DE3247894A1 - Testsystem und verfahren zur bestimmung von nad(p)h - Google Patents
Testsystem und verfahren zur bestimmung von nad(p)hInfo
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Description
Merck Patent Gesellschaft mit beschränkter Haftung Darmstadt
22. Dezember 1982
Testsystem und Verfahren zur Bestimmung von NAD(P)H
Merck Patent Gesellschaft
mit beschränkter Haftung
mit beschränkter Haftung
Darmstadt
Testsystem und Verfahren zur
Bestimmung von NaD(P)H
Bestimmung von NaD(P)H
Die Erfindung betrifft ein Testsystem und ein Verfahren mit erweitertem Meßbereich zur Bestimmung von
NAD(P)H bzw. von unter Bildung oder Verbrauch von
NAD(P)H reagierenden Substraten oder Enzymen.
NAD(P)H bzw. von unter Bildung oder Verbrauch von
NAD(P)H reagierenden Substraten oder Enzymen.
Die Bestimmung klinischer Parameter erfolgt in der
Mehrzahl der Fälle über hochspezifische Dehydrogenase-Reaktionen, in deren Verlauf mittel- oder unmittel-
Mehrzahl der Fälle über hochspezifische Dehydrogenase-Reaktionen, in deren Verlauf mittel- oder unmittel-
bar NAD(P)H gebildet oder verbraucht wird. Die dabei
umgesetzte Menge NAD(P)H, absolut oder pro Zeiteinheit,
ist ein Maß für die Konzentration der zu untersuchenden Substanz in einer Flüssigkeit. Als besonders vorteilhaft
erweist sich die Dehydrogenäse-Reaktion in
Bezug auf Stöchiometrie und geringe Störanfälligkeit. Nachteilig ist dagegen, daß aufgrund der Absorptionseigenschaften des Coenzymmoleküls eine Auswertung
der Meßreaktion nur mit Photometern mit UV-Meßbereich möglich ist; eine rein visuelle Auswertung kann nicht
der Meßreaktion nur mit Photometern mit UV-Meßbereich möglich ist; eine rein visuelle Auswertung kann nicht
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erfolgen. Dies wird erst möglich durch Kopplung der eigentlichen NAD(P)H-bildenden Reaktion mit einer
Farbreaktion. Es sind eine Vielzahl von Verfahren beschrieben, die dies durch direkte oder mit Hilfe
von Elektronenüberträgern wie Phenazinmethosulfat oder Diaphorase vermittelte Übertragung der Redoxäguivalente
auf unterschiedliche Redoxindikatoren erreichen. Zu diesen Substanzen zählen z.B. Cytochrome,
komplexierte oder chelatisierte Eisenionen, Dichlorphenolindophenol,
Tetrazoliumsalze usw.. Bekannt ist auch die Kopplung der Meßreaktion mit einer Reaktionsfolge (DE-AS 15 98 263, EU 54 146), wobei die Farb~
stoffbildung über eine intermediär gebildete Substanz erfolgt. Allen diesen Systemen ist ein sequentieller
Reaktionsverlauf gemeinsam, bei dem jeweils das Produkt der erstenTeilreaktion Ausgangssubstanz
der zweiten usw. ist.
In der Patentanmeldung P 32 11 167 ist ein Verfahren
beschrieben, bei dem eine zu bestimmende Substanz zu verschiedenen unterscheidbaren Produkten umgesetzt
wird, so daß ein gegenüber den üblichen Tests größerer Meßbereich bei gleicher Meßgenauigkeit erhalten wird.
