DE3043814A1

DE3043814A1 - Teilchenerfassungsvorrichtung und -verfahren

Info

Publication number: DE3043814A1
Application number: DE19803043814
Authority: DE
Inventors: Wallace H. Miami Springs Fla. Coulter; Michael R. Miami Fla. Groves
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1979-11-23
Filing date: 1980-11-20
Publication date: 1981-09-03
Also published as: CA1151730A; AU6457280A; NL8006326A; CH639767A5; IT8050207A0; JPS5686336A; FR2470377B1; FR2470377A1; ES497018A0; AU540023B2; JPH0225133B2; GB2064133A; SE8008148L; BR8007591A; GB2064133B; IT1148275B; US4298836A; ES8201313A1

Description

Patentanwälte " "" "**

DIpl.-lng. E. Eder - 4 - Q Γ) Λ ^ 8 1 L

β München 40, ElisabethstraßeM

COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah/Florida

Teilchenerfassungsvorrichtung und -verfahren

Die Erfindung bezieht sich auf Teilchenerfassungsvorrichtungen und -verfahren im allgemeinen, und insbesondere auf Vorrichtungen und Verfahren zur Untersuchung von Teilchensystemen mit dem Impedanzmeßverfahren.

Seit seiner über 25 Jahre zurückliegenden Erfindung hat das sogenannte Coulter-Prinzip zur größen- und zahlenmäßigen Erfassung von Teilchen eine Vielfalt von Verfahren und Vorrichtungen zur elektronischen Zählung, größenmäßigen Bestimmung und Untersuchung mikroskopischer Teilchen nach sich gezogen, wobei die in einem Fluid suspendierten Teilchen abgetastet werden (US-PS 2,656,508). Nach diesem bekannten Prinzip wird zwischen zwei Gefäßen über in die jeweiligen Volumen des Suspensionsfluids eintauchende Elektroden ein Gleichstrorafluß hergestellt. Die einzige Flussigkeitsverbindung zwischen den beiden Volumen erfolgt über eine Durchflußöffnung. In dieser Durchflußöffnung wird der elektrische Stromfluß und ein elektrisches Feld erzeugt. Die öffnung und das in ihr und um sie herum erzeugte elektrische Feld bilden eine Meßzone. Jeweils beim Durchtritt eines Teilchens durch diese Meßzone verändert sich während der Durchtrittsdauer die Impedanz des Volumens der Meßzone und ändert dadurch den Stromfluß und das elektrische Feld in der Meßzone, wobei ein Signal erzeugt wird, welches einer auf diese Veränderung ansprechenden Erfassungsvorrichtung zuführbar ist.

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Es hat sich gezeigt, daß die bei Durchtritt eines Teilchens hervorgerufene Veränderung der Impedanz innerhalb der Meßzone im wesentlichen dem Teilchenvolumen proportional ist, wenn die Querschnittsfläche des Teilchens wesentlich kleiner ist als die Querschnittsfläche der öffnung und der Teilchendurchmesser kleiner ist als die axiale Länge der öffnung. Es wurden zahlreiche Ausführungsformen entwickelt und auf den Markt gebracht, bei welchen zur Messung des Teilchenvolumens oder der Teilchengröße die von einer Impedanzmeßanordnung erhaltene Signalamplitude gemessen wird.

Eine derartige Meßanordnung mißt die elektrische Größe des Teilchens, welche nachfolgend als "Teilchengröße" oder "gemessene Größe" bezeichnet wird.

Es hat sich herausgestellt, daß die Gestalt des Teilchens die gemessene Größe beeinflußt, so daß diese nicht exakt dem tatsächlichen oder wahren Volumen des Teilchens entspricht. Aufgrund der hydrodynamischen Fokusierung in den meisten Vorrichtungen erfahren längliche Teilchen im allgemeinen eine im wesentlichen parallele Ausrichtung ihrer Längsachse zur Mittelachse der Durchtrittsöffnung. Von zwei Teilchen gleichen Volumens, wovon eines kugelförmig und das andere länglich ist, weist daher das kugelförmige Teilchen bei seinem Durchtritt durch die öffnung senkrecht zum Stromfluß eine größere Querschnittsfläche auf als das längliche Teilchen. Die durch das kugelförmige Teilchen erzeugte Verzerrung des elektrischen Feldes ergibt dabei ein größeres Signal für die gemessene Größe als die durch das längliche Teilchen hervorgerufene Verzerrung, obwohl beide Teilchen gleiches Volumen besitzen. Um dies zu kompensieren, wurden die Teilchen je nach Gestalt durch einen sogenannten Formfaktor klassifiziert. Wenn z.B. einem extrem länglich geformten Teilchen der Formfaktor 1.0 zugeschrieben wird, dann kommt einem kugelförmigen Teilchen gleichen Volumens der Formfaktor 1.5 zu. Mit einer bekannten Vorrichtung, welche eine doppelte Meßöffnungsanordnung besitzt, ist dieser Formfaktor bestimmbar (US-PS 3 793 587).

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Bei dieser Anordnung liegt die Länge der einen öffnung in der Größenordnung der Teilchenlängen oder ist kleiner als diese. In dieser öffnung erzeugt daher ein längliches Teilchen einen Impuls, der nach seinem Anstieg für eine bestimmte Zeitdauer seinen Höchstwert hält und dann erst abfällt.

Der von einem kugelförmigen Teilchen erzeugte Impuls fällt hingegen sofort nach Erreichen seines Spitzenwertes wieder ab. Nach dem vorgenannten Stand der Technik wird auch vorgeschlagen, die gemessene Größe zu korrigieren, indem man die für ein Teilchen erhaltene Impedan ζ veränderung durch den Formfaktor des Teilchens dividiert. Der komplizierte Aufbau elektrischer Felder läßt aber an solchen Korrekturen viel zu wünschen übrig.

