DE3231994A1 - Verfahren und vorrichtung zur umsetzung von festen und fluessigen phasen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur umsetzung von festen und fluessigen phasen

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DE3231994A1 DE19823231994 DE3231994A DE3231994A1 DE 3231994 A1 DE3231994 A1 DE 3231994A1 DE 19823231994 DE19823231994 DE 19823231994 DE 3231994 A DE3231994 A DE 3231994A DE 3231994 A1 DE3231994 A1 DE 3231994A1
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Description

MOCHIDA- PHARMACEUTICAL CO*. , LTD., TOKYO / JAPAN
Verfahren und .Vorrichtung zur Umsetzung von festen und flüssigen" Phasen
•Die Erfindung betri'f ft ein 'verfahren und eine Vorrichtung zum Umsetzen,· von festen und flüssigen. Phasen. Insbesondere'betriff t sie"ein Verfahren, mittels dem man eine reaktive'Substanz,; die an eine feste Phase gebunden ' ist, und eine reaktive"Substanz in einer flüssigen Phase 'miteinander' umsetzen kann, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens,
Immunologische Verfahren, die Antigen-Antikörper-Reaktionen anwenden,· um .quantitativ sehr· geringe Mengen von Substanzen in Körperflüssigkeiten zu bestimmen oder für die Bestimmung.der Konzentration von verabreichten Arzneimitteln im Blut oder im Urin eines Organismus
sind bekannt.,Verschiedene Methoden, die auf verschiedenen Bestimmurigsprinzipien beruhen, sind hierfür bekannt
und werden praktisch angewendet. Dazu gehört die Radio-Immunoassay (RIA), Enzym-Immunoassay (EIA) und Fluoreszenz-Immunoassay (FIA), die wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und hohen Wirksamkeit zur quantitativen Bestimmung in weitem Masse angewendet werden.
Bei der Durchführung dieser Assays wendet man hauptsächlich die sogenannte Sandwich-Methode oder die kompetitive Methode an.,Insbesondere die Sandwich-Methode wird in grossem Masse angewendet/ weil sie einen hohen Grad an analytischer Genauigkeit ermöglicht und leicht durchzuführen ist.
Bei der Sandwich-Methode wird das zumessende Antigen mit einem insolubilisierten entsprechenden Antilörper umgesetzt (erste Reaktion), wodurch sich ein Antigen-'Antikörper-Komplex bildet. Dieser Komplex wird mit einem mit einem Markierungsmittel markierten- Antikörper umgesetzt/ der in der Lage ist, sich mit dem zu bestimmenden Antigen zu kombinieren (markierter Antikörper) (zweite Reaktion). Dann wird der markierte Antikörper in zwei Anteile aufgeteilt; in einen, der sich mit dem Ahtigen-Antikörper-Komplex kombiniert und in einen anderen, der sich nicht kombiniert hat und die Aktivität des Markierungsmittels in einem der beiden Anteile wird gemessen. Weiterhin werden gleiche Verfahren für einen Antikörper bekannter Konzentration wiederholt, um dadurch Kalibrierungskurven»aufzustellen. Die Menge des zu bestimmenden Antigens wird aus den KaIibrierungskurven erhalten. Das Markierungsmittel kann beispielsweise ein Enzym, eine radioaktive oder eine
fluoreszierende Substanz sein.
Bei der kompetitiven Methode, die zuerst bei der Radio-Immunoassay angewendet wurde, führt man die Messung wie folgt durch:
Reagiert man das zu bestimmende Antigen und eine gegebene Menge des markierten Antigens mit dem dem zu messenden Antigen entsprechenden insolubilisierten Antikörper, dann kombinieren sich beide Antigene kompetitiv.mit dem insolubilisierten Antikörper. Dann wird das markierte Antigen in zwei Anteile geteilt; in einen-, der sich mit dem insolubilisierten Antikörper kombiniert.hat und in einen anderen, der sich nicht kombiniert hat und die Aktivität des /Markierungsmittels in einem der beiden Anteile wird gemessen. Weiter-'hin führt man.ähnliche Verfahren für ein Antigen bekannter Konzentration durch, um dadurch eine ''Kalibrierungskurve auszubilden. Die Menge des zu bestimmenden Antigens kann.man aus der Kalibrierungskurve erhalten.
