DE3318184A1 - Traeger zur beschichtung mit immunologisch aktivem material - Google Patents

Traeger zur beschichtung mit immunologisch aktivem material

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
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    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures

Description

BOEHRINGER MANNHE-IM-GMEf]H-" *··* '·-*"·· 2H7Q 1 g 1 Q Λ
Träger zur Beschichtung mit immunologisch aktivem Material
In der Immunologie werden häufig Kunststoffartikel benutzt, an deren Oberfläche immunologisches Material gebunden ist. Durch die Verwendung derartig beschichteter Kunststoffartikel wird die bei einem immunologischen Testverfahren üblicherweise erforderliche Trennung des gebundenen von dem nichtgebundenen Anteil erleichtert. So werden beispielsweise Radioimmunoassays und Enzymimmunoassays zur Bestimmung eines Antigens oder Haptens durchgeführt, indem man die Lösung mit dem zu bestimmenden Antigen oder Hapten in ein Kunststoffgefäß gibt, dessen Innenseite mit dem gegen das Antigen bzw. Hapten gerichteten Antikörper beschichtet ist. In das Gefäß wird ferner eine bekannte Menge des zu bestimmenden Antigens bzw. Haptens gegeben, das in charakteristischer Weise markiert ist, beispielsweise mit einem Enzym oder einem radioaktiven Material. Das zu bestimmende Antigen/Hapten und das markierte Antigen/Hapten konkurrieren um die Antikörperbindungsstellen. Es stellt sich ein Gleichgewicht zwischen dem an den Antikörper gebundenen und dem in der Lösung verbliebenen freien Anteil des Antigens bzw. Haptens ein.
Die Lösung mit dem freien Anteil wird aus dem Gefäß entfernt Der durch den Antikörper gebundene Anteil bleibt an der Gefäßwand haften und kann dort nachgewiesen werden.
Um mehrere miteinander vergleichbare Bestimmungen durchführen zu können, ist es erforderlich, daß die Beschichtung der Kunststoffgefäße mit dem entsprechenden Antikörper, falls ein Antigen bzw. Hapten nachgewiesen werden soll, bzw. mit einem Antigen oder Hapten, falls ein Antikörper nachgewiesen werden soll, mit sehr großer Gleichmäßigkeit erfolgt. Schwankt die Beschichtungsdichte von Gefäß zu
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Gefäß, so wirkt sich dies auf die sehr empfindliche immunologische Reaktion aus. Die Meßergebnisse werden verfälscht.
Es sind die verschiedenartigsten Träger in Form von Platten, Kugeln, Streifen, Stäbchen oder Reagensröhrchen aus den verschiedenartigsten Kunststoffen im Handel. Werden diese
handelsüblichen Träger mit immunologischem Material beschichtet, so schwankt die Beschichtungsdichte und damit das bei der immunologischen Reaktion erhaltene Meßergebnis erheblich. Es werden Variationskoeffizienten beobachtet, die im allgemeinen bei den hochempfindlichen
Immunotesten nicht akzeptiert werden können. In Clin.Chem. lb_ (1980) 741-744 werden beispielsweise für Microtiterplatten aus Polystyrol Variationskoeffizienten von 5,2
bis 29,5 % angegeben.
Es hat nicht an Versuchen gefehlt, die Variationskoeffizienten zu verbessern. So wird beispielsweise gemäß
DE-OS 25 44 366 versucht, durch Glutardialdehyd-Vernetzung die Bindung des immunologischen Materials an die Trägero.berfläche zu verstärken und zu vereinheitlichen. Auch
durch Variation der Beschichtungszeiten, mit Hilfe
einer Vorbeschichtung bzw. Nachbeschichtung wurde versucht, eine einheitliche Beschichtungsdichte zu erzeugen (vgl. Biochemica et Biophysica Acta 492 (1977) 399-407). Darüberhinaus wird in J. Immunol. .Methods _2_3 (1978) 23-28 sowie 47 (1981) 121-124 berichtet, daß durch Zusatz
eines Detergens (Twecn 20 bzw. Tween 80) eine verstärkte Adsorption des immunologischen Materials an die Trägeroberfläche erreicht wird. Ein weiterer Versuch, die
Beladungsdichte gleichmäßig zu gestalten, bestand darin, das immunologische Material kovalcnt an die Trägeroberfläche zu binden. Dieses Prinzip ist beispielsweise in der DH-OS 27 38 138 beschrieben und beansprucht.
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All diese Bemühungen führten zwar zu einer verstärkten Bindung der Antikörper bzw. des Antigens an die Kunststoffoberfläche und führten auch zu einer Verbesserung des Variationskoeffizienten. Die bisher üblichen Handelsprodukte weisen Variationskoeffizienten von 5 bis 10 % auf. Es ist somit nicht gelungen, in solchem Maße eine gleichmäßige Beladungsdichte zu erzeugen, daß die mit diesen Materialien erhaltenen Meßergebnisse in der Praxis zufriedenstellen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Kunststoffträger bereitzustellen, der gleichmäßig mit immunologisch aktivem Material beschichtet werden kann.
Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, daß Träger bereit-1^ gestellt werden, die aus Kunststoffen mit einem Gehalt an Hilfs- und Zusatzstoffen von weniger als 1 Gew.-I bestehen.
Die bisher zur Herstellung solcher Kunststoffartikel für immunologische Zwecke verwendeten Kunststoffe enthalten üblicherweise je nach Kunststoff 1-50 Gew.-°s Hilfsund Zusatzstoffe. Als solche Hilfs- und Zusatzstoffe werden üblicherweise Stabilisatoren, Gleitmittel, Weichmacher, Trennmittel, Pigmente, Füllstoffe usw. verwendet. Luran, ein häufig zur Herstellung von Kunststoffträgern verwendeter Kunststoff, enthält beispielsweise 1-5 Gew.-? 0, Polyvinylchlorid sogar bis 50 Gew.-% solcher Zusatzstoffe.
