DE3102621C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Heparinen mit niederem Molekulargewicht und ausgezeichne­ ten pharmakologischen und therapeutischen Eigenschaften, bei dem ein durch Depolymerisation von Heparin erhaltenes Produkt sulfatiert wird.

Heparin ist ein wohlbekanntes und stabiles, einwertiges oder zweiwertiges Salz der instabilen Heparinsäure. Es ist ein Polymerisat aus einer Disaccharideinheit, gebil­ det durch Hexuronsäuren (D-Glukoron- und L-Iduronsäure) und Glukosamin-6-O- und -N-sulfat, verbunden durch alpha-1,4- Glykosidbindungen.

Die Antigerinnungseigenschaften von Heparin sind seit zahlreichen Jahren bekannt, nämlich seit seiner Ent­ deckung und Isolierung aus Geweben im Jahre 1917.

Heparin liegt in unterschiedlichen Formen in zahlreichen Geweben und Zellen vor, und es ist mehr oder weniger lose an eine Proteineinheit gebunden. In der Haut und insbeson­ dere in den Lungen von unterschiedlichen Arten liegt Hepa­ rin in einer hochmolekularen Form vor, welche gegenüber der Wirkung von Ascorbinsäure oder von einigen Enzymen, deren Anwesenheit in der Intestinalschleimhaut angenommen wird, empfindlich ist. Nach der Behandlung mit Sscorbin­ säure oder mit Homogenaten von Intestinalschleimhäuten können diese makromolekularen Formen von Lungen- oder Haut­ heparin zu der gleichen Molekulargröße des Heparins redu­ ziert werden, das aus der Intestinalschleimhaut isoliert werden kann.

Das Heparin, welches aus Intestinalschleimhaut isoliert wurde und ein mittleres Molekulargewicht von 15 000 Dalton be­ sitzt, oder Heparine aus anderen Quellen, welche auf diesen Wert nach irgendwelchen der zuvor beschriebenen, konven­ tionellen Methoden reduziert wurden, stellen Produkte mit minimaler Größe der natürlichen Heparinmoleküle dar. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein solcher Heparintyp als normales Heparin bezeichnet. Tatsächlich existieren im Körper keine Enzyme, welche das Heparin aus Intestinalschleim­ haut in Fraktionen mit niedrigerem Molekulargewicht auf­ spalten könnten, und es wurden auch keinerlei chemische Methoden bislang entwickelt, welche zur Depolymerisierung des normalen Heparinmoleküls ohne Gesamtverlust seiner biologischen Aktivität in der Lage gewesen wären.

Nur bestimmte mikrobielle Enzyme, z. B. Heparinase aus Flavobacterium heparinum, sind in der Lage, das Heparin­ molekül in modifizierte Disaccharideinheiten vollständig zu dissoziieren. Diese Methode wurde bei Strukturunter­ suchungen eingesetzt, hat sich jedoch als ungeeignet her­ ausgestellt, um irgendwelche neuen, biologisch aktiven Moleküle zu gewinnen.

Aus der DE-OS 28 33 898 ist ein Verfahren zur Herstellung von Oligoheteropolysacchariden, bestehend aus einer Heparinfraktion mit Molekulargewichten zwischen 2000 und 5000 bekannt, bei dem Heparin-Oligomere mit den entsprechenden Molekularge­ wichten mit einem Sulfotrioxid einer stickstoffhaltigen organischen Base in alkalischem Milieu behandelt werden. Das Ausgangsmaterial, d. h. die Heparin-Oligomeren mit Mole­ kulargewichten zwischen 2000 und 5000, stammen aus der Depolymerisation von Heparin. Zur Depolymerisation des Heparins wird auf chemische oder enzymatische Methoden hingewiesen.

In Adv. Exp. Med. Biol., 1975, 52 (Heparin), Seiten 119-130, wird über oral aktive niedermolekulare Derivate des Heparins berichtet. Auf Seite 119 wird angegeben, daß durch Elution von Cellulose, Gelfiltration auf Sephadex® oder verschiedene Löslichkeiten in Alkohol-Wasser-Mischungen erhaltene Frak­ tionen einen Molekulargewichtsbereich von 4000-16 000 Dalton aufweisen und eine biologische Aktivität im Bereich von 70 bis 176 I.U. haben. Bei diesen Fraktionen handelt es sich nicht um Heparinfraktionen, die durch Depolymerisation und anschließende Sulfatierung erhalten wurden. Auf Seite 120, Absatz 1, werden die angewandten Materialien und Ver­ fahren beschrieben. Außer dem Abbau des Heparins durch Heparinase werden die Depolymerisation in einer Mischung von Ascorbinsäure und Kupfersulfat in Natriumchlorid und Natriumphosphat bei pH 7,8 sowie die entsprechende Depoly­ merisation genannt, bei der anstelle von Kupfersulfat eine Wasserstoffperoxid-Lösung verwendet wurde.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren der eingangs genannten Art, bei dem Heparin mit niedrigerem Molekulargewicht ohne Gesamtverlust seiner biologischen Aktivität erhalten wird.

