DE3321238A1 - Verfahren und vorrichtung zur fusion von zellen - Google Patents
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Description
3 3 2 1
Kernforschungsanlage Jülich
Gesellschaft mit beschränkter Haftung
Gesellschaft mit beschränkter Haftung
Verfahren und Vorrichtung zur Fusion von Zellen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Fusion von Zellen, bei dem die in einer
Zellsuspension im Fusionsraum befindlichen Zellen durch äußere Kräfte auf einen geringen Abstand
zueinander gebracht werden und in der Membranstruktur der einander benachbarten Zellen durch
äußere Einwirkungen Störungen verursacht werden, die zur Bildung von Membranbrücken zwischen
benachbarten Zellen und zur Verschmelzung der Zellen führen.
Zwei Zellen in einer Suspension sollten, wenn sie sich berühren und ein enger Kontakt zwischen
den Membranen beider Zellen entsteht, miteinander verschmelzen, da die Bausteine in der
Membran beweglich sind. Eine derartige spontane Verschmelzung (Fusion) von Zellen wird unter
natürlichen Bedingungen nicht oder nur äußerst selten beobachtet. Eine bekannte Ausnahme stellt
die Befruchtung einer Eizelle durch eine Samenzelle bei der sexuellen Fortpflanzung dar. Die spontane
Fusion wird durch die negative Ladung der Phospholipide und anderer Membrankomponenten behindert.
Sie führt zur Abstoßung der Zellen, wenn sie sich auf einen geringen Abstand genähert haben.
Zellverschmelzung erfordert aber, daß die beiden Membranen sich bis auf einen Abstand von weniger
als 10 cm nähern können.
Die mit technischen Mitteln durchgeführte Fusion von Zellen ist in einem weiten Anwendungsbereich
einsetzbar. So ist es für die biologisch- medizinische Forschung von großem Interesse, eine
große Zahl von Zellen miteinander zu verschmelzen. Bei geeigneter Größe der durch Fusion mehrerer
oder gegebenenfalls vieler Zellen - beispielsweise 1000 bis 10000 Blutkörperchen - entstandenen
großen Zellen lassen sich dann Mikroelektroden, Mikrodruckmeßsonden und andere Sensoren ohne
irreversible Zerstörung der Membran in die große Zelle einführen. Die Technik, über die Sensoren
direkt eine Reihe von Zellen und Membranfunktionen zu erfassen, ist dabei für die klinische Diagnostik,
z.B. bei der Früherkennung von Erkrankungen sowie generell für die Grundlagenforschung von
Bedeutung.
Die Technik der Fusion von Zellen kann außerdem eingesetzt werden für die Bildung von Hybridzellen
durch Verschmelzung von zwei Zellen unterschiedlicher Herkunft. Dabei können Zellhybride aus Pflanzenzellen,
aus denen wieder ganze Pflanzen gezüchtet werden können oder Zellhybride aus tierischen
Zellen, über die monoklonale Antikörper, z.B. gegen Tumore und Leukämie, gewonnen werden können,
gebildet v/erden. Als Beispiel sei genannt die Verschmelzung einer Lymphozytenzelle mit einer
Myelomzelle, die besonders aus medizinischer
und pharmazeutischer Sicht von großem Interesse ist. Bestimmte Lymphozyten bilden gegen Fremdstoffe
im Organismus Antikörper, z.B. gegen ein Fremdeiweiß, das in die Blutbahn injiziert
worden ist. Isoliert man die Lymphozyten und fusioniert sie mit einer Tumorzelle, wie der
Myelomzelle, so besteht die Chance, daß sich
eine sogenannte Hybridomzelle bildet, die die -«.. Eigenschaft beider Elternzellen besitzt. Diese
Zelle produziert Antikörper, und zwar spezifisch nur gegen den betreffenden Fremdstoff (sogenannte
monoklonale Antikörper). Sie ist unsterblich und läßt sich im Gegensatz zu einer normalen
ausdifferenzierten Zelle, wie dem Lymphozyten, permanent in Nährmedien vermehren.
