DE3033691A1

DE3033691A1 - An ein substrat gebundene diamintriessigsaeuren und ihre chelate

Info

Publication number: DE3033691A1
Application number: DE19803033691
Authority: DE
Inventors: Irwin Dr. Wieder; Robert H. Dr. Los Altos Calif. Wollenberg
Original assignee: Analytical Radiation Corp
Current assignee: Analytical Radiation Corp
Priority date: 1979-09-10
Filing date: 1980-09-08
Publication date: 1981-03-19
Also published as: GB2060623B; US4352751A; FR2469416B1; GB2060623A; JPS60243052A; JPS5659741A; FR2469416A1; JPS60252684A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine neue Diamintriessigsöure, die Metallchelate bilden kann; sie betrifft insbesondere einen bifunktioneilen Liganden, der dazu verwendet werden kann, Metallionen an organische Substrate (Reste oder Moleküle), wie z.B. organische Target-Moleküle oder Antikörper zu binden, sie betrifft speziell an ein Substrat (ein Molekül oder einen Rest) gebundene, fluoreszierende Seltene Erdmetalle he la te, die in Fluoreszenznachweis- bzw. -analysenverfahren verwendet werden können.

Fluoreszenzverfahren werden zunehmend häufiger in chemischen, biochemischen und medizinischen Analysen verwendet. Fluoreszenzmeßverfahren sind von Natur aus extrem empfindlich. Sie bieten mindestens die Empfindlichkeit von radiochemischen Verfahren.ohne daß dabei die mit der Strahlung verbundenen Gefahren auftreten.

In den US-Patentschriften 4 150 295 und 4 058 732 sowie in "Immunofluorescence and Related Staining Techniques", Knapp et al, Eds. (1978, Elsevier/North Holland Biomedical Press), Seiten 67 bis 80, ist das generelle Konzept der quantitativen Bestimmung von nicht-fluoreszierenden Substraten auf Fluoreszenzbasis unter Verwendung von Fluorophoren mit einer lange Abklingzeit (Zerfallslebensdauer), verglichen mit der Umgebungsfluoreszenz, beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine Fluoreszenzmarkierung im Atommaßstab (Fluorophor) chemisch covalent an den Einzelmolekülen eines Substrats fixiert. Dieses Substrat kann ein organisches Target-Molekül selbst sein oder es kann ein Molekül sein, das im wesentlichen mit einem Target-Molekül identisch ist, oder es kann ein für ein Target-Molekül spezifischer Antikörper sein. Nach Durchführung

1 30012/087

303369]

geeigneter Verfahren, die von der Form des Assays abhängen, werden die markierten Substrate angeregt und unter Anwendung von zeitgesteuerten (time-gated) Verfahren, wie sie in den drei obengenannten Publikationen beschrieben sind, wird ihre Fluoreszenz gemessen. Aus der Größe der festgestellten Fluoreszenz und einer vorher aufgestellten Fluoreszenz/Konzentration-Standardkurve wird die Target-Menge bestimmt.

Fluorophore und markierte Substrate (Moleküle oder Reste), die für eine solche Bestimmung brauchbar sind, haben im Idealfalle eine lange Fluoreszenzbkling-Lebensdauer und behalten ihre Fähigkeit zu fluoreszieren während der Analysendauer bei. Für empfindliche Assays (Nachweisverfahren oder Analysenverfahren) ist es auch wichtig, daß der Fluorophor und seine Bindung an andere Substrate (Moleküle oder Reste) selbst in sehr niedrigen Konzentrationen, beispielsweise im Bereich

3 3

von Nanogramni/cm und niedriger, z.B. sogar bis zu Femtogramm/cm , stabil sind. Für viele Immunoassays ist es erwünscht, daß der Fluorophor wasserlöslich ist, so daß er in einem Medium mit Antikörpern umgesetzt werden kann, in dem die Immunreaktivität beibehalten wird.

Zu den erfindungsgemäßen Metallchelaten gehört eine Familie von an ein Substrat gebundenen Liganden, die alle diese erwünschten Eigenschaften besitzen. Außerdem sind sie einfach und billig herzustellen.

Die Erfindung besteht im breitesten Sinne darin, daß ein organisches Substrat (Molekül oder Rest) (hier mit der Abkürzung "T" bezeichnet) mit mindestens einer der funktioneilen Gruppen -N-H, -N-H, -O-H und

-S-H an eine und im wesentlichen nur eine der vier Carboxylgruppen von Diamintetraessigsäuren gebunden werden kann unter Bildung einer stabilen

130012/0871

ORIGINAL INSPECT^D

303369

Struktur, welche die in der nachfolgenden allgemeinen Formel (i) angegebene Konfiguration hat:

HOOC-CH₂ CH₂-COOH j

^N- R N j (I)

T-L-OC-CH^ ^CH₂-COOH j

worin R eine zwei oder mehr Atome lange covalente Brücke (Brückenbindung) und L das deprotonierte Äquivalent der funktioneilen Gruppe an dem Substratmolekül T bedeuten.

Da T mehr als eine L-Gruppe enthalten kann, kann innerhalb dieser Formel auch mehr als eine Diamintriessigsäure auf diese Weise covalent gebunden werden. Diese covalent gebundenen Produkte (der Formel i) werden hier als "an ein Substrat gebundene Diamintrisäuren" bezeichnet (unter "Substrat" sind hier Reste, Moleküle und sonstige Körper zu verstehen). Sie bilden mit verschiedenen Metallionen stabile Chelate. Diese Chelatkomplexe der nachfolgend angegebenen Formel (il) bilden einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung:

HOOC-CH₂ CH₂-COOH ,

^N- R N^ j

T-L-OC-CH^ ^CH₂-COOH

worin R, T und L die oben angegebenen Bedeutungen haben und M ein Metallion bedeutet, das mit Diämintri- oder -tetrasäuren einen Koordinationskomplex bilden kann.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich

13 0 012/0871

bei dem Metallion M um ein Ion eines Seltenen Erdmetalls (Metalls der Seltenen Erden), das einen fluoreszierenden Chelatkomplex bilden kann.

Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein besonders vorteilhafter Komplex gebildet, wenn auch ein Aktivator oder Flooder, wie z.B. Salicylsäure, in einer ternären Komplexkombination zusammen mit dem Seltenen Erdmetallion und der an ein Substrat gebundenen Diamintrisäure vorhanden ist.

Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration oder Anwesenheit eines organischen Substrats T, wie z.B. eines Target-Moleküls oder eines Antikörpers, das mindestens eine der Gruppen -N-H, -N-H, -0-H und -S-H enthält.

Das Verfahren besteht darin, oaß man ein Substratmolekül mit einem beträchtlichen Überschuß eines Diamintetraessigsäuredianhydrids der allgemeinen Formel

OC-CH_{2 CH} __co j

O ^u R N^ ² \ \ (ΠΙ)

^C"^CH2 ^XCH₂-CO

worin R eine zwei oder mehr Atome lange covalente Brücke bedeutet, unter solchen Bedingungen in Kontakt bringt, daß mindestens eine dieser Gruppen an dem Substratmolekül mit einer der Anhydridgruppen des Dianhydrids reagiert unter Bildung eines an ein Substrat gebundenen Diamintrisäureanhydrids;

die verbleibende (restliche) Anhydridgruppe hydrolysiert unter Bildung der an ein Substrat gebundenen Diamintrisäure; die an ein Substrat gebundene Diamintrisäure in Lösung mit einem Seltenen

130012/0871

ORIGINAL INSPECTED

Erdmetallion mischt unter Bildung eines an ein Substrat gebundenen Seltenen Erdmetallchelats;

dann, gegebenenfalls unter Anwendung geeigneter Methoden, je nach Typ des angewendeten Assay, dieses an ein Substrat gebundene Seltene Erdmetallehelat mit einem Aktivator, wie z.B. einer Salicylsäure, behandelt (flutet);

die Intensität der Fluoreszenz dieses fluoreszierenden Komplexes mißt; und

die Intensität der festgestellten Fluoreszenz in Beziehung setzt zu der Intensität der Fluoreszenz einer bekannten Konzentration eines solchen fluoreszierenden Komplexes.

Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Target-Moleküls durch Ankuppeln eines oder mehrerer Tetrasäuredianhydridmoleküle der Formel (IH) an die Zentren -0-H, -S-H, -N-H oder -N-H an einem für ein Target-Molekül spezifischen Antikörper unter

Bildung eines Antikörpers, an den ein oder mehr Diamintrisäuremolekule covalent gebunden sind;

Bildung eines Seltenen Erdmetallchelats dieser an einen Antikörper gebundenen Trisäure;

Einwirkenlassen einer Menge des gekuppelten Antikörpers auf ein Gewebe, ein flüssiges oder festes Substrat, von dem man annimmt, daß es das Target-Molekül enthält, um das Target an den Antikörper zu binden, Entfernen des überschüssigen ungebundenen Antikörpers, Behandeln (Fluten) des Gewebes, des flüssigen oder festen Substrats mit einem für das Seltene Erdmetall-Trisäure-Chelat spezifischen fluoreszierenden Aktivator und Messen oder Bestimmen (Nachweisen) der Fluoreszenz als

130012/0871

Indikator für die Menge oder Anwesenheit der Target-Moleküle.