Ausgehend von dem eingangs genannten Verfahren wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß Heparin mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 15 000 Daltons durch Behandlung mit Kationenaustauscherharzen angesäuert wird unter Bildung von Heparinsäure und diese Heparinsäure durch Erhitzen in einem Autoklaven in Anwesenheit von Peroxiden depolymerisiert wird unter Bildung von Heparamin mit niedrigem Molekular­ gewicht, das dann zum entsprechenden Heparin mit niedrigerem Molekulargewicht sulfatiert wird.

Ein Schema der Reaktionen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens ist im folgenden dargestellt,

worin < und 7<<22, falls ≈26,7, wobei dies der -Wert ist, welcher Heparin mit ≈ 15 000 D entspricht.

Er berechnet sich wie folgt:

worin 562 der Wert der Disaccharideinheit (der chemischen Formel C₁₂H₁₅O₁₆NS₂Na₃) ist, der durch die zuvor gezeigten Formeln (I) und (IV) dargestellt wird.

Gemäß dem zuvor gegebenen Reaktionsschema zeigt die Formel I das Natriumsalz von normalem Heparin. Aus Gründen der Ein­ fachheit zeigt diese Formel nur D-Glukuronsäure und nicht den Teil des Moleküls, der L-Iduronsäure enthält. In glei­ cher Weise kann ein beliebiges anderes einwertiges oder zwei­ wertiges Kation anstelle des Natriumkations vorliegen.

Dieses Heparin I wird angesäuert, um die freie Säure hier­ von herzustellen, die Heparinsäure der Formel II entsprechend der im Schema gezeigten Stufe a).

Die Heparinsäure der Formel II wird in der Stufe b) unter Verlust der größeren Anzahl von N-Sulfatgruppen und unter Bildung eines Heparamins der Formel III depolymerisiert.

Abschließend wird das Heparamin der Formel III in der Stufe c) unter Rückbildung der N-Sulfatgruppen behandelt, um das Endprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens zu er­ halten, d. h. Heparine der Formel IV, welche als LMW-Hepa­ rine bzw. RD-Heparine definiert werden, wobei LMW niedri­ ges Molekulargewicht und RD rekonstituiert+depolymeri­ siert bedeuten.

Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Heparinsäure aus normalem Heparin I durch Behandlung mit Kationenaustauscherharzen angesäuert.

Die Heparinsäure II wird dann in der Stufe b), der Depoly­ merisationsstufe, behandelt, wobei diese in einem Autoklaven in Anwesenheit eines Peroxids, z. B. von H₂O₂, durch Erhitzen auf einen Druck vorzugsweise zwischen 1 und 2 bar durchgeführt wird und wobei die Autoklaven­ behandlung zu vorher ausgewählten Zeitpunkten gestoppt werden kann, z. B. nach 15, 30, 60, 120 bzw. 240 Minuten. Auf diese Weise ist es möglich, Endprodukte, d. h. - oder RD-Heparine mit unterschiedlichen mittleren Molekulargewichten in einem Bereich annähernd zwischen 12 000 und 4000 D bei Ver­ wendung von normalem Heparin mit von 15 000 D zu erhalten. Die Ausbeuten dieser Depolymerisation sind in allen Fällen gleich, sie betragen etwa 65 Gew.-%. Die Abnahme des mitt­ leren Molekulargewichts wird durch Titration der endständi­ gen, reduzierenden Gruppen nach der Methode von Somogji oder durch Bestimmung der Verminderung der spezifischen Viskosität verfolgt bzw. bestimmt.

Die Produkte der Depolymerisation sind Heparamine III mit niederem Molekulargewicht, wobei das Molekulargewicht hiervon niedriger als dasjenige des entsprechenden Ausgangsheparins I bis zu einem Wert von einem Drit­ tel ist, was von den vorher ausgewählten, unterschied­ lichen Zeiten der Autoklavenbehandlung abhängt.

Da bei dieser Depolymerisationsstufe, wie bereits zuvor beschrieben, der Hauptanteil der an den Stickstoff ge­ bundenen Sulfatgruppen verloren geht, wird das Heparamin III abschließend, d. h. nach dem Abkühlen des Rekationsgemisches und einem Anheben des pH-Wertes, einer Behandlung zur Wieder­ einführung der aktiven Schwefelsäuregruppen zur Herstellung des Endproduktes IV entsprechend dieser Stufe c) nach an sich bekannten Methoden unterworfen, beispielsweise durch Reaktion mit Sulfotrioxiden von stickstoffhaltigen Basen, z. B. Pyridinsulfotrioxid, Trimethylaminsulfotrioxid, usw., und zwar in Anwesenheit von alkalischen Karbonaten, oder durch Reaktion mit Chlorsulfonsäure und stickstoffhaltigen Basen.