Als Kunststoffe können erfindungsgemäß prinzipiell alle Kunststoffe verwendet werden, die sich zur Herstellung von Kunststoffgegenständen im Spritzgußverfahren eignen. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kunststo ffträger haben sich besonders vorteilhaft erwiesen: Polystyrol, Luran bzw. Polyvinylchlorid. Es ist lediglich darauf zu achten, daß nur solche Kunststoffchargen verwendet
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werden, deren Hilfs- und Zusatzstoffgehalt weniger als 1 Gew.-°a beträgt. Vorzugsweise werden nur Luranchargen eingesetzt mit einem Hilfs- und Zusatzstoffgehalt von weniger als 0,02 Gew.-°ö oder Polystyrolchargen mit einem Hilfs- und Zusatzstoffgehalt von weniger als 0,05 Gew.-I.
Die Kunststoffträger können in jeder beliebigen Form hergestellt werden. Üblich sind Platten, Kugeln, Reagensröhrchen oder auch Streifen und Stäbchen. 10
Die Kunststoffträger werden üblicherweise im Spritzgußverfahren hergestellt. Die Spritzgußbedingungen können in den üblichen Grenzen gewählt werden. Es ist jedoch darauf zu achten, daß der gewählte Druck und die gewählte Temperatur während des Spritzvorgangs in engen Grenzen gehalten werden. Ferner ist es, um optimale Ergebnisse zu erlangen, erforderlich, daß die Oberfläche der Spritzgußform sehr homogen ist und keine Unebenheiten aufweist.
Die erfindungsgemäß hergestellten Kunststoffträger lassen sich bekannterweise mit immunologisch aktivem Material, d.h. mit Antikörpern, Antigenen und Haptenen beschichten. Hierzu wird eine Lösung des immunologisch aktiven Materials eine zur Beladung ausreichende Zeit auf die Kunststoffträger einwirken lassen. Als Lösungsmittel wird im allgemeinen Wasser benutzt, das einen geeigneten Puffer enthält. Der pH-Wert der Lösung liegt vorzugsweise im neutralen Bereich. Zur vollständigen Beladung des Kunststoffträgers genügt im allgemeinen eine Hinwirkungszeit von 12-24 Stunden. Die Temperatur kann im Bereich von 15-30 gewählt werden. Sie sollte jedoch während der Inkubation nur innerhalb - 0,50C schwanken.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, der eigentlichen Beladung eine Nachbeladung anzuschließen, bei der die mit dem immunologischen Material beschichteten Kunststoffträger einer Lösung ausgesetzt werden, die ein geeignetes Salz, beispielsweise Natriumchlorid, und ein Stabilisierungsmittel, beispielsweise Rinderserumalbumin, enthält. Zur Nachbeladung genügen 10-120 Minuten, vorzugsweise 15-60 Minuten.
Die so beschichteten Röhrchen werden steril verpackt und als solche in den Handel gebracht. Sie sind mehrere Monate stabil und können in üblichen Immunotestverfahren verwendet werden. Sie weisen einen Variationskoeffizient von ·< 5 auf. Die mit den erfindungsgemäßen Kunststoffträgern erhaltenen Testergebnisse weisen eine deutlich geringere Schwankungsbreite auf als die Resultate, die in analoger Weise mit bisher üblichen Kunststoffträgern gewonnen worden sind.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:
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Beispiel Antikörperlösung
95 2 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat p.a. werden in 5 1 Wasser gelöst und mit 5 N Natronlauge auf pH 7,1 eingestellt. Diese Lösung wird in 165 1 Wasser eingerührt. Der pH-Wert wird auf 7,1 - 7,4 gegebenenfalls durch Zugabe von 5 N Natronlauge eingestellt.
In 500 ml dieser .Pufferlösung werden 8,5 ml Antiserum- und 8,5 ml Rinderserumalbumin-Lösung OjS g auf 25 ml Wasser) gegeben und 30 Minuten gerührt. Die so erhaltene Antiserum-Lösung wird mit Puffer auf 2 1 aufgefüllt und wiederum 30 Minuten gerührt. Diese Lösung wird mit der restlichen Pufferlösung vereinigt und erneut 30 Minuten gerührt.
Beladung
100.000 Röhrchen aus Polystyrol 168N K21 (enthält <O,9 % Zusatzstoffe) werden jeweils mit 1,5 ml - 5 % gefüllt.
Die Antikörperlösung wird 16-18 Stunden bei 20 ± O,5°C auf die Röhrchen einwirken lassen und danach abgesaugt.
Nachbeladung
Zunächst werden 1710 g Natriumchlorid p.a. 570 g Serumalbumin vom Rind Typ II in 180 1 Wasser gelöst, 30 Minuten gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die mit Antikörper beladenen Röhrchen werden jeweils mit 1,7 ml - 5 ο der oben beschriebenen Nachbeladungslösung gefüllt. Die Lösung wird 15-30 Minuten auf die
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Röhrchen einwirken lassen. Danach werden die Röhrchen entleert und zweimal ausgespült und in einer Trockenbox 14-16 Stunden getrocknet.
Ermittlung des Variationskoeffizienten
Aus jeder Untereinheit (= 10.000 Röhrchen) einer Beladungscharge werden willkürlich 100 Röhrchen (=1 %) gezogen und registriert. Die Röhrchen werden in zwei Gruppen zu je 50 Röhrchen für eine erste und zweite Testserie aufgeteilt. Mit den Röhrchen der ersten Testserie wird ein üblicher Enzymimmuntest durchgeführt. Nach erfolgter Substratreaktion werden die Lösungen an einem Photometer gegen Substratlösung in einer Durchflußküvette vermessen und die erhaltenen Extinktionswerte registriert.
Aus den Einzelextinktionen E1 bis E5 wird die gemittelte Extinktion E errechnet. Die Standardabweichung S wird nach Gleichung (1)
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und der Variationskoeffizient VK nach Gleichung (2) (2) VK = S / E /"%_?
ermittelt.
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Für die oben beschriebenen, aus Polystyrol 168N K21 hergestellten Röhrchen ergibt sich auf diese Weise ein Variationskoeffizient von VK = 2,8 %.