Gegenstand der Erfindung sind an ein Substrat (ein Molekül oder einen Rest) gebundene Diamintriessigsäuren der allgemeinen Formel

HOOC-CH₂ CH₂-COOH

R N

T-L-OC-CH₂ ^CH₂-COOH |

worin T ein organisches Substrat (Rest oder Molekül), das mindestens eine funktioneile Amin-, Hydroxyl- oder Thiolgruppe enthält, L den Rest mindestens einer dieser funktioneilen Gruppen und R eine zwei oder mehr Atome lange covalente Brücke bedeuten und

Verfahren zu ihrer Herstellung, zur Herstellung von Metallchslaten daraus und zur Verwendung der Chelate. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den bei der Bildung der Chelate verwendeten Metallionen um Ionen von Seltenen Erdmetallen, die fluoreszierende Chelate bilden können, die ihrerseits in Fluoroassay-Verfahren eingesetzt werden können.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen unter den folgenden Abschnitten näher beschrieben:

An ein Substrat (Molekül oder Rest) gebundene Diamintrisäureverbindun-

Metallkomplexe,

ternäre Kombinationen mit Floodern (Aktivatoren), Herstellungsverfahren,

Substratmoleküle und

Analysenverfαhren.

130012/0871

An ein Substrat (Molekül oder Rest) gebundene Diamintrisäureverbindungen

Diese Verbindungen haben die in der allgemeinen Formel I angegebene Struktur. In der Formel I bedeutet R eine zwei oder mehr Atome lange covalente Brücke. Die zwei oder mehr Atome beziehen sich auf die Atome in der Brücke selbst. Sie können gewünschtenfalls durch zusätzliche Atome oder Gruppen substituiert sein. Die Funktion von R besteht darin, die beiden Amindiessigsäuregruppen in einem Abstand voneinander covalent so miteinander zu verbinden, daß die beiden Amindiessigsäuregruppen mit Metallionen ein stabiles Chelat bilden können. Somit kann als R jede beliebige Gruppe verwendet werden, die diese Funktion erfüllt, ohne das Chelatbildungsvermögen der Amindiessigsäuregruppen zu beeinträchtigen.

Bei R handelt es sich vorzugsweise um eine gegebenenfalls substituierte 2 bis 8 Atome lange covalente Brücke, die ausgewählt wird aus Kohlenstoff-Sauerstoff-Ätherbrücken, Kohlenstoff-Stickstoff-Polyalkyl-sec.- oder tert.-Amidbrücken und Kohlenstoff-Kohlenstoff-Brücken einschließlich der Alkylene, Cycloalkylene und Arylene, die alle entweder unsubstituiert sind oder an der Brücke anhängende Substituenten enthalten. Zu geeigneten Substituenten gehören beispielsweise Alkyle mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, Aryle mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyle und AIkaryle mit 7 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen. Die Brücken oder die obengenannten Substituenten können auch substituiert sein durch Carboxyle, Carbonyle, Äther, Carbamate, sekundäre Amide, Sulfonate, Sulfamate und dgl. Zu Beispielen für R-Gruppen gehören Äthylen, n-Propylen, Isopropylen, die verschiedenen Butylene einschließlich n-Butylen, 1- und 2-Methylpropylen, 1-Propyläthylen, 1-Cyclohexyläthylen, 1-Phenyläthylen, alkylsubstituierte 1-Phenyläthylene und Propylene, 1-Benzyläthylen, 2-Amidopropylen, Cyclohexyl-l,2-en, Phenyl-l,3-en, der Diäthylenäther -CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-, der Triäthylendiäther -CH CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-Q-L- und dgl. Die vorstehende Aufzählung ist keineswegs abschließend,

130012/0871

sondern zeigt nur einige repräsentative typische Ausfuhrungsformen der Gruppe R.

Aus Gründen der Einfachheit der Herstellung sind die unsubstituierten Alkylene mit einer Länge von 2 bis 5, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatome bevorzugte Gruppen R, wobei Äthylen und Propylen besonders bevorzugt sind und Äthylen die am meisten bevorzugte G_ruppe R ist.

Die an ein Substrat (eine Gruppe oder Rest) gebundenen erfindungsgemäßen Diamintrisäureverbindungen enthalten eine oder mehrere funktioneile Gruppen L, bei denen es sich handelt um ein primäres oder sekundäres Amidstickstoffatom, ein Estersauerstoffatom oder ein Thioesterschwefelatom. Jede Einheit L dient als covalente Bindung zwischen einer Einheit des DiamiηIigenden und dem Substratmolekül T. Die Wahl von L hängt von der Art des Substratmoleküls ab, da L von einem an dem Substratmolekül vorhandenen Amin (primär oder sekundär), einem Hydroxyl oder Thiol abgeleitet sein kann. Im allgemeinen sind die Amidstickstoffatome bevorzugte L-Gruppen, wobei die Amidgruppe (die somit von einer primären Amingruppe an T abgeleitet ist) am meisten bevorzugt ist.

Die an ein Substrat gebundenen erfindungsgemäßen Diamintrisäureverbindungen enthalten zwei Amingruppen, von denen eine zwei Essigsäuregruppen und die andere eine Essigsäuregruppe und ein Essigsäure/L-T-Addukt trägt. Aus Gründen der Vereinfachung werden die drei Essigsäuregruppen hier (sowohl in der Beschreibung als auch in den Ansprüchen) in ihrer protonierten Form dargestellt, es sei jedoch darauf hingewiesen, daß diese Gruppen, die schwache Säuren darstellen, tatsächlich in einem Gleichgewicht zwischen der dargestellten protonierten Form und der entsprechenden deprotonierten Salzform -COO vorliegen. Die genauen Mengenanteile der beiden Formen hängen von

130012/0871

dem pH-Wert und der Zusammensetzung der Umgebung bei der Verwendung ab. Es ist klar, daß die dargestellte protonierte Form auch das tatsächlich existierende Gleichgewicht zwischen den beiden Formen darstellen soll.

Metallkomplexe

Die an ein Substrat gebundenen erfindungsgemäßen Diamintrisäuren stellen wirksame c-helat bildende Liganden dar. Es scheint, daß ihr Komplexbildungsvermögen ähnlich, wenn nicht praktisch das gleiche ist wie dasjenige der entsprechenden,nicht an ein Substrat gebundenen Diamintetroessigsäureliganden (wie z.B. Äthylendiamintetraessigsäure-EDTA). Es scheint ferner, daß die vierte Carbonylgruppe, obgleich sie zum Binden an das Substrat (die Gruppe oder den Rest) verwendet wird, als Koordinationspunkt mit Metallionen fungieren kann und daß somit die Dissoziationskonstanten von mit den erfindungsgemäßen Diamintrisäuren gebildeten Komplexen sehr ähnlich denjenigen sind, die mit den bekannten Diamintetraessigsäuren erhalten werden.

Zu den Metallionen M, die komplex gebunden werden können, gehören Ionen von Radionukleotiden sowie nicht-radioaktive Metallionen. Obgleich dies noch nicht im einzelnen nachgewiesen worden ist, scheint es, daß praktisch alle bekannten Komplexe von Metallionen mit EDTA und ihre nicht an Substrate gebundenen Analogen unter Verwendung der an Substrate gebundenen erfindungsgemäßen Liganden hergestellt werden können. So können beispielsweise Komplexe gebildet werden, worin M Ionen der Übergangsmetalle sowie der Seltenen Erdmetalle sowohl der Aktiniden- als auch der Lanthaniden-Reihe bedeutet. Zu Beispielen

j j I

für durch M repräsentierte Metallionen gehören: Al ,

130012/0871

Co⁺⁺, Co⁺⁺⁺ _r Cr⁺⁺,

Cr+++, cu⁺⁺, Dy+++_r Er⁺⁺⁺, Eu⁺⁺⁺, Fe⁺⁺,

Gd+++, Hg++, Ho+++, ln++⁺, La⁺⁺⁺, Lu⁺⁺⁺, Mn⁺⁺, Mn⁺++,

Nd+++, Ni++, Pb++, Pd⁺⁺, Pm⁺⁺⁺, Pr⁺⁺⁺, Pu⁺⁺⁺, Pu⁺⁺⁺⁺,

OiU f Oil ,XO ,xfx ,XX ,

f ν , ν , Vu₉ , y , Yb , Zn , und

Wegen des Umfangs der möglichen Metallionen, die eingearbeitet werden können, und des breiten Bereiches und der Verschiedenartigkeit der Eigenschaften, die solche Metallionen aufweisen, können die erfindungsgemäßen Metallionenkomplexe auf dem gesamten Gebiet der chemischen Analyse verwendet und angewendet werden. Die Anwesenheit der Metallionen, die erfindungsgemäß an das Substratmolekül gebunden sind, kann durch Verfahren, wie z.B. durch Radioassay, durch Röntgenstreuung oder Fluoreszenz, durch NMR- oder ESR-Verschiebungen oder dgl., je nach dem eingearbeiteten Metallion, nachgewiesen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den verwendeten Metallionen um solche Seltenen Erdmetallionen, die Komplexe mit chelatbildenden Liganden vom EDTA-Typ bilden. Unter diesen bevorzugt sind Terbium, Dysprosium, Europium, Samarium und Neodymium, wobei Terbium und Europium besonders bevorzugt sind und Terbium das am meisten bevorzugte Seltene Erdmetall für die Bildung des Metallions M ist.