Ein Verfahren zur Fusion von Zellen der eingangs bezeichneten Art ist aus Biochimica et Biophysica
Acta, 694 (1982), 227 - 277 (Electric Field-Mediated Fusion And Related Electrical Phenomena, U. Zimmermann)
bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren - dessen Ablauf unter dem Mikroskop beobachtet
werden kann - 'wird der Membrankontakt zwischen wenigstens zwei Zellen durch Anlegen eines alternierenden,
schwach inhomogenen Feldes erzeugt.
Durch das elektrische Feld werden, bedingt durch Polarisationsprpzesse in der Zelle, Dipole
erzeugt, die sich gegenseitig anziehen, wenn die Zellen während ihrer Wanderung im elektrischen
Feld sich einander nähern (sogenannte Dielektrophorese). Nach der Bildung der Zellenreihe
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werden die Störungen in der Membranstruktur zwischen benachbarten Zellen durch einen elektrischen
Durchbruchpuls ausgelöst (J. Membrane Biol. 67,
165 - 182 (1982), Electric Field-Induccd Cell-to-Cell
Fusion, U. Zimmermann and J. Vienken).
Dabei werden - nach den bisherigen Modellvorstellungen - Löcher in der Membrankontaktζone
benachbarter Zellen erzeugt, die zu einem zytoplasmatischen
Kontinuum zwischen den beiden
f'Ö Zellen und zur Brückenbildung von Lipiden zwischen
den Membranen der benachbarten Zellen führen. Die Lipidmoleküle ordnen sich nicht mehr in
ihre ursprüngliche Membran ein. Sobald sich eine Brücke gebildet hat, kommt es aus energetischen
5 Gründen zur Abrundung des entstandenen Gebildes,
das aus den über die Lipidbrücken miteinander verbundenen Zellen besteht.
Bei der Durchführung der bekannten Verfahrensweise
der Sammlung der Zellen durch Dielektrophorese
ist es jedoch erforderlich, daß die Lösung, in der sich die Zellen während der Durchführung
des Verfahrens befinden, möglichst wenig leitend ist, da sonst die Wärmeentwicklung zu hoch ist,
was zu Turbulenzen und zur Zerstörung des engen Membrankontaktes zwischen einander benachbarten
Zellen führen kann. Das ist insofern von Nachteil, als eine nur wenig leitfähige Lösung nicht oder
wenig zellverträglich ist und die Zellen daher in einem wenig leitenden Medium Schädigungen
erleiden können, was u.a. ihre Lebensdauer beeinträchtigt.
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r · # V ■*
Es ist ferner bekannt, die elektrischen Abstoßungskräfte, die bei geringem Abstand zwischen den
Membranen zweier Zellen auftreten, durch Einsatz bestimmter Chemikalien, wie Polyethylenglykol
(PEG) oder inaktivierte Viren, auszuschalten. Sowohl Viren als auch PEG vernetzen die beiden
Zellmembranen, so daß ein enger Membrankontakt entsteht. Gleichzeitig werden durch die Viren
und das PEG Störungen in der Membranstruktur erzeugt, die durch Einstellen unphysiologischer
Bedingungen, wie z.B. Zugabe hoher Konzentrationen von Calciumionen und Wahl eines sehr hohen oder
niedrigen pH-Wertes, noch verstärkt werden. Diese Störungen bewirken, daß sich in der Membrankontaktzone
Löcher bilden und es damit zur Ausbildung von Phospholipidbrücken zwischen den benachbarten Zellmembranen kommt. Dies führt
zur Verschmelzung der beiden Zellen unter Ausbildung einer neuen Einheit.
Bei der Durchführung der zuletzt genannten bekannten Verfahren kann jedoch die Zahl der miteinander
zu verschmelzenden Zellen nicht gesteuert werden. Einerseits führt eine zu geringe Zelldichte
in der die Zellen enthaltenden Lösung praktisch zu keinen Fusionsprodukten, da die Zellen nicht
in Kontakt zueinander kommen. Andererseits führt eine für eine Fusion hinreichende Zelldichte
- die auch durch Zentrifugieren der die Zellen enthaltenden Lösung erreicht werden kann - in
unkontrollierter Weise zu Produkten, die aus dem Zwei-, Drei-, Vier- oder Vielfachen von
individuellen Zellen bestehen.
