geben. Die Ionenaustauschkapazität (engl. Abk.: IEC) für Pikrinsäure war 1,32 mMol/g überzogenen Trägers, während diejenige für Hämoglobin 65 mg/g überzogenen Trägers betrug.

Die Elementaranalyse des überzogenen Siliziumdioxids ergab 5,59% C, 1,29% H und 2,26% N. Wenn Sauerstoff (ca. 1,3%) eingeschlossen wird, beträgt der Überzug 10% der Produktmasse. Das Verhältnis von C zu N deutet darauf hin, daß 21% der Stickstoffreste vernetzt sind. Indem die IEC für Pikrinsäure mit der Elementaranalyse verglichen wird, wird festgestellt, daß 77% der Stickstoffreste mittels der Pikrinsäureuntersuchung festgestellt wurden und sich daher am Ionenaustausch beteiligen können.

250 mg überzogenen Trägers wurden in 10 ml von 1molaren NaCl suspendiert und mit 0,1 Normal-HCl titriert. Wie aus Fig. 1 ersichtlich, verändert die Suspension ihren pH-Wert, wobei das Material als schwacher Anionenaustauscher fungiert und die Ladung in einem Kontinuum über den pH-Bereich 0-9 abnimmt. Wie in Fig. 1 dargestellt, die Titrierungskurven in 1 M NaCl zeigt, sind A Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser), 0,25 g, und B Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) mit einem Überzug aus Polyäthylenimin 6, 0,25 g, mit einer IEC von 495 µMol Pikrinsäure.

Siliziumdioxid mit einem Überzug aus Polyäthylenimin wurde in Form einer Aufschlämmung in Säulen von 4,2 mm×25 cm gegeben. Säulen, die mit überzogenen, großporigen Siliziumdioxidteilchen gefüllt waren (10 µm Teilchendurchmesser), wurden dazu verwendet, Eiweißmischungen zu lösen. Die Auflösung von Eiweißstoffen aus menschlichem Serum ist in Fig. 2 dargestellt. In Fig. 2 hatte die Säule die Abmessungen 25×0,4 cm und war mit mit Polyäthylenimin überzogenem Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) gefüllt; die Probe bestand aus 100 µl menschlichen Serums 33% verdünnt; das Eluiermittel war 20 min Lineargradient; 0,02 M Trisazetat, pH-Wert 8,0, bis 0,02 M Trisazetat + 0,5 M Natriumazetat, pH-Wert 8,0; Durchflußgeschwindigkeit 2,0 ml/Min; der Einlaßdruck betrug 984,5 N/cm², und die Erkennung erfolgte mittels A₂₈₀.

Isoenzyme wurden dadurch festgestellt, daß ihre enzymatische Aktivität mittels eines geeigneten Erkennungsmittels hinter der Säule überwacht wurde; Fig. 3 zeigt das Aktivitätsprofil von Laktatdehydrogenase-Isoenzymen aus einem Rattennierenhomogenat. In Fig. 3 hatte die Säule die Abmessungen 25×0,4 cm und war mit mit Polyäthylenimin überzogenem Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) gefüllt; die Probe war 100 µl 105 000×g überschüssig, 15fach verdünnt; die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1,5 ml/Min; der Einlaßdruck war 1828,4 N/cm², und die Erkennung erfolgte hinter der Säule mittels Milchsäure und NAD; Überwachung mittels der Fluoreszenz.

Siliziumdioxid mit einer größeren Oberfläche (10 µm Teilchendurchmesser) wurden überzogen, in Säulen gefüllt und für die Auflösung von Mischungen kleiner Moleküle verwendet. Die hohe IEC und Selektivität dieser Füllung gestatten die isokratische Auflösung vieler Verbindungen, wie z. B. Karbonsäuren, wie in Fig. 4 dargestellt, und Phenole, wie in Fig. 5 dargestellt.