Die zwischen dem Metallion M und der an ein Substrat gebundenen Diamiηtrisäure gebildeten Komplexe werden als äquimolare l:1-Metall/~ Chelat-Komplexe angesehen. Sie werden strukturell dargestellt durch die oben angegebene allgemeine Formel II.

Ternäre Kombinationen mit Floodern (Aktivatoren)

Die bevorzugte Anwendung der an ein Substrat gebundenen erfindungsgemäßen Diamintrisäuren ist ihre Verwendung als chelatbildende Liganden

130012/0871

in fluoreszierenden Seltenen Erdmetallkomplexen. Es hat sich erwiesen, daß die Brauchbarkeit dieser Komplexe in analytischen Fluoreszenzverfahren wesentlich verbessert wird, wenn eine dritte Komponente in dem Komplex vorhanden ist. Diese dritte Komponente, ein Promotor, wird allgemein als "Flooder" bezeichnet, weil diese Komponente in der Regel in großem Überschuß zugegeben wird. Flooder, die auch als Promotoren oder Sensibilisatoren bezeichnet werden (hier wird dafür stets der Ausdruck "Flooder" verwendet) erhöhen den Wirkungsgrad der Fluoreszenzanregung der Seltenen Erdmetallchelate und sie werden bereits in nicht an ein Substrat gebundenen Seltenen Erdmetallionen und Chelaten verwendet (vgl. Dagnall et al., "Analyst", 92, 358 bis 363 (1967); Heller und Wasserman, ¹¹J. Chem. Phys.", 42, 94-9 bis 955 (1965); McCarthy und Winefordner, "Anal. Chem.", 38, 848 (i960); Taketatsu et al., "Talanta", Ki, 1081 bis 1087 (1966); Alberti et al., "Anal. Chem.", 38, 214 bis 216 (1966), und Charles et al., "J. Inorg. Nucl. Chem.", 28, 529 bis 536 (1966)). Die darin beschriebenen brauchbaren Flooder können auch erfindungsgemäß verwendet werden. Dabei handelt es sich nicht um eine abschließende Aufzählung, sondern nur um einige erläuternde Beispiele aus der großen Anzahl von Floodern (Aktivatoren), die erfindungsgemäß zusammen mit den an ein Substrat gebundenen erfindungsgemäßen Diamintrisäuren verwendet werden können.

Viele dieser Flooder scheinen Koordinationseigenschaften zu haben und dadurch zu wirken, daß sie Zentren an dem Seltenen Erdmetallion besetzen, die noch nicht von dem an ein Substrat gebundenen Diamintrisäureliganden besetzt sind. Dadurch werden sie eng an das Metallion gekoppelt, so daß eine wirksame Energieübertragung von dem Flooder auf das Seltene Erdmetall möglich ist.

Beispiele für komplexbildende Flooder (Aktivatoren) sind 5-Sulfosalicylsäure (5-SSA), 4-Aminosalicylsäure, Salicylsäure, andere substituierte Salicylsäuren, Dipicolinsäure und dgl. Diese Materialien sind insbesondere verwendbar in Verbindung mit Terbiumkomplexen, wobei diese Anwendung ihre Wirkung demonstriert.

Ein Komplex aus einer an ein Substrat gebundenen Diamintrisäure und Terbium weist eine Anregungsbande in der Nähe von 240 nm auf. Dies ist eine verhältnismäßig schwache Bande und sie liegt bei dieser Wellenlänge nicht in einem zweckmäßigen Teil des Spektrums. Wenn 5-SSA als Flooder zugegeben wird, ist eine starke Anregungsbande im nahen ultravioletten Bereich nahe bei 310 nm, einer vom Standpunkt der Probentransmission aus betrachtet viel besser geeigneten Wellenlänge zu beobachten.

Zu Beispielen für Flooder, die in Verbindung mit Europium besonders geeignet sind, gehören Salze, wie Kaliumcarbonat, Natriumwolframat und dgl., sowie organische Materialien, wie Phenanthrolin.

Außer in den Fällen, in denen die Konzentration der an ein Substrat gebundenen Diamintrisäure hoch ist, beispielsweise 10 bis 10 M beträgt, wobei in diesem Falle die Flooder-Konzentration ähnlich hoch ist, ist die verwendete Flooder-Menge sehr groß, bezogen auf die Menge der an ein Substrat gebundenen Diamintrisäure. Im allgemeinen

3
werden vorzugsweise mindestens 10 mal so viel Flooder als Metallionen oder Diamintrisäure auf molarer Basis verwendet, wobei molare Über-Schüsse von 10 bis 10 besonders bevorzugt sind. Diese großen Überschüsse sind erforderlich, weil die Stabilität der Flooder-Diamin-Komplexe um viele Größenordnungen geringer ist als die Stabilität des Komplexes zwischen dem Diamin und dem Seltenen Erdmetall.

130012/0871

Der mit einem Flooder behandelte Komplex wird einfach gebildet durch Zugabe des Flooders zu dem bereits gebildeten Seltenen Erdmetallchelatkomplex in Lösung. Dies wird im allgemeinen unmittelbar vor der Messung der Fluoreszenz des mit einem Flooder behandelten Komplexes durchgeführt. Obgleich es noch nicht genau bekannt ist, wird angenommen, daß der mit einem Flooder behandelte Komplex, der sich dabei bildet, eine 1:1:1-molare ternäre Kombination aus der an ein Substrat gebundenen Diamintrisäure, einem Seltenen Erdmetall und dem Flooder darstellt.

Herstellungsverfahren

Die an ein Substrat (Rest, Kiolekül) gebundenen Diamintrisäuren können einfach hergestellt werden, indem man eine Substratsubstanz (die mindestens eine Gruppe -N-H, -N-H, -S-H oder -0-H- enthalten muß) mit

einem beträchtlichen molaren Überschuß eines Diamintetraessigsäuredianhydrids der oben angegebenen allgemeinen Formel III in flüssiger Phase in einem polaren aprotischen flüssigen organischen Reaktionsrnediv'ni in Kontakt bringt. Zu brauchbaren Reaktionsmedien gehören Aceton, Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Hi-PA und dgl.

Es können auch Gemische dieser Materialien verwendet werden. Wenn die reaktionsfähige Gruppe an dem Substratmolekül ein Amin, insbesondere ein primäres Amin ist, kann Wasser als Lösungsmittel verwendet werden, es können aber auch Wasser enthaltende Lösungsmittelgemische verwendet werden.

Dieses Inkontaktbringen wird unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß die aktive Gruppe an dem Substratmolekül mit einer der beiden

130012/0871

Anhydridgruppen an dem Diamin reagieren kann. Für den Fall, daß die aktive Gruppe an dem Substratmolekül ein Amin ist, tritt bei dem Inkontaktbringen eine Reaktion bei mäßigen Bedingungen, beispielsweise bei Temperaturen von etwa 5 bis etwa 100 C auf, wobei Temperaturen von etwa 10 bis etwa 75 C bevorzugt sind. Für den Fall, daß die aktive Gruppe an dem Substrat ein Thiol oder ein Hydroxyl ist, werden im allgemeinen etwas strengere Bedingungen angewendet, beispielsweise Temperaturen von 25 bis etwa 150 C. In diesem Falle sind Temperaturen von 35 bis etwa 125 C bevorzugt. Diese Differenz in Bezug auf die Reaktionsfähigkeit kann ausgenutzt werden, um eine selektive Reaktion mit Amingruppen unter Ausschluß der Reaktion mit Thiolen oder Hydroxylen zu bewirken, falls dies vorteilhaft ist. Die angewendeten Reaktionszeiten hängen natürlich umgekehrt von der angewendeten Temperatur ab. Im allgemeinen werden Reaktionszeiten von etwa 0,5 Stunden bis etwa 2 Tagen angewendet, wobei Reaktionszeiten von 1 Stunde bis etwa 36 Stunden bevorzugt sind. Diese Zeit- und Temperaturangäbeη dienen lediglich als Anhaltspunkte. In bestimmten Situationen, beispielsweise bei extrem wärmeempfindlichen oder wärmeunempfindlichen Targets, kann es von Vorteil sein, außerhalb der hier angegebenen beispielhaften Bereiche zu arbeiten. Als allgemeine Regel gilt, daß die Anwendung der niedrigeren Temperaturen innerhalb dieser Bereiche bevorzugt ist, da sie zu einer besseren Selektivität der Reaktion zwischen dem Anhydrid und dem Substratmolekül führt.

Es ist wesentlich, daß ein Überschuß des Dianhydrids verwendet wird. Es sollten Dianhydrid:Substratmolekül-Verhältnisse von mindestens 4:1 angewendet werden, wobei Verhältnisse von 5:1 bis etwa 10:1 bevorzugt sind. Die obere Grenze dieses Verhältnisses ist eine willkürliche Grenze und sie beruht auf wirtschaftlichen Erwägungen. Es können auch größere Anhydridmengen als in diesem Bereich angegeben verwendet werden

130012/0871

und gute Ergebnisse erzielt werden. Auch eine solche Arbeitsweise liegt innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung, sie wird aber auch als Verschwendung angesehen, da das überschüssige Anhydrid bei der nachfolgenden Aufarbeitung durch Hydrolyse zerstört wird.

