DE3409029A1

DE3409029A1 - Polysaccharid-rdp-substanz, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE3409029A1
Application number: DE19843409029
Authority: DE
Inventors: Hisao Kado; Yoshitada Tokio/Tokyo Mori; Suguru Yokohama Kanagawa Takeo; Kiichi Fujisawa Kanagawa Uchida; Nobuhiro Tokio/Tokyo Watanabe
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd; Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp; Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1983-03-18
Filing date: 1984-03-13
Publication date: 1984-10-11
Also published as: DE3409029C2; JPS59170017A; US4764507A; FR2542745A1; FR2542745B1; GB8407083D0; GB2139240B; JPH0372085B2; GB2139240A

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Polysaccharid-RDP-Substanz, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein Antitumormittel, ein Immunomodulierungsmittel und ein Wirts - Abwehrmittel gegen Infektionserkrankungen, welche diese Substanz als wirksame Komponente (Wirkstoff) enthal-

20 ten.

Bekanntlich werden Polysaccharide aus verschiedenen Quellen gewonnen, beispielsweise aus Basidiomyceten (japanisches.Patent Kokai Koho Nr.94012/1978), aus Bakterien (japanisches Patent Kokai Koho Nr. 76896/1979), aus Schimmelpilzen (japanische Patentpublikation Nr. 59 097/1978), aus Algen (japanisches Patent Kokai Koho Nr. 28923/1977) und aus Getreide (grains) (japanisches Patent Kokai Koho Nr. 139713/1978).

Es ist auch bekannt, daß diese Polysaccharide eine Antitumoraktivität besitzen. Bei der Verwendung dieser Polysaccharide als Antitumormittel treten jedoch verschiedene Probleme auf, wie z.B. geringe Ausbeuten, ein komplizier-

35 tes Herstellungsverfahren, Toxizität und dgl.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß eine neue Polysaccha-

-Jt-

rid-RDP-Substanz aus Reiskleie gewonnen werden kann und daß die Polysaccharid-RDP-Substanz wirksam ist als Antitumormittel, als Immunomodulierungsmittel und als körpereigenes (Wirts) Abwehrmittel gegen Infektionserkrankungen.

5 Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind:

1) Die neue Polysaccharid-RDP-Substanz;

2) ein Verfahren zur Herstellung der neuen Polysaccharid-RDP-Substanz gemäß Punkt (1), das die folgenden Stufen

10 umfaßt:

Behandlung von Reiskleie mit heißem Wasser, um die Polysaccharid-RDP-Substanz in das Wasser zu extrahieren, Zugabe eines polaren organischen Lösungsmittels oder eines Aussalzungsmittels zu dem die extrahierte Substanz enthaltenden Wasser zur Erzeugung von Niederschlagen, welche die Polysaccharid-RDP-Substanz enthalten, Isolieren der Niederschläge und

Durchführung einer Deproteinisierungsbehandlung mit den Niederschlagen;

3) ein Antitumormittel, das die neue Polysaccharid-RDP-Substanz gemäß Punkt (1) als einen wirksamen Bestandteil (Wirkstoff) enthält;

4) ein Immunomodulierungsmittel, das die neue Polysaccharid-RDP-Substanz gemäß Punkt (1) als einen wirksamen Bestand-

25 teil (Wirkstoff) enthält; und ein

5)Wirts (körpereigenes) Abwehrmittel gegen Infektionserkrankungen, das die neue Polysaccharid-RDP-Substanz gemäß Punkt (1) als einen wirksamen Bestandteil (Wirkstoff) enthält.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten PoIysaccharid-RDP-Substanz;

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der Polysaccharid-RDP-Substanz; und

1 3
Fig. 3 ein C-NMR-Spektrum der Polysaccharid-RDP-Sub-

stanz.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Polysaccharid-RDP-Substanz, ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz sowie ein Antitumormittel, ein Immunomodulierungsmittel und ein Wirts-Äbwehrmittel gegen Infektionserkrankungen, welche diese Substanz als wirksame Komponente (Wirkstoff) enthalten.