Bei der Durchführung\dieser Reaktionen ist es vorteilhaft, die Innenwandoberfläche eines Gefässes als Träger für eine reaktive Substanz, wie den zu insolubilisierenden Antikörper, zu Verwenden. Häufig wird beispielsweise ein Kunststoff-Reagenzglas verwendet, weil es sowohl als Träger für die Insolubilisierung als auch als Reaktionsgefäss dient und leicht gehandhabt werden kann. Die Innenwandoberfläche eines Reaktionsgefässes ist jedoch insofern unvorteilhaft, als dessen Oberfläche, an weicher sich ein-Antikörper oder eine andere reaktive
Substanz fixieren kann, kleiner ist als im .Falle von anderen Trägern, wie Kunststoffkugeln, Filterpapier oder Zelluloseteilchen, und sie kann deshalb nur eine geringere Menge einer reaktiven Substanz tragen. Infolgedessen verlängert sich bei den üblichen Verfahren, bei denen ein Reagenzglas- oder ein anderes Reaktionsgefäss, das an seiner Innenwand eine ins'olubilisierte reaktive Substanz trägt, aufrechtgehalten und stillgehalten wird, oder bei dem der Inhalt absatzweise gerührt wird. , . .
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu. stellen, mittels dem man eine reaktive, an eine Festphase fixierte Substanz und eine reaktive Substanz in einer Flüssigphase wirksam umsetzen kann.·
Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, ein verbessertes Reaktionsverfahren zur Bestimmung der Menge einer reaktiven Substanz in einer flüssigen Phase mittels einer reaktiven Substanz,.die an einer festen" Phase fixiert ist, zu zeigen. *
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine schnelle Reaktionsmethode zur Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer flüssigen Phase mittels eines Antikörpers oder Antigens oder eines Komplexes von"diesen, die an einer festen Phase fixiert sind, zu zeigen.
Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine Vorrichtung , zu zeigen, bei welcher die Reaktiorisgefässe in einer geneigten Stellung rotieren, um die vorerwähnten Verfahren auszuüben. \ . ·
" Weitere Ziele und Merkmale der Erfindung gehen aus
der Beschreibung und den Zeichnungen, die bevorzugte ■ ; Ausführungsfarmen der Erfindung sind, hervor.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung einer nach ,." . dem erfindungsgemässen Verfahren und nach " .·..',■ dem Stand der Technik erhaltenen Kalibrierungskurve ,
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung, die an-
zeigt, dass beim erfindungsgemässen Verfahren die Reaktionszeit verkürzt werden kann,
Fig. 3 ' ist eine grafische Darstellung und zeigt
eine Standardkurve für die AFP-Assay des •Beispiels 1,
ist eine grafische Darstellung und zeigt die Standardkurve für die CEA-Assay in . Beispiel 2,
ist eine Ansicht einer erfindungsgemässen Vorrichtung,
ist eine Ansicht und zeigt das Kraftübertragungssystem für die Vorrichtung von Fig. 5,
Fig. 7 ' zeigt eine weitere Vorrichtung gemäss einer
Ausführungsform der Erfindung, und
* Fig. 4
20 , - ■
Fig. 5
25
Fig. 6 ·
Fig. 8 und 9 sind teiivergrössertö Ansiöhteii-und zeigen, wie die Reaktiönsgefässe in der Vorrichtung^gemäss- Fig.-Ψ angebrächt -sind..
Die Erfindung beruht auf intensiven Untersuchungen " ■ und die Nachteile der Übliclien Verfahren>-bei denen man ein Reaktionsgefäss als Träger für^-die Insölubilisierung verwendet, zu vermeidend Als Ergebnis würde gefun-^ den, dass man einen höheren Empfindlichkeitsgräd und
10! eine Verringerung der Reaktionszeit erzielen kannν wenn das Reaktiönsgefäss in; einem; bestimmten Winkel geneigt ist und sich während der Umsetzung mit einer bestimmten Geschwindigkeit dreht/ anstelle auifecht unä still gehalten zu werden oder anstelle "eines absatzweisen Um-' rührens des Inhaltes. Dies hat zu der vbrliegend4n Erfindung geführt. ■ ' " < ; ; ■ i' ^: -■:■'- ...-■>.