Dies wird durch Verwendung mehrerer, unabhängig voneinander die gleiche zu bestimmende Substanz umsetzender
Enzymsysteme erreicht, wobei eines eine NAD-abhängige,
ein anderes eine NAD-unabhängige Dehydrogenase enthält. Der einzige Nachteil dieses Verfahrens besteht
darin, daß für einen großen Teil der zu unter*-
suchenden Substanzen in der klinischen Diagnostik
3q die erforderlichen NAD-unabhängigen Enzyme - im Gegensatz
zu den entsprechenden NAD-abhängigen Enzymen nicht im Handel erhältlich sind.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Testsystem zur Bestimmung von NAD(P)H zu entwickeln,
das einen gegenüber den üblichen Systemen vielfach größeren Meßbereich hat, und das mit jederzeit im
Handel erhältlichen Enzymen durchgeführt werden kann.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß unter bestimmten Bedingungen eine unabhängige Umsetzung von
NAD(P)H mit verschiedenen Redoxindikatoren möglich
TO ist. Unabhängig bedeutet dabei, daß z.B. die Umsetzung
des zweiten Redoxindikators (mit dem niedrigeren elektrochemischen Potential) erst nach weitgehend vollständiger
Umsetzung des ersten (mit dem höheren elektrochemischen Potential) erfolgt, so daß eine getrennte
Auswertung möglich ist. Dies war umso überraschender, als zu erwarten war, daß bei gleichzeitigem Vorliegen
der Redoxindikatoren durch die Wechselwirkung der einzelnen Substanzen untereinander und durch fremde
Einflüsse (Sauerstoff, Testsubstanzen) Störungen auftreten.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Testsystem mit erweitertem Meßbereich zur Bestimmung von NAD(P)H bzw.
von unter Bildung oder Verbrauch von NAD(P)H reagierende Substraten oder Enzymen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß es gleichzeitig mehrere, unabhängig voneinander gegenüber NAD(P)H als Elektronenakzeptor
fungierende Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Bestimmung von NAD(P)H bzw. von unter Bildung
oder Verbrauch von NAD(P)H reagierenden Substraten oder Enzymen in wäßriger Lösung, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Probelösung gleichzeitig mit
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mehreren, unabhängig voneinander gegenüber NAD(P)H als
Elektronenakzeptor fungierenden Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen behandelt
wird, wobei verschiedene analytisch unterscheidbare Endprodukte entstehen, die meßtechnisch oder visuell
ausgewertet werden-
Je nach Art des Redoxindikators kann die Übertragung der Elektronen direkt oder mit Hilfe eines sogenannten
Elektronenüberträgers erfolgen. Vorzugsweise enthält das Testsystem Elektronenüberträger, die eine katalytische
Wirkung auf die Redoxindikatoren ausüben. Geeignete Elektronenüberträger sind z.B. Phenazinmethosulfat
(PMS), Phenazinethosulfat (PES), Methoxyphenazinmethosulfat
(MPMS), Meldolablau, Diaphorase usw. sowie Gemische dieser Substanzen.
Als Redoxindikatoren kommen prinzipiell alle Substanzen in Frage, die ein höheres elektrochemisches
Potential als NAD(P)H/NAD(P) besitzen und deren oxidierte und reduzierte Form visuell, photometrisch
oder mit elektrochemischen Verfahren eindeutig zu unterscheiden sind.t Geeignete Redoxinikatoren für das
erfindungsgemäße Testsystem sind z.B. Oxazin- und Thiazinfarbstoffe, Tetrazoliumsalze usw. (DE-PS
28 34 743, Proc. Soc. Exp. Biol. 104, 407 (I960)),
vorzugsweise Dichlorphenolindophenol (DIP), 3-(4-Jodphenyl)-2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid
(INT) und 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid
(MTT). Die Verwendung dieser Redoxindikatoren in Dehydrogenase-Testsystemen
3Q war bisher auf Systeme mit nur einem Redoxindikator
beschränkt. Überraschenderweise konnte nun gezeigt werden, daß bei Vorliegen mehrerer Redoxindikatoren
mit verschiedenen Normalpotentialen Test-
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systeme mit erweitertem Meßbereich zur Verfugung gestellt
werden können. Die Normalpotentiale der Redoxindikatoren sollten zwischen -0,3 und +0,5, insbesondere
zwischen -0,3 und +0,3 liegen. Die Bestimmung wird in der Regel in gepufferten wäßrigen Lösungen
durchgeführt, wobei der pH-Wert zwischen 4,5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 5,0 und 7,0 liegen sollte. Geeignete
Puffer zur Einstellung dieser pH-Werte sind z.B. Phosphatpuffer, Citratpuffer, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure-Natriumsalz,
Bis-(2-hydroxyethyl)-aminotris(hydroxymethyl)methan,
Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)-Dikaliumsalz
usw., vorzugsweise Phosphatpuffer und Citratpuffer.