Die erfindungsgemäße Polysaccharid-RDP-Substanz wird gewonnen bzw. hergestellt aus Reiskleie durch Extraktion und Reinigung ο Diese Reiskleie ist ein Nebenprodukt/ das bei der Herstellung von poliertem Reis aus unpoliertem Reis erhalten wird, und sie unterliegt keinen Beschränkungen in bezug auf die Art des unpolierten Reises, das Produktionsgebiet, den Grad der Polierrate und dgl. Vor der Extraktion und Reinigung der Polysaccharid-RDP-Substanz aus der Reiskleie ist es zweckmäßig, die Reiskleie vollständig zu waschen, um pulverisierten (oder zerkleinerten) Reis und andere Verunreinigungen zu eliminieren. Erfindungsgemäß können auch Reiskleiearten, die bereits für andere Zwecke verwendet worden sind, wie z.B. eine entfettete Reiskleie, die ein Rückstand nach der Extraktion von Reiskleien-

25 öl aus Reiskleie ist, verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Polysaccharid-RDP-Substanz wird gewonnen bzw. hergestellt durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln oder Aussalzungsmitteln zu einem Extrakt, der durch Heißwasser-Behandlung von Reiskleie erhalten worden ist, zur Erzeugung von Niederschlagen und gewün_schtenfalls Auflösung der erhaltenen Niederschläge in Wasser, um sie zu reinigen.

Die Reiskleie wird nach der Pulverisierung durch einen. Separator, beispielsweise ein Sieb, passiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und, falls erforderlich, mit Wasser gewaschen. Es ist zweckmäßig, die lipidlösliche Fraktion unter Verwen-

* dung von organischen Lösungsmitteln, wie ζ.B..Ethylacetat, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Äther, η-Hexan, Benzol, Petroläther, Aceton und dgl., zu entfernen.

Die.Heißwasser-Behandlung der Reiskleie wird durchgeführt durch Einführen der Reiskleie und von destilliertem oder gereinigtem Wasser in einer Menge von etwa dem 5- bis 10-fachen der Menge der Reiskleie in einen Behälter oder einen Druckbehälter, beispielsweise einen Tank aus rostfreiem stahl, einen emaillierten Tank, einen Glastank, eine Durchfluß-Rohrextraktionsvorrichtung und dgl. mit oder ohne Rühren unter einem Druck von 0 bis 15 kg/cm², vorzugsweise von 0 bis 5,0 kg/cm², und bei einer Temperatur von 70 bis 200⁰C, vorzugsweise von 100 bis 15O⁰C, für einen

¹^ Zeitraum von 10 min bis 24 h, vorzugsweise von 0,5 bis 5 h. In der Praxis ist es zweckmäßig, die Heißwasser-Behandlung bei einem Druck von 0 bis 3,0 kg/cm² und einer Temperatur von 100 bis 140⁰C für einen Zeitraum von 1 bis

5 h durchzuführen. 20

Der bei der Heißwasser-Behandlung erhaltene Extrakt wird verschiedenen Operationen unterworfen, beispielsweise einer Filtration, einer Zentrifugierung und dgl., um Feststoffe abzutrennen, und erforderlichenfalls wird er dann auf ein geeignetes Volumen eingeengt durch Anwendung verschiedener Methoden, wie z.B. der Einengung bei vermindertem Druck, der Ultrafiltration und dgl., einzeln oder in Kombination miteinander. .

Durch Sammeln der Niederschläge, die bei der Zugabe eines wasserlöslichen polaren organischen Lösungsmittels oder eines Aussalzungsmittels zu dem Extrakt gebildet werden, erhält man eine rohe Polysaccharid-RDP-Substanz.

ob zu polaren organischen Lösungsmitteln, die in diesem Verfahren verwendet werden können, gehören Methanol, Ethanol, Propanol, Aceton und dgl. Die Menge des polaren.organischen Lösungsmittels, die verwendet wird, wird festgelegt

409029

■4-

unter Berücksichtigung der Menge der gewünschten Substanz, die in dem Extrakt enthalten ist, und dgl. So kann beispielsweise im Falle von Ethanol dieses in einer solchen Menge zugegeben werden, daß die Ethanolkonzentration 30 bis 50 Vol./Vol.-% beträgt. Die gebildeten Niederschläge werden vorzugsweise mit dem organischen Lösungsmittel wie vorstehend angegeben, beispielsweise mit Ethanol und dgl., gewaschen.

Zu den Aussalzungsmitteln, die in dem obigen Verfahren verwendet werden können, gehören Natriumchlorid, Ammoniumsulfat und Kaliumchlorid. Das Aussalzungsmittel wird in der Regel zugegeben, bis der Grad der Sättigung 0,5 bis 1 erreicht hat, um dadurch Niederschläge zu erzeugen.