Claims (8)

Patentansprüche
1. Träger zur Beschichtung mit immunologisch aktivem Material, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Kunststoff mit einem Gehalt an Hilfs- und Zusatzstoffen von weniger als 1 Gew.-% besteht.
2. Träger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kunststoffe Polystyrol, Luran, Polypropylen und/oder Polyvinylchlorid verwendet werden.
3. Träger gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Kunststoff Luran mit einem Gehalt an Hilfs- und Zusatzstoffen von weniger als 0,02
^5 Gew.-I oder Polystyrol mit einem Gehalt an Hilfsund Zusatzstoffen von weniger als 0,05 Gew.-°s verwendet wird.
4. Verfahren zur Herstellung eines Trägers gemäß einem 2(^ der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß er in üblicher Weise im Spritzgußverfahren hergestellt worden ist.
5. Mit immunologisch aktivem Material beschichteter
Träger, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Kunststoff mit einem Gehalt an Hilfs- und Zusatzstoffen von weniger als 1 Gew.-I besteht.
6. Träger gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
als Kunststoffe Polystyrol, Luran® Polypropylen und/ oder Polyvinylchlorid verwendet werden.
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7. Träger gemäß Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Kunststoffe Luran mit einem Gehalt an Hilfsund Zusatzstoffen von weniger als 0,02 Gew.-I oder aus Polystyrol mit einem Gehalt an Hilfs-.und
5 Zusatzstoffen von weniger als 0,05 Gew.-I verwendet wird.
8. Verwendung eines Trägers gemäß einem der Ansprüche 5-7 bei der Durchführung von Immunoassays.
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