Bei den hier verwendeten Dianhydriden handelt es sich entweder um bekannte Materialien (vgl. die US-Patentschrift 3 497 535) oder sie können unter Anwendung üblicher Verfahren für die Herstellung von Dicarbonsäureanhydride^ beispielsweise durch Erhitzen der Tetrasäure auf 150 C oder dgl. (z.B. 80 C bis 180 C) in Gegenwart eines molaren Überschusses von Essigsäureanhydrid und eines tertiären Amins für einen längeren Zeitraum, wie z.B. 12 bis 36 Stunden,aus den entsprechenden Diamintetraessigsäuren hergestellt werden.

Nach der Bindung des Substratmoleküls an das Dianhydrid wird die verbleibende (restliche) Anhydridgruppe zu der entsprechenden Diessigsäure hydrolysiert. Diese Hydrolyse erfolgt durch Vermischen der Kupplungsreaktionsmischung mit einem Überschuß Wasser jenseits der Anzahl von Molen Anhydrid, die hydrolysiert werden sollen, und durch Erhitzen. Geeignete Temperaturen liegen innerhalb des Bereiches von etwa 30 bis etwa 125 C. Geeignete Zeiten betragen etwa 1 Minute bis etwa 2 Stunden. Bevorzugte Temperaturen und Zeiten liegen innerhalb der Bereiche von 40 bis 105 C bzw. 2 Minuten bis 90 Minuten. Alternativ können auch andere Bedingungen, wie sie für die Hydrolyse von Carbonsäureanhydriden zu Säuren (z.B.. Essigsäureanhydrid zu Essigsäure) bekannt sind, angewendet werden.

Der Überschuß gegenüber der stöchiometrischen Anhydridmenge, der zur Bildung der an ein Substrat gebundenen Trisäure verwendet wird,

130012/0871

wird von dem an ein Substrat gebundenen Material abgetrennt. Die Entfernung des Anhydridüberschusses kann entweder vor oder nach der Hydrolyse des Anhydrids zu der Säure erfolgen je nachdem, wie es am zweckmäßigsten ist. Wenn der Überschuß nicht entfernt wird, steht er für die Reaktion mit Metallionen und den gegebenenfalls vorhandenen Floodern zur Verfügung und es besteht die Möglichkeit der Bildung von Komplexen, welche die genaue Bestimmung der Menge der an ein Substrat gebundenen Diamintrisäure störaaDiese Abtrennung des gebundenen Diamins von dem nicht-gebundenen Diamin kann nach irgendeinem Verfahren bewirkt werden, das zwischen den an ein Substrat gebundenen und nicht-gebundenen Molekülen unterscheidet. Die beiden Species unterscheiden sich in Bezug auf ihre Größe voneinander, so daß chromatographische Verfahren, wie· z.B. die Gelpermeationschromatographie, die Hochdruckflüssigchromatographie, die Kolonnenchromatographie, beispielsweise unter Verwendung eines Silicagelsubstrats, oder die Dünnschichtchromatographie angewendet werden können. Zur Durchführung dieser Trennung können auch Membranverfahren, wie z.B. die Dialyse und die Ultrafiltration, angewendet werden. In vielen Fällen kann sich das gebundene Material von dem nichtgebundenen Anhydrid oder der nicht-gebundenen Säure durch einige physikalische Eigenschaften, wie z.B. die elektrische Ladung oder Löslichkeit, unterscheiden. Ein solcher Eigenschaftsunterschied kann auch als Basis für die Trennung ausgenutzt werden, beispielsweise durch selektive Extraktion oder Elektrophorese. Obgleich hier vorzugsweise die chromatographischen Trennungen angewendet wurden und im allgemeinen bevorzugt werden, sollte das jeweils angewendete Verfahren festgelegt werden auf der Basis der jeweils verwendeten Materialien und der jeweils angewendeten Trennung. Die von überschüssigem Anhydrid oder überschüssiger Säure befreite, an ein Substrat gebundene Diamintrisäure wird dann in den Metallkomplex überführt.

130012/0871

Bei der Hydrolyse entstehen die gewünschten, an ein Substrat gebundenen Diamintrisäuren der Formel I. Diese können in die Metallkoordinationsverbindungen der Formel II überführt werden, indem man die Trisäure mit dem gewünschten Metallion in Kontakt bringt. Dieses Inkontaktbringen wird im allgemeinen in Lösung durchgeführt. Die verwendete Metallionenmenge sollte etwa 1 Mol Ionen pro Mol Trisäure betragen. Der Komplex zwischen dem Metallion und der Trisäure ist ein starker Komplex mit großen Stabilitätskonstanten. Dies bedeutet, daß es nicht erforderlich ist, große Überschüsse an Metallionen zu verwenden, um di· Komplexbildungsreaktion zu fördem_r und in einigen Fällen können Ionenüberschüsse die Genauigkeit der späteren Fluoreszenzmessungen beeinträchtigen (stören).

Die Metaljfcomplexbildungsstufe wird im allgemeinen in einem wäßrigen Reaktionsüi^ium durchgeführt. Gewünschtenfalls ist es sehr zweckmäßig, das Wassftf enthaltende Hydrolysereaktionsmedium zu verwenden. Dies bedeutet, 4aß die Metallionen im ollgemeinen in Form ihrer wasserlöslichen Salz·^ z.B. in Form der Halogenide, Nitrate, Acetate oder dgl., je nach Elgrjung, zugegeben werden.

Die Zugabe des Metallions wird zweckmäßig bei Umgebungsbedingungen durchgeführt. Die Komplexbildung wird durch stark erhöhte Temperaturen nicht begünstigt und es ist auch nicht ersichtlich, daß stark herabgesetzte Temperaturen irgendeinen Vorteil bieten. Ein Temperaturbereich von 5 bis etwa 40 C ist aus Bequemlichkeitsgründen im allgemeinen bevorzugt.

Im Falle der Seltenen Erdmetallionenkomplexe für fluorometrische Assay-Verfahren (Nachweis- bzw. Analysenverfahren) ist es häufig erwünscht, dem Metallionenkomplex einen "Flooder" zuzusetzen. Diese

130012/0871

BAD ORIGINAL

Zugabe des Flooders erfolgt in der Regel unmittelbar vor der Messung der Floureszenz. Sie wird erzielt durch Zugabe eines Überschusses des Flooders zu der Lösung des Metallionenkomplexes. Diese Zugabe wird ebenfalls bei mäßigen Bedingungen, beispielsweise bei einer Temperatur von 5 bis 40 C, durchgeführt.

Substratmoleküle (species Molecules)

Substratmoleküle, die covalent gebunden in die erfindungsgemäßen, an ein Substrat gebundenen Diamintrisäurematerialxen und die erfindungsgemäßen Komplexe eingearbeitet werden können, sind organische Moleküle, die ausgewählt werden aus "Target-Molekülen", wobei diese Materialien.in den obengenannten US-Patentschriften 4 150 295 und 4 058 732 beschrieben sind, Molekülen, die im wesentlichen identisch sind mit "Target-Molekülen", und Antikörpern, die für das "Target-Molekül" spezifisch sind. Diese Substsatmoleküle enthalten mindestens eine der primären Amin-, sekundären Amin-, Thiol- oder Hydroxylgruppen. Diese aktiven Gruppen können von Natur aus an dem Substratmolekül vorhanden sein oder sie können an einer covalent an das Substratmolekül gebundenen "Abstandhalter"-Einheit vorhanden sein. Der Abstandhalter dient dazu, die Möglichkeit der Wechselwirkung (Störung) zwischen der Diamintrisäuregruppe und dem Substratmolekül selbst minimal zu halten. Eine solche Wechselwirkung (Störung) könnte in bestimmten Situationen sehr schädlich sein, beispielsweise dann, wenn das Substratmolekül immunreaktive Eigenschaften aufweisen muß oder an irgendeiner anderen Substraterkennungsstufe teilnehmen muß. Der "Abstandhalter" kann auch verwendet werden, um lediglich die erforderlichen aktiven Amin-, Thiol- oder Hydroxylgruppen zu liefern. Der hier verwendete Ausdruck "Substrat" umfaßt Materialien mit und ohne addierte Abstandhalter.

130012/0871

Die Verwendung von Abstandhaltern oder "Brücken"-Molekülen zum Binden von aktiven Molekülen an nicht-aktive Gruppen, wie z.B. Substrate, wurde auf den Gebieten der Enzymimmobilisierung, der Chromatographie und dgl. entwickelt (vgl. z.B. die US-Patentschriften 3 278 392 und 3 873 514 und Wilche, "FEBS LETT", 33 (i)_f 70 bis 72). Obgleich in diesen Publikationen die hier verwendeten genauen Systeme nicht angegeben sind, ist darin ein breiter Bereich von Reagentien beschrieben und es sind die Vorteile angegeben, die durch die Verwendung von Abstandhaltern erzielt werden können.