Die Erfindüngv betrifft somit ein Verfahren für ,eine Umsetzung, bei welchem ein ReäktionsgefSss in einer geneig- ten Stellung gedreht wird, sowie eine Vorrichtung zur , Durchführung des Verfahrens. In der nächfolgenden.Beschreibung ist das Reaktiönsgefäss ein Reagenzglas, die Substanz, die an dex innenwandöberfiä'chie'd^s Reagenzglases getragen wird, ein Antikörper und" die?Substanz in der flüssigen Phase ein· Antige,n.- -Di&de :Kcmbihation wird jedoch nur zur Vereinfachung- dör^: Beschreibung angewendet und bedeutet nicht, dass i3ie Erfindung auf eine solche-Kombination beschränkt ist. ". ; -
Substanzen in Körperflüssigkeiten.'liegen gewöhnlich in sehr geringen Mengen vor 'und -die Körperflüssigkeiten '
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- ίο -
per se sind häufig nur in geringen Volumina verfügbar. Jedes Verfahren zur Messung solcher Substanzen erfordert" deshalb einen hohen Grad an analytischer Empfindlichkeit für die nur in sehr geringen Mengen verfügbaren Proben. Deshalb hat man üblicherweise den Antikörper an die Innenwandoberfläche eines Reagenzglases nur in der Nähe des Bodens fixiert, z.B. in einer Fläche, die eine Höhe von bis zu 1 cm vom Boden des Rohres einnahm .
Demgegenüber ermöglicht die vorliegende Erfindung das Pikieren eines Antikörpers auf einer grösseren Fläche, einschliesslich des oberen Teils des Reagenzglases, weil die Probe, selbst wenn sie auch nur in einem kleinen Volumen zur Verfugung steht, in dem Reaktionsgefäss einen guten Kontakt mit dem Antikörper erhält, wenn man das Reaktionsgefäss in geneigter Stellung, wie vorher erwähnt, rotiert. Darüber hinaus bedeutet das Drehen bzw. Rotieren des Reagenzglases auch ein Umrühren des Inhaltes und dadurch wird die Messung mit hoher Sensibilität in einer kürzeren Zeit ermöglicht.
Tabelle 1 zeigt die Beziehung zwischen dem Neigungswinkel des Reaktionsgefässes und der relativen Menge der zum Benetzen des den Antikörper tragenden Teils des Reaktionsgefässes erforderlichen Probe, wenn die fixierte Fläche des Antikörpers in dem Gefäss konstant · ist. Tabelle 2 zeigt die Beziehung zwischen dem Neigungswinkel des Reaktionsgefässes und der Kontaktfläche zwischen der Probe und der Innenoberfläche des Gefässes, wenn die Menge der' Probe konstant ist.
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Tabelle
Ne igung swinke1 relatives Volumen der benötigten
Probe .
90° (senkrecht)
45°
30°
20°
10°		 1
etwa 1/2
11 ., 1/3
1/5
1/10
Tabelle
Neigungswinkel relative Grosse der Kontaktfiäche
90° (senkrecht) 1
40° etwa 1,5
30° Il 2
20° Il 3
10° Il 4
Es gilt die allgemeine Regel, dass zwei Reaktanten umso 30 wirksamer umgesetzt werden können, je grosser deren KOntaktflache ist. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht/ nimmt das
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benötigte Probenvolumen zum Benetzen der konstanten Kontaktfläche mit einer Verminderung des Neigungswinkels des Reaktionsgefässes in Richtung der horizontalen Lage ab. Infolgedessen ist es wünschenswert, das Reaktionsgefäss so nahe als möglich in die horizontale Stellung zu bringen, unter der Voraussetzung, dass die umzusetzende Flüssigkeit nicht ausfliesst. Selbst wenn die Neigung des Reaktionsgefässes schon fast horizontal ist, z.B. etwa 5° oberhalb der horizontalen Lage, besteht nicht die Gefahr, dass die Probe den Boden des Gefässes nicht berührt, sofern das Volumen; der Probe nicht ausserordentlich klein ist. Obwohl keine obere Grenze hinsichtlich des Neigungswinkels des Reaktionsgefässes besteht, soll diese Neigung doch vorzugsweise unterhalb 45° und insbesondere bei 10 bis 20° liegen, um das Probenvolumen einzusparen und die analyti-. 'sehe Empfindlichkeit zu erhöhen.
Vorzugsweise rotiert man das in geneigter Lage befindliehe Reaktionsgefäss mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 100 Upm und insbesondere 25 bis 55 Upm. übersteigt die Rotationsgeschwindigkeit 100 Upm, dann fliesst die Probe nicht mehr längs der Rohrwandung, sondern rotiert in dem Gefäss und dadurch wird der volle Kontakt , der Probe mit dem Antikörper gestört. Bei einer Rotationsgeschwindigkeit von weniger als 10 Upm wird dagegen die Rührwirkung, die durch die Rotation des Gefässes bewirkt wird, erheblich vermindert.