Außerdem kommt der durch hydrodynamische Druckkräfte erzeugten Verformung des Teilchens bei seinem Durchtritt durch die Meßöffnung bzw. der Teilchenform große Bedeutung zu, sowohl als ein die gemessene Größe beeinflussender Faktor, als auch als getrennter Parameter zur Untersuchung von Teilchen. Die Verformung bzw. Gestalt der Teilchen beeinflußt erstens ihren Formfaktor, welcher wiederum die gemessene Größe beeinflußt. Außerdem hängt der Verformungszustand einer biologischen Zelle nicht nur vom Zelltypus ab, sondern auch vom Alter der Zelle. Zum Beispiel sind die Erythrozyten von Säugern kernlos. Im Gegensatz zu den Leukozyten sind die Erythrozyten aufgrund ihrer geringen inneren Viskosität leicht verformbar. Außerdem wird innerhalb eines bestimmten Zelltyps die Membran mit zunehmendem Alter starrer und damit weniger verformbar. Darüber hinaus vermutet man, daß sich der pathologische Zustand einer Zelle auch auf ihre Verformbarkeit bzw. ihre natürliche Gestalt auswirkt.

Bei einer Vorrichtung nach der eingangs genannten US-PS 2,656,508 wurde das elektrische Feld über eine Gleichstrom- oder Niederfrequenz-Quelle erzeugt. Wie bereits erwähnt, ist die bei Durchtritt eines Teilchens hervorgerufene elektrische Veränderung eines elektrischen Feldes kleiner Abmessungen, welches von einer

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Gleichstrom oder Niederstrom-Quelle erzeugt wird, im wesentlichen proportional der Teilchengröße. Gleichstrom wird hier mit Nullfrequenz gleichgesetzt. Inzwischen wurde jedoch dieses Impedanz-Meßverfahren wesentlich erweitert/ um nicht nur auf die größenbedingten Eigenschaften der zu untersuchenden Teilchen beschränkte Informationen zu erhalten, sondern auch Informationen über Eigenschaften ihrer Zusammensetzung und über die Art der Teilchensubstanz (US-PS 3 503 974, 3 502 973). Die bekannten Anordnungen dieser Art arbeiten mit mindestens zwei Stromquellen,, welche beide gleichzeitig die Meßzone speisen, und zwar eine Hochfrequenzquelle und eine Gleichstromquelle mit "Null Frequenz" bzw. mit einer so niedrigen Frequenz, daß der Blindanteil der Teilchenimpedanz einen vernachlässigbaren Einfluß auf die Ansprechempfindlichkeit der Vorrichtung hat. Ein sehr nützlicher Teilchen-Bestimmungsfaktor ist die sog. "Opazität" der Teilchen. Im allgemeinen wird anhand der Opazität der größenmäßige Unterschied der bei Hochfrequenz und der bei Nieder- oder Nullfrequenz gemessenen Größe bestimmt.

Auf dem Gebiet der Zytologie ist jeder neue meßbare Teilchen-Bestimmungsfaktor für die Identifizierung, Untersuchung und Klassifizierung von Teilchen wertvoll. Zellen haben z.B. eine Membran mit einem sehr hohen, im Bereich eines Dielektrikum liegenden spezifischen Widerstand. Der Zellinhalt besitzt jedoch gute Leitfähigkeit, wobei unterschiedliche Zellarten unterschiedliche spezifische Innenwiderstände besitzen. Man nimmt außerdem an, daß auch der pathologische Zustand der Zelle ihren spezifischen Innenwiderstand beeinflußt. Man ist daher bestrebt, diesen spezifischen Innenwiderstand jeder einzelnen Zelle zu messen.

Ein bekanntes Verfahren (US-PS 3 890 568) offenbart das elektrische Feldbild einer Meßöffnung und lehrt außerdem die Messung der Teilchenlänge zum Zwecke der Korrektur unrichtiger Größenmessung bei die Meßzone längenmäßig übertreffenden, länglichen Teilchen.

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Nach diesem bekannten Verfahren läßt sich allerdings die Länge des Teilchens nur dann genau bestimmen, wenn die Teilchenlänge den wirksamen Erfassungsbereich übersteigt, d.h. den Bereich, innerhalb welchem das Teilchen wirksam erfaßt werden kann. Dies ist eigentlich nur dann der Fall, wenn die untersuchten Teilchen wie z.B. Fasern, sortiert werden. Bei den meisten Teilchen, z.B. biologischen Zellen, beträgt die Länge der Meßöffnung ein Vielfaches der Teilchenlänge, selbst wenn die Teilchen durch die mitwirkenden hydrodynamischen Kräfte eine Streckung erfahren.

Nach einem weiteren bekannten Verfahren ("Fast Imaging in Flow: A Means of Combining Flow-Cytometry and Image Analysis" V.Kachel et al., The JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, Vol.27, Νο.1 (1979), S.335-341 = Schnelle Bilddarstellung in der Strömung: Vorrichtung zur Kombination von Durchfluß-Zytometrie und Bildanalyse" ) kann die Gestalt der Teilchen nachträglich untersucht werden, d.h. nach erfolgtem Durchtritt des Teilchens durch die Meßöffnung. Bei dieser Anordnung ist einer Meßöffnung eine Elektronik zugeordnet, die für eine begrenzte, vorbestimmte Untergruppe von Zellen ein Blitzlicht auslöst, um Bilder dieser vorbestimmten Zellen auf einen Film zur anschließenden Speicherung und späteren Untersuchung zu projizieren. Mit dieser Anordnung ist jedoch keine für alle Teilchen erfolgende Zuordnung von Teilchengestalt und gemessenen Volumen möglich. Die Information über die Gestalt läßt sich weder ohne weiteres noch rasch in vom Computer verarbeitbare Größen umsetzen, da es sich letztlich nur um ein Bild auf einem Film handelt. Außerdem sind die Durchflußgeschwindigkeiten auf 5 m/sec beschränkt, wobei lediglich eine Höchstzahl von 150 Bildern pro Sekunde aufnehmbar ist, und dabei eben nur für bestimmte Teilchen. Die üblichen Durchflußgeschwindigkeiten liegen bei 5-10 m/sec und bei einer Zählrate von 1.000 bis 5.000 Teilchen pro Sekunde.