Obgleich die vorliegende Erfindung mit jedem beliebigen Substratmolekül (species molecule) durchgeführt werden kann, das von Natur aus oder durch Verwendung eines Abstandhalters die erforderliche Amin-, Thiol- oder Hydroxylgruppe enthält, ist die Erfindung mit besonderem Vorteil anwendbar auf biologisch aktive Target-Moleküle einschließlich therapeutischer Arzneimittel bzw. Drogen, Enzyme, Hormone, Peptide, Macromoleküle inklusive Proteine und Lipide, Haptene, Antigene und dgl. Diese Moleküle weisen in der Regel mindestens eine der erforderlichen aktiven Gruppen auf und bei ihnen tritt häufig das Problem auf, daß die Analyse oder der Nachweis schwierig oder sogar unmöglich ist wegen der winzigen Mengen, in denen sie in biologischen Systemen vorhanden sind.

Beispiele für Substratmoleküle können somit reichen von einfachen organischen Target-Molekülen mit den erforderlichen funktionellen Gruppen, wie z.B. niederen Alkanolen - wie Methanol, Äthanol, Butanol, Hexanol, Cyclohexanol und dgl·; niederen aromatischen Hydroxyverbindungen - wie Phenol, 2,4-Dinitrophenol und Kresolen; über niederes Alkyl und aromatische Amine - wie Äthylamin, Diäthylamin, Butylamin und Isopropylamin;-niedere Thiole -■ wie Propanthiol und Butanthiol;

130012/0871

sowie Targets bis zu den komplizierteren Arzneimittel- und biologischen Molekülen einschließlich der Hormone Thyroxin, Trijodthyronin, der menschlichen Wachstumshormon-Gonadotropine, Gastrointestinalhormone, Insulin und dgl.; den therapeutischen Arzneimitteln bzw. Drogen, wie Digoxin, Morphon, Procainamid und dgl.; den Proteinen, Antikörpern und dgl. Im Falle von großen Molekülen, wie Proteinen und Antikörpern, kann mehr als eine (sogar eine große Anzahl) der erforderlichen funktionellen Zentren an jedem Substratmolekül vorliegen, so daß jedes Substratmolekül mehr als eine covalent daran gebundene Diamintrisäuregruppe aufweisen kann. Die vorstehende Aufzählung von möglichen Substratmolekülen (species molecules) soll nur den breiten Bereich von Targets demonstrieren, die erfindungsgemäß an die Diamintrisäuren gebunden werden können, ohne daß diese Aufzählung abschließend ist, und die Erfindung ist keineswegs auf die genannten Beispiele beschränkt.

Analysenverfahren

Wie bereits angegeben, ist es mit der vorliegenden Erfindung möglich, Metallionenkomplexe an Substratmoleküle oder an Antikörper von Substratmolekülen covalent zu binden. Der Nachweis (die Bestimmung) dieser Metallionen nach an sich bekannten Verfahren kann zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge der Substratmoleküle angewendet werden. Wie ebenfalls bereits erwähnt, können zur Bestimmung der vorhandenen Substratmenge dann, wenn das eingearbeitete Metallion ein Radionukleotid ist, Radioassay-Verfahren angewendet werden. Alternativ können Atomabsorptionsverfahren zur Messung der Metallmenge und der damit bestimmten Target-Menge angewendet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich

130012/0871

bei dem Metall um ein Seltenes Erdmetall und das daraus resultierende Chelat wird durch einen Flooder oder auf andere Weise fUr die Fluoreszenz aktiviert. Die zahlreichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Radioimmunoassays entwickelt worden sind, können im allgemeinen auf den Fluoreszenz-Immunoassay angewendet werden. Dazu gehören Inkubationsverfahren, Konkurrenzbindungsverfahren und die Trennung von gebundenen und freien markierten Targets, wie beispielsweise in den Aufsätzen "Radioimmunoassay and Related Techniques" von J. I. Thöreu et al., CV. Mosby Co., St. Louis, Missouri/USA (1978), und "Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry", Ed., C.A.Pasternack, Heyden, London, New York, Rheine (1975), diskutiert.

Der Hauptunterschied zwischen dem Radioimmunoassay und dem Fluoreszenz-Immunoassay liegt in der End-Ablesungsstufe. Im ersteren Falle werden die radioaktiven Desintegrationen ausgezählt, im letzteren Falle wird die Fluoreszenz angeregt und gemessen.

Bevorzugt werden die zeitgesteuerten (time-gated) Fluoreszenzverfahren, wie sie in den US-Patentschriften 4 150 295 und 4 058 732 beschrieben sind, angewendet, da sie die Erzielung einer wesentlich höheren Empfindlichkeit erlauben.

Im Falle der mit den erfindungsgemäßen Seltenen Erdmetallchelaten markierten fluoreszierenden Antikörper können sie zur Bestimmung bzw. zum Nachweis von freien Targets in Körperflüssigkeiten verwendet werden oder bei einer anderen bevorzugten Anwendungsform können sie zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Anwesenheit (oder der Menge) spezifischer Arten von biologischen Zellen oder Bakterien verwendet werden, vorausgesetzt, daß diese Zellen oder Bakterien neuartige Targets oder Gruppen von Targets auf ihrer Oberfläche aufweisen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Herstellungsbeispiele, Beispiele «nd Anwendungsbe^p^le^^rläutert, _ohne }_edoch

zu sein.

- 28 -

Herstellung von Diamintetraessigsäuredianhydriden

a) Äthylendiamintetraessiqsäuredianhydrid

Eine Mischung von 364 g Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), 510 g Essigsäureanhydrid und 600 g Pyridin wurde auf 65 C erhitzt und 24 Stunden lang bei dieser Temperatur gehalten. Die Mischung wurde dann abgekühlt und in einem Strahlenschutzkasten filtriert. Der gewonnene Feststoff wurde mit Diäthyläther gewaschen und getrocknet. Man erhielt 96 % des theoretischen Gewichts an EDTA-Dianhydrid. Die Elementaranalyse bestätigte, daß es sich bei dem erhaltenen Prdoukt um das Dianhydrid handelte.

b) Propylendiamintetraessigsäuredianhydrid

Nach dem in der US-Patentschrift 3 660 388 angegebenen Verfahren wurden 92 g 1,3-Propyiendiamintetraessigsäure, 152 g Essigsäureanhydrid und 113g Pyridin 24 Stunden lang bei 65 C gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde gewonnen, dreimal mit Diäthyläther gewaschen und in einem Vakuumofen bei 100 C getrocknet. Bei dem getrockneten Produkt handelte es sich um das gewünschte Dianhydrid.

c) Phenylen-T _f2-diamin-tetraessigsäuredianhydrid

Nach dem in der US-Patentschrift 3 660 388 angegebenen Verfahren wurden 34 g 1,3-Phenylendiamintetraessigsäure, 72 g Essigsäureanhydrid und 39 g Pyridin 24 Stunden lang bei 65 C gerührt. Die Mischung wurde abgekühlt und filtriert. Der abgetrennte Feststoff wurde mit Benzol gewaschen und getrocknet. Dabei handelte es sich um das gewünschte

130012/0871

Dianhydrid.

Beispiel 1

Α) Bindung von Thyroxin an EDTA-Dianhydrid

Ein 100 ml-Kolben wurde evakuiert und mit der Flamme getrocknet, anschließend wurde er in drei Cyclen evakuiert und mit trockenem Argon gefüllt. Der Kolben wurde abgekühlt und es wurden 433 mg EDTA-Dianhydrid, hergestellt gemäß den obigen Herstellungsverfahren, sowie 300 mg L-Thyroxin-natriumsalzpentahydrat eingeführt. Dieses Schilddrüsenhormon ist von fundamentaler Bedeutung, da es lebenswichtig ist für das normale Wachstum und den Stoffwechsel, und es ist im Handel erhältlich. Das Molverhältnis von Dianhydrid zu Hormon betrug 5:1. Bei Zugabe von 10 ml DMF (Dimethylformamid) erhielt man eine hellgelbe Lösung. Der Kolben wurde mit einer Folie abgedeckt und 20 Stunden lang auf 55 C erwärmt. Es wurde ein Flecktest angewendet, um zu zeigen, daß das gesamte Hormon mit dem Dianhydrid reagiert hatte unter Bildung des Produkts:

I HOOC-CH

I COOH

B) Hydrolyse des restlichen Anhydrids

Das Produkt (A)wurde nicht isoliert. Statt dessen wurden 4 ml destilliertes Wasser zu dem Kolben zugegeben und das Erhitzen wurde weitere 1,5 Stunden lang fortgesetzt. Dies bewirkte, daß die restlichen Anhydrid-

130012/0 871

ORIGINAL INSPECTED

gruppen hydrolysieren unter Bildung der Thyroxin-gebundenen Äthylendiamintriessigsäure. Die Trisöure und die EDTA, die sich gebildet hatten, wurden unter Anwendung irgendeines geeigneten Filtrierverfahrens in Form einer filtrierten Flüssigkeit gewonnen.

C) Trennung der EDTA von der Trisäure

Das Rohprodukt des Abschnittes (B) wurde durch eine gefüllte Silicagelkolonne eluiert unter Verwendung von ÄthanolrWasser (95:5) und 95 % wäßrigem Alkohol:30 % wäßrigem Ammoniak (80:20) als Eluierungsmittel. Die Trisäure wurde mit dem wäßrigen Ä'thanol:wäßrigen Ammoniak eluiert und als reine Verbindung durch TLC gesammelt. Die NMR-, Elementaranalyse und IR-Analyse zeigten, daß es sich bei dem gewonnenen Produkt um die gewünschte Thyroxin-gebundene Trisäure (C) in Form des Ammoniumsalzes in einer Ausbeute von 59 % handelte.