In Fig. 4 werden Phenoxyessigsäuren wie folgt dargestellt: A) Phenoxyessigsäure; B) o-Chlorphenoxyessigsäure; C) 2,6-Dichlorphenoxyessigsäure; D) 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure; E) 2,3-Dichlorphenoxyessigsäure und F) 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, wobei die Säule gefüllt ist mit mit Polyäthylenimin überzogenem Siliziumdioxid größerer Oberfläche (10 µm Teilchendurchmesser) und die Abmessungen 25×0,4 cm aufweist; die Probe betrug 100 µl und enthielt 0,02 mg von jeder Verbindung; das Eluiermittel war 0,05 M Kaliumphosphat + 0,1 M Natriumazetat, pH-Wert 7,5, die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1,0 ml/Min; der Einlaßdruck war 879,0 N/cm², und die Erkennung wurde mittels A₂₅₄ überwacht.

In Fig. 5 werden Phenole wie folgt dargestellt: A) Phenol; B) Catechol; C) Resorzin und D) Phlorglucinol, wobei die Säule gefüllt war mit mit Polyäthylenimin überzogenen Siliziumdioxid größerer Oberfläche (10 µm Teilchendurchmesser) und die Abmessungen 25×0,4 cm aufwies; die Probe betrug 100 µl und enthielt 0,1 mg von jeder Verbindung; das Eluiermittel war 0,05 M Kaliumphosphat + 0,1 M Natriumazetat, pH-Wert 5,5, und enthielt 10% Methanol; die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1,0 ml/Min; der Einlaßdruck war 668,1 N/cm², und die Erkennung wurde mittels A₂₅₄ überwacht.

Mononukleotide wurden mit einem Gradienten aufgelöst, wie dies in Fig. 6 dargestellt ist, und hierfür reichte eine kurze Säule (6,2 cm lang) aus. In Fig. 5 werden 5′-Mononukleotide wie folgt dargestellt: A) CMP; B) AMP; C) UMP und D) GMP, wobei die Säule mit mit Polyäthylenimin überzogenem Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) gefüllt war und die Abmessungen 6,2×0,4 cm aufwies; die Probe betrug 100 µl und enthielt 0,07 mg von jeder Verbindung; das Eluiermittel war 3 min Lineargradient (1,75 min Verzögerung); 0,01 M Kaliumphosphat, pH-Wert 3,0, bis 1,0 M Kaliumphosphat, pH-Wert 2,0; die Durchflußgeschwindigkeit betrug 3,0 ml/Min; der Einlaßdruck war 175,8 N/cm², und die Erkennung wurde mittels A₂₅₄ überwacht.

Beispiel 2 Demonstration der gleichmäßigen Adsorption von Aminen durch poröses Siliziumdioxid

1 bis 2 g eines porösen Siliziumdioxids (wie im folgenden Beispiel näher gekennzeichnet) wurden in einer 10%igen Lösung von Polyäthylenimin 6 in Methanol geschwenkt und entgast, dann gefiltert und auf einem Trichter mit Unterdruck luftgetrocknet. 100 mg des resultierenden überzogenen, nicht vernetzten Materials wurden entfernt, um die Pikrinsäure-IEC festzustellen. Das verbleibende Material wurde durchnäßt und kurzzeitig im Trichter mit einem Methanolstrom übergossen und danach wieder luftgetrocknet. Dieser Waschvorgang wurde achtmal wiederholt; nach jeder Waschung wurde eine Probe des Materials entnommen, um den Pikrinsäureversuch durchzuführen. Die Kurve der Fig. 7 zeigt, daß das adsorbierte Amin ohne weiteres zu einer gut haftenden Schicht abgewaschen wird, die wahrscheinlich eine Monoschicht darstellt und nach 4 oder 5 Waschvorgängen erreicht wird. Spätere Waschungen entfernen diese Schicht viel langsamer. Handelsübliche HPLC-Siliziumdioxide variieren bis zum Vierfachen bezüglich der Menge des ursprünglich adsorbierten Amins und der Menge, die in der Monoschicht verbleibt. Dies zeigt, daß die Adsorption ein aktiver Vorgang ist und von der Zusammensetzung der Oberfläche des Siliziumdioxids beeinflußt wird.

Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) wurde mit verschiedenen Mengen Polyäthylenimin 6 überzogen. Die überzogenen Proben wurden mit einer 10%igen Lösung von Pentaerythritol-Tetraglycidiläther in Dioxan vernetzt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde, und wurden dann bezüglich ihrer Pikrinsäure- und Hämoglobin-IEC untersucht. Die Kurve in Fig. 8 zeigt, daß die Hämoglobin-IEC mit der Menge des Oberflächenamins (bestimmt mit Pikrinsäure) schnell zunimmt, bis die Aminkonzentration 450 µMol/g überzogenen Trägers erreicht. Wenn die Aminmenge diese Konzentration übersteigt, nimmt die Hämoglobin-IEC viel langsamer zu. Dies weist darauf hin, daß eine Monoschichtüberzug von Polyäthylenimin 6 auf diesem bestimmten Siliziumdioxid 450 µMol Aminreste/g überzogenen Trägers enthält. Derselbe Wert wurde unabhängig hiervon beim Methanolwaschversuch in Fig. 7 erhalten. Diese Ergebnisse zeigen auch, daß die Oberfläche des Siliziumdioxids bei jener Konzentration vollständig mit Polyäthylenimin 6 bedeckt ist; der Überzug läßt keine größeren Flächen frei.

Beispiel 3 Herstellung eines Filmüberzugs auf poröses Siliziumdioxid mit Hilfe von verschiedenen Aminen

Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) wurde in 10%igen Lösungen von verschiedenen Aminen (im folgenden aufgelistet) geschwenkt und entgast; die Produkte wurden mittels Filtrierung gesammelt und mit Pentaerythritol-Tetraglycidiläther vernetzt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Amingehalte der so erzeugten Überzüge wurden mittels des Pikrinsäureverfahrens gemessen, wie aus Tabelle 1 hervorgeht:

Tabelle 1

Vernetzte Aminüberzüge auf Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser)

Wie nachgewiesen, verhielten sich diese Amine ähnlich zueinander und auch zu einer Monoschicht von Polyäthylenimin 6 auf dem gleichen Träger; 1500-1600 µMol Amin/g überzogenen Trägers (siehe Fig. 7). Dies weist darauf hin, daß überschüssiges Amin, das nicht für die Bildung einer Monoschicht benötigt wird, im Zuge der Vernetzung herausgewaschen wird. Ferner wurde festgestellt, daß ein Verhältnis von 1 : 1 zwischen den adsorbierenden Obrflächenstellen und der Anzahl der Aminreste in einer Monoschicht besteht, unabhängig davon, ob das Amin einfacher oder polymerer Art ist.

Bei diesen Ergebnissen bildete N,N-Diäthyläthylendiamin eine Ausnahme, indem es zu einem schlechten Überzug führte. Dies resultiert aus der niedrigen Anzahl von aktiven Wasserstoffatomen im Molekül, was eine extensive Vernetzung ausschließt. Der sich ergebende Überzug war instabil und wurde während der auf die Vernetzung folgenden Waschungen abgewaschen.

Beispiel 4 Die Verwendung von verschiedenen Vernetzungsmitteln zur Stabilisierung von Filmüberzügen auf porösem Siliziumdioxid

2 g Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser) wurden in einer 15%igen Lösung von Polyäthylenimin 6 in Methanol geschwenkt und entgast, danach herausfiltriert und in einem Trichter bei reduziertem Druck luftgetrocknet. Das überzogene, nicht-vernetzte Produkt wurde in acht 270-g-Proben unterteilt, worauf jede dieser Proben mittels eines verschiedenen Mittels wie folgt vernetzt wurde:

Probe A

In 5 ml Dioxan, die 2 mMol 2-Methyl-2-Nitro-1,3-Propandiol enthielten, geschwenkt und entgast. Die Mischung wurde drei Tage lang bei Raumtemperatur belassen, und dann wurde sie 30 Minuten lang auf einem Dampfbad, mit gelegentlichem Schwenken, erhitzt. Das Produkt wurde mittels Filtrierung gewonnen und dann mit Azeton, Wasser, Diäthylamin, Wasser und wieder Aceton gewaschen und dann luftgetrocknet.

Probe B

In 5 ml Dioxan, die 2 mMol 1,3-Dibrompropan enthielten, geschwenkt und entgast. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen, dann 30 Minuten lang auf einem Dampfbad, mit gelegentlichem Schwenken, erhitzt. Das Produkt wurde dann filtriert und wie Probe A gewaschen.