Es wurde auch bereits vorgeschlagen, eine Impedanzmeßöffnung mit einer in Strömungsrichtung nachgeschalteten Erfassungsvorrichtung für Lichtabsorption, Streulicht und Fluoreszenzlicht zu kombinieren (US-PS 3 710 933). Derartige, an der Durchtrittsöffnung strömungsmäßig nachgeschalteten Stellen vorgenommene optische Messungen liefern aber nicht die für die Erfindung er-

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forderlichen Informationen. Nach anderen bekannten Anordnungen werden die Impedanz und die obenerwähnten optischen Signale in optisch klaren Durchflußzellen gleichzeitig gemessen. Obwohl die Streulichtmuster von der Teilchenform beeinflußt werden, ist dieser Effekt nur mit Hilfe sehr komplizierter Geräte erfaßbar und bestimmbar, und auch nur mit begrenzter Genauigkeit, da er einerseits von Streulicht überdeckt wird, welches von einem in erster Linie von der Teilchengröße herrührenden reflektiertem Licht stammt und außerdem von gebrochenem Licht, das in erster Linie von den Durchlässigkeitseigenschaften des Teilchens, d.h. von Absorption und Brechungsindex, und von seiner Größe abhängt.

Außerdem gibt es auch zahlreiche Lichtspalt-Verfahren zur Analyse von Teilchen mit Hilfe eines schmalen Strahlenganges. ("Imaging in Flow", D.B.Kay et al., in THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, Vol.27, No. 1(1979), S.329-334).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, die es ermöglichen, den spezifischen Widerstand jedes Teilchens direkt zu messen.

Die Erfindung löst diese Aufgabe mit den Merkmalen der Patentansprüche 1 und 8.

Die vorliegende Erfindung sieht ein Teilchenerfassungsverfahren und eine entsprechende Vorrichtung vor, wonach die in einem Flüssigkeitsstrom suspendierten Teilchen hydrodynamisch fokusiert durch eine die Impedanz messende öffnung geschickt werden. Eine Niederfrequenzstromquelle versorgt die Meßöffnung mit Strom, um ein erstes Impedanzsignal zu erzeugen, welches im wesentlichen die Teilchengröße darstellt. Eine mit der öffnung verbundene Hochfrequenzstromquelle erzeugt ein zweites Impedanzsignal, welches im wesentlichen den Innenwiderstand des Teilchens darstellt, welcher wiederum abhängig ist von Größe, Gestalt, Ausrichtung und spezifischem Innenwiderstand des Teilchens. Die exakten Form- und Voluraenmessungen gestatten es,aus den im zweiten Impedanzsignal enthaltenen Meßwerten des Innenwiderstandes eine genaue Bestimmung des spezifischen Teilchenwiderstandes abzu-

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leiten. Die Bestimmung des spezifischen Widerstandes jeden einzelnen Teilchens stellt einen wertvollen und neuartigen Bestimmungsfaktor für die Analyse und Erkennung biologischer Zellen dar.

Bei den bisher bekannten Anordnungen konnte das zweite Impedanzsignal zwar zur Messung des Teilcheninnenwiderstandes herangezogen werden, aber diese Messung hat an sich keinen Wert, da die Messung des Innenwiderstandes sich nicht nur mit dem spezifischen Innenwiderstand des Teilchens verändert, sondern auch mit dessen Größe, Gestalt und Ausrichtung. Man konnte zwar mit den bekannten Anordnungen auch die beiden Impedanzsignale zur Messung der Opazität des Teilchens verwenden, aber auch dieser Meßwert erlaubt keine unmittelbare Aussage, da die Messung der Opazität wesentlich von der Gestalt, der Ausrichtung und dem spezifischen Innenwiderstand des Teilchens abhängt. Vorrichtung und Verfahren nach der Erfindung halten die länglichen Teilchen während der gesamten Signalerzeugungsphase längs eines vorbestimmten Durchtrittsweges stets in gleicher Ausrichtung. Die neuartige Kombination der drei erzeugten Signale ermöglicht dann eine exakte Ableitung des spezifischen Innenwiderstandes der Teilchen, der bisher mit keinem der bekannten Durchflußsysteme erhältlich war. Damit stellt die Erfindung der Zytologie einen neuen, wertvollen Bestimmungsfaktor zur Verfügung.

Nach einer neuartigen.Unterkombination der Vorrichtung und des Verfahrens nach der Erfindung wird eine optische Erfassungseinrichtung zur Bestürmung der Durchgangsdauer des Teilchens und damit der Teilchenlänge verwendet. Diese neuartige Dnterkombination ermöglicht es, allein anhand des ersten Impedanzsignals und des Signals für die Durchgangsdauer den Formfaktor, das wahre Volumen und die verformte oder natürliche Teilchengestalt zu bestimmen.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

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Nachfolgend wird die Erfindung anhand der in der Zeichnung dargestellten Ausführungsformen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 eine Teilchenerfassungsvorrichtung, teilweise
in Seitenansicht, im Schnitt und teilweise als schematisches Diagramm;

Fig. 2 ein elektrisches Schema einer biologischen Zelle sowie ihrer Suspensionsflüssigkeit.

Die in Fig. 1 dargestellte Teilchenerfassungsvorrichtung 10 weist ein Probenzuführrohr 12, ein das Rohr 12 koaxial umgebendes Mantelrohr 14 und eine mikroskopische Durchflußöffnung 16 am Ende des Mantelrohres 14 auf. Ein von einer (nicht dargestellten) unter Druck stehenden Vorratsquelle zugeführter Flüssigkeitsstrom mit darin einzeln suspendierten Teilchen bewegt sich durch das Rohr 12. Durch das Rohr 14 fließt ein von einer zweiten unter Druck stehenden (nicht gezeigten) Quelle gelieferter laminarer Hüllstrom, der den Teilchenstrom umgibt. Bei Austritt aus dem Rohr 12 verengt sich der Durchmesser des Teilchenstroms durch hydrodynamische Druckkräfte, sobald der Teilchenstrom die Geschwindigkeit des Hüllstroms erreicht hat. Der Hüllstrom dient auch zur Zentrierung des Teilchenstromes, so daß die Teilchen die öffnung 16 längs der Mittelachse 18 durchwandern und etwaige länglich
geformte Teilchen mit ihrer Längsachse zur Mittelachse 18 ausgerichtet sind. Die aus der öffnung 16 tretenden Teilchen gelangen in eine Flüssigkeit enthaltende Durchflußkamtier 20, welche teilweise von einer optisch klaren Küvette 22 umgeben ist.
Diese Küvette 22 ist wiederum von einem Metallgehäuse 24 umgeben. Die Durchflußkammer 20 enthält vorzugsweise einen zweiten Hüllstrom, der über ein Einlaßrohr aus Metall 26 zugeführt wird.