Das erfindungsgemässe Reaktionsverfahren hat folgende Vorteile:
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(1) . Durch das kontinuierliche Drehen des Reaktionsgefasses wird ein ausreichendes Rühren der: Reaktionsmischung ermöglicht und: die Reaktionsef fiz,j.enz: verbessert und ebenso auch die Empfindlichkeit und die. Genauigkeit der Assay erhöht. .. ._ - .....·., ,; , . . ,
(2) IM in einem Assay-System eine,|iohe Empfindlichkeit zu erreichen, hat man bisher höhere Volumina der Proben verwendet,- Bei der vorliegenden Erfindung reicht es dagegen aus, Probevolumina zuverwenden, die nur ungefähr 1/2 bis 1/10 der bisher verwendeten Volumina ausmachen, wie dies in Tabelle 1 gezeigt wird. Dies hat die gleiche Wirkung, als ob man bei den üblichen Verfahren mit Probenvolumina arbeitet, die 2 bis 10 mal so gross wie die bisher verwendeten sind.
(3) Wenn bei den üblichen Verfahren das Volumen der Probe klein ist, wird der Gradient der Kalibrierungskurve kleiner und dadurch wird die.Genauigkeit der mittels dieser Methode erzielten Messung vermindert.
Erfindungsgemäss kann jedoch die Kontaktfläche zwischen der Probe und der Innenoberfläche des Reaktionsgefasses um das 1,5- bis 4-fache gegenüber dem bisherigen erhöht werden, selbst wenn man nur ein kleines Probenvolu-, men anwendet, wie dies in Tabelle 2 gezeigt wird. Da der Antikörper an die vergrösserte Fläche gebunden werden kann, ist es möglich, ein Assay-System mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit zu erhalten. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse eines Assays für O^-Phytoprotein (AFP) unter Verwendung der gleichen Reagentien und der gleichen Probenvolumina. Die Versuche wurden bei jeder
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Konzentration jeweils 5 mal wiederholt und zwar sowohl mit dem erfindungsgemässen Verfahren wie auch mit dem üblichen Verfahren. Fig. 1 zeigt die Kalibrierungskurve, bezogen auf die Ergebnisse der Tabelle 3. Es ist festzuhalten, dass die erfindungsgemäss erhaltene Kalibrierungskurve einen höheren Gradienten hat als die nach dem üblichen Verfahren erhaltene und dass die erfindungsgemässe Methode eine höhere Genauigkeit ermöglicht. Diese Assays für AFP wurden in einem Reaktionsgefäss, das in einem Winkel von 10° geneigt war und mit einer Geschwindigkeit von 30 üpm rotierte, erzielt.
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Tabelle 3 '
ÄFP-Konz entration
{ng/ml)		 0 . 1 . 10 100
übliches Verfahren
optische Dichte (x+SE) 0,193+0,007 0,240+0,007 0,346+0,009 0,639+0,019
CV% 8,5 . 6,2 6,0 6,7
erfindungsgemässes
Verfahren
optische Dichte (x+SE) 0,025+0,001 0,15 4+0,002 0,412+0,105 0,970+0,006
CV% 7,4 2,4 2,6 1,3
σι ι
NJ CaJ
(JD CD
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(4) Die Reaktionszeit kann erheblich verkürzt werden. Tabelle 4 zeigt einen Vergleich der Assay-Zeiten, die zur Erzielung gleicher analytischer Empfindlichkeiten und Genauigkeiten benötigt werden, d.h. Kalibrierungskurven mit gleichen Gradienten und unter Verwendung der gleichen Reagentien bei einem Assay für AFP. Das Reaktionsgefass war mit einem Winkel von 20° geneigt und wurde mit 40 Upm rotiert. Die so erhaltenen Standardkurven werden in Fig. 2 gezeigt. Es ist festzustellen, dass die Verminderung der Assay-Zeit so gross war, dass die Reaktion, die bei der bisherigen Methode bisher, insgesamt 12 Stunden benötigte, beim erfindungsgemässen Verfahren in 1 Stunde durchgeführt werden konnte. Dagegen ergibt eine verkürzte Reaktionszeit bei einer üblichen Standardmethode eine Standardkurve mit einem sehr kleinen Gradienten, wie in C in Fig. 2 gezeigt wird, und wobei sich dann ein Assay nicht durchführen lässt.