Die Deproteinisierung und Reinigung der Polysaccharid-RDP-Substanz können entweder vor der Zugabe des organischen Lösungsmittels oder des Aussalzungsmittels zu dem Extrakt oder nach der Bildung der Niederschläge durch die Zugabe des organischen Lösungsmittels oder des Aussalzungsmittels und die anschließende Auflösung der Niederschläge in Wasser durchgeführt werden.

Zur Durchführung der Reinigungs- und Deproteinisierungsbehandlung können verschiedene bekannte Verfahren angewendet werden. Beispielsweise wird einamyldytisches Enzym und/- oder ein proteolytisches Enzym einer die Polysaccharid-RDP-Substanz enthaltenden Lösung zugegeben, um die darin enthaltenen Verunreinigungen, wie z.B. Stärke, Protein und dgl., in Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht umzuwandeln. Diese Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht werden in einer nachfolgenden Reinigungsstufe entfernt.

Als derartige' Enzyme können ein amylolytisches Enzym, beispielsweise tf-Amyläse, iso-Amylase, Pululanase und dgl., ein proteolytisches Enzym, beispielsweise Papain, Pepsin, Trypsin, Pronase und dgl., und erforderlichenfalls

andere Enzyme verwendet werden. Bei dieser Enzymbehandlung ist es bevorzugt, daß das Enzym in einer Menge (Verhältnis) von 1/1000 bis 1/5000 des Substrats zugegeben wird und daß die Behandlung 0,5 bis 24 Stunden lang, vorzugsweise 1 bis

5 15 Stunden lang, durchgeführt wird.

Zusätzlich können die folgenden Reinigungs- und Deproteinisierungsverfahren angewendet werden: ein Verfahren, bei dem eine anorganische oder organische Säure, wie z.B. Eisessig, Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Gerbsäure, Trichloressigsäure und dgl. einer wäßrigen Lösung, welche die oben beschriebene Polysaccharid-RDP-Substanz in einem Mengenanteil von etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 3 bisetwa 5 Gew.-% enthält, zugesetzt wird. Wenn Niederschläge gebildet werden, werden sie durch Operationen, wie Filtrieren, Zentrifugieren und dgl., entfernt und anschließend werden die zurückbleibenden Säuren, anorganischen Ionen und niedermolekularen Fraktionen 1 bis 3 Tage lang gegen fließendes Wasser oder destilliertes Wasser unter Verwendung einer semipermeablen Membran, wie z.B. einer Cellophan-Membran, einer Collodion-Membran oder dgl.,dialysiert; ein Ionenaustauschverfahren, bei dem ein Kationenoder Anionenaustauscher, wie z.B. Dowex,Amberlite, Duolite, Diaion oder dgl., verwendet wird; ein Ultrafiltrationsverfahren, bei dem eine Membran mit einem fraktionellen Molekulargewicht von 1000 bis 100 000 verwendet wird; die Gelfiltration; die Zentrifugierung; die Behandlung mit Aktivkohle; die Einengung (Konzentration) und eine Kombination davon. Außerdem kann die RDP-Substanz unter Verwendung von Säuren und/oder einigen Enzymen bis auf Molekulargewichte von 1 000 000 bis 10 000 hydrolysiert werden unter Aufrechterhaltung der biologischen Aktivitäten. Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren kann eine große Menge Protein aus der Polysacchari'd-RDP-Substanz entfernt werden. Eine geringe Menge Protein, das chemisch an die Polysaccharid-RDP-Substanz gebunden ist, kann jedoch nicht vollständig entfernt werden. In diesem Falle ist es möglich, das Protein aus der Polysaccharid-RDP-Substanz nach einem Verfahren,

1 wie z.B. dem Sevag-Verfahren_/vollständig zu entfernen.

Diese Reinigungsverfahren können einzeln oder in Kombination miteinander angewendet werden und diese Kombinationen und die Reihenfolge, in denen sie angewendet werden, unterliegen keinen Beschränkungen.

Durch Lyophilisieren oder Sprühtrocknen einer die hochmolekulare Polysaccharid-RDP-Substanz enthaltenden wäßrigen Lösung, die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt worden ist, kann eine weiße RDP-Substanz in Form eines Pulvers erhalten werden.