Da an der öffnung 16 ein Druckabfall auftritt, ist der zweite
Hüllstrom dazu gedacht, ausreichende hydrodynamische ■ Druckkräfte zu erzeugen, um etwaige länglich geformte Teilchen mit
ihrer Längsachse zur Mittelachse 18 ausgerichtet zu halten und Teilchen durch die Durchflußkammer 20 und die Austrittsdüse 27

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zu tragen. Die vom zweiten Hüllstrom erzeugten hydrodynamischen Druckkräfte gewährleisten, daß für etwaige, bei ihrem Durchtritt durch die öffnung 16 verformte Teilchen auch während der anschließenden, noch zu beschreibenden optischen Erfassung derselbe Verformungsgrad erhalten bleibt. Der Aufbau dieser Teilchenerfassungsvorrichtung ist an sich bekannt und im einzelnen in der US-Patentschrift 3 710 933 beschrieben. Diese Anordnung ist hier jedoch etwas abgewandelt durch den Einbau einer strömungsverzögernden Trennwand 28, welche die mit Flüssigkeit gefüllte Kammer 20 von einer luftgefüllten Kammer 29 trennt. Obwohl die Teilchen die öffnung längs der Mittelachse 18 durchwandern, sind auch andere Durchtrittsbahnen denkbar. Zum Beispiel läßt siah der Teilchenstrom auch auf einer vorbestimmten, unter einem Winkel zur Mittelachse 18 durch die öffnung 16 verlaufenden Bahn 16 führen. Wesentliche gemeinsame Bedingung aller denkbaren Durchtrittsbahnen ist, daß die hydrodynamischen Druckkräfte die Längsachse der Teilchen stets zur vorgesehenen Durchtrittsbahn ausgerichtet halten müssen, unabhängig davon, ob die Durchtrittsbahn auf oder außerhalb der Mittelachse 18 verläuft.

Von einer Lichtquelle 30, vorzugsweise ein Rotlaser, wird ein kollimierter Lichtstrahl 32 auf eine erste zylindrische Linse 34 geworfen. Die zylindrische Linse 34 richtet den Strahl zu einem "spalt"förmigen Strahlengang 36 aus, welcher auf einen horizontal ausgerichteten Strich-Brennpunkt 38 auf der Mittelachse 18 gelangt. Nach seinem Durchgang durch den Strich-Brennpunkt 38 wird das Licht durch einen Dämpfer 39 aufgefangen. Das hier als einzelne Lichtstrahlen 41 gezeichnete Streulicht wird von einer Detektorvorrichtung 42, vorzugsweise einem Fotodetektor 42, erfaßt. Mit dieser Anordnung läßt sich die Dauer des Durchgangs jedes einzelnen Teilchens bestimmen. Die Lichtstreuung wird durch das vordere Ende eines Teilchens ausgelöst und hält so lange an, bis das rückwärtige Ende des Teilchens den Strahlengang passiert hat. Der Strich-Brennpunkt 38 liegt genau unterhalb der öffnung 16, so daß die hydrodynamischen KräfteVerformte oder von Natur aus länglich gestaltete Teilchen stark genug sind, um die Ausrichtung und etwaige Verformung der Zelle auch während des

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Durchgangs durch den Strich-Brennpunkt 38 beizubehalten. Der Abstand zwischen der öffnung 16 und der Auslaßdüse 27 ist in Fig. 1 zum besseren Verständnis der optischen Messung übertrieben wiedergegeben. Obwohl die Impedanzmessung und die optische Erfassung an verschiedenen Stellen der Mittelachse 18 erfolgen/ könnten sie bei Verwendung bekannter lichtdurchlässiger Durchflußzellen auch gleichzeitig erfolgen. Das von der Detektorvorrichtung 42 erhaltene Signal wird in einer Impulsdauerschaltung 43 bekannter Bauart zu einem Signal verarbeitet, welches die Zeitdauer darstellt, während der sich ein Teil des Teilchens im Strahlengang 36 befand, d.h. seine Durchgangsdauer. Diese Schaltung ist an sich bekannt (US-PS 3 890 568). Da sich die Geschwindigkeiten der Teilchen bei ihrem Durchgang durch den Strich-Brennpunkt 38 bestimmen lassen, kann mit Hilfe eines Digitalcomputers 44 die Durchgangsdauer jeden Teilchens der Länge seiner Längsachse zugeordnet werden.

Das Probeneinlaßrohr 12, welches aus leitendem Material hergestellt ist, dient in der bevorzugten Ausführungsform als der Impedanzmeßöffnung 16 vorgeschaltete Elektrode. Das ebenfalls aus leitendem Material bestehende Einlaßrohr 26 dient als in Strömungsrichtung gesehen der öffnung 16 nachgeschaltete Elektrode. Das Mantelrohr 14 besteht aus nichtleitendem Material. Die öffnung 16 ist in einer am Ende des Mantelrohres 14 angeordneten Saphir-Membran 45ausgebildet. Da die öffnung 16 die einzige Flüssigkeitsverbindung zwischen dem Rohr 12 und dem Rohr 26 darstellt, wird in der öffnung 16 ein elektrisches Feld erzeugt. Nach einer bekannten Anordnung sind eine Niederfrequenz-Stromquelle 46 und eine Hochfrequenz-Stromquelle 48 über einen Leiter 50 elektrisch mit dem Probeneinlaßrohr 12 und über einen Leiter 52 mit dem Einlaßrohr 26 verbunden, an welchem Massepotential anliegt. Die Niederfrequenz-Stromquelle 46 liefert Gleichstrom mit "Null Frequenz" bzw. einen Strom mit einer so niedrigen Frequenz, daß bei typischer Durchtrittsdauer der Teilchen die Blindkomponente der Teilchenimpedanz eine vernachlässigbare Auswirkung auf die Ansprechempfindlichkeit der Vorrichtung 10 hat.