Die Auswahl der für das erfindungsgemäße Testsystem verwendeten Redoxindikatoren erfolgt nach der Unterscheidbarkeit
der bei der Umsetzung gebildeten Meßsignale, vorzugsweise nach der Extinktionsänderung
bei verschiedenen Wellenlängen (photometriscne Auswertung) oder nach der unterscheidbaren Farbänderung
der Testlösung (visuelle Auswertung). Im letzten Fall
sind insbesondere Kombinationen von Redoxindikatoren geeignet, von denen je eine Form farblos bzw. nur
schwach gefärbt ist. Nachstehend sind einige bevorzugte Redoxindikatoren mit ihren Normalpotentialen bei einem
pH-Wert von 7 und die entsprechenden Farbänderungen aufgezählt.
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-er-
| Substanz | Potential | Farbe der | Farbe der | |
| bei pH 7,0 | oxidierten | reduzierten | ||
| Form | Form | |||
| NADH | -0,32 | |||
| 5 | DIP | +0,23 | blau | farblos |
| MTT | +0,11 | farblos | blau | |
| INT | +0,09 | farblos | rot | |
| Thionin | +0,06 | violett | farblos | |
| Methylenblau | +0,01 | blau | farblos |
Aus der Tabelle geht hervor, daß die Kombination der
Redoxindikatoren DIP/INT mit einem Farbübergang in der
1. Stufe von blau nach farblos und in der ..2. Stufe von farblos nach rot besonders vorteilhaft ist. Beide
Substanzen besitzen sowohl zwischen oxidierter und redüzierter
Form einer jeden Substanz als auch zwischen den Substanzen deutliche Unterschiede im Absorptionsspektrum
und im visuellen Farbeindruck. Eine Umsetzung der beiden Substanzen im Gemisch mit NAD(P)H führt zu einer
unabhängigen Umsetzung von DIP und INT und damit zu einem gegenüber einem System mit nur je einer dieser
Substanzen erheblich erweiterten Meßbereich. Die Substanz mit dem höheren Normalpotential (DIP) wird nahezu
vollständig vor der zweiten Substanz (INT) umgesetzt. Bei einer NAD(P)H-Bestimmung mit DIP als einzigem
Redoxindikator wird ein Konzentrationsbereich bis etwa 0,26 mmol/1 erfaßt, mit INT ein Bereich bis
etwa 0,13 mmol/1 und mit der Kombination von DIP und INT ein Bereich bis etwa 0,55 mmol/1, d.h., daß mit
dem erfindungsgemäßen Testsystem ein doppelter bis mehr als 4facher Konzentrationsbereich von NAD(P)H
erfaßt wird. Die photometrische Auswertung kann z.B.
über eine Registrierung der Extinktion bei zwei verschiedenen Wellenlängen (460 und 650 nm) erfolgen. Bei
der visuellen Auswertung läßt sich eine weitere Steigerung der erhaltenen Farbstufen durch Zusatz eines
GSPHA46 J-ol
sogenannten Hintergrundfarbstoffes (z.B. Titangelb) erhalten.
Bei der Kombination der Redoxindikatoren INT/Thionin
erfolgt entsprechend den Normalpotentialen zuerst die Reduktion von INT und anschließend diejenige von Thionin.
Je nach dem gewählten Auswerteverfahren sind eine Vielzahl von Kombinationen von Redoxindikatoren für das
erfinduhgsgemäße Verfahren verwendbar.
Das Testsystem nach der Erfindung kann prinzipiell für alle NAD(P)H-BeStimmungen sowie für alle NAD(P)H verbrauchenden
oder bildenden Reaktionen verwendet werden. Die zu untersuchenden Proben sind vorzugsweise Körperflüssigkeiten
wie Serum/ Plasma, Urin usw.. Die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in der für enzymatische Methoden üblichen Weise, wobei man
im allgemeinen zuerst die NAD(P)H-umsetzende Reaktion ablaufen läßt und danach das gebildete oder verbrauchte
NAD(P)H bestimmt. Selbstverständlich ist bei NAD(P)H-bildenden Reaktionen auch eine direkte Kopplung möglieh.