Die auf diese Weise erhaltene Polysaccharid-RDP-Substanz hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften;

Diese Substanz passiert eine Dialysemembran nicht und ist in organischen Säuren oder organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Eisessig, Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol und dgl., Aceton, Hexan, Benzol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Ligroin, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Äthern unlöslich, jedoch in Wasser löslich; eine 1 %ige wäßrige Lösung der erfindungsgemäßen Substanz

25 ist neutral;

die erfindungsgemäße Substanz hat keinen Schmelzpunkt und wird bei 22O⁰C braun und bei 28O⁰C schwarz (Verkohlung bzw. Carbonisierung);
die Elementaranalyse zeigt, daß die in dem weiter unten beschriebenen Beispiel 1 erhaltene erfindungsgemäße Substanz 38,10 % Kohlenstoff, 6,2 7 % Wasserstoff, 50,73 % Sauerstoff und 4,90 % Asche enthält;

eine 1 %ige wäßrige Lösung der erfindungsgemäßeη Substanz reagiert positiv bei den folgenden Farbreaktionen:

35 Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, -Garbazol-Schwefelsäure-Reaktion, Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion und Molisch-Reaktion,

und sie reagiert negativ bei den folgenden Farbreaktionen: Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folin-Reaktion, Elson-Morgan-Reaktion und Stärke-Jod-Reaktion; die spezifische Drehung der in dem weiter unten besehriebenen Beispiel 1 erhaltenen erfindungsgemäßen Substanz

in

beträgt /*7_D = +142 bis 145° (H₂O);

Es'wurde bestätigt, daß die Aschekomponente Si, P, K, Na, Ca, Mg und dgl. enthält, und aufgrund der Tatsache, daß die RDP-Substanz bei der Gelfiltration unter Verwendung von Sepharose CL-6B (hergestellt von der Firma Pharmacia Chemicals AB) im Ablaufvolumen eluiert wird, wird angenommen, daß die obengenannten Elemente nicht unabhängig voneinander in Form eines Elements oder einer Verbindung davon in der RDP-Substanz vorliegen, sondern daß sie in einem Zustand vorliegen, in dem sie an ein Grundgerüst der RDP-Substanz gebunden sind;

die überstehende Flüssigkeit, die erhalten wird bei einem Verfahren, das umfaßt die Hydrolyse der RDP-Substanz mit 1 η Schwefelsäure bei 100⁰C für 3 Stunden und die anschließende Zugabe von Bariumcarbonat zur Neutralisation, reagiert positiv'bei den folgenden Farbreaktionen: Molisch-Reaktion, Anthron-Reaktion, Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion und dgl., und sie reagiert negativ bei den folgenden Farbreaktionen: Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folin-Reaktion und dgl.;

in dem obigen Hydrolysat wurde durch Dünnschichtchromatographie-Analyse stets Glucose nachgewiesen. Beim Entwickeln mit den nachstehend angegebenen vier Lösungsmitteln bei der Dünnschichtchromatographieanalyse der Produkte, die durch vollständige Hydrolyse der RDP-Substanz mit Ameisensäure und Schwefelsäure erhalten wurden, konnten keine Flecken mit' Ausnahme des einen als Glucose identifizierten

35 nachgewiesen werden:

1) Ethylacgtat : Methanol ·: Essigsäure : Wasser (65 : 15 : 10)

2) Ethylacetat : Isopropanol : Wasser (65 : 23 : 12)

3) Isopropanol : Pyridin : Wasser : Essigsäure (8:8:4:

4) n-Butanol : Pyridin : Wasser (6 : 4 : 3). Daraus kann geschlossen werden, daß die erfindungsgemäße RDP-Substanz ° ein Polysaccharid ist, das im wesentlichen aus Glucose als alleiniger Zuckerkomponente besteht.

Die erfindungsgemäße RDP-Substanz hat ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, ein Infrarot-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 2 dargestellt

13
ist, und ein C-NMR-Spektrum, wie es in Fig. 3 dargestellt

ist. Aufgrund des Infrarot-Absorptionsspektrums und der spezifischen Drehung wird angenommen, daß in der RDP-Substanz eineo<-Bindung vorliegt.
15

Aufgrund der vorstehend beschriebenen Daten wird angenommen, daß die erfindungsgemäße RDP-Substanz ein Polysaccharid ist, das Glucose als alleinige Zuckerkomponente enthält.