Insbesondere im Hinblick auf die Bildung von Hybridzellen durch Verschmelzung von nur zwei
Zellen unterschiedlicher Herkunft sind die zuletzt genannten bekannten Verfahren sehr unzufriedenstellend.
Denn Zellhybride, die eine neuartige Kombination von Eigenschaften aufweisen,
müssen nach der Durchführung der bekannten Verfahren erst durch die Anwendung sehr zeitraubender
Selektionsmethoden isoliert werden.
Die Gewinnung von Zellhybriden aus Pflanzenzellen, aus denen wieder ganze Pflanzen gezüchtet
werden können oder von Zellhybriden aus tierischen Zellen, über die monoklonale Antikörper,
z.B. gegen Tumore und Leukämie, gewonnen werden können, erfordert eine Fusionstechnik,
bei der jeweils nur zwei Zellen miteinander fusionieren.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Fusion von Zellen zu schaffen, bei dessen
Durchführung sich die Zellen auch in einer höher leitenden Lösung befinden können, die Zellen
aber dennoch von dem eigentlichen Verfahrensschritt der Fusion zunächst auf geringen Abstand
zueinander gebracht werden.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß die Zellen mit magnetischen Teilchen
dotiert und einem den Fusionsraum durchdringenden inhomogenen magnetischen Feld derart ausgesetzt
werden, daß sich die dotierten Zellen in geringem Abstand zueinander ansammeln, worauf
--4Z
-r
zur Erzeugung der Störungen in der Membranstruktur der benachbarten Zellen die Zellen entweder
dem Puls eines elektrischen Feldes von mindestens der Höhe der Durchbruchspannung oder die Störungen
in der Membranstruktur verursachenden Chemikalien, wie Polyethylenglycol, oder die Störungen in
der Membranstruktur verursachenden inaktivierten Viren, wie Sendai-Viren, ausgesetzt werden.
-*.. Der Verfahrensschritt des Sammelns der Zellen
läuft, da er allein unter Einwirkung magnetischer Kräfte und ohne elektrischen Stromfluß erfolgt,
ohne jegliche Wärmeentwicklung ab. Dabei können die Zellen auch in einer Lösung mit höherer
Leitfähigkeit suspendiert sein, beispielsweise in dem für die Zellen vorgesehenen Nährmedium
oder in einem Medium, dessen Kalium-Konzentration gleich der Ionenkonzentration in der Zelle ist.
Für den Fall, daß die Fusion der Zellen durch elektrischen Durchbruch erfolgen soll, genügt
dann - infolge der höheren Leitfähigkeit der Zellsuspension - eine Pulslänge im Bereich von
Nano-Sekunden.
Durch die Verfahrensweise gemäß der Erfindung
ist eine kontrollierte Fusion zweier oder einer vorbestimmten Anzahl von Zellen auch dann möglich,
wenn Polyethylenglycol oder Sendai-Viren zur • Störung der Membranstruktur eingesetzt werden.
Die miteinander zu verschmelzende Zahl der Zellen kann dabei auch durch die vorgegebene Zelldichte
in der Zellsuspension gesteuert werden. Darüberhinaus ist durch das Verfahren gemäß dor Erfindung
auch die Möglichkeit geschaffen worden, diese "nichtelektrischen" Fusionsverfahren im Hinblick
auf die Dosierung der die Störungen bewirkenden Mittel genauer zu untersuchen bzw. zu optimieren
■-42,
Das insbesondere auch deshalb, weil die Sammlung
der Zellen am Ort der höchsten Felddichte bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung
unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. 5
Zweckmäßig istr daß die magnetischen Teilchen
auf die Oberfläche der Zellen aufgebracht werden. Um die magnetischen Teilchen in möglichst feiner
Verteilung auf die Oberfläche der Zellen aufzubringen und um außerdem zu vermeiden, daß sich in der
Zellsuspension einzelne, nicht an der Oberfläche der Zellen adsorbierte magnetische Teilchen
befinden, werden die Zellen zweckmäßigerweise zur Aufnahme der magnetischen Teilchen auf ihre
Oberfläche in eine Lösung gegeben, die die magnetischen Teilchen kolloidal gelöst enthält.