Probe C

In 5 ml Dioxan, die 2 mMol Dithiobis (Succinimidylpropionat) enthielt, geschwenkt und entgast. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen, dann wurde sie filtriert und wie Probe A gewaschen.

Probe D

In 5 ml Dioxan, die 2 mMol Äthylenglycol-Diglycidiläther enthielt, geschwenkt und entgast. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen, dann 40 Minuten lang auf einem Dampfbad, mit gelegentlichem Schwenken, erhitzt. Das Produkt wurde dann filtriert und wie Probe A gewaschen.

Probe E

In 5 ml Dioxan, die 2 mMol Zyanchlorid (cyanuric chloride) enthielten, geschwenkt und entgast. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen, dann herausfiltriert und mit Methanol, Wasser, Diäthylamin, Wasser, Methanol und Azeton gewaschen und dann luftgetrocknet.

Probe F

In 5 ml 0,01molaren Natriumboratpuffers (pH-Wert=9,2), der 5 mMol Dimethyladipimidat-Dihydrochlorid enthielt, geschwenkt und entgast. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen, dann filtriert. Das Produkt wurde mit Wasser, Diäthylamin, Wasser und Azeton gewaschen, dann luftgetrocknet.

Probe G

In 5 ml Dioxan, die 2 mMol Epichlorhydrin enthielten, geschwenkt und entgast. Die Mischung wurde 1,5 Tage bei Raumtemperatur belassen, dann 40 Minuten lang auf einem Dampfbad, mit gelegentlichem Schwenken, erhitzt. Das Produkt wurde dann filtriert und wie Probe A gewaschen.

Probe H (Kontrollprobe)

In 5 ml Dioxan, die kein Vernetzungsmittel enthielten, geschwenkt und entgast, 30 Minuten lang auf einem Dampfbad, mit gelegentlichem Schwenken, erhitzt, filtriert und wie Probe A gewaschen. Dann wurde das Produkt luftgetrocknet.

Die Produkte wurden bezüglich ihrer Hämoglobin- und Pikrinsäure-IEC untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt:

Tabelle 2

IEC von Polyäthylenimin-6-Überzügen auf Siliziumdioxid (10 µm Teilchendurchmesser), mittels verschiedener Reagenzien vernetzt

Aus Tabelle 2 geht hervor, daß das Diepoxidharz, der Nitroalkohol und das Alkylbromid-Vernetzungsmittel zu guten Anionenaustauschüberzügen führte, sowohl für kleine Moleküle, als auch für Eiweißstoffe. Die anderen Vernetzungsmittel waren für den Zweck weniger geeignet. Dimethyladipimidat-Dihydrochlorid war ein anomaler Fall und führte zu einem Überzug mit einer niedrigen Kleinmolekül-IEC, aber einer hohen Protein-IEC.

In einem ähnlichen Experiment wurden verschiedene Epoxidharze als Vernetzungsmittel miteinander verglichen. 1,2 g Siliziumdioxid (30 µm Teilchendurchmesser) wurden mit Polyäthylenimin 6 aus einer 5%igen Lösung in Methanol überzogen. 130 mg Proben des Produkts wurden dann in 5 ml von 10%igen (w/v) Lösungen von Epoxidharzen in Dioxan geschwenkt und entgast. Die Mischungen wurden 16 Stunden bei Raumtemperatur belassen, dann 45 Minuten lang auf einem Dampfbad, mit gelegentlichem Schwenken, erhitzt. Die Produkte wurden mittels Filtrierung gesammelt und dann mit Azeton, Wasser und wieder Azeton gewaschen und dann luftgetrocknet. Mittels des Pikrinsäureverfahrens wurde die IEC der Produkte ermittelt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt:

Tabelle 3

IEC von Polyäthylenimin-6-Überzügen auf Siliziumdioxid (30 µm Teilchendurchmesser), die mittels verschiedener Epoxidharzen vernetzt wurden

Keiner der Überzüge unterschied sich wesentlich von den anderen bezüglich seiner Kleinmolekül-IEC. Daraus kann gefolgert werden, daß jedes polyfunktionale Epoxidharz mit Polyäthylenimin 6 einen guten, vernetzten Anionenaustauschüberzug bildet. Der mit Bisphenol-A-Diglycidyläther erzeugte Überzug wäre ungeeignet für Proteinchromatographie, da er aromatische Reste enthält; er könnte jedoch für bestimmte Spezialanwendungsgebiete nützlich sein.