Darüber hinaus verbrauchte die erfindungsgemäße RDP-Substanz bei der Perjodat-Oxidation 1,7 Mol Natriumperjodat und setzte 0,85 Mol Ameisensäure pro Glucoserest frei. Das Smith-Abbau-Verfahren dieser Substanz ergab Glyzerin, nachgewiesen durch Papierchromatographieanalyse. Die Methylierungsanalyse dieser Substanz ergab 2,3,4-Tri-O-methyl-D-glucose zusammen mit einer geringen Menge an Tetramethyl- und Dimethylglucosederivaten.

Aufgrund der vorstehend angegebenen Daten wird angenommen, daß die erfindungsgemäße RDP-Substanz ein Polysaccharid ist, das eine o(-1,6-Glucosid-Bindung als Hauptkette aufweist.

13
Außerdem zeigte die C-NMR-Analyse der erfindungsgemäßen RDP-Substanz die Anwesenheit von oo-1,6-gebundenen Glucose-Resten und einer viel geringeren Menge von o6-1,4-gebundenen Glucose-Resten.

Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäße Polysaccharid-

RDP-Substanz verschiedene biologische Aktivitäten, beispielsweise eine Antitumor-, Inununomodulations- und Wirts-Abwehr-Aktivität gegen Infektionserkrankungen, aufweist. Die Methoden und Ergebnisse der Bestimmung dieser biologisehen Aktivitäten der in Beispiel 1 hergestellten erfindungsgemäßen Polysaccharid-RDP-Substanz wird nachstehend näher beschrieben.

1) Antitumor-Aktivitäten

a) Effekt der intraperitonealen Verabreichung der RDP-Sub-

stanz gegen einen syngenetischen Tumor Meth-A

Auf 50 sechs Wochen alte weibliche BALB/C-CRJ-Mäuse (durchschnittliches Gewicht 20 g) wurden intraperitoneal Tumorzellen (1 χ 10 Zellen/Maus) transplantiert, die vorher eine Woche lang intraperitoneal in einer Maus des gleichen Stammes gezüchtet worden waren. Diese Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt: eine Gruppe zu 20 Mäusen als Kontrollgruppe und drei Gruppen zu 10 Mäusen jeweils als Testgruppen. An fünf aufeinanderfolgenden Tagen _t vom· Tage nach der Transplantation der Tumorzellen ab gerechnet, wurde die RDP-Substanz, aufgelöst in einer Salzlösung*) intraperitoneal in einer Dosis von 10, 30 oder 100 mg pro kg (mg/kg)' an die Testgruppen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde andererseits nur eine Salzlösung in der gleichen Weise verabreicht.

Die Überlebenszeit (Tage) wurde bestimmt und die Verlängerung des Lebens wurde nach der folgenden Gleichung errechnet:

durchschnittliche Überlebenszeit Verlängerung des ^{(Tage) der} Testgruppe

¹^*^{3 {%)} x

durchschnittliche Überlebenszeit (Tage) der Kontrollgruppe

b) Effekt der oralen Verabreichung der RDP-Substanz gegen

einen syngenetischen Tumor Meth-A

Auf 50 sechs Wochen alte weibliche BALB/C-CRJ-Mäuse (durchschnittliches Gewicht 20 g) wurden subkutan im Achselbereich Tumorzellen (1 χ 10^ Zellen/Maus) transplantiert, die eine Woche lang intraperitoneal in einer Maus des glei- *) physiologische Kochsalzlösung

chen Stammes gezüchtet worden waren. Diese Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt: eine Gruppe zu 20 Mäusen als Kontrollgruppe und drei Gruppen zu 10 Mäusen jeweils als Testgruppen. An 10 aufeinanderfolgenden Tagen, vom Tage nach der Transplantation der Tumorzellen ab gerechnet, wurde die RDP-Substanz, gelöst in einer Salzlösung, oral in einer Dosis von 10, 30 oder 100 mg/kg an die Testgruppen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde andererseits nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise verabreicht. 35 Tage nach der Transplantation der Tumorzellen wurden die Mäuse getötet und der Tumor, der sich entwickelt hatte, wurde herausgeschnitten und gewogen. Die Inhibierungsrate wurde aus der folgenden Gleichung errechnet:

durchschnittliches Gewicht des Tumors bei der Test-Inhibierungs-Rate (%) = ( 1 - gruppe

durchschnittliches Gewicht des Tumors bei der Kontroilgruppe

Die Antitumor-Aktivitäten der RDP-Substanz, wie sie bei den vorstehend beschriebenen Verfahren (a) und (b) bestimmt wurden, sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Probe

Dosis
(mgAg)