Tabelle 4
übliche Verfah
ren (Gefäss steht
aufrecht und
still)		 erfindungsgemässes
Verfahren (Gefäss
ist geneigt und
wird rotiert) .
erste Reaktion
zweite Reaktion
Enzymreaktion		 60 min
60 min
10 std		 20 min
20 min
20 min
-; 17 -
:.3231 99A
Das beim erfindungsgemässen Verfahren verwendete Reaktionsgefäss kann beispielsweise ein Reagenzglas, eine optische Zelle oder eine Probenküvette sein, in welcher eine reaktive Substanz an der Innenwandung fixiert ist und mit einer geringen Menge der darin befindlichen Probe umgesetzt wird. Vorzugsweise ist das Reaktionsgefäss ein kreisförmiger oder ein mit einem polygonalen Boden versehener Zylinder aus Glas oder Kunststoff mit einem Innendurchmesser..von 25 mm. Das erfindungsgemässe Verfahren kann beispielsweise angewendet werden (a) zum Umsetzen eines an.der Innenwandung des Reaktionsgefässes fixierten Antikörpers mit einem Antigen in einer flüssigen Phase und zwar beispielsweise auch im Falle einer EIA mittels der Sandwich-Methode, (b) zum Umsetzen eines markierten Antikörpers mit dem Antikörper-Antigen-Komplex der durch die in.(a) erfolgte Reaktion gebildet wurde, unter Ausbildung eines Komplexes aus dem zu bestimmenden insolubilisierten Antikörper "-Antigen und dem markierten Antikörper oder (c) zum Umsetzen eines Enzymsubstrats mit dem Komplex gemäss (b), unter Durchführung einer Enzymreaktion. Im Falle einer kompetitiven Reaktion kann man das erfindungsgemässe Verfahren verwenden, wenn man das zu messende Antigen und das markierte Antigen mit dem insolubilisierten Antikörper umsetzte. Selbstverständlich gibt es zahlreiche weitere Verwendungen für das erfindungsgemässe Verfahren und die erfindungsgemässe Vorrichtung, die für den Fachmann offensichtlich sind.
Um das Reaktionsgefäss zur Durchführung der Erfindung so zu neigen und zu rotieren, kann man alle Mittel und
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Vorrichtungen verwenden, solange diese das Gefäss im vorgeschriebenen Winkel halten und mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit rotieren. Für diesen Zweck ist es aber vorteilhaft, die erfindungsgemässe, speziell entwickelte Vorrichtung zu verwenden, mittels der man das Verfahren einfach und gut durchführen kann.
Die erfindungsgemässe Vorrichtung zum Rotieren eines Reaktionsgefässes in einer, geneigten Stellung umfasst eine oder mehrere laterale Reihen von in gleichmässigem Abstand befindlichen Haltern, die von der Aussenoberflache eines Rahmens herausragen, Mittel zum Rotieren des Halters in der gleichen Richtung mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit, und Mittel, um den Rahmen in eine solche Position zu bringen, dass die Halter mit einem vorbestimmten Winkel zur horizontalen Lage nach oben geneigt sind.
Die Vorrichtung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen näher beschrieben. Fig. 5 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemässen Vorrichtung. In gleichem Abstand befindliche längliche Halter 1 ragen aus einer Aussenoberfläche eines Rahmens 2 und tragen die darauf befindlichen Reaktionsgefässe A. Die Halter 1 rotieren in der gleichen Richtung mittels eines Motors 3 durch ein Kraftübertragungssystem, das anschliessend unter Bezugnahme auf Fig. 6 erläutert wird. Die Rotationsgeschwindigkeit des Halters kann in einem Bereich von 10 bis 100 Upm mittels der Einstellvorrichtung 7 gewählt werden. Der Rahmen 2 wird mittels einer Schraube 5 an einer stationären Basis 4 so befestigt,
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dass die Halter 1,die von dessen Aussenoberflache herausragen, nach oben in einem Winkel zwischen 0 und 90° zur horizontalen Lage neigt sind, über die Halter 1 kann man Hüllen mit einem gewünschten Durchmesser ziehen, um die Entfernung zwischen zwei benachbarten Haltern 1 so einzustellen, dass die Halter 1 in der Lage sind, Reaktionsgefässe mit dem gewünschten Durchmesser darauf zu rotieren.