Nach einer gewissen Zeit, nach der der Adsorptions« Vorgang weitgehend beendet ist, können die in
der kolloidalen Lösung vorhandenen überschüssigen magnetischen Teilchen durch Abzentrifugieren
der Zellen von diesen getrennt werden.
Es kann Cerner zweckmäßig sein, daß die magnetischen
Teilchen nicht an der Oberfläche der Zellen adsorbiert, sondern in diese eingebracht werden
sollen. Dazu wird die Durchlässigkeit der Membran der Zellen, die sich in einer die magnetischen
Teilchen in kolloidaler Form enthaltenden Lösung befinden, durch Anwendung eines elektrischen
Feldpulses erhöht, so daß die magnetischen Teilchen ■in das Zellinnere gelangen. So werden beispielsweise
durch eine Zellsuspension die Erythrozyten und Fe 0 -Partikeln enthält ein Feldpuls von etwa
15 kV/cm und 50 μΞ Dauer appliziert und damit
Copy
- y-
y-
eine hinreichende Permeabilitätserhöhung der Zellmembranen
erzielt, um die Fe.,O .-Teilchen in
die Erythrozyten gelangen zu lassen.. Nach Ausheilen der Permeabilitätserhöhung können die zusätzlich
an der Oberfläche adsorbier-ten Magnetteilchen durch mehrmaliges Waschen der Zellen mit einer
isotonen Lösung entfernt worden.
Zweckmäßigerweise werden als magnetische Teilchen ferromagnetische Teilchen, insbesondere Fe_O.-Partikeln,
eingesetzt.
Für den Fall, daß eine besondere Ausrichtung der Zellen, insbesondere eine Aufreihung der
Zellen in Form einer Perlenkette, gewünscht ist, werden die Zellen nach der Sammlung im
Bereich der höchsten Felddichte des magnetischen Feldes einem äußeren, inhomogenen elektrischen
Feld einer Frequenz im Bereich von 5 kHz bis 2 MHz und einer Stärke im Bereich von 10 V/cm
bis 2000 V/cm je nach Größe der Zellen für kurze Zeit - im allgemeinen einige Sekunden - derart
ausgesetzt, daß sich die Zellen in der vorbestimmten Ausrichtung aneinanderreihen. Da die Zellen
vor Anwendung des elektrischen Wechselfsides bereits durch die Einwirkung des magnetischen
Feldes gesammelt worden waren, bedarf es nur einer kurzen Einwirkung des elektrischen Feldes, um
die gewünschte Aufreihung der Zellen zu erreichen. Eine Erwärmung der Zellsuspension und
damit der Zellen ist damit - bei gleichzeitigem Erzielen einer Zellenreihe - weitgehend vermieden.
Für den Fall, daß die Störungen in der Membran-
- 10 -
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1CK - /Ιέ'
Struktur durch Verwendung von Polyethylenglycol oder Sendai-Viren bewirkt werden, wird zweckmäßigerweise
zunächst das Mittel der die Zellen enthaltenden Suspension zugegeben, danach die Zellen
gesammelt oder gesammelt und anschließend in Reihen ausgerichtet und sodeinn Calciumionen
zur Bewiikung der Störungen in der Membran der Zellen zugegeben. Bei Verwendung von Sendai-Viren
wird außerdem die Temperatur auf 37 0C erhöht. Bei dieser Verfahrensweise setzt die Wirkung
der Mittel erst nach Ausrichtung der Zellen ein.