Kontrolle
(Kochsalzlösung} -

RDP-Substanz

10
. 30
100

intraperitoneale Verab- orale Verabreichung

reichung (a)

durchschnitt liche überlebenszeit (Tage)

21.0

27.3

>42.0

35.7

Verlängerung des
Lebens (%)

130

>200

170

(b)

durchschnitt
liches
Tumorgewicht

9.30

5.12
3.72
4.65

Inhibierungsrate (%)

45 60 50

-VE-

Aus den Ergebnissen der Tabelle I ist zu ersehen, daß die RDP-Substanz eine starke Antitumor-Aktivität aufweist bei einer optimalen Dosis von etwa 30 mg/kg sowohl bei der intraperitonealen als auch bei der oralen Verabreichung. 5

Außerdem wurde bestätigt, daß die RDP-Substanz auch wirksam ist gegenüber dem Lewis-Lungencarcinom, dem Melanoma B-16, dem Sarcome 180 und dem Ehrlich-Ascites-Carcinom innerhalb eines Dosisbereiches von 10 bis 100 mg/kg bei intraperitonealer oder oraler Verabreichung, mit dem Ergebnis, daß die Tumorinhibierungsrate 30 bis 70 % betrug. Außerdem war die RDP-Substanz nicht toxisch, wie nachstehend näher beschrieben. Es wird angenommen, daß die RDP-Substanz als sehr wirkungsvolles Antitumormittel verwendet werden-wird.

2) Immunomodulierungsaktivitäten

a) Kohlenstoff-Freisetzungs-Test (CCT)

Dieser Test wird angewendet zur Bestimmung des Effekts der RDP-Substanz in bezug auf die Verstärkung der phagocytischen Aktivität von Makrophagen unter den Immunomodulierungswirkungen.

Die in einer Salzlösung gelöste RDP-Substanz wurde intraperitoneal an eine Testgruppe von sechs vier Wochen alten weiblichen ICR-CRJ-Mäusen (durchschnittliches Gewicht 20 g) 2 Tage lang verabreicht. Andererseits wurde an die Kontrollgruppe nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise verabreicht. Am dritten Tage wurden 0,25 ml einer Kohlenstofflösung (hergestellt durch Verdünnen einer Druckerschwärze-Fount India, hergestellt von der Firma Perikan Co., mit einer Salzlösung auf das 5-fache) in die Schwanzvene injiziert. Unmittelbar nach der Injektion und auch 10 min nach der Injektion wurden 0,025 ml Blut aus dem Venenplexus der Äugenhöhlenrückwand der Maus gesammelt, in 3,5 ml einer 0,01 M Natriumcarbonatlösung suspendiert und es wurde die Extinktion-(Absorption) (OD--J bei 650 nm gemessen, um die Rate der Abnahme der Konzentration des Kohlenstoffs in dem Blut zu bestimmen. Dies wird durch einen Phago-

42-

cyten-Index angezeigt, definiert ist:

der durch die folgende Gleichung

Phagocyten-Index '=

1OgC₁ - logC,

T₂ -

worin C₁ eine Extinktion (OD₆₅₀) zum Zeitpunkt T₁ und eine solche zum Zeitpunkt T₂ bedeuten.

Bei den Tumor tragenden Mäusen wurden Sarcoma 180-Zellen in den Muskel des Hinterbeins der Mäuse (1 χ 10⁷ Zellen/ Maus) 7 Tage vor dem Beginn der Verabreichung der RDP-Substanz transplantiert und danach wurden die Mäuse auf ^die gleiche Weise wie oben getestet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

	Probe	Dosis (mg Ag)	Tabelle II	Relativ wert	Toner-tragende	Mäuse
I	Kontrolle fKochsalz)	-	normale Maus	100	Phagocyten- Index	Relativ wert
RDP- Substanz	. 10 30	Phagocyten- Index	125 220	101 ^Xl°"	100
	100	42.8 ^χ10~	202	110 150	109 149
	53.7 94.2		130	129
	86.5

Aus den Ergebnissen der Tabelle II ist zu ersehen, daß sowohl bel-den normalen als auch bei den Tumor tragenden Mäusen die Verabreichung der RDP-Substanz in einer Menge von 10 bis 100 mg/kg/ insbesondere in einer Menge von 30

-wr-

mg/kg, die Funktion des Reticuloendothel-Systems der Mäuse verstärkte (verbesserte) und die phagocytische Aktivität der Macrophagen erheblich verstärkte.