Fig. 6 zeigt die Vorrichtung gemäss Fig. 5 von der Rückseite der Halter 1 und zeigt das Kraftübertragungssystem dafür. Die Drehung des Motors 3 wird durch einen Geschwindigkeitsverminderer 6 auf ein vorbestimmtes Niveau vermindert und mittels eines Kegelrades 8 auf eines der Zahnräder 9, die zu den Haltern 1 koaxial ausgerichtet sind, übertragen. Die Rotation des koaxialen Zahnrades 9 wird auf die anliegenden koaxialen Zahnräder 9 von einem zu dem anderen durch Zwischenzahnräder 10, die die Rotationsrichtung regulieren, übertragen, so dass alle Halter 1 in der gleichen Richtung rotieren. Falls ein grosser vertikaler Abstand zwischen zwei anliegenden Reihen der Halter 1 benötigt wird, ist es erforderlich, die Entfernung zwischen den Reihen der Zwischenzahnräder 10 auf der Rückseite des Rahmens 2 zu vergrössern und eine Kette zwischen einem der Zwischenzahnräder in einer Reihe und einem der Zwischenzahnräder in einer anderen Reihe vorzusehen.
Die Erfindung kann man auch in einer anderen Vorriehtung durchführen, die eine Fördervorrichtung, wie ein Förderband, hat und auf dessen Förderoberfläche
frei rotierbare Rollen montiert sind, bei der Mittel zum Antreiben der Fördervorrichtung in eine Richtung mit einer vorbeschriebenen Geschwindigkeit vorgesehen sind, ein bewegtes Band vorgesehen ist, um die Reaktionsgefässe in einer vorbestimmten Richtung mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit zu rotieren, während sie die auf den Rollen montierten Reaktionsgefässe berühren, und Mittel zum Halten der Reaktionsgefässe in einer geneigten Position in einem vorbestimmten Winkel gegenüber der Horizontalen, wobei die öffnungen der Reaktionsgefässe angehoben sind.
Diese Vorrichtung wird näher unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert. Fig. 7 zeigt eine weitere Vorrichtung gemäss der Vorrichtung und Fig. 8 und 9 sind teilvergrösserte Ansichten, in welchen die Art, in welcher die Reaktionsgefässe in der Vorrichtung gemäss Fig. 7 gehalten werden, gezeigt wird. Eine Förderkette 101 hat eine Förderoberfläche, auf welcher frei rotierende Rollen 117 montiert sind. Reaktionsgefässe A werden von diesen Rollen 117 getragen. Die Kette 101 wird mittels eines Motors 106 über einen Geschwindigkeitsverminderer 105, Zahnräder 104 und Wellen 103 sowie Kettenzahnräder 102 angetrieben, wodurch das Reaktionsgefäss allmählich in eine Richtung gedreht wird. Die Zeit für die Bewegung der Rollen in eine Richtung zu einer angrenzenden Rollenposition kann im gewünschten Masse mittels der Kontrollvorrichtung 107 gewählt werden und beträgt vorzugsweise 0,5.bis 5 Minuten.
Die Reaktionsgefässe werden mittels des Gurtes 109,
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der gegen die Gefässe mittels der Anpressrollen 108 gedrückt wird, rotiert. Der Gurt 109 wird mittels eines Motors 114 über einen Geschwindigkeitsverminderer 113, Zahnräder 112, Wellen 111 und Riemenscheiben 110 angetrieben. Die Geschwindigkeit des Gurtes kann mittels einer Kontrollvorrichtung 115 so eingestellt werden, dass die Reaktionsgefässe mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 100 üpm rotieren.
Die Vorrichtung wird beispielsweise auf einer Trägerplatte 116 so montiert, dass die Reaktionsgefässe ihre Achse in einem Winkel zwischen 0 und 90° zur Horizontalen, wobei die öffnungen angehoben sind, zu liegen kommen.
Die Vorrichtung kann verwendet werden, um die Reaktions-. gefässe eines nach dem anderen automatisch zu befördern, während sie sich kontinuierlich drehen und deren Inhalt kontinuierlich gerührt wird..Infolgedessen ist es beispielsweise möglich, eine Vielzahl von Reaktionsgefässen, von denen jedes eine Flüssigprobe enthält, eines nach dem anderen auf dem Förderband an einer Ausgangsstellung aufzulegen, die Reaktion in dem Reaktionsgefäss durchzuführen, während dieses rotiert und automatisch weiterbewegt wird, und dann die Ergebnisse der Reaktion an einer vorbestimmten Position automatisch, beispielsweise mittels eines Spektrofotometers, zu untersuchen. Deshalb ist die erfindungsgemässe Vorrichtung besonders für die Automatisierung eines Assay-Systems geeignet. Selbstverständlich kann man auch hier in den beispielhaft genannten Vorrichtungen Änderungen vornehmen, ohne vom Umfang der Erfindung abzu-' weichen.