Beim Ausbeuten an Endprodukten sind unabhängig von der Be­ handlungszeit im Autoklaven in allen Fällen hinsichtlich des Gewichtes gleich, wenn auf die Menge an Ausgangs­ heparin rückbezogen wird.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Menge von 20 g Natrium- oder Calciumheparin mit einer Antigerinnungsaktivität von 150 IU/mg (IU=Internationale Einheiten) wurde in 100 ml entionisiertem Wasser aufgelöst und auf eine Säule gegeben, welche 100 ml Kationenaustauscher­ harz in der H⁺-Form (Amberlite® IRC 120) enthielt.

Die Säule wurde mit 100 ml entionisiertem Wasser gewaschen, und die Flüssigkeiten wurden aufgefangen. Der pH-Wert der Lösung betrug 1 bis 1,5. 20 ml einer gesättigten Lösung von Wasserstoffperoxid (36%) wurden hinzugegeben, und die Flüs­ sigkeit wurde in einem Autoklaven 15 Minuten bei 1 bar er­ hitzt. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde der pH- Wert mit 2N NaOH auf 7,2 angehoben, dann wurden 16 ml Pyri­ din und 16 g Pyridinsulfotrioxid unter Rühren hinzugesetzt.

Die Reaktion wurde für 12 Stunden fortgeführt, wobei kleine Zugaben von Pyridin zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes zwi­ schen Werten von 5 und 6 erfolgten. Der pH-Wert wurde dann mit NaOH auf 8 angehoben, und die Lösung wurde im Vakuum auf 100 ml unter Entfernung des überschüssigen Pyridins konzentriert. Salze wurden in einer Mischbettionenaustauscher­ säule entfernt, und die Lösung wurde sterilfiltriert und gefriergetrocknet.

Ausbeute=65% in Form eines weißen Pulvers mit einer Anti­ gerinnungsaktivität von 85-100 IU/mg und einem mittleren Molekulargewicht nach der Somogji-Methode von 2/3 des Wertes des Ausgangsmaterials.

Beispiel 2

20 g Natrium- oder Calciumheparin mit einer Aktivität von 150 IU/mg wurden in 100 ml Wasser (entionisiert und steri­ lisiert) aufgelöst und durch Behandlung über einem Kationen­ austauscherharz in der H⁺-Form von den Kationen befreit.

Zu der Lösung mit einem pH-Wert von 1 bis 1,5 wurden 20 ml Peressigsäure als 40%ige Lösung zugesetzt, dann wurde die­ ses Gemisch 60 Minuten bei 1 bar in einem Autoklaven be­ handelt.

Nach dem Abkühlen und dem Erhöhen des pH-Wertes auf 7,2 wurden 20 g Trimethylaminsulfotrioxid+20 g Na₂CO₃ zuge­ setzt. Das Reaktionsgemisch wurde für mehrere Stunden bei einer 60°C nicht übersteigenden Temperatur gerührt, dann wurde es über eine Mischbettionenaustauschersäule (Dowex® Retardion 11 A 8) geschickt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 6 eingestellt, die Lösung wurde abgekühlt und es wur­ den 3 Volumina Ethanol zugesetzt. Der weiße Niederschlag wurde gesammelt, mit Ethanol oder Methanol oder Aceton gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.

Das erhaltene Endprodukt besaß eine Antigerinnungsaktivität von 35 bis 50 IU/mg und einen Wert nach der Somogji- Methode von 1/3 des Wertes des Ausgangsmaterials.

Beispiel 3

Unter Wiederholung der Arbeitsweise von Beispiel 1 jedoch mit der Ausnahme, daß die Autoklavenbehandlung 30 Minuten bei 2 bar betrug, wurde ein Endprodukt mit einer Anti­ gerinnungsaktivität von 35-50 IU/mg und einem Wert von etwa 1/3 des Ursprungswertes erhalten.

Es wurde vorher angegeben, daß das Produkt IV eine chemische Zusammensetzung, nämlich Gehalte an Sulfatgrupen, Hexosamin­ gruppen, Hexuronsäuregruppen, und bestimmte physikalisch- chemische Eigenschaften (spezifische optische Drehung) be­ sitzt, die mit denjenigen des gereinigten Heparins I iden­ tisch sind, daß es jedoch einen unterschiedlichen Wert bei der Titration der endständigen, reduzierenden Gruppen nach der Somogji-Methode, eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität und verschobene Wellenlängenabsorptionsmaxima in den mit basischen Farbstoffen gebildeten Komplexen, z. B. dem Komplex mit Toluidinblau, ergibt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen LMW- Heparine oder RD-Heparine zeigen sehr vorteilhafte pharma­ kologische und therapeutische Eigenschaften im Vergleich zu normalem Heparin I.