5 b) Plague-Bildungs-Zellen-Test (PFC)

Dieses Verfahren wird angewendet zur Bestimmung des Effekts der RDP-Substanz auf die Verstärkung (Verbesserung) der Antikörper-Bildungsfähigkeit als Folge der Aktivierung von B-Zellen des Wirts unter den Immunomodulierungswirkungen.

Die RDP-Substanz, gelöst in einer Salzlösung, wurde intraperitoneal an eine Testgruppe von sechs 4 Wochen alten weiblichen ICR-CRJ-Mäusen (durchschnittliches Gewicht 20 g) an drei aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise verabreicht. Am vierten Tage und auch am 11. Tage wurden rote Schafs-Blutkörperchen in die Schwanzvene (4 χ 10⁸ Zellen/Maus) injiziert■ _f um die Mäuse zu sensibilisieren. 4 Tage nach der Injektion wurde das Plaque-Bildungsvermögen der Milzzellen der Mäuse bestimmt nach dem Verfahren von Cunningham. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

	Dosis	■	10	Tabelle III	Sensibilisierung am 11. Tage	Relativ wert (%)
Probe	(xngAg)	'30	Sensibilisierung am 4. Tag	Anzahl der Plaquen pro Milz	100 ·
	100	Anzahl der Relativ- Plaquen pro viert Milz (%)	2.4 ⁱ¹⁰⁴	250
K ontrolle (Salzlösung)"	2.7 ^Xl° 100	6.0	360
RDP- Substanz	4.1 150	8.6	337
	7.0 260	8.1
	6.3 233

Aus den Ergebnissen der Tabelle III ist zu ersehen, daß die Verabreichung der RDP-Substanz in einer Dosis von 10 bis 100 mg/kg die Fähigkeit zur Bildung von Antikörpern erheblich verstärkte (verbesserte). 5

c) Hypersensibilisierungsreaktion vom verzögerten Typ

(DHR)

Dieses Verfahren wird angewendet zur Bestimmung des Effekts der RDP-Substanz in bezug auf die Verstärkung der Wirkung der durch Zellen vermittelten Immunität als Folge der Aktivierung von T-Zellen des Wirts unter den Immunomodulierungswirkungen.

Die RDP-Substanz, gelöst in einer Salzlösung, wurde oral an eine Testgruppe von sechs 8 Wochen alten ICR-CRJ-Mäusen (weiblich, durchschnittliches Gewicht 27 g) an acht aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde andererseits nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise verabreicht. Am vierten Tage nach der Verabreichung wurde eine 5 %ige Ethanollösung von Picrylchlorid auf den Abdominalbereich aufgetragen, der rasiert worden war, um eine primäre Sensibilisierung zu erzielen. Am 11. Tage wurde eine 1 %ige Olivenöllösung von Picrylchlorid auf die Vorderseite und die Rückseite jedes Ohrs der Maus aufgetragen, um eine sekundäre Sensibilisierung zu erzielen. 24 Stunden später wurde eine Zunahme der Dicke des Ohrs mittels eines Meßinstruments (Lehre) gemessen; d.h., die Zunahme der Dicke des Ohres wurde durch Messung des Unterschieds der Dicke vor dem Aufbringen und nach dem Aufbringen bestimmt. Andererseits wurde im Falle der Tumortragenden Mäuse Sarcoma .180 (1 χ 10 Zellen/Maus) intraperitoneal transplantiert vor der Verabreichung der RDP-Substanz und danach wurde das gleiche Verfahren wie oben wiederholt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV

35 angegeben.

1	Dosis (mg/kg)	-nr- Tabelle IV	Relativ wert	Tumor-tragende	Maus
	30 100 500	normale Maus	100 245 240 173	Zunahme der Dicke des Ohrs(mm)	Relativ wert
Probe 5	. Zunahme der Dicke des Ohrs (mm)			0.94 ^Xl° 100 2.40 255 2.35 250 2.08 221 .
Kontrolle (Salzlösung) RDP- 10 Substanz	3.39 8.30 8.14 5.86

15Aus den Ergebnissen der Tabelle IV ist zu ersehen, daß die in einer Dosis von 30 bis 500 mg/kg oral verabreichte RDP-Substanz die durch Zellen vermittelte Immunität sowohl bei den normalen als auch bei den Tumor-tragenden Mäusen sehr verstärkte (verbesserte).