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Das Reaktionsverfahren wird nun in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
(a) Zubereitung des Reaktionsreagenzglases
2 ml eines monoklonalen Anti-AFP-Antikörpers (A) (1 jng/ml) wurden in jeweils ein Polystyrol-Reagenzglas mit einem Durchmesser von 12 mm und einer Höhe von 100 mm gegeben und die Inkubierung wurde 20 Minuten bei 500C durchgeführt. Dann wurde jedes Reagenzglas mit einer 0,05M Phosphat-Puffersalzlösung (PBS) mit dem pH-Wert 6,4 gewaschen, wodurch man ein mit dem Antikörper (A) sensibilisiertes Reagenzglas erhielt.
Ein anderer monoklonaler Antikörper (B) mit einem von (A) unterschiedlichen Klon wurde mit Meerrettichperoxidase (Boehringer Mannheim Grade I,. nachfolgend als HRPO bezeichnet) markiert, wobei die Methode von Nakane et al, beschrieben in J. Histochem. Cytochem., 22.1 1084 (1974), angewendet wurde. Der Antikörper wurde mit PBS 49:1 verdünnt und 1 ml des verdünnten Antikörpers wurde in jedes Polystyrol-Reagenzglas,, das mit dem Antikörper (A) sensibilisiert war, gegeben. Nachdem die Reagenzgläser lyophilisiert worden waren, wurden sie dicht verschlossen und lagen nunmehr als Reagenz gläser für die AFP-Assay vor.
(b) Assay für AFP
Die gemäss (a) bereiteten Reagenzgläser für die AFP-Assay wurden mit 0,9 ml PBS gefüllt. In jedes Reagenzglas wurden 0f1 ml einer Standard-AFP-Lösung eingefüllt, die erhalten worden war, indem man AFP mit normalem Humanserum verdünnte, so dass sie 1, 10, 100 oder 1.000 ng AFP pro ml enthielten. Die Reagenzgläser wurden auf die Halter in der Vorrichtung gemäss Fig. 5 gelegt und waren zur Horizontalen in einem Winkel von 20° geneigt. Die Reaktion wurde 30 Minuten durchgeführt, während die Reagenzgläser mit einer Geschwindigkeit von 50 üpm rotierten. Nach der Umsetzung wurden die Reagenzgläser mit einer physiologischen Kochsalzlösung, enthaltend 0,005 % Tween 20 (nachfolgend als Waschmittel bezeichnet) gewaschen. In jedes Reagenzglas wurden dann 2 ml einer Enzymsubstratlösung, enthaltend 50 mg/dl 5-Aminosalicylsäure und 0,01 % Wasserstoffperoxid, gegeben. Die Reagenzgläser wurden wiederum auf die Halter mit einer Neigung nach oben in einem Winkel von 20° zur Horizontalen gelegt und die Umsetzung wurde 30 Minuten durchgeführt, während welcher die Reagenzgläser mit einer Geschwindigkeit von 50 Upm rotierten.
Zur Beendigung der Umsetzung wurden 50 μΐ 2 % Natriumazid zugegeben. Die Absorption der Reaktionsmischung wurde bei einer Wellenlänge von 500 nm spektrofotometrisch bestimmt. Die erhaltene Kalibrierungskurve wird in Fig. 3 gezeigt.
- 7Λ -
Beispiel 2
(a) Zubereitung der Reaktions-Reagenzgläser
In jedes Polystyrol-Reagenzglas (Durchmesser .8mm, Höhe 100 mm) wurden 2 ml monoklonaler Anti-karzinoembryotisches Antigen (CEA)-Antikörper (A1) (1 mg/ml) gegeben und 20 Minuten bei 560C inkubiert. Dann wurde das Reagenzglas mit PBS gewaschen, wobei man mit dem CEAr-Antikörper (A1) sensibilisierte Reagenzgläser erhielt.
Ein anderer monoklonaler Antikörper (B1) mit einem vom Antikörper (A1) unterschiedlichen Klon wurde nach
dem in (a) in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit .HRPO markiert. Der Antikörper wurde mit PBS auf das 50-fache Volumen verdünnt und 1 ml des verdünnten. Antikörpers wurde in' jeweils 1 Reagenzglas, das mit dem CEA-Antikörper (A1) sensibilisiert war, gegeben. Nach dem Lyophilisieren der Reagenzgläser wurden.diese dicht verschlossen, unter Erhalt von Reagenzgläsern für die
CEA-Assay.