θ) Bildung eines Komplexes aus(C)und einem Ion eines Seltenen Erdmetalls

Eine bekannte Menge der in dem Abschnitt (C) gewonnenen Thyroxin-gebundenen Diamintriessigsäure wurde ausgewogen und in einigen ml 0,1 η NaOH gelöst. Innerhalb von wenigen Minuten wurde eine stöchiometrische Menge eines Halogenide eines Seltenen Erdmetalls (in diesem Beispiel wurde spezifisch Terbiumchlorid verwendet) zugegeben und gemischt unter Bildung einer homogenen Lösung, die den gewünschten 1:l-Komplex (D) aus einem Ion eines Seltenen Erdmetalls (Terbium) und Thyroxin-gebundener Diamintriessigsäure sowie Natriumchlorid, das kein störender Faktor war, enthielt.

130012/0871

Ε) Bildung eines ternären Komplexes von D mit einem Flooder

Ein aliquoter Anteil des Terbiumkomplexes des Abschnittes (θ) wurde in 10 ml Wasser gegeben zur Erzielung einer Konzentration von etwa 10 molar. Es wurde 5-Sulfosalicylsäure in einer Konzentration von

10 molar zugegeben zur Herstellung eines TerbiumϊThyroxin-gebundenen DiamintrisäurerFlooder-Komplexes. Bei der Anregung (Erregung) bei etwa 330 nm wies dieser Komplex eine starke Fluoreszenz auf, die bei 545 nm nachgewiesen werden konnte. Die Anwendung dieser Fluoreszenzeigenschaft auf den Nachweis bzw. die Bestimmung von Thyroxin wird weiter unten erläutert.

Beispiel 2

Das Herstellungsverfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt mit zwei Änderungen. Anstelle von Terbiumchlorid wurde in der Stufe (D) Europiumchiorid verwendet. Anstelle von 5-SSA wurde als Flooder Phenanthrolin verwendet. Dies führte zur Bildung des Europiumchelats und ternären Komplexes entsprechend den in Beispiel 1 gebildeten Terbiumkomplexen. Der Europiumkomplex fluoreszierte bei Verwendung zusammen mit einem Phenanthrolin-Flooder und erlaubte die Bestimmung der in den Lösungen vorhandenen Thyroxinmenge nach dem weiter unten beschriebenen Verfahren.

Beispiel 3

Α) Bindung von Cholesterin an EDTA-Dianhydrid und Hydrolyse

Ein 10 ml-Rundkolben wurde durch Erhitzen mit der Flamme getrocknet und dann mit Argon gefüllt. Dann wurden 200 mg (0,52 mMol) umkristalli-

130012/0871

siertes Cholesterin und 662 mg (2,59 mMol) des Dianhydrids gemäß Herstellungsbeispiel (a) eingeführt. Der Kolben wurde 45 Minuten lang unter Vakuum stehen gelassen und dann wurden 3 ml getrocknetes DMF zugegeben und die Mischung wurde 36 Stunden lang bei 90 C gehalten. Während dieser Zeit blieb die Mischung im wesentlichen homogen und farblos. Sie wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter weiterem Kühlen wurden 3 ml entionisiertes Wasser zugegeben. Es entstand ein Niederschlag und die heterogene Mischung wurde 10 Stunden lang gerührt.

Die Mischung wurde mit 40 ml Diäthyläther:Aceton (l:4) verdünnt, was zu einem zusätzlichen Niederschlag führte. Die Mischung wurde filtriert und der Feststoff wurde mit 10 ml einer Äther/Äceton-Mischung gewaschen. Die Filtrate wurden gesammelt, eingedampft und mit weiterem Äther verdünnt, um noch mehr Feststoff zu bilden. Dieser wurde gesammelt und zu dem vorher gesammelten Feststoff zugegeben. Nach dem Trocknen erhielt man 322 mg (48 % der Theorie) der gewünschten N-(Äthanol-0-cholesterin)äthylendiamintriessigsäure. Die NMR- und TLC-Analyse zeigte, daB das Produkt sehr rein war. Die Elementaranalyse stimmte mit der gewünschten Verbindung überein.

B) Bildung des Metallionenkomplexes

30 mg des Materials gemäß Abschnitt(A)wurden in 3 ml 0,1 η NaOH gelöst. Es wurden Ionen eines Seltenen Erdmetalls (entweder von Terbium oder Dysprosium) in einer etwa stöchiometrischen Menge (1,00 bis 1,05 Mol pro Mol der Verbindung des Abschnitts (A)) zugegeben. Dies führte zur Bildung eines Komplexes aus dem Ion des Seltenen Erdmetalls und dem Material gemäß Abschnitt(Αλ Dieses Material wies bei der Aktivierung durch Zugabe eines Überschusses eines Flooders Fluoreszenzeigenschaften auf, die in Fluoroassay-Verfahren vorteilhaft waren. Diese Flooder-

130012/0871

Zugabe wurde wie in Beispiel Ί angegeben durchgeführt.

Beispiel 4 Kupplung mit einem einfachen Alkanol

1 mMol Isopropanol wurden mit 10 ml getrocknetem DMF nach dem Verfahren des Beispiels 3 gemischt. 5 mMol des Dianhydrids des Herstellungsbeispiels (a) wurden zugegeben und die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 90 C gehalten. Dies führte dazu, daß die Hydroxylgruppe des Alkanols mit dem Anhydrid reagierte und das Alkanol in einer Esterkonfiguration kuppelte. Dieser Ester kann entweder vor oder nach der Hydrolyse der Anhydrideinheiten von dem restlichen Anhydrid abgetrennt werden. Durch Mischen des Esters mit dem gewünschten Metallion können Komplexe gebildet werden.

Beispiel 5 Kuppeln mit einem einfachen Amin

Das Herstellungsverfahren des Beispiels 4 wurde wiederholt mit zwei Änderungen. Erstens wurde das Isopropanol auf äquimolarer Basis durch Äthylamin ersetzt, zweitens waren die Reaktionsbedingungen weniger streng, es wurde eine Temperatur von 35 C angewendet. Die Äthylenaminmoleküle addierten sich an das Dianhydrid in einer Amidkonfiguration·

Beispiele 6 bis 8 Kupplung mit anderen einfachen Gruppen

Die Kupplung des Beispiels 4 wurde wiederholt, wobei diesmal das in Bei-

130012/0871

spiel 4 verwendete Isopropanol durch Phenol, Äthylthiol und Diäthylamin ersetzt wurde. Im Falle von Diäthylamin wurde auch eine niedrigere Temperatur (35 C) angewendet. Bei diesen Wiederholungen erhielt man die gekuppelten Produkte auf der Basis jedes der neuen Ausgangsmaterialien. Gewünschtenfalls können sie zur Herstellung von Metallionenkomplexen weiterverarbeitet werden.

Beispiel 9 Kupplung, mit einem Amin in einer wäßrigen Umgebung

Die Kupplung des Beispiels 5 wurde wiederholt mit zwei zusätzlichen Änderungen. Anstelle des DMF-Lösungsmittels wurde Wasser verwendet und anstelle einer 24-stündigen Reaktion bei 35 C wurde eine 36-stündige Reaktion bei 30 C angewendet. Unter diesen milden Bedingungen reagierten die aktiveren Amingruppen und es erfolgte eine bevorzugte Bindung der Amine an die Dienhydride unter Bildung der gewünschten Trisäuren. Diese Reaktion ähnelt der bevorzugten Reaktion eines Amins mit Essigsäureanhydrid in einer wäßrigen Umgebung (vgl. Caldwell et al, JACS, 64, 1695 (1942)). Dies ist ein bevorzugtes Verfahren zum Kuppeln von Trisäuren mit Proteinen und Antikörpern.

Beispiel 10

A) Bindung von Thyronin an PDTA-Dianhydrid

In einen getrockneten Kolben wurden 6 mMol PDTA-Dianhydrid, hergestellt nach den Angaben in den Herstellungsbeispielen, und 1 mMol der essentiellen Aminosäure Thyronin, vom Handel bezogen, eingeführt. Das Molverhältnis von Dianhydrid zu Thyronin betrug 6:1. Es wurde DMF in einer

130012/0871

Menge von 50 ml zugegeben und die entstandene Lösung wurde auf 35 C erwärmt und 30 Stunden lang bei dieser Temperatur gehalten. Mit der ■Mischung wurde ein Flecktest auf einer TLC-Platte durchgeführt und es wurde gefunden, daß sie kein nicht-umgesetztes Thyronin enthielt und daß sie das gewünschte Thyronin-gebundene Propylendiamintriessigsäureanhydrid enthielt.

Β) Hydrolyse, Abtrennung und Koroplexbilduna.