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Einziges Kriterium ist, daß die bei Durchtritt von Teilchen durch die öffnung 16 unter Verwendung einer Niederfrequenz-Stromquelle erhältlichen Signale in erster Linie proportional der Teilchengröße sind. Gleichzeitig mit dem von der Quelle 46 gelieferten Strom fließt durch die öffnung 16 von der Quelle 48 Hochfrequenzstrom mit z.B. im Funk Spektrum oder höher liegender Frequenz. Jede der beiden Quellen 46 und 48 erzeugt bei Durchtritt eines Teilchens durch die öffnung 16 typische «,getrennt erfaßbare Signale, wobei das Niederfrequenzsignal (L.F.) fast gänzlich auf der Größe des Teilchens beruht, und das Hochfrequenzsignal (R.F., oberhalb 1 MHz) nicht nur auf der Größe beruht, sondern auf den kombinierten Auswirkungen von Größe, Gestalt, spezifischen Widerstand und Blindwiderstand. Die erhaltenen Signale werden über Leiter 50 und 52 einer üblichen Erfassungseinrichtung 54 zugeführt. Diese besteht aus einer Detektorvorrichtung 56 für die RF Signale und einer Detektorvorrichtung 58 für die LF Signale, wobei beiden Detektorvorrichtungen 56 und 58 die Signale über die Leiter 50 und 52 zugeführt werden. Das von der Detektorvorrichtung 58 erzeugte erste Impedanzsignal S (LF) ist in erster Linie auf die Größe der Teilchen bezogen. Zu dieser Detektorvorrichtung gehören Verstärker, Filter und andere bekannte Schaltungsanordnungen, wie sie beim handelsüblichen Coulter Counter vorgesehen sind, und noch zusätzliche Vorrichtungen, wie z.B. ein Tiefpassfilter um zu verhindern, daß R.F.-Signale den Stromkreis beeinträchtigen. Beträgt die Niederfrequenz nicht Null, dann ist auch eine Demodulierschaltung eingebaut. Die Detektorvorrichtung 56 schließt eine Amplitudenmodulations-Erfassungsvorrichtung als Demodulatorstufe für das R.F.Signal ein, welche ein impulsförmiges zweites Impedanzsignal S_._ erzeugt. Diese Detektorvorrich-

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tung 56 kann Filter, Verstärker, Demodulatoren und andere bekannte Schaltungen einschließen. Der Aufbau der Stromquellen 46 und 48 der Detektorvorrichtung 54 ist allgemein bekannt (US-PS 3 502 974 und 3 502 973). Die luftgefüllte Kammer 29 schafft einen Luftspalt zwischen der elektrolytischen Lösung oberhalb der öffnung 16 und der elektrolytischen Lösung unterhalb der öffnung 16, wodurch Hochfrequenzstromverluste reduziert werden.

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Der Computer stellt das erste Impedanzsignal S (LF), das zweite Impedanz signal S (RF) und das von der Impulsdauerschaltung 43 gelieferte Durchgangsdauersignal digital dar, ordnet Teilchen für Teilchen zu und speichert sie. Bei der bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erzeugung der optischen Signale an einer Stelle unterhalb der Stelle, an der die Impedanzsignale erzeugt werden. Zwischen den früher erzeugten ersten und den zweiten Impedanzsignalen und der Erzeugung des Längensignals besteht daher eine Zeitverzögerung. Die Speicherfähigkeit des Digitalcomputers 44 berücksichtigt diese Zeitverzögerung und ermöglicht es, die drei Signale jedem Teilchen zuzuordnen.

Als Alternative kann auch eine festverdrahtete Schaltungsanordnung verwendet werden, um die Impedanzsignale zu verzögern und die Zuordnung der drei Signale zu ermöglichen.(US-PS 3 976 862). Zur besseren Veranschaulichung der vom Computer 44 durchgeführten Berechnungen ist dieser in eine erste Speicher-, Zuordier- und Rechnereinheit 60 und eine zweite Speicher-, Zuordner- und Rechnereinheit 62 unterteilt. Eiie festverdrahtete Schaltungsausführung des Computers 44 ist möglich und weist diese getrennten Einheiten auf. Vorzugsweise wird jedoch der Digitalcomputer 44 mit gespeicherter Programmsteuerung verwendet. Der Rechnereinheit 60 wird das Impedanzsignal (S(LF) und das Durchgangsdauersignal t zugeführt, und aus diesen Signalen berechnet sie die Gestalt jeden Teilchens und modifiziert das Impedanzsignal S(LF), um einen wahren Volumenraeßwert V und einen Meßwert für das Verhältnis Länge zu Breite (a/b) für jedes Teilchen zu erhalten. Die Rechnereinheit 60, welcher das Impedanzsignal S(RF) nicht zugeführt zu werden braucht, erzeugt ein Solches wertvolles Ausgangssignal, da die ImpedanzSignale S(LF) so korrigiert werden können, daß das wahre Volumen V erhältlich ist und das Längen-Breitenverhältnis a/b der Teilchenverformung entspricht. Außerdem sieht die Erfindung eine neuartige optische Erfassungsvorrichtung vor, die einen spaltförmigen Lichtstrahlengang 36 zur Bestimmung des Durchgangsdauersignals t verwendet. Die Einheit 60 berechnet auch den Formfaktor f aus dem Durchgangsdauersignal t und dem Impedanzsignal S(LF) und gibt diesen an die Rechner einheit 62 weiter. Damit wird der Einheit 62 für jedes Teilchen eine neuartige Kombination von Signalen zugeführt, nämlich das Impedanzsignal S(RF), das

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Impedanzsignal S(LF) und ein Formfaktor f, welcher wiederum aus dem Impedanzsignal S(LF) und dem Durchgangsdauersignal t von der Einheit 60 errechnet wurde. Die Einheit 62 setzt die Signale digital um, ordnet sie Teilchen für Teilchen zu und speichert sie. Aus der neuartigen Kombination aller drei Eingangssignale kann die Einheit 62 den spezifischen Innenwiderstand β . für jedes Teilchen berechnen. Ein Zuordner 64 ordnet das wahre Volumen V den Verhältnis-Meßwert a/b und den spezifischen Innenwiderstand ρ . jedem einzelnen Teilchen zu, und ein Leser 66 druckt die erhaltenen Daten aus und/oder stellt sie dar. Die mathematischen Grundlagen für diese Berechnungen werden nachfolgend noch erläutert.

Obwohl die vorliegende Erfindung für Teilchen im allgemeinen gedacht ist, ist mit der Bezeichnung "Teilchen" insbesondere an von einer Membran umhüllte Teilchen gedacht, d.h. an sog. Zellen. Zellen können z.B. biologische Zellen oder künstliche membranumhüllte Zellen sein.