(b) Assay für CEA
Die gemäss (a) zubereiteten Reagenzgläser.wurden jeweils mit 0,9 ml PBS und 0,1 ml einer Standard-CEA-Lösung, hergestellt durch Verdünnen von CEA mit normalem Humanserum, so dass sie 1,3, 10, 30 oder 100 ng CEA pro ml enthielten, gefüllt. Die Reagenzgläser wurden
- 25 -
- 25 -
auf ein Förderband gemäss Fig. .7 gelegt, wobei sie in einem Winkel von 10° zur Horizontalen aufwärts geneigt waren. Die Umsetzung wurde 20 Minuten durchgeführt und während dieser Zeit rotierten die Reagenzgläser mit einer Geschwindigkeit von 30 Upm. Dann wurde jedes Reagenzglas mit dem Waschmittel gewaschen und mit 2 ml einer Enzymsubstratlösung, enthaltend 100 mg/dl o-Phenylendiamin und eine 0,3 %-ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid, gefüllt. Die Reagenzgläser wurden wiederum auf das Förderband mit einer Neigung nach oben von 10° zur Horizontalen gelegt. Die Umsetzung wurde 20 Minuten durchgeführt, während welcher die Reagenzgläser mit einer Geschwindigkeit von 30 Upm rotierten. Dann wurden 0,5 ml 4N Salzsäure zur Beendigung der Umsetzung zugegeben. Die Absorption der Reaktionsprodukte wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm spektrofotometrisch bestimmt. Die erhaltene Kalibrierungskurve wird in Fig. 4 gezeigt.

Claims (7)

  1. PATENT ANS P R Ü C H E
    Verfahren zum Umsetzen einer ersten reaktiven Substanz, die an die Innenwandoberfläche eines Reaktionsgefässes gebunden ist, mit einer zweiten reaktiven Substanz in einer flüssigen Phase, bei dem man eine Flüssigkeit, enthaltend die zweite reaktive Substanz, in das Reaktionsgefäss eingibt, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäss mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 100 Upm rotiert, während es in einem Winkel zwischen 5 und 45° zur Horizontalen geneigt ist.
  2. 2. Verfahren gemäss- Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, , dass das Pveaktionsgefäss in
    einem Winkel zwischen 10 und 20° zur Horizonta-' len geneigt ist.
  3. 3. Verfahren gejiiäss, Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet/ dass die Rotationsgeschwindigkeit, zwischen 25-und 55 üpm liegt.
  4. '. 4. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Reaktionsgefäss 4in mit einem kreisförmigen Boden versehener Zylinder ist und aus Glas oder Kunststoff besteht und,einen Innendurchmesser von 5-20 mm hat.
  5. 5. Verfahren gemäss Anspruch T oder 2, dadurch . g e k e η η z, e\ i c -h η e t Λ dass das erste Reaktionsgefäss ein Zylinder mit einem polygonalen .Boden aus Glas oder Kunststoff ist und einen Innendurchmesser von 5 Isis 20 mm hat.
  6. 6. Vorrichtung zum Rotieren von einem oder mehreren Reaktionsgefässen in geneigter Stellung, g e k e η η ζ e .-i. c h η e t * durch eine oder mehrere laterale Reihen von in gleichmässigem Abstand bestehenden Haltern (1), die von einer Aussenoberfläche eines Rahmens, (2) hervorstehen. Mittel zum Rotieren der Halter (3, 6, 1,10) in der gleichen Richtung in einer vorbestimmten Geschwindigkeit und Mittel (5) /- um den Rahmen in eine solche Position zu bringen, dass die Halter in. einem vorbestimmten winkel zur Horizontalen aufwärts geneigt, sind« '-.··, '.
  7. 7. Vorrichtung zum Rotieren wenigstens"eines Reaktionsgefässes in einer geneigten Stellung, g,e kenn ζ e ich'η et· -durch/eine Fördervorrichtung (101) mit einer Förderoberfläche, auf welcher frei rotierbare Rollen {117) montiert sind, Mittel (102, 103, 104 j 105, 10S) * zum Antreiben der Fördervorrichtung in einer Richtung mit einer Geschwindigkeit in einem vorgeschriebenen Bereich, einem Gurt-(1O9),.der mit den auf den Rollen (117) befindlichen Reaktionsgefässen in Kontakt ist und sich so bewegt, dass das Reaktionsgefäss sich in einer vorbestimmten Geschwindigkeit in einer vorbestimmten Richtung bewegt und Mittel (116), um das Reaktionsgefäss in einer aufwärts geneigten Richtung in einem vorbestimmten Winkel
    < „ ,. ~~ ■ ■ zur Horizontalen zu halten. ' '
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