DE3331627A1 - Verfahren zur immunologischen bestimmung fuer proteine in koerperfluessigkeiten, unter verwendung monovalenter antikoerperfragmente - Google Patents

Verfahren zur immunologischen bestimmung fuer proteine in koerperfluessigkeiten, unter verwendung monovalenter antikoerperfragmente

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DE3331627A1 DE19833331627 DE3331627A DE3331627A1 DE 3331627 A1 DE3331627 A1 DE 3331627A1 DE 19833331627 DE19833331627 DE 19833331627 DE 3331627 A DE3331627 A DE 3331627A DE 3331627 A1 DE3331627 A1 DE 3331627A1
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Patentanwälte Dipl.-Ιν^ϊ HvWe ΐοκλίΑΝΝ,-Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke
D1PL.-ING. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr,-Ing. H. LiSKA Dipl.-Phys. Dr. J. Prechtel
HVa POSTFACH 860 820
MOHLSTRASSE 22
TELEFON (089) 980352
TELEX 522621
TELEGRAMM PATENTWEtCKMANN MÜNCHEN
Max-Planck-Gesellschaft
zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Bunsenstraße 10, 3400 Göttingen
Verfahren zur immunologischen Bestimmung für
Proteine in Körperflüssigkeiten, unter Verwendung
monovalenter Antikörperfragmente
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung für Proteine in Körperflüssigkeiten, die eine nichtparallele Inhibitionskurve zu einem Referenzinhibitor zeigen, unter Verwendung monovalenter Antikörperfragmente sowie hierfür geeignete monovalente Antikörperfragmente.
Immunologische Verfahren sind Standardverfahren zum spezifischen und quantitativen Nachweis von Proteinen
10 und Peptiden in Körperflüssigkeiten, wie z. B. Serum oder Urin und in Gewebeextrakten, welche sich durch
eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität auszeichnen und daher eine große Bedeutung für die klinische
Diagnostik erlangt haben.
Der Radio-Immuno- Assay beruht darauf, daß man mit
Hilfe möglichst hochgereinigter Antigene (z. B. Proteine oder Peptide) in geeigneten Versuchstieren ein Antiserum herstellt. Das Antiserum wird zusammen mit
einer vorgegebenen Menge radioaktiv markierten Antigens und der zu untersuchenden Körperflüssigkeit inkubiert. Enthält die Körperflüssigkeit das entsprechende Antigen, so findet man im gebildeten Immunkomplex weniger Radioaktivität, da ein Teil des radioaktiv markierten Antigens durch das in der Körperflüssigkeit vorhandene, nichtmarkierte Antigen verdrängt wird. Diese Verdrängung (Inhibition) des radioaktiv markierten Antigens ist proportional zu der zugegebenen Menge Körperflüssigkeit. Die Verdrängungsreaktion wird in einem separaten Ansatz durch Zugabe von gereinigtem Antigen bekannter Konzentration zu dem System markiertes Protein/Antiserum kalibriert. Üblicherweise beobachtet man für beide
Inhibitoren (gereinigtes Protein bzw. Körperflüssigkeit) parallele Inhibitionskurven, so daß sich die Menge Antigen in der Körperflüssigkeit aus dem Vergleich beider Kurven errechnen läßt. 5
Bei dem auf demselben Prinzip beruhenden Enzym-Immuno-Assay, verwendet man als Partner der Immunreaktion Enzyme (EIA, ELISA). Weiterhin besteht die Möglichkeit,die Markierung mit Fluorochromen vorzunehmen.
In einer Reihe von Systemen wurde jedoch beobachtet, daß die Inhibitionskurven von gereinigtem Referenzprotein und Körperflüssigkeit einen nichtparallelen Verlauf zeigen (Fig. la). Dabei ist üblicherweise die Kurve der Körperflüssigkeit weniger steil als die des Referenzproteins. Das bedingt naturgemäß eine beträchtliche Unsicherheit in der quantitativen Auswertung oder macht diese sogar unmöglich. Dieses Problem tritt insbesondere bei extracellulären Matrixproteinen auf.
Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist die Annahme, daß die Körperflüssigkeit nicht das intakte Protein, sondern eine modifizierte (z. B. proteolytisch abgebaute) Form enthält, die eine geringere Affinität für den Antikörper aufweist. Andere Erklärungsmöglichkeiten beinhalten eine Reihe nicht näher charakterisierte technische Parameter, wie z. B. hohe Proteinkonzentration oder Viskosität der zu testenden Körperflüssigkeit, die in unspezifischer Weise zu einer Veränderung des Inhibitionsprofils beitragen.
Eine typische Beobachtung zu diesem Problem wurde bei der Entwicklung eines Radio-Immuno-Assays für Aminopropeptid (Prokollagenpeptid Typ III) gemacht (Rohde et al., Eur. J. Clin. Invest. 9, 451-459 (1979)). Hier
konnte das intakte Peptid im Serum nachgewiesen werden und zeigte im Vergleich zu authentischem Aminopropeptid eine parallele Inhibitionskurve. Urin hingegen enthält eine abgebaute Form des Peptids und seine immunologische Aktivität ist durch eine nichtparallele Inhibitionskurve charakterisiert (Fig. la). Eine quantitative Bestimmung des Prokollagens in Urin ist damit nicht möglich.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, dieses Problem zu lösen und ein Verfahren zu schaffen, das eine einfache quantitative Bestimmung von Proteinen, die unter ungünstigen technischen Bedingungen vorliegen, ermöglicht.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Proteinen in Körperflüssigkeiten, die zu einem Referenzinhibitor eine nichtparallele Inhibitionskurve zeigen,welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Antiserum spezifische monovalente Antikörperfragmente verwendet werden.
Die Verwendung von monovalenten Antikörperfragmenten bei immunologischen Untersuchungen ist aus der Literatur bekannt. Jedoch wurde bisher angenommen, daß normalerweise kein Affinitätsunterschied zwischen bivalenten Antikörpern und monovalenten Antikörperfragmenten besteht. So fand man z. B. keinen Unterschied in der Hemmwirkung von Antikörpern gegen Creatinkinase auf die Creatinkinaseaktivität, wenn man dazu bivalente oder monovalente Antikörper verwendete (U. Würzburg, Kontakte 3, S. 10-17 (1978)).
Es war daher überraschend, daß die Verwendung monovalenter Antikörperfragmente anstelle von bivalenten Antikörpern zu einer deutlichen Verbesserung der Inhibitionskurve bei immunologischen Bestimmungen von z.B. extracellulären Matrixproteinen führt bzw. in einigen Fällen eine immunologische Bestimmung überhaupt erst ermöglicht.
Am Beispiel des Aminopropeptids zeigt eine vergleichende Analyse von Antikörper und monovalentem Antikörperfragment im Immun-Test mit intaktem Prokollagenpeptid als markiertem Protein und als Referenzinhibitor in beiden Fällen eine vergleichbare Nachweisempfindlichkeit. Urinproben zeigen im Test mit dem monovalenten Antikörperfragment eine parallele Inhibitionskurve und erlauben damit eine verläßliche quantitative Bestimmung des Prokollagenpeptids Typ III in diesem Material (Fig. Ib).
Aber auch bei der Bestimmung von Aminopropeptid in Seren ist die Verwendung von monovalenten Antikörperfragmenten anstelle von bivalenten Antikörpern vorteilhaft. Die Analyse der Seren zeigt eine fünf- bis sechsfach höhere Konzentration an Prokollagenpeptid bei Messung mit dem Antikörperfragment-Test im Vergleich zur Messung der gleichen Seren mittels bivalenter Antikörper. Die biochemische Analyse der Seren durch Molekularsiebchromatographie zeigt, daß etwa ein Fünftel des Aminopropeptids als intaktes Material (Molekulargewicht 45000), der Rest als degradierte Form (Molekulargewicht 10000) vorliegt. Der Test mit bivalentem Antikörper weist hauptsächlich nur intaktes Aminopropeptid nach, während durch den Antikörperfragment-Test beide Formen erfaßt werden, wodurch die
35 Empfindlichkeit der Methode verbessert wird. Die
umfassende Analyse des Aminopropeptids in der inaktiven und in der degradierten Form mit Hilfe des Antikörperfragment-Tests stellt eine wertvolle Erweiterung für Serum- und Urinanalysen, z. B. zur Diagnose von Leberfibröse, dar.
Ein Beispiel für ein weiteres Protein der angegebenen Klasse, dessen Bestimmung in Körperflüssigkeiten für die Diagnose von Diabetes und Lebererkrankungen von
10 Bedeutung ist, ist das Humanlaminin Pl. Auch hier konnte durch die Verwendung von monovalenten Antikörperfragmenten eine Verbesserung der immunologischen Bestimmungsmethoden erzielt werden. Andere Beispiele von Proteinen, für welche sich die
15 Erfindung eignet, sind extracelluläre Matrixproteine wie Kollagene, Prokollagene und Fibronectin.
Zur immunologischen Bestimmung von Proteinen wie extracellulären Matrixproteinen mit Hilfe von mono-
valenten Antikörperfragmenten gemäß Erfindung können alle bekannten immunologischen Methoden angewandt werden. Beispielsweise können alle Ausführungsformen des RIA-Testes, z. B. sequentielle Sättigungsanalyse oder Gleichgewichtsanalyse, Markierung mit Chloramin T oder Bolton-Hunter-Reagenz, (Lit: Felber, Meth. Biochem. Anal. 2j2, 1, 1974; Skelley et al., Clin. Chem. 19, 146-186, 1973) eingesetzt werden. Das betrifft auch den Enzym-Immuntest. Eine Einschränkung betrifft die Separierungstechnik soweit die Tests auf dem Fc-Anteil des Antikörpers beruhen (fehlt im Fab), wie z. B. die Komplexierung von Antikörpern mit Protein A von Staphylokokken. Andere Separierungsverfahren, z. B. zweiter Antikörper in gebundener oder löslicher Form sind äquivalent. Ebenso sind Verfahren mit fluorochrom-
35 markierten Antikörpern geeignet.
Die Herstellung der Antiseren kann in üblicher Weise
durch Injektion des Antigens in Versuchstiere, vorzugsweise Kaninchen, erfolgen. Zweckmäßig wird dabei in
Gegenwart von komplettem Freund 'schein Adjuvans gearbeitet. Es können die in derartigen Fällen üblichen
Antigenmengen verabreicht werden. Als besonders geeignete Dosis bei Verwendung von Kaninchen erwiesen sich ' 0,5 bis 1 mg pro Tier. Das gebildete Antiserum wird
dann in der dem Fachmann bekannten Weise gewonnen und
kann weiter gereinigt werden, beispielsweise nach
Methoden der Affinitätschromatographie.
Die Präzipitation mit einem zweiten Antikörper gegen
Immunglobulin ist eine besonders gut geeignete Ausführungsform für den Fab-Test. Die Antiseren enthalten für diesen Zweck genügend Antikörper gegen Fab. Eine
Immunisierung mit Fab ist deshalb nicht notwendig.
Besonders günstige Ergebnisse wurden mit Ziegenantiseren erzielt.
20
Die monovalenten Antikörperfragmente können aus den
gereinigten Antikörpern oder aus der Immunglobulinfraktion der Antiseren nach den üblichen Verfahren hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Antikörper durch Pepsin abgebaut. Anschließend wird reduziert und man erhält auf diese Weise das Fab1-Fragment. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Fab-Fragmente verwendet, die durch Papainabbau unter reduzierenden Bedingungen hergestellt
30 werden.
Durch die Erfindung wird erreicht, daß sonst schwer
bestimmbare Proteine, wie z.B. extracelluläre
Matrixproteine, mit hoher Genauigkeit und sehr großer
Empfindlichkeit nach immunologischen Methoden bestimmt werden können, wobei die Markierung radioaktiv erfolgen kann oder durch eine der anderen bekannten Markierungen
ersetzt werden kann. Für bestimmte Proteine der angegebenen Klasse ermöglicht die Erfindung erstmals eine immunologische Bestimmung.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher:
Beispiel 1
Das Prokollagen-III-Peptid wird aus foetaler Kalbshaut gewonnen und gereinigt. Antiseren wurden im Kaninchen gegen Prokollagen III oder Prokollagen-III-Peptid hergestellt, wie in der EU-PS 4940 beschrieben.
Für den RIA-Test werden 25 \ig des Prokollagen-III-Peptides mit 0,5-lmCi Jod-125 unter Verwendung der Chloramin-T-Methode markiert und nicht gebundenes Jod durch Dialyse entfernt. Aus den Antiseren wird die Immunglobulin-G-Fraktion an DEAE-Zellulose oder der spezifische
2 0 Antikörper durch Affinitätschromatographie an einer
Prokollagen-III-Säule nach Standardverfahren gewonnen. Diese Materialien wurden durch Pepsinabbau und Reduktion in monovalente Fab1 Fragmente (Nisonoff et al., Arch. Biochem.Biophys. £9, 230-244 (I960)) oder durch Papainabbau in monovalente Fab Fragmente (Mage, Meth. Enzymol. 70, 142-150, 1980) überführt. Die Fragmente wurden anschließend durch Molekularsiebchromatographie an Sephacryl S-200R (Säule l,5xl20cm in 0,2M Ammoniumbicarbonat) von nicht-degradiertem Antikörper oder
30 bivalenten Fragmenten abgetrennt.
Die Durchführung des RIA-Testes erfolgt dann in Gegenwart eines Detergens (0,04% Tween 20) wie in EU-PS 4940 beschrieben. Die Fällung der Immunkomplexe wird dann mit einem zweiten Antikörper gegen Immunglobulin G vorgenommen, sie kann auch nach einer anderen dem Fachmann geläufigen Methode durchgeführt werden.
Beispiel 2
Es wird wie im Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch ausgehend von Lamininfragment Pl, welches wie in EU-PS 4940 beschrieben, gewonnen worden war. Markierung, Reinigung und RIA-Test werden wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
10 Beispiel 3
Die Mengen von Aminopropeptid in biologischen Proben wurden erfindungsgemäß mit Fab1 Fragmenten unter Verwendung des Peptids CoI 1-3 als Referenzinhibitor gemessen. Die Analyse des Serums von 53 normalen erwachsenen Personen im Alter von 20 bis 65 Jahren sowie 7 Urinproben zeigten gute Reproduzierbarkeit, gewöhnlich mit 10 bis 20% Variation. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 1
Reproduzierbarkeit der mit Fab-RIA erhaltenen Werte für zwei zufällig ausgewählte Serum- und Urin-Proben.
Probe .
(Test A oder B) a)
Procollagenpeptid-Menge Jng/ml) gemessen bei Verdünnung 1:5 1:10 1:20
Mittel +S.D.
Serum Nr. 23 A
B		 26
30		 30
31		 39
28
Serum Nr. 24 A
B		 30
27		 28
21		 N) N)
VO VO
Urin Nr. 1 A
B		 59
93		 OO 00
VO 00 		109
99
Urin Nr. 14 A
B		 47
62		 54
55		 56
52
32 + 7
30 + 2
29 + 1
26 + 4
85 +
94 + 5
52 + 5
56 + 5
Sequentielle Sättigungstests, ausgeführt bei verschiedenen Gelegenheiten mit zwei verschiedenen Präparaten von markiertem Antigen, jedoch gleichem Fab-Fragment und Bezugsinhibitor.
Mittel aus je 2 Bestimmungen pro Verdünnung
CaJ CaJ CaJ

Claims (9)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur immunologischen Bestimmung für Proteine in Körperflüssigkeiten, die eine nichtparallele Inhibitionskurve zu einem Referenzinhibitor zeigen, dadurch gekennzeichnet , daß als Antiserum spezifische monovalente Antikörperfragmente verwendet werden.
  2. 2. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von
    extracellulären Matrix-Proteinen in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet , daß als Antiserum spezifische monovalente Antikörperfragmente verwendet werden.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß eine radioimmunologische Bestimmung durchgeführt wird.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß man monovalente Antikörperfragmente verwendet, die durch Pepsinabbau des Immunglobulins und
    25 nachfolgende Reduktion hergestellt wurden.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ,
    dadurch gekennzeichnet, daß man monovalente Antikörperfragmente verwendet, die durch Papainabbau unter reduzierenden Bedingungen hergestellt wurden.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
    dadurch gekennzeichnet,
    daß Prokollagen-III-peptid bestimmt wird.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
    dadurch gekennzeichnet,
    daß Laminin Pl bestimmt wird.
  8. 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, 10 dadurch gekennzeichnet,
    daß Antigenfragmente im Urin bestimmt werden.
  9. 9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
    daß Antigenfragmente im Serum bestimmt werden.
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