Für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung unter Verwendung von die Störungen
in der Membranstruktur bewirkenden Chemikalien oder Viren ist eine Vorrichtung geeignet, bei
der eine Kammer mit einem aus elektrisch nichtleitenden Wänden gebildeten Raum zur Aufnahme einer
Zellsuspension vorgesehen ist und bei der ein Magnet derart an der Kammer angeordnet ist,
daß der Raum der Kammer von einem inhomogenen magnetischen Feld durchdrungen wird. Als Magnet
kann ein Permanentmagnet, jedoch auch ein Elektromagnet odor eine Kombination von beiden Verwendung
finden, mit der man beispielsweise die magnetischen Feldkräfte praktisch bis auf Null ändern kann.
Für die Durchführung der Ausführungsvariante des Verfahrens gemäß der Erfindung, bei der
die Störungen in der Membranstruktur der Zellen durch elektrischen Durchbruch bewirkt werden,
ist eine Vorrichtung geeignet, bei der eine Kammer mit einem aus elektrisch nichtleitenden
Wänden gebildeten Raum zur Aufnahme einer Zellsuspension vorgesehen ist, in den wenigstens
COPY ■
zwei Elektroden derart hineinragen, daß ein zwischen den Elektroden begrenzter Bereich gebildet
wird, in welchem die Zellen einem zwischen den Elektroden ausgebildeten elektrischen Feld
ausgesetzt sind und bei dem ein Magnet an der Kammer derart angeordnet ist, daß der Raum der
Kammer von einem inhomogenen magnetischen Feld durchdrungen wird.
Eine vorteilhafte Ausführungsform der Vorrichtung
besteht bei beiden VorrichtungsVarianten darin, daß der Magnet derart an der Kammer angeordnet
ist, daß das den Raum durchdringende magnetische Feld mit seiner höchsten Dichte einem in den
Raum der Kammer hineinragenden Teil des Magneten entspringt. Das in den Raum hineinragende Teil
des Magneten ist dabei zweckmäßigerweise eine Spitze oder Kante aufweisender Polschuh. Der Polschuh
kann dabei zugleich eine dor Elektroden sein.
Ausführungsvarianten der Vorrichtung gemäß der Erfindung sind in der Zeichnung schematisch dargestellt
und werden im folgenden näher erläutert:
Es zeigen
Figur 1 den Kammerraum zur Aufnahme der Zellsuspension mit beidseitig des Raumes
angeordneten Magnetpolen, Figur 2 den Kammerraum mit nur auf einer
Seite des Raumes angeordnetem Magneten,
Figur 3 Anordnung des Magneten gemäß Figur 1 mit in den Kammerraum hineinragenden
Elektroden,
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Figur 4 Anordnung des Magneten gemäß Figur 1 mit in den Kammerraum hineinragendem
und zugleich als Elektrode ausgebildetem Teil des Magneten,
Figur 5 Anordnung des Magneten gemäß Figur 1,
bei der beide Magnetpole in den Kammerraum hineinragen und als Elektroden
ausgebildet sind,
Figur 6a Draufsicht auf eine Kammer zur Behandlung der Zellen im elektrischen Feld mit
in den Kammerraum hineinragendem Polschuh des Magneten,
Figur 6b Längsschnitt durch die Kammer gemäß Figur 6a entlang der Linie A-B.
Die in Figur 1 und Figur 2 gezeigten Anordnungen dienen der Durchführung derjenigen Verfahrensvarianten, bei denen der Durchbruch der Zellen
durch chemische Mittel oder durch inaktivierte Viren bewirkt wird. Der Kammerraum 1 ist dabei
entweder oben offen oder geschlossen, wobei im letzteren Fall eine Möglichkeit zum Füllen
des Kammerraumes mit Zellsuspension, beispielsweise eine Zu- und Ableitung, vorgesehen ist.