Auch lassen sich Enzymaktivitäten dadurch bestimmen,
daß die Reaktion zu einer bestimmten Zeit gestoppt und das in dieser Zeit gebildete oder verbrauchte
NAD(P)H bestimmt wird. Die Redoxindikatoren werden vorzugsweise gleichzeitig zur Probelösung gegeben;
eine zeitlich getrennte Zugabe ist ebenfalls möglich.
Das erfindungsgemäße Testsystem eignet sich auch in Form von damit inprägnierten saugfähigen Materialien
als Indikator zur Bestimmung von NAD(P)H.
GSPHA46 J-ol
Bestimmung von NAD(P)H
Es werden die folgenden 3 Ansätze hergestellt:
Ansatz A Ansatz B Ansatz C
0,01 mmol/l PMS 0,01 mmol/l PMS 0,01 mmol/l PMS
0,25 mmol/l DIP 0,2 mmol/l INT 0,2 mmol/l INT
0,025 mmoi/1 Titangelb 0,025 mmol/l Titangelb 0,25 mmol/l DIP
0,025 mmol/l Titangelb
0,15 mol/1 Citrat- 0,15 mol/1 Citrat- 0,15 mol/1 Citrat-
puffer pH 5,8 puffer pH 5,8 puffer pH 5,8
Zu je 2 ml dieser Ansätze werden verschiedene Mengen an NADH (NADPH) gegeben. Nach jeweils 10 Minuten werden
die Extinktionen bei 460 und 650 nm sowie der Farbeindruck der jeweiligen Testlösung ermittelt. Abhängig
von der eingesetzten NADH- bzw. NADPH-Konzentration
in der Gesamttestlösung ergeben sich für den Farbeindruck folgende Resultate:
| NADH (NADPH) | Resultierender | Farbeindruck | der Testlösung | |
| 20 | [mmol/l] | Ansatz A | Ansatz B | Ansatz C |
| 0 | tiefblau | gelb | tiefblau | |
| 0,05 | dunkelblau | orange | dunkelblau | |
| 0,09 | blau | braun | blau | |
| 0,13 | hellblau | rot | hellblau | |
| 25 | 0,17 | blaugrün | blaugrün | |
| 0,22 | grün | grün | ||
| 0,24 | gelbgrün | gelbgrün | ||
| 0,26 | gelb | ocker | ||
| 0,27 | orange | |||
| 30 | 0,30 | braun | ||
| 0,34 | rotbraun | |||
| 0,38 | rot | |||
| 0,55 | dunkelrot | |||
| GSPHA46 J-ol |
Die Änderung der Extinktion der jeweiligen Testlösung ist in Abb. 1 dargestellt.
Während mit den Ansätzen A und B eine visuelle Bestimmung der NADH-Konzentration im Bereich bis maximal 0,25 mmol/1
möglich ist, ist mit Ansatz C eine Bestimmung bis zu 0,55 mmol/1 möglich.
Bestimmung von NADH
Zu 2 ml einer Lösung enthaltend
0/01 mmol/1 MPMS
0,2 mmol/1 INT
0,03 mmol/1 Thionin und
0,15 mol/1 Citratpuffer, pH 5,2
0,2 mmol/1 INT
0,03 mmol/1 Thionin und
0,15 mol/1 Citratpuffer, pH 5,2
werden verschiedene Mengen NADH gegeben. Nach 10 Minuten werden die Extinktionen der jeweiligen Testlösungen bei
460 und 600 nm ermittelt. Die erhaltenen Resultate,, abhängig
von der eingesetzten NADH-Konzentration in der Gesamttestlösung, sind in Abb. 2 dargestellt.
Für den Testansatz mit beiden Farbstoffen erhält man einen etwa doppelt so großen Meßbereich für die NADH-Bestimmung
als bei entsprechenden Testansätzen mit jeweils nur einem Farbstoff.