Die wichtigste Eigenschaft hiervon ist ein modifiziertes Verhältnis sowohl in vitro als auch in vivo (bei Tier­ experimenten und bei Mengen) zwischen der antithrom­ botischen Aktivität und der Gesamtantigerinnungsaktivi­ tät, gemessen durch das Verhältnis

worin bedeuten Anti-Xa-Test = Yin-Test
APTT = aktivierte, partielle Thromboplastinzeit.

Die verschiedenen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen RD-Heparine zeigen zunehmende Werte des Verhältnisses von

mit abnehmenden Werten , obwohl die spezifische Anti­ gerinnungsaktivität mit abnehmendem Wert abnimmt.

In jedem Fall besitzt normales Heparin mit einem Wert = 15 000 eine Gesamtantigerinnungsaktivität 150 IU/mg und ein Verhältnis Anti-Xa/APTT=1, während RD-Heparine gemäß der Erfindung eine Gesamtantigerinnungsaktivität <150 IU/mg und einen Wert für Anti-Xa/APTT von <1 besitzen.

Insbesondere ist das Verhältnis beinahe doppelt so hoch für die Verbindung IV im Verhältnis zu dem Wert der Verbindung I. Dies bedeutet, daß auf Basis der gleichen Antigerinnungs­ aktivität die antithrombotische Aktivität der Verbindung IV doppelt so hoch wie von normalem Heparin I ist. Anders aus­ gedrückt bedeutet dies, daß für die Werte der Antigerinnungs­ aktivität nur die Hälfte einer Dosis der Verbindung IV oder sogar weniger erforderlich ist, um die gleiche antithrombo­ tische Wirkung zu erzielen, wie sie mit einer Gesamtdosis von normalem Heparin erreicht wird.

Die oben angegebenen Werte wurden bei Tierexperimenten durch Messung der Schutzwirkung von intravenös applizierten Ver­ bindungen I und IV gegenüber der Bildung von Thrombin und Thromboplastin-induzierten Thromben bestätigt.

Daher ist es mit den RD-Heparinen, welche nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren hergestellt werden können, möglich, das am meisten geeignete Produkt hinsichtlich der Werte der spezi­ fischen Antigerinnungsaktivität und des spezifischen Verhält­ nisses von antithrombotischer Wirkung zu Antigerinnungswir­ kung für bestimmte Anwendungszwecke auf dem Gebiet des Schutzes gegenüber Thrombosen auszuwählen.

Beispielsweise kann ein Patient in thrombogenen Stadium mit sehr verkürzter Gerinnungszeit ein antithrombotisches Mittel mit einer ziemlich hohen Antigerinnungsaktivität erfordern, während ein Patient, der einem chirurgischen Eingriff unter­ zogen wird, wo die beiden Risiken der Kapillarblutung und der postoperativen Thrombose gegeben sind, ein anti­ thrombotisches Mittel mit geringer Antigerinnungsaktivität benötigen könnte.

Zusätzlich verbleiben Verbindungen IV nach der subkutanen Applikation beim Menschen länger im Blutstrom als die Ver­ bindung I. Unterschiedliche Tests, nämlich die Rekalzifi­ zierungszeit, die aktivierte, partielle Thromboplastinzeit (APTT), die Thrombinzeit, die Anti-Xa-Aktivität, wurden für Untersuchungen angewandt, wie lange Verbindungen IV im Kreis­ lauf verbleiben.

Darüber hinaus zeigen die Verbindungen IV eine gewisse orale Absorption bei bestimmten Tierarten (Ratten, Mäusen, Hunden), während die Verbindung I oral nicht absorbiert wird.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht, bei dem ein durch Depolymerisation von Heparin erhaltenes Produkt sulfatiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß Heparin mit einem mittleren Molekular­ gewicht von etwa 15 000 Daltons durch Behandlung mit Kationenaustauscherharzen angesäuert wird unter Bildung von Heparinsäure und diese Heparinsäure durch Erhitzen in einem Autoklaven in Anwesenheit von Peroxiden depolymerisiert wird unter Bildung von Heparamin mit niedrigem Molekulargewicht, das dann zum entsprechenden Heparin mit niedrigem Molekulargewicht sulfatiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfatierung durch Behandlung mit Sulfotrioxiden von stickstoffhaltigen, organischen Basen in Anwesen­ heit einer Base durchgeführt wird.