Fig. 2 zeigt ein bekanntes Schaltschema zur elektrischen Darstellung einer Zelle und der sie umgebenden Suspensionsflüssigkeit und ist hier lediglich als Analoghilfe zum besseren Verständnis gedacht. Die Zelle ist als gestrichelter Umriß 68 dargestellt. Die verschiedenen elektrischen Widerstandswerte R in Ohm, die noch beschrieben werden, lassen sich mittels bekannter Formeln auf die spezifischen elektrischen Widerstände der angegebenen Substanzen oder Lösungen beziehen.. Der spezifische Widerstand^) , der der Reziprokwert zur Leitfähigkeit p ist, wird im allgemeinen in Ohm/Zentimeter gemessen. Die spezif ischaa Widerstandswerte fit, /⁰Ii,, A· bezeichnen den spezifischen Widerstand der die Zelle umgebenden elektrolytischen Supensionsflüssigkeit, der Zellmembran und der inneren Bestandteile der Zelle. Eine Schaltung 70 besteht daher aus einer Reihenschaltung eines Widerstandes R1 (p_e) , Widerstand R2 (p_t) und eines Widerstands R3(^), welche jeweils einen Teil der Suspensionsflüssigkeit darstellen. Parallel zum Widerstand R2(o_e) ist ein die Zelle darstellender Kreis 72 geschaltet. Dieser Kreis 72 schließt zweifach in Reihe die Impedanz der Zellmembran ein, wie durch die Parallelschaltung eines Widerstandes R4(A₎₁) und einer Kapazität Cl sowie eines Wider-

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stands R5(n_M) und eine Kapazität C2 darstellt, wobei die beiden Impedanzen als gleich angenommen werden.

Zwischen den beiden Impedanzen liegt ein Innenwiderstand R6{p.) in Reihe. Dieser Innenwiderstand Ro(P₁) hat sich für die Untersuchung von Zellen als sehr wichtig herausgestellt. Die vorbestimmte Durchtrittsbahn 74 ist hier mit der Längsachse der Zelle ausgerichtet dargestellt. Bei dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel würde die vorgesehene Durchtrittsbahn entlang der Mittelachse 18 verlaufen. Der Stromfluß wird als parallel zur vorgesehenen Durchtrittsbahn 74 angenommen. Zum besseren Verständnis sei nun eine Drehung der Zelle angenommen. Wenn die Zelle eine Längsachse besitzt und diese fortschreitend sich winklig zu der vorgesehenen Durchtrittsbahn 74 verlagert, verringert sich auch der Innenwiderstand R6(jO.) fortschreitend. Es hat sich gezeigt, daß alle Zellen zum Zeitpunkt der Messung gleich ausgerichtet sein müssen, um den Widerstandswert R6(p.) der einzelnen Zellen vergleichen zu können. Aus diesen an einem hier nicht weiter besprochenen Analogmodell angestellten Überlegungen ergibt sich, daß die Messung des spezifischen Zellenwiderstands ρ. von der Gestalt der Zelle und ihrer Ausrichtung abhängig ist. Daher muß die wahre Zellgestalt ermittelt und die Ausrichtung beibehalten werden, um den spezifischen Innenwiderstand der Zelle aus den gemessenen Parametern berechnen zu können. Dies wird durch die Tatsache erschwert, daß der spezifische Widerstand /Q^₁ der Membran größenmäßig den spezifischen Innenwiderstand/0 . bei weitem übersteigt, obwohl dieser normalerweise größer ist als der spezifische Widerstand /0_ß der Suspensionsflüssigkeit.

Die neuartige Signalkombination gestattet es, mit der Vorrichtung 10, den spezifischen Innenwiderstand Ω .Zelle für Zelle zu bestimmen. Die mathematischen Grundlagen zur Bestimmung des spezifischen Innenwiderstands bzw. seines Umkehrwerts, der inneren Leitfähigkeit Ol werden nachstehend erläutert.

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Wie ersichtlich., lassen sich der Formfaktor f, der spezifische Innenwiderstand P₁, oder sein Umkehrwert, die Leitfähigkeit σ, bestimmen. Zusätzlich kann äas Impedanzsignal S (LF) so korrigiert werden, daß es das wahre Volumen V wiedergibt. Das Impedanzsignal S(LF) läßt sich mit folgender Gleichung über den Faktor f auf das wahre Volumen V' beziehen:

(LF)fef;v_p-E(LF)

Mit folgender Gleichung läßt sich das Impedanzsignal S(RF) auf das wahre Volumen V über den Formfaktor f beziehen:

Die Opazität Op erhält man wie folgt:

(3) -Qp =

E(RF)

S(UF) [KPe/AHf-1)]-E(LF)

Nachstehend wird ein Verfahren zur Ableitung der Gleichungen (1) und (2) beschrieben. Man gdht davon aus, daß das Teilchen eine verlängerte Ellipsoid-Gestält besitzt. Es wird nun die Laplace-Gleichung für die Ellipsoidkobrdinaten des Teilchens gelöst, wobei die lange Achse des simulierten ellipsoidförmigen Teilchens die Koordinatenachse ζ bestimmt, welche parallel zum elektrischen Feld und zum Stromfluß in der Meßöffnung verläuft. Zunächst kann man den Green¹ sehen Lehrsatz, der ein Volumenintegral als Flächenintegral liefert, wie folgt schreiben, wobei keine Ladung vorhanden ist*

wobei 0 die eingegrenzte Pötentialverteilung außerhalb des Teilchens ist und η ein zur Oberfläche s nach außen senkrechter Vek-

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tor. Die Fläche der Meßöffnung 16 wird dann integriert und ergibt folgendes Flächenintegral:

cs> £=ψ ·Ε·ν_ο = 5(Ε)·ν_ο

wobei Δ R die Änderung des Widerstands R der Meßöffnung bei Durchtritt eines Teilchens ist, E die elektrische Feldstärke an jedem Punkt innerhalb der Meßöffnung, ν das wirksame Öffnungsvolumen und S(E) das gemessene Impedanzs.ignal. Das an der Oberfläche des Teilchens anliegende Potential läßt sich durch die Lösung der Laplace¹sehen Gleichung erhalten, mit den Grenzbedingungen, daß an der Membran ein Potential anliegt, und daß durch die Membran stetiger Stromdurchgang erfolgt. Es bestehen dann folgende Beziehungen:

wobei ξ -j ,"ξ £ und ^₃ die Ellipsoidkoordinaten sind. Die anderen Glieder der Gleichung lassen sich wie folgt definieren:

-OO (9)

do) R(u) = [(u+a²) - (u + b²) · (u+c²)] 130036/0531

i 2

wobei a die lange, b die kurze und c die lange Halbachse des verlängerten Ellipsoid darstellen. Die Bezeichnung u steht für eine verallgemeinerte Koordinate. Das Glied CX₁= dem Flächenintegral des Teilchens geteilt durch 4 γ und ergibt:

dl)

(X .j ist wiederum durch die" entsprechenden Grenzbedingungen für die Bestimmung des Potentials innerhalb und außerhalb der Zelle zu definieren.