GSPHA46 J-ol
- Vf-
Bestimmung von NADH
Es werden die folgenden Ansätze hergestellt:
Ansatz A
Ansatz B
0,01 mmol/1 Meldolablau 0,25 mmol/1 DIP 0,025 mmol/1 Titangelb
Ö,15 mol/1 Citratpuffer
pH 5,8
0,01 mmol/1 Meldolablau 0,25 mmol/1 DIP 0,2 mmol/1 INT
0,025 mmol/1 Titangelb 0,15 mol/1 Citratpuffer pH 5,8
Zu je 2 ml dieser Ansätze werden· verschiedene Mengen
an NADH-gegeben. Nach jeweils 10 Minuten wird der Farbeindruck der jeweiligen Testlösung ermittelt.
Abhängig von der eingesetzten NADH-Konzentration in der Gesamttestlösung ergeben sich für den Farbeindruck
folgende Resultate:
| NADH Resultierender Farbeindruck der Testlosung | Ansatz A | Ansatz B |
| [mmol/1] | tiefblau | tiefblau |
| 0 | türkis | türkis |
| 0,10 | dunkelgrün | dunkelgrün |
| 0,20 | hellgrün | hellgrün |
| 0,25 | hellbraun | |
| 0,30 | hellrot-violett | |
| 0,35 | weinrot | |
| 0,40 | dunkelrot | |
| 0,50 |
Während mit Ansatz A eine visuelle Bestimmung der NADH-Konzentration
im Bereich bis 0,25 mmol/1 möglich ist, ermöglicht Ansatz B eine Bestimmung bis 0,5 mmol/1.
GSPHA46 J-ol
Bestimmung von Harnstoff im Serum
Zu 1,5 ml Reaktionslösung enthaltend
0,03 mol/1 Phosphatpuffer, pH 7,6
2,2 mmol/1 ADP
4.0 mmol/1 Ketoglutarat 0,5 mmol/1 NADH 30 KU/1 Glutamatdehydrogenase und
30 KU/1 Urease
werden 25 μΐ einer Serumprobe mit jeweils verschiedenem
Harnstoffgehalt (eingestellt durch Zugabe von Harnstoff, überprüft mit Standardmethode) gegeben. Nach 10 Minuten
werden jeweils 350 μΐ einer Lösung enthaltend
0,35 mol/1 Citratpuffer, pH 5,8
0,05 mmol/1 PMS 1,34 mmol/1 DIP
1.1 mmol/1 INT
0,13 mmol/1 Titangelb 250 U/l Diaphorase
zugegeben und nach weiteren 5 bis 10 Minuten der Farbeindruck der Reaktxonslösung im Durchlicht ermittelt. Man
erhält folgende Resultate:
GSPHA46 J-ol
1S
| Harnstoff | Resultierender Farbeindruck |
| [mg/dl] | der Testlösung |
| 0 | rot |
| 30 | rotbraun |
| 45 | braun |
| 55 | orange |
| 60 | ocker |
| 70 | gelbgrün |
| 80 | grün |
| 100 | blaugrün |
| 120 | hellblau |
| 150 | dunkelblau |
| 180 | tiefblau |
Während bei einem Testansatz mit nur einem Farbstoff
■] 5 visuelle Harnstoffbestimmungen bis zu 70 mg/dl durchgeführt
werden können, erlaubt das erfindungsgemäße System Bestimmungen bis zu 180 mg/dl.
Bestimmung von Harnsäure im Urin Zu 1,3 ml Reaktionslösung enthaltend
| 0,03 | mol/1 | Phosphatpuffer, pH 8, | 5 |
| 42 | mraol/1 | KCl | |
| 1,43 | mol/1 | Ethanol | |
| 0,5 | mmol/1 | NADP+ | |
| 1750 | U/l | Katalase | |
| 150 | U/l | Aldehyddehydrogenase | und |
| 50 | U/l | Uricase |
werden 200 ul Urinproben mit verschiedenem Harnsäuregehalt
gegeben (eingestellt durch Zugabe von Harnsäure, überprüft mit Standardverfahren). Nach 20 Minuten werden
GSPHA46 J-ol
zu der jeweiligen Testlösung 350 μΐ einer Lösung gegeben,
die folgende Bestandteile enthält:
0,5 mol/1 Citratpuffer, pH 5,8
0,05 mmol/1 PES
1,34 mmol/1 DIP
1,10 mmol/1 INT und
0,13 mmol/1 Titangelb
Nach weiteren 10 Minuten wird der Farbeindruck der Reaktionslösung im Durchlicht ermittelt. Man erhält fol-ο
gende Resultate:
Harnsäure Resultierender Farbeindruck [mg/dl] der Testlösung
0 ψ tiefblau
9 dunkelblau
15 blau
21 hellblau
29 blaugrün
37 grün
40 gelbgrün
42 ocker
45 braun
50 rotbraun
57 rot
64 dunkelrot
Während bei einem entsprechenden Test mit nur einem Farbstoff visuelle Harnsäurebestimmungen in einem
Bereich bis etwa 40 mg/dl durchgeführt werden können, sind mit dem erfindungsgemäßen System bis über 60 mmol/1
noch sicher erfaßbar.