Bei der in Figur 3 dargestellten Anordnung ragen in den Kammerraum zwei Elektroden 2 und 3 hinein,
deren Abstand je nach Art und Größe der zu behandelnden Zellen im allgemeinen zwischen -5 μΐη.
und 1000 pm liegt. Die dem Nordpol des Magneten,
dem das magnetische Feld mit hoher Felddichte entspringt, zugewandte Elektrode 3 liegt direkt
an der dem Nordpol zugewandten Kammerwand an
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oder ist als diese ausgebildet. Zu dieser Elektrode gelangen die Zellen, die sich auf den Ort höchster
magnetischer Felddichte zu bewegen. Die Zellen sammeln sich dabei in dichter Packung und können
durch einen über die Elektroden geleiteten elektrischen Puls in der Höhe der Durchbruchsspannung
fusioniert werden. Die Elektroden sind dabei im allgemeinen an eine - in der Zeichnung nicht
dargestellte - Einrichtung zur Erzeugung eines Rechteckpulses (für den elektrischen Durchbruch)
bis 300 V angeschlossen.
Sollen die Zellen nach der Sammlung im magnetischen Feld und vor der Fusionierung in Form einer
Perlenkette aneinandergereiht werden, so ist an die Elektroden im allgemeinen eine Einrichtung
zur Erzeugung eines elektrischen Wechselfeldes mit einer Ausgangsspannung von 50 V angeschlossen.
Bei der in Figur 4 dargestellten Anordnung ragt ein Teil des Magneten - ein eine Spitze aufweisender
Polschuh - in den Kammerraum 1 hinein und ist zugleich als Elektrode 3 ausgebildet. Bei dieser
Ausführungsform v/erden die 'Zellen direkt an der Spitze der Elektrode 3 gesammelt.
Eine Ausführungsform der Vorrichtung, bei der sowohl Nord- als auch Südpol des Magneten in
den Kammerraum 1 hineinragen und zugleich als Elektroden 2 und 3 ausgebildet sind, zeigt Figur
5.
In Figur 6a und 6b ist eine besondere Ausführungsform einer Kammer zur elektrischen Behandlung
von Zellen dargestellt. Dor Kaum 1 der Kammer „_v '%
COPY ^
- 14 -
wird begrenzt durch eine Grundplatte 4 und ein die seitlichen Wände des Raumes bildendes Seitenteil
5. Zur oberen Begrenzung des Raumes kann eine Deckplatte oder eine Folie vorgesehen sein.
5
In den Raum 1 ragen zwei Elektroden 2 und 3 hinein, von denen die Elektrode 3 plattenförmig
und aus einem Material mit relativ großer magnetischer Permeabilität (Weicheisen) ausgebildet
ist. Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird durch die Elektrode 3 - beispielsweise
durch Kontakt mit einem Stabmagneten der magnetische Kraftfluß geleitet, um so den
gewünschten Verlauf der den Raum 1 durchdringenden magnetischen Kraftlinien zu erhalten.
An der Oberfläche von erythroleukämischen Zellen (Friend-Zellen) wurden Fe3O.-Partikeln (Magnetit)
adsorbiert. Hierzu wurde 1 ml der Zellsuspension mit 100 μΐ einer kolloidalen isotonen Fe^C^-Lösung
versetzt. Zur Erhöhung der Adsorption der Fe,0^-
Partikeln wurde zusätzlich noch 1 mg Pronase (oder Dispase) zugegeben (die kolloidale Fe3O.-Lösung
war durch Filtration einer Fe3O4-AUfschlämmung
durch ein Membranfilter mit 0,45 um Porendurchraesser
hergestellt worden). Nach einer Inkubationszeit von etwa einer Stunde, nach der der Adsorptionsvorgang weitgehend abgeschlossen war, wurden
die Zollen durch Abzentrifugieren aus der Lösung
von den überschüssigen Fe^^Partikeln abgetrennt,
15 " copy
da die Fe3O4~Partikeln in der kolloidalen Lösung
nicht abzentrifugierbar sind. Die Zellen wurden anschließend in einer isotonen Lösung gewaschen.
Die mit den magnetischen Teilchen dotierten Zellen wurden in einer isotonen 0.3 molaren
Mannitlösung inkubiert, der 41,5 % Polyethylenglycol
(PEG; MW 6000) sowie 15 % Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben wurden.