-f 'Vr

(12) CX =

¹ ATC

(13)

ώ=ά+Φ =0

-Ze -^r* -'η

α«)

(15)

du .F²Qi)-

f-l

»b-cT du ² 4 F²(u) · RM

21 -

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Hierbei stellen /O. und ρ den spezifischen Innenwiderstand bzw. spezifischen Außenwiderstand der Zelle dar, V bezeichnet das Potential der Membran (gekennzeichnet durch den unteren Index "m") an den Polen (gekennzeichnet durch den oberen Index "o") des mit der Stromflußrichtung ausgerichteten Ellipsoids. Es sind nun die Grenzbedingungen für die Gleichung (14) zu prüfen. Die erste Grenzbedingung ist das Zuschalten der Niederfrequenz-Stromquelle 46, welche in der öffnung 16 ein elektrisches Feld E(LF) erzeugt. Man erhält folgendes Ergebnis:

(16) V&=f-a.E(LF)

wobei S(E) = S(LF) und E = E(LF)
Folglich:

(17) S(LF) =*·(%)· E(L F)

Bezogen auf die Figuren 1 und 2 bedeutet die erste Grenzbedingung, daß bei Zuschaltung der Niederfrequenzstromquelle 46 die Kapazitäten C1 und C2 eine so hohe Impedanz erzeugen, daß sie im wesentlichen als offene Stromkreise wirken. Daher ist der Innenwiderstand einer Zelle wegen des hohen spezifischen Widerstands der Membran nicht erfaßbar. Die zweite Beschränkung für die Gleichung (14) ergibt sich bei Zuschalten der Hochfrequenzstromquelle 48, welche in der öffnung ein elektrisches Feld E(RF) erzeugt. Ist die Frequenz hoch genug, z.B. 30 MHz, so erhält man folgendes Ergebnis:

^vm ^u I

wobei S(D) - S(RF) und E = E(RF)
Damit ergibt sich:

α« S(RF)=f

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'- 22 -

Bezogen auf die Figuren 1 uhd 2 bedeutet diese zweite Grenzbedingung, daß bei Zuschältung der Hochfrequenzstromquelle 48 die Kapazitäten C1 und C2 im wesentlichen kurzschließen und als Shunts zu den sehr hohen Widerständen der Membran wirken. Daher läßt sich dann der spezifische Innenwiderstand der Zelle ohne weiteres messen. Berechnet irian nun die Opazität, so ergibt sich folgende Beziehung:

_S(RF)_

(20) Op= ,. .

S(LF)

In der Gleichung (20) sind alle Variablen bekannt, mit Ausnahme desFormfaktors f und des spezifischen Innenwiderstands ^O.. Wenn man also den Formfaktor f bestimmen kann, kann der spezifische Innenwiderstand Ω . errechnet werden. Dies läßt sich durch Entwicklung der nachstehenden Beziehungen bewerkstelligen. Das wahre Volumen ν der Zelle uhd die Länge a werden auf den Formfaktor

f, bei dem die:kurzen...Halbaahsen b und c gleich sind, durch folgende Gleichungen bezogen:

(21) b =

(22) m= (23)

f-l =

m'

nvcosh m ο 3

for ro >

Somit liefern die Gleichungen (17) und (23) gleichzeitig zwei nicht lineare Gleichungen zur Lösung des Formfaktors f und des wahren Volumens V . Zur Berechnung dieser beiden Ausdrücke sind lediglich das Impedanzsighal S(LF) und das Durchgangsdauersignal t für die Teilchenlänge,a erforderlich. Die Gleichung (21) geht

13 0036/0531 GRlGlNALiNSPECTED

davon aus, daß das Teilchen Ellipsoidgestalt besitzt. Wie in Fig.1 gezeigt, werden der Formfaktor f und das wahre Volumen V · in der Rechnereinheit 60 errechnet. Sobald der Formfaktor f aufgelöst ist, läßt sich die Gleichung (20) durch die Rechnereinheit 62 auflösen und der spezifische Innenwiderstand p für jede Zelle erhalten. Diese Berechnung erfordert die Zuführung des"Impedanzsignals S(RF), des Impedanzsignals S(LF) und des Formfaktors f.

Ein anderes elektronisches Verfahren zur Bestimmung der Länge der Längsachse von Teilchen wurde beid.ts genannt (US-PS 3 793 587), Obwohl die vorliegende Erfindung eine neuartige optische Erfassungseinrichtung zur Bestimmung der Teilchenlänge vorsieht, ist die Bestimmung der Längsachse länglicher Teilchen auch nach diesem bereits erwähnten Verfahren mit der doppelten Meßöffnungsanordnung durchführbar, wenn auch mit geringerer Genauigkeit. Hat man einmal die Teilchenlänge, sei es mit der bekannten Erfassungselektronik oder mit der neuen optischen Erfassungselektronik, ermittelt, dann ermöglicht die neuartige Kombination der Eingangssignale, d.h. des Impedanzsignals S(LF), des Impedanzsignals S(RF) und der Teilchenlänge die Bestimmung des spezifischen Innenwiderstandes ρ. der Zelle. Bei der bekannten doppelten Meßöffnungsanordnung besitzt die eine öffnung eine axiale Länge in der Größenordnung der Teilchenlängen oder ist etwas kleiner als diese. Die Dauer des vora Teilchen erzeugten Impulses entspricht der Teilchenlänge. Mit dem in den Ansprüchen verwendeten Begriff "Erfassungsvorrichtung" sind somit sowohl die optische Erfassungsvorrichtung, wie z.B. der spaltförmige Strahl 36 als auch elektronische Erfassungsvorrichtungen, wie z.B. die bekannte öffnung mit kurzer axialer Länge gemäß der doppelten Meßöffnungs-Anordnung gemeint.