Die in den Tabellen 2 und 3 beschriebenen Vernetzungsmittel werden bezüglich ihrer allgemeinen Struktur (wie bisher beschrieben) in Tabelle 4 zusammengefaßt:

Tabelle 4

Strukturelle Eigenschaften verschiedener Vernetzungsmittel

Beispiel 5 Herstellung eines Polyäthylenimin-Filmüberzugs auf verschiedenen inorganischen Stoffen

220 mg Siliziumdioxid oder Aluminiumhydroxid oder Titandioxid (siehe unten) wurden in einer 10%igen Lösung von Polyäthylenimin 6 in Methanol geschwenkt und entgast. Die Stoffe wurden mittels Filtrierung gesammelt und auf einem Trichter bei reduziertem Druck luftgetrocknet. Die überzogenen Träger wurden in 10%igen Lösungen von Pentaerythritol-Tetraglycidyläther in Dioxan geschwenkt und vernetzt, 11 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen und dann 50 Minuten auf einem Dampfbad, mit gelegentlichem Schwenken, erhitzt. Die Produkte wurden dann herausfiltriert, mit Azeton, Wasser und wieder Azeton gewaschen, und dann luftgetrocknet. Die Kleinmolekül-IEC der resultierenden Überzüge wurde mittels Pikrinsäure festgestellt, wie in Tabelle 5 dargestellt. Eine Probe von porösem Glas (controlled-pore glass) wurde ähnliche behandelt, außer daß die Vernetzung mittels einer 10%igen Lösung von Bisphenol-A-Diglycidyläther durchgeführt wurde. Es folgt die Tabelle 5:

Tabelle 5

IEC von vernetzten Polyäthylenimin-6-Überzügen auf verschiedenen anorganischen Trägern

Da Aluminiumhydroxid und Titandioxid eine höhere Dichte als Siliziumdioxid aufweisen, führt ein Vergleich der Überzüge auf der Basis von Trägermasse statt Trägervolumen zu einer Unterbewertung der Leistung einer mit überzogenem Aluminiumhydroxid oder Titandioxid gefüllten Säule. Solche Säulen können für die Anwendung bei hohen pH-Werten geeignet sein, wo Siliziumdioxid nicht stabil ist.

Der Anionenaustausch-Filmüberzug (wie z. B. in Beispiel 1 beschrieben) besitzt die folgenden Vorteile gegenüber Anionenaustauschüberzügen auf Silanbasis mit zweivalenten Bindungen:

a) Ionenaustauschkapazität (IEC): die IEC eines Trägers mit einem Filmüberzug ist bis zu 20mal größer als diejenige eines Trägers mit einem Überzug aus aminhaltigem Silan. Dies gestattet die Resolution von einigen Verbindungen, wie z. B. Karbonsäuren, ohne einen Gradienten. Er bewirkt auch effizientere Trennungen von Stoffen, wie z. B. Proteinen und Nukleotiden, die mit Gradienten aufgelöst sind.
b) Reproduzierbarkeit: die IEC von verschiedenen Proben von HPLC-Trägern mit Filmüberzügen variieren um weniger als 10%.
c) Dauerhaftigkeit: Anionenaustauschüberzüge auf Silanbasis verschlechtern sich bei der Eluierung mit wäßrigen Puffern. Keine derartige Verschlechterung wird bei Filmüberzügen festgestellt, die in wäßrigen Medien so stabil wie das darunterliegende Siliziumdioxid sind. Säulen, die mit filmüberzogenen Teilchen gefüllt sind, haben eine wesentlich längere Lebensdauer als Säulen, die mit Stoffen auf Silanbasis gefüllt sind, woraus geschlossen werden kann, daß der Filmüberzug zu einem bestimmten Grad auch das darunterliegende Siliziumdioxid schützt.