Die Zellen wurden in eine Fusionskammer der in Figur 1 dargestellten Art gegeben. Die Magnetfeldstärke
des verwendeten Magneten betrug an dessen Oberfläche ca. 1 kG. (Wie sich gezeigt
hat, konnte der Sammlungsvorgang jedoch bereits bei Verwendung eines Stückes magnetisierten
Stahlbleches bei Erythrozyten, die mit Fe3O4-Partikeln
dotiert worden waren, festgestellt werden.)
Nach Sammlung der Zellen am Ort der größten Felddichte wurde in den Kammerraum vorsichtig
eine Lösung zugegeben, die 1OmM CaCl2 in 0.3 molarer
Mannitlösung enthielt. Durch die Zugabe der Calciumionen wurde die Fusion der aneinanderliegenden
Zellen durch PEG ausgelöst.
Entsprechend Ausführungsbeispiel 1 wurden Avena-Sativa-Protoplasten
mit Magnetitteilchen dotiert und mit PEG fusioniert.
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32Ί238
Wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurden erythroleukämische Zellen mit Magnetitteilchen
dotiert und im magnetischen Feld gesammelt.
In der die Zellen enthaltenden Lösung war jedoch kein PEG, sondern inaktivierte Sendai-Viren
einer Konzentration von etwa 2 χ 10 HAU/ml (haemagglutinierende Einheiten) enthalten. Nach
Sammlung der Zellen im magnetischen Feld wurde die doppelte Menge einer Lösung zugegeben, die
etwa 4 mM/1 CaCl2 in phosphatgepufferter isotoner
NaCl-Lösung enthielt. Darauf folgende Temperaturerhöhung
auf 37 0C löste Fusion aus.
Wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurden Avena-Sativa-Protoplasten mit Magnetitteilchen
dotiert und im magnetischen Feld gesammelt. Die Suspensionslösung enthielt 5 mM CaCl,,
und 1 mg Pronase/ml, was einer elektrischen Leitfähigkeit von 1 χ 1 θ"~ -O- x cm entspricht.
Nach Sammlung der Zellen wurde ein Feldpuls von 2400 V/cm und 500 ns Dauer appliziert und
auf diese Weise die Zellen fusioniert.
Wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurden Avena-Sativa-Protoplasten mit Magnetitteilchen
dotiert und im magnetischen Feld gesammelt. Die Suspensionslösung hatte die in Ausführungsbeispiel
4 angegebene Zusammensetzung. Zur Ausbildung von Zellenreihen wurde ein elektrisches
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Wechselfeld einer Frequenz von 1500 kHz und einer Stärke von 200 V/cm für 5 Sekunden angelegt,
Hiernach wurde, wie in Ausführungsbeispiel 4 beschrieben, mittels eines elektrischen Feldpulses
fusioniert.
Alle vorgenannten Ausführungsbeispiele wurden mittels einer Kammer der in Figur 61/6b dargestellten
Art durchgeführt, wobei allerdings bei den Ausführungsbeispielen 1 bis 3 eine elektrische
Spannung nicht angelegt wurde.
-Z3,
- Leerseite -
Claims (16)
1. !Verfahren zur Fusion von Zellen, bei dem die —in einer Zellsuspension im Fusionsraum befindlichen
Zellen durch äußere Kräfte auf einen geringen Abstand zueinander gebracht werden
und in der Membranstruktur benachbarter Zellen durch äußere Einwirkungen Störungen verursacht
werden, die zur Bildung von Membranbrücken zwischen den benachbarten Zellen und zur Verschmelzung
der Zellen führen, dadurch gekenn-
zeichnet, daß die Zellen mit magnetischen
Teilchen dotiert und einem den Fusionsraum durchdringenden inhomogenen magnetischen Feld derart
ausgesetzt werden, daß sich die dotierten Zellen in geringem Abstand zueinander ansammeln, worauf
zur Erzeugung der Störungen in der Membranstruktur der benachbarten Zellen die Zellen entweder
dem Puls eines elektrischen Feldes von mindestens der Höhe der Durchbruchspannung oder die Störungen
in der Membranstruktur verursachenden Chemikalien,
wie Polyethyienglycol, oder die Störungen in
der Membranstruktur-verursachenden inaktivierten Viren, wie Sendai-Viren, ausgesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen
.Teilchen auf die Oberfläche der Zellen aufgebracht PT 1.682 " werden.