GSPHA46 J-ol
Bestimmung von Lactatdehydrogenase im Sertun
Zu I72 ml Reaktionslösung enthaltend
0,03 mol/1 Phosphatpuffer, pH 7,5 0,6 mmol/1 Pyruvat und
0,5 mmol/1 NADH
werden 100 μΐ einer Serumprobe mit verschiedener LDH-Aktivität
zugegeben (eingestellt durch Zugabe von LDH, überprüft mit Standardmethode). Nach 10 Minuten bei
25 0C werden 300 μΐ einer Lösung zugegeben, die
0,5 mol/1 Citratpuffer, pH 5,8 1,34 mmol/1 DIP
1,10 mmol/1 INT 0,05 mmol/1 PMS 0,13 mmol/1 Titangelb und 4 mmol/1 Oxamidsäure
enthält. Nach weiteren 10 Minuten wird der Farbeindruck der jeweiligen Gesamttestlosüng bestimmt. Man erhält
folgende Resultate:
LDH Resultierender Farbeihdruck
[u/l] der Testlösung
| 32 | rot |
| 96 | rotbraun |
| 160 | braun |
| 25 210 | orange |
| 225 | ocker |
| 255 | gelbgrün |
| 290 | grün |
| 370 | blaugrün |
| GSPHA46 J-Ol |
AS
430 hellblau
500 blau
560 dunkelblau
640 tiefblau
Während bei einem entsprechenden Test mit nur einem Farbstoff LDH-Bestimmungen mit visueller Auswertung
in einem Bereich bis maximal 225 U/l durchgeführt werden können, sind mit dem erfindungsgemäßen Testsystem
Bestimmungen bis über 600 U/l möglich.
GSPHA46 J-ol
Ab - Leerseite -
Claims (8)
1. Testsystem mit erweitertem Meßbereich zur Bestimmung von NAD(P)H, bzw. von unter Bildung
oder Verbrauch von NAD(P)H reagierenden Substraten oder Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß
es gleichzeitig mehrere, unabhängig voneinander gegenüber NAD(P)H als Elektronenakzeptor fungierende
Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen enthält.
2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die als Elektronenakzeptoren fungierenden Substanzen Redoxindikatoren mit einem Normalpotential
zwischen -0,3 und +0,5, vorzugsweise zwischen -0,3 und +0,3, sind.
3. Testsystem nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Elektronenüberträger
enthält.
GSPHA46 J-ol
ORIGINAL fNSPECTED
4. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß es als Redoxindikatoren Dichlorphenolindophenol und ein Tetrazoliumsalz
enthält.
5. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Elektronenüberträger
Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat, Methoxyphenazinmethosülfat,
Meldolablau, Diaphorase oder Gemische dieser Substanzen enthält.
6. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Hintergrundfarbstoff enthält.
7. Verfahren zur Bestimmung von NAD(P)H bzw. von unter Bildung oder Verbrauch von NAD(P)H reagierenden
Substraten oder Enzymen in wäßriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Probelösung gleichzeitig
mit mehreren, unabhängig voneinander gegenüber NAD(P)H als Elektronenakzeptor füngierenden
Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen behandelt wird, wobei verschiedene
analytisch unterscheidbare Endprodukte entstehen, die meßtechnisch oder visuell ausgewertet
werden. "
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in einer gepufferten wäßrigen
Lösung vom pH-Bereich 4,5 - 8, vorzugsweise 5,0 7, durchgeführt wird.
GSPHA46 J-ol
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