Nach den in Beispiel 1 angegebenen generellen Verfahren wurde das Anhydrid des Abschnitts(A)in situ hydrolysiert und von der gebildeten überschüssigen PDTA durch Säulenchromatographie abgetrennt. Dabei erhielt man die gewünschte Thyronin-gebundene Triessigsäure. Die Lösung der gewünschten Trisäure wurde in drei gleiche Teile aufgeteilt. Der erste Teil (der schätzungsweise etwa 0,2 mMol der Trisäure enthielt) wurde mit 1 bis 2 mMol Kobaltchlorid in Form einer wäßrigen Lösung gemischt. Dabei erhielt man ein Kobaltchelat der an Thyronin gebundenen Triessigsäure. Der zweite Teil wurde mit 0,2 mMol Terbium in Form einer Lösung von Teroiumbromid in Kontakt gebracht. Dabei erhielt man ein Terbiumchelat der Trisäure. Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurden

2
1 χ 10 mMol des Flooders 4-Aminosalicylsäure zugegeben zur Herstellung des 1 :1 :1-Terbium/Trisäure/Flooder-Komplexes. Die dritte Portion wurde vorsichtig mit 1 bis 2 mMol In in Form seines Chlorids in Kontakt gebracht. Dabei entstand der In -Komplex der an Thyronin gebundenen Trisäure.

Beispiel Π

Das Herstellungsverfahren des Beispiels 5 wurde wiederholt, jedoch mit einer Änderung. Anstelle von EDTA-Dianhydrid wurde Cyclohexylen-

130012/0871

ORIGINAL INSPECTED

1,2-diamintetraessigsäuredianhydrid verwendet. Dies führte zur Bildung der an Äthylendiamin gebundenen Triessigsäure. Diese Verbindung der Formel

wurde mit Europiumionen in Kontakt gebracht, wobei der Europium-

komplex entstand, der seinerseits durch Zugabe eines 10 -molaren Überschusses des Flooders Kaliumcarbonat in einen fluoreszenzaktiven Komplex überführt wurde. Dieser Komplex ist durch Fluoreszenzverfahren nachweisbar.

Verwendung der an ein Target gebundenen Diamintriessigsäure-Komplexe zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Target-Moleküle

Als erste Stufe wird demonstriert, daß die Fluoreszenz eines mit einem Substrat verbundenen Diamintrisäure/Seltenen Erdmetallion-Komplexes in Beziehung steht zur Konzentration des Komplexes.

Es wurde eine Reihenverdünnung einer Lösung des an Thyroxin gebundenen Diamintriessigsäurekomplexes mit Terbium (hergestellt wie in dem Abschnitt (ty) des Beispiels 1 angegeben) mit Thyroxinkonzentrationen von 10 molar bis 2,5 χ 10 molar durchgeführt. Es wurde ein Flooder zugegeben (10 —molare 5-Sulfosalicylsäure). Bei einem pH-Wert von etwa 11,5 wurde die Fluoreszenz jeder der Proben gemessen

130012/0871

unter Verwendung eines zeitabhängigen Fluorimeters und unter Anwendung von Meßmethoden, wie sie in "Immunofluorescence and Related Staining Techniques", Knapp et al, Eds., 67-80, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1978, beschrieben sind. Die Signale wurden auf ein doppeltlogarithmisches Papier aufgetragen und es wurde festgestellt, daß sie über diesen Bereich linear waren. Die

-12
Kurve kann bis auf etwa 10 molar als Schwellenwertsnachweisgrenze extrapoliert werden. Bei dem Nachweisschwellenwert handelt es sich um die Konzentration, bei welcher das Fluoreszenzsignal gerade gleich der Fluktuation der Signale gegenüber einer Blindprobe ist. Die Signale einer Blindprobe umfassen das Photoverstärker-Dunkelrauschen und die restlichen Hintergrundsignale des Probenbehälters, der Lösungsmittel, der Puffer und dgl. Die Tatsache, daß ein lineares Diagramm erhalten wurde, zeigt, daß die Konzentration eines markierten Substrats durch Messung der Fluoreszenz desselben bestimmt werden kann.

Diese Erkenntnis wird praktisch angewendet zur Bestimmung der Konzentration von Thyroxin in Proben mit einer unbekannten Konzentration in Plasma. Zuerst wird eine Standardkurve entsprechend den Vorschriften wie bei einem Radioimmunoassay aufgestellt. Dann wird eine Reihenverdünnung von nicht an ein Substrat gebundenem Thyroxin in einem thyroxinfreien Plasma hergestellt. Das thyroxinfreie Plasma wird nach bekannten Verfahren hergestellt, welche die Denaturierung sämtlicher Thyroxinbindender Plasmaproteine umfassen. Die Konzentrationen betragen 1,2, 4, 8 und 16 μg/dl. Der pH-Wert wird eingestellt und es wird eine festgelegte Menge des an den Komplex gebundenen Thyroxins (D des Beispiels l) jeder Verdünnung zugegeben zusammen mit einer festgelegten Menge Antikörper, für Thyroxin. Diese Mischung wird bei konventionellen Konkurrenzbindungsbedingungen inkubiert. Das an den Anti-

130012/0871

körper gebundene und das freie Thyroxin werden dann unter Anwendung irgendeiner der bekannten Trennungsstufen der Ammoniumsulfatausfällung, " der doppelten Antikörperausfällung, der Polyäthylenglykolausfällung, der Dextran-Aktivkohle-Ausfällung, der Säulentrennung oder dgl. voneinander getrennt. Die gebundene Fraktion wird dann in einem Puffer suspendiert, es wird ein Flooder zugegeben und die Fluoreszenz wird gemessen unter Anwendung des weiter oben beschriebenen zeitabhängigen Verfahrens. Die festgestellte Fluoreszenz wird gegen die Konzentration des ungebundenen Thyroxins in den Standardpro!>$f> aufgetragen.*Ts wird eine Kurve aufgestellt, die bestätigt,*^hß bei höheren Konzentrationen an ungebundenem Thyroxin das gebundene Material weniger in der Lage ist, in Bezug auf die Antikörperzentren zu konkurrieren^und daß die beobachtete Fluoreszenz niedriger ist. Die aufgestellte Kur*te..wira dann zur Bestimmung der Thyroxinkonzentration in unbekannten Proben verwendet.

Serumproben, die unbekannte Mengen Thyroxin enthielten, wurden auf ihren Gesamtgehalt an Thyroxin hin untersucht (analysiert). Zuerst wurden sie engesäuert, um irgendwelche bindenden Proteine zu denaturieren und das Thyroxin aus irgendeiner Bindung freizusetzen. Dann wurden sie nach der pH-Werteinstellung mit einer Standardmenge des an Thyroxin gebundenen Diamintrisäure-Metallkomplexes gemäß TeU(D^ Beispiel 1, und einer Standardmenge Thyroxin-Antikörper wie bei der Aufstellung der Standardkurve behandelt. Die Mischung wurde wie oben angegeben inkubiert. Die gebundenen und nicht-gebundenen Materialien wurden voneinander getrennt. Es wurde ein Flooder zugegeben und die Fluoreszenz wurde gemessen. Die Thyroxinkonzentration in der unbekannten Probe wurde dann von der Standardkurve auf der Basis der festgestellten Fluoreszenz abgelesen.

130012/0871
ORIGINAL INSPECTED

Anwendung der an einen Antikörper gebundenen Diamintrisäure-Komplexe auf Assays (Nachweis- bzw. Analysenverfahren) ^ ₁ .

A) Antikörper-Assay

In einigen Fällen handelt es sich bei dem Target-Molekül (dem nachzuweisenden oder zu bestimmenden Molekül) um einen Antikörper. So kann es beispielsweise medizinisch wichtig sein, das Spektrum der Immunoglobulin (igE)-Antikörper bei einem an Allergie leidenden menschlichen Patienten zu bestimmen. Der Patient kann IgE-Antikörper gegen verschiedene Allergene und in verschiedenen Mengen besitzen und für eine richtige Behandlung ist es von entscheidender Bedeutung, diese Verteilung zu kennen. Um die Menge der IgE-Antikörper im Blut oder in einer anderen Körperflüssigkeit zu bestimmen, wird das fragliche Allergen kovalent an ein Festphasen-Substrat gekoppelt unter Anwendung bekannter Verfahren und das Substrat wird der Körperflüssigkeit des Patienten ausgesetzt» Nach einer geeigneten Inkubationszeit unter geeigneten Bedingungen wird das Substrat herausgenommen und gewaschen. Eine repräsentative Menge des IgE-Äntikörpers, der für das Allergen auf dem Feststoffsubstrat spezifisch ist, ist nun auf dem Substrat, gebunden an das Allergen, vorhanden. Das Substrat wird nun dem an ein Terbium-Diamintrisäure-Chelat gebundenen Antikörper gegen Human-IgE ausgesetzt; dieser Anti-IgE-Antikörper ist im allgemeinen für alle Unterklassen von Human-IgE spezifisch unabhängig von dem beteiligten Allergen. Nach der zweiten Einwirkung, erneut unter geeigneten Bedingungen, wird das Feststoffsubstrat erneut gewaschen und mit einem Flooder, wie z.B. Natriumwolframat, behandelt. Die Fluoreszenz wird dann gemessen, vorzugsweise unter Verwendung eines zeitgesteuerten (time-gated) Fluorimeters,wie vorstehend angegeben. Unter Anwendung bekannter Verfahren können für jedes Allergen mit bekannten IgE-Mengen Standardkurven aufgestellt werden und

130012/0871

die unbekannte IgE-Menge in einer Humanprobe kann auf diese Weise durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt werden.

B) Assay für Zellen oder Bakterien

Zellen oder Bakterien können auf ihren Oberflächen verschiedene Molekularmarkierungen aufweisen. Diese Markierungen können in einigen Fällen identifiziert, isoliert oder gereinigt und zur Herstellung von Antikörpern, die für die Markierung spezifisch sind, verwendet werden. Diese Antikörper können, wenn sie an den erfindungsgemäßen Diamintrisäure-Metall-Komplex gebunden sind, zum Identifizieren bestimmter Zellen oder Bakterien verwendet werden, die auf ihrer Oberfläche die Markierungen aufweisen. Die Zellen oder Bakterien werden den an den Diamintrisäure-Metall-Komplex gebundenen Antikörpern ausgesetzt und wenn die Markierung vorhanden ist, wird eine verhältnismäßig hohe Konzentration des gebundenen Antikörpers an die Oberfläche gebunden. Diese Zellen werden dann in einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluofeszenzzellen-Strömungssystem untersucht und die fluoreszierenden Zellen oder Bakterien werden für ein gegebenes Volumen ausgezählt, wodurch ihre Anwesenheit in quantitativer oder qualitativer Weise nachgewiesen wird.

Die vorstehend beschriebenen Assays stellen lediglich zwei Beispiele für die vielen möglichen Assays dar, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen, an ein Substrat gebundenen Diamintriessigsäurekomplexe durchgeführt werden können. Natürlich können auch andere äquivalente Verfahren angewendet werden.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann

130012/0871

selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Claims

PATENTANWÄLTE: A. GRUNECKER

H. KINKELDEY

DFl-ING

W. STOCKMAIR

DR-ING ■ AeE ICAUTECH)

3033691 ^Κ· SCHUMANN

_a DR. BER MAT DtPU PHYS

P. H. JAKOB

DlPL-ING

Q. BEZOLD

Dft RSR Mar - DtPL-CHEM-

8 München" 22

MAXIMILIANSTRASSE 4-3

P 15 452

8. September 1980

AUALYTICAL RADIATION CORPORATION

Panchita Way,

Los Altos, California 94-022

An ein Substrat gebundene Diamintriessigsäuren und ihre

Chelate

Patentansprüche

I.y An ein Substrat gebundene Diamintriessigsäure, g e k e η η zeichnet durch die allgemeine Formel

HOOC-CH₀ ^CH₉-COOH

²\ / ^Δ

T-L-OC-CH^ ^CH₂-COOH

(D

worin bedeuten:

R eine zwei oder mehr Atome lange covalente Brücke,

T ein organisches SubstratmolekUl mit einer funktionellen

Gruppe, ausgewählt aus -N-H, -N-H, -0-H und -S-H und

H
L die funktionelle Gruppe in einer deprotonierten Form,

130012/0871

ORIGINAL INSPECTED

die T covalent an ein Carbonylkohlenstoffatom der Diamintriessigsäure bindet.

2. Diamintriessigsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (i) R eine 2 bis 8 Atome lange Kohlenstoff-Sauerstoff -Ätherbrücke oder eine 2 bis 4 Atome lange Kohlenstoff-Kohlenstoff -Brücke bedeutet.

3. Diamintriessigsäure nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (i) R eine 2 bis 4 Atome lange Brücke bedeutet, die ausgewählt wird aus Alkylenen und 1,2- und 1,3-Arylenen und Cycloalkylenen, die gegebenenfalls substituiert sind durch einen Substituenten aus der Gruppe der Alkyle mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, der Aryle mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, der Aralkyle und Alkaryle mit 7 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen, wobei die Substituenten selbst gegebenenfalls substituiert sind durch Cärboxyle, Carbonyle, Äther, sekundäre Amide, Halogene, Sulfonate oder Sulfamate.

4. Diamintriessigsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (i) R Äthylen bedeutet.

5. Diamintriessigsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der funktionellen Gruppe

an dem Substratmolekül um ein sekundäres Amin-N-H handelt, so daß L eine sekundäre Amin-Brücke bedeutet.

6. Diamintriessigsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der funktionellen Gruppe an dem Substratmolekül um ein primäres Amin-N-H handelt, so daß L eine

130012/0871

primäre Amid-Brücke bedeutet.

7. Diamintriessigsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, ■dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der funktioneilen Gruppe an dem Substratmolekül um eine Hydroxylgruppe-O-H handelt, so daß L eine Carboxylesterbrücke bedeutet.

8. Diamintriessigsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei T um ein biologisches Molekül handelt, das ausgewählt wird aus der Gruppe der Hormone, Lipide, Arzneimittel bzw. Drogen, Proteine, Haptene, Enzyme, Antigene und Antikörper.

9. Diamintriessigsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei L um ein primäres Amid handelt, das abgeleitet ist von einem an dem Substrat T vorhandenen primären Amin. wobei es sich bei dem Substrat um Thyroxin oder Thyronin handelt.

10. Metallchelat, gekennzeichnet durch ein Metallion in einem im wesentlichen 1:1-molaren Chelatkomplex mit der an ein Substrat gebundenen Diamintriessigsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis

11. Metallchelat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Metallion um ein Ion eines Seltenen Erdmetalls handelt, das mit der an ein Substrat gebundenen Diamintriessigsäure einen fluoreszierenden Komplex bilden kann.

12. Metallchelat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Metallion um das Ion eines Seltenen Erdmetalls aus der Gruppe Terbium, Dysprosium, Europium, Samarium und Neodymium handelt.

130012/087 1

30335:) !

13. Metallchelat nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß L eine primäre Amidbrücke bedeutet, die von einem primären Amin abgeleitet ist, das an dem Substrat T vorhanden ist, wobei es sich bei dem Substrat um einen Antikörper handelt.

14. Metallchelat nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß L eine primäre Amidbrücke bedeutet, die von einem primären Amin abgeleitet ist, das an dem Substrat T vorhanden ist, wobei es sich bei dem Substrat um Thyroxin handelt.

15. Metallchelat nach Anspruch 13 und/oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Metallion ausgewählt wird aus den Ionen von Terbium und Europium.

16. Fluoreszierende Kombination, dadurch gekennzeichnet, daß sie enthält oder besteht aus dem Metallchelat nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 15 und einem Flooder (Aktivator).

17. Fluoreszierende Kombination nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Flooder um ein Salicylat handelt.

18. Fluoreszierende Kombination nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Flooder um 5-Sulfosalieylsäure handelt.

19. Verfahren zur Herstellung der an ein Substrat gebundenen Diamintriessxgsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Substratmolekü'l mit einer funktionellen Gruppe, ausgewählt aus -N-H, -N-H, -0-H und -S-H mit mindestens 4 Mol eines Diamindian-

130012/0871

ORIGINAL INSPECTED

hydrids der allgemeinen Formel

^CH2-^CO| (III)

O N R N h

OCCH^ ^

worin R die in den Ansprüchen 1 bis 9 angegebenen Bedeutungen hat, pro Mol Substratmolekül in flüssiger Phase bei einer Temperatur von

etwa 5 bis etwa TOO C etwa 0,5 Stunden bis etwa 2 Tage lang in Kontakt bringt und
b) die verbleibenden (restlichen) Anhydridgruppen hydrolysiert.

20. Verfahren zur Herstellung einer fluoreszierenden, an ein Substrat gebundenen Diamintriessigsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Substratmolekül mit einer funktionellen Gruppe, ausgewählt aus -N-H, -N-H, -0-H und -S-H mit mindestens 4 Mol eines Diamindianhydrids

H
der allgemeinen Formel.

/ ν

worin R eine zwei oder mehr Atome lange covalente Brücke bedeutet, pro Mol Substratmolekül in flüssiger Phase bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa TOO C etwa 0,5 Stunden bis etwa 2 Tage lang in Kontakt bringt,

b) die verbleibenden (restlichen) Anhydridgruppen hydrolysiert,

c) die in der Stufe (b) gebildete, an ein Substrat gebundene Diamintriessigsäure gewinnt (abtrennt), ·

130012/0871

d) die gewonnene (abgetrennte), an ein Substrat gebundene Diamintriessigsäure mit einer Lösung eines Seltenen Erdmetallions, das mit der Triessigsäure einen fluoreszierenden Komplex bilden kann, in Kontakt bringt und

e) den fluoreszierenden Komplex mit einem Flooder in einem beträchtlichen molaren Überschuß in Kontakt bringt.

21. Verfahren zur Durchführung der Fluoreszenzspektroskopie mit der fluoreszierenden Kombination nach mindestens einem der Ansprüo'ne 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die fluoreszierende Kombination mit mindestens einem Strahlungsimpuls einer Impulsdauer, die, verglichen mit der Fluoreszenzabklinglebensdauer der fluoreszierenden Kombination kurz ist, anregt und

b) die Fluoreszenz der fluoreszierenden Kombination bestimmt, nachdem die Fluoreszenz der Umgebungssubstanzen im wesentlichen abgeklungen (zerfallen) ist.

22. Verfahren nach Αηφ ruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß als fluoreszierende Kombination ein an Thyroxin gebundene Diamintriessigsäure-Terbiun-5-Sulfosalicylsäure-Komplex verwendet wird, wobei die

Strahlung eine Wellenlänge von etwa 330 nm (3300 £) hat und die Bestimmung (der Nachweis) bei einer Wellenlänge von etwa 545 nm (54-50. S) durchgeführt wird.

130012/0871

ORIGINAL INSPECTED