ba/ha - 2 -
COPY
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet , daß die magnetischen Teilchen in die Zellen eingebracht werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichent , daß die Zellen
zur Aufnahme der magnetischen Teilchen in eine kolloidale, die magnetischen Teilchen enthaltende
Lösung gegeben werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen ferromagnetische
Teilchen sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet , daß die magnetischen Teilchen Fe-jO.-Partikeln sind.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß nach Sammlung der Zellen im Bereich der höchsten Felddichte des magnetischen Feldes
die Zellen einem äußeren inhomogenen elektrischen Feld einer Frequenz im Bereich von 5 kHz bis
2 MHz und einer Stärke im Bereich von 10 V/cm bis 2000 V/cm je nach Größe der Zellen für kurze
Zeit derart ausgesetzt werden, daß sich die Zellen in vor bestimmter Ausrichtung ane'inanderreihen.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge k.e nnzeichnet ,
daß für den Fall, daß die Störungen in der Membranstruktur durch Verwendung von Polyethylenglycol
bewirkt werden, zunächst Polyethylenglycol der
die Zellen enthaltenden Suspension zugegeben wird, danach die Zellen im magnetischen Feld
gesammelt oder gesammelt und aneinandergereiht werden und sodann Calciumionen zur Bewirkung
der Störungen in der Membran der Zellen zugegeben werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß für den Fall, daß die Störungen in der Membranstruktur durch Verwendung von inaktivierten
Sendai-Viren bewirkt werden, zunächst die Viren der die Zellen enthaltenden Suspension zugegeben
werden, danach die Zellen im magnetischen Feld gesammelt oder gesammelt und aneinandergereiht
werden und sodann Calciumionen zur Bewirkung der Störungen in der Membran der Zellen zugegeben
werden.
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10. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens unter Verwendung von die Störungen in der Membranstruktur
bewirkenden Chemikalien oder Viren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
der eine Kammer mit einem aus elektrisch nicht leitenden Wänden gebildeter Raum zur Aufnahme
einer Zellsuspension vorgesehen ist, g e k e η η zeichnet durch einen derart
an der Kammer angeordneten Magneten, daß der Raum (1) der Kammer von einem inhomogenen magnetischen
Feld durchdrungen wird.
11. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens unter Verwendung von die Störungen in der Membran-
struktur bewirkendem elektrischen Durchbruch gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei der eine
Kammer mit einem aus elektrisch nicht leitenden Wänden gebildeter Raum zur Aufnahme einer ZeIlsuspension
vorgesehen ist, in den wenigstens zwei Elektroden derart hineinragen, daß ein zwischen den Elektroden begrenzter Bereich gebildet
wird, in welchem die Zellen einem zwischen den Elektroden ausgebildeten elektrischen Feld ausgesetzt
sind, gekennzeichnet durch einen derart an der Kammer angeordneten Magneten,
daß der Raum (1) der Kammer von einem inhomogenen magnetischen Feld durchdrungen wird.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet,
daß der Magnet derart an der Kammer angeordnet ist, daß das den Raum (1) durchdringende magnetische
Feld mit seiner höchsten Dichte einem in den Raum der Kammer hineinragenden Teil des Magneten
entspringt.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12r dadurch
gekennzeichnet , daß der in den Raum hineinragende Teil des Magneten ein eine Spitze oder Kante aufweisender Polschuh (3)
ist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadur.ch
gekennzeichnet, daß der Polschuh (3) zugleich Elektrode ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis
14, dadurch gekennzeichnet, daß der Magnet ein Permanent- oder ein Elektromagnet
ist.
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5
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis
14, dadurch gekennzeichnet, daß der Magnet aus einer Kombination aus einem
Permanentmagneten und einem Elektromagneten besteht.
Priority Applications (8)
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