Die Erfindung ergibt also einen Ionenaustauschüberzug hoher Kapazität, der auf alle porösen oder nicht-porösen, bei der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie verwendeten anorganischen Stoffe aufgebracht werden kann.

In den vorangegangenen Beispielen wurde die Verwendung von verschiedenen Aminen, Vernetzungsmitteln bzw. inorganischen Stoffen beschrieben, und die Adsorption des Filmes durch eine zur Ionenanziehung alternative Kraft wurde auch beschrieben.

Bei den dargestellten Beispielen wurde die Adsorption des Amins und seine Vernetzung auf der Trägeroberfläche mit Hilfe von zwei verschiedenen Lösungen durchgeführt. Es ist jedoch möglich, einen Filmüberzug aus einer einzigen, Amin und Vernetzungsmittel enthaltenden Lösung herzustellen. Bei einem solchen Verfahren wird ein Träger in einer Lösung, die Polyäthylenimin 6 und ein polyfunktionales Epoxidharz enthält, geschwenkt und entgast. Das Material wird mittels Filtrieren gesammelt und eine Stunde lang in einem Ofen bei 80° erhitzt. Das Produkt besitzt dann eine Pikrinsäure-IEC, die gleich derjenigen eines Stoffes ist, der in einer zweiten Lösung vernetzt wurde. Dies ist jedoch kein bevorzugtes Herstellungsverfahren, da es zu weniger reproduzierbaren Ergebnissen führt und zu einer Verklebung der Trägerteilchen miteinander führen kann.

Die Erfindung ist besonders geeignet für das Gebiet der Flüssigkeitschromatographie, wobei jedoch Stoffe mit einem filmförmigen Aminüberzug auch auf dem Gebiet der industriellen Abwässeraufbereitung verwendet werden könnten. Beispielsweise könnten preiswertes Siliziumdioxid mit einem derartigen Überzug zur Chelierung von Metallionen verwendet werden, wobei diese durch einfaches Filtrieren aus der Lösung entfernt werden können, und auch stark anionische Abwasserstoffe könnten auch mittels eines derartigen Verfahrens entfernt werden. Zusätzlich könnten industriell interessante Enzyme mit Hilfe des gleichen preiswerten Siliziumdioxids mittels Adsorption gebunden werden. Solche Enzyme würden ihre Aktivität behalten, und nach ihrer Verwendung als Katalysatoren könnten sie durch einfaches Filtrieren der Mischung wiedergewonnen werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Trägermaterials mit einem dünnen adsorbierten organischen polymeren Film für die Flüssigkeitschromatographie, wobei das Trägermaterial eine Affinität gegenüber dem zu adsorbierenden Überzugsmaterial aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das Überzugsmaterial durch elektrostatische Kräfte an der Oberfläche des Trägermaterials adsorbiert und anschließend der adsorbierte polymere Film vernetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial ein anorganisches Material verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial Siliziumdioxid, Aluminiumhydroxid und Titandioxid eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine der Funktionsgruppen des polymeren Films die Affinität mit der Oberfläche des Trägermaterials und die andere die Vernetzung bewirken.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vernetzung ein Vernetzungsmittel eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorbat ein Amin eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Amin ein Polyäthylenimin 6, 1,3-Diamin-2-Hydroxypropan, Tetraäthylenpentamin und Äthylendiamin eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vernetzungsmittel Alkylbromid, Epoxidharz und Nitroalkohol verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkylbromid 1,3-Dibrompropan und als Nitroalkohol 2-Methyl-2-Nitro-1,3-Propandiol verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Epoxidharz ein polyfunktionales Epoxidharz eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Epoxidharz aus der Gruppe Pentaerythritol-Tetraglycidyläther, Bisphenol-A-Diglycidyläther, Glyceryl-Diglycidyläther, Äthylenglycol-Diglycidyläther eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Filmmaterial und das Vernetzungsmittel gleichzeitig als Mischung auf das Trägermaterial aufgebracht werden.

13. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 12 hergestellten überzogenen Trägers zur Prüfung der Ionenaustauschkapazität von Proteinen.