Die von den Teilchen hervorgerufenen elektrischen Veränderungen treten innerhalb der Wirkgrenzen der öffnung 16 auf, welche als Meßzone oder Tastbereich bezeichnet werden. Es ist bekannt (US-PS 3 890 568) , daß sich die Meßzone über die axiale Länge der öffnung 16 wesentlich hinaus erstreckt. Bei der vorliegenden Anmel-

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dung wird davon ausgegangeil; daß die Meßzone den Bereich um die öffnung 16 mit einschließt -_t in welchem die elektrische Feldintensität mindestens ein Prozent oder mehr der Intensität im Mittelbereich innerhalb der öffnung 16 beträgt.

Bie bekannte Durchflußanoräriung mit der Durchflußkammer 20 nach der US-PS 3 710 933 stellt natürlich nur ein mögliches Ausführungsbeispiel für die vorliegende Erfindung dar, die hierauf in keiner Weise beschränkt ist=

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung läßt sich jede Durchflußvorrichtung verwenden, in der Teilchen hydrodynamisch fokusiert durch eine Impedanzmeßöffnäng geschickt werden.

itentanwSifa

·^E-

;ί·ΐ34

ORIGINAL INSPECTED

130036/0531

Claims

Patentanwalt· 3 O A 3 8 1 4

Dipl.-ing. E. Edef
DIpI.-Ing. K. Schleschlc*
•München 40, EllsabethstreBe34

COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah/Florida

Teilchenerfassungsvorrichtung und -verfahren

Patentansprüche :

("I .JTeilchenerfassungsvorrichtung mit einer Meßöffnung zur Messung der Impedanz von in einer Flüssigkeitsströmung einzeln suspendierten Teilchen, einer Fokusiervorrichtung für den' Teilchenstroip, um die Teilchen hydrodynamisch fokusiert auf einer vorbestimmten Bahn durch die Meßöffnung zu bewegen und mit einer ersten elektrischen Stromquelle, welche der Öffnung elektrischen .Strom niedriger Frequenz unter Erzeugung eines ersten Impedanzsignals zuführt, gekennzeichnet durch einen Signalgeber, vorzugsweise einen optischen Signalgeber (30, 34, 39, 40, 42. 43) zur Erzeugung eines die Länge jeden Teilchens darstellenden Längensignals (t) und durch eine Vorrichtung (44) zur Zuordnung des Längensignals zu dem entsprechenden ersten Impedanz signal (S₇. _) ,

JjJc

wobei durch die Erzeugung und Zuordnung dieser Signale alle für die Berechnungen der Teilchengestalt erforderlichen Parameter erhältlich sind.

130036/0531 _c^_TPn

ORIGINAL INSPECTED
2. Teilchenerfassungsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Signalgeber als optischer Signalgeber (3O_r 34, 49, 40,-42, 43) ausgebildet ist, welcher einen durch einen Spalt tretenden Lichtstrahlengang (36) erzeugt, durch welchen jedes Teilchen während seiner hydrodynamischen Fokusierung erfaßbar und ein die Dauer des Teilchendurchgangs durch den schmalen Strahlengang darstellendes Längensignal (t) erzeugbar ist.
3. Teilchenerfassungsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Signalgeber als optischer Signalgeber (30, 34, 39, 40, 42, 43) oder als ein die Impedanz messender Signalgeber ausgebildet ist, daß die öffnung (16) von einer zweiten Stromquelle (48, 56) mit Hochfrequenzstrom versorgt wird, welcher ein zweites elektrisches Impedanzsignal (S_.„) erzeugt und daß eine Vorrichtung (44) vorgesehen ist zur Zuordnung des ersten Impedanzsignals (S_LF), des zweiten Impedanzsignals (S„_) und des Längensignals (t) jeden Teilchens

Kr

um den spezifischen Innenwiderstand ( a .) jeden Teilchens zu bestimmen.
4. Teilchenerfassungsvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Rechneranordnung (60) zur Berechnung eines Formfaktors (f) aus dem ersten Impedanzsignal (S-_) und dem Längensignal (t) jeden Teilchens.
5. Teilchenerfassungsvörrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Rechneranordnung (60), mit welcher mittels des ersten Impedanzsignals (S__F) und des Längensignals (t) der vom ersten Impedanzsignal hergeleitete Größenmeßwert unter Berücksichtigung der Teilchengestalt korrigierbar und der echte Volumenwert (V ) jeden Teilchens ermittelbar ist.
6. Teilchenerfassungsvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Rechneranordnung (60) das als Bestimmungsfaktor für die Teilchengestalt dienede Verhältnis (a/b) von Länge und Breite des Teilchens errechenbar ist.

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30438H
7. Teilchenerfassungsvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden Teilchen Zellen sind.
8. Verfahren zur Teilchenerfassung, bei welchem in einem Flüssigkeitsstrom einzeln suspendierte Teilchen hydrodynamisch fokusiert durch eine öffnung zur Messung der elektrischen Impedanz bewegt werden, wobei ein durch die öffnung fließender Niederfrequenzstrom eine erste elektrische Meßgröße für die Impedanz liefert, gekennzeichnet durch eine vorzugsweise optische Messung der Länge jeden Teilchens während seiner hydrodynamischen Fokusierung und durch Zuordnung der ersten Impedanzmeßgröße zur Teilchenlängenmeßgröße zur Ermittlung von Informationen über die Teilchengestalt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine jeweils elektronische oder optische Messung jeder Teilchenlänge, wobei ein Hochfrequenzstrom durch die öffnung fließt und ein zweites elektrisches Impedanzmeßsignal liefert, und durch Zuordnung des ersten Impedanzsignals, des zweiten Impedanzsignals und des Längenmeßwertes jeden Teilchens zur Berechnung des spezifischen Innenwiderstandes jeden Teilchens.

•ntanwitte

ing. E. Edef

Dlpl.-lrfa.K/SWhieschke

8Mönchen\o, Ellsaboth3tra8e34

130036/0531 - ⁴ -