Aus den Ergebnissen der vorstehend beschriebenen Tests (a), (b) und (c) ist zu ersehen, daß die RDP-Substanz verschiedene ImmunitätsWirkungen mit verschiedenen Mechanismen stark verbessert. Das Immunomodulierungsmittel .kann in

25den Fällen verwendet werden, in denen die Immunitätsfunktion abnimmt oder die Erkennungsfunktion gegenüber dem Fremd-Antigen gering ist. Es wird daher angenommen, daß die RDP-Substanz Verwendung finden wird beispielsweise als therapeutisches Mittel oder als therapeutisches Hilfsmittel oder als Mittel zur Verhinderung oder als Mittel zur Beschleunigung der Erholung nach der Operation bei Infektionserkrankungen und bösartigen Tumoren.

Zusätzlich zum vorstehend beschriebenen Immunitätsaktivierungs- oder -erholungsvermögen kann das Immunomodulierungsmittel manchmal dazu verwendet werden, die abnorm stimulier-■ te Immunitätsreaktion zu normalisieren; es kann beispielsweise auf Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Rheumatismus,

1 Collagenerkrankungen und Allergie, angewendet werden.

3) Wirts-Abwehraktivität

Es ist bekannt, daß die Wirts-Aktivitäten von Lebewesen gegenüber bakteriellen Infektionserkrankungen auf folgenden Prinzipien basieren: eine wird als sogenannte Humoral-Immunität bezeichnet, die von der Bildung von Antikörpern gegen die eingedrungenen'Bakterien abhängt, und eine andere wird als sogenannte Zellen-vermittelte Immunität bezeichnet, in der Makrophagen und T-Zellen die eingedrungenen Bakterien bekämpfen. Im allgemeinen weist der lebende Körper ausreichende eigene Abwehr-Aktivitäten gegenüber dem Eindringen dieser Fremd-Bakterien auf. Es ist jedoch bekannt, daß im Tumor-tragenden Zustand, insbesondere im späteren Krebsstadium, diese Aktivitäten stark abfallen, weshalb eine schwerwiegende Schädigung schon durch einige nicht-pathogene Bakterien hervorgerufen wird., die in der Regel in dem Wirt existieren.

20 um zu bestimmen, ob die RDP-Substanz die Wirts-Abwehraktivitäten des Wirts gegenüber durch solche Bakterien hervorgerufenen Infektionserkrankungen verstärkt (verbessert) , wurde die Inhibierungs-Aktivität der RDP-Substanz gegenüber der Infektion durch Escherichia coli,

einem typischen Infektions-Mikroorganismus, an der, wie angenommen wird, die Humoral-Immunität teilnehmen kann, und gegenüber der Infektion durch Listeria monocytogenes, an der, wie angenommen wird, die durch Zellen vermittelte Immunität teilnehmen kann, untersucht.

7 Wochen alte ICR-CRJ-Mäuse (weiblich, durchschnittliches Gewicht 26 g) wurden in vier Gruppen zu jeweils 20 Mäusen aufgeteilt. Die RDP-Substanz, gelöst in einer Salzlösung, wurde subkutan in den Rücken der Mäuse in einer Dosis von 10, 30 oder 100 mg/kg an drei Tagen und einem Tag vor der Infektion -injiziert. Der Kontrollgruppe wurde nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise injiziert.

Dann vnarden im Falle von E. coli die Mäuse mit 2 χ 10 Zellen/Maus subkutan in den Rücken infiziert und im Falle von L. monocytogenes wurden die Mäuse mit 2 χ 10 Zellen/ Maus intraperitoneal infiziert. Nach 1 Woche wurde die Anzahl der überlebenden verglichen. Der Schutzeffekt wurde aus der folgenden Gleichung errechnet:

Anzahl der überlebenden Anzahl der überlein der Testgruppe - benden in der Kon-Schutzeffekt _ trollgruppe

Q (%) Anzahl der Mäuse in einer Gruppe x100

Die Ergebnisse sind in der Tabelle V angegeben.

Tabelle V

Verabreichungszeit vor der Infektion

Bakterien	Probe	TYicH «;	1 Tag vorher	Schutz	3 Tage vorher	Schutz
			Anzahl der	effekt (%)	Anzahl der	effekt (%)
		img/Kgj	Überleben		Überleben
			den		den
	Kontrolle		π		π
	(Salzlösung)
E. coli				80		85
SB-OOl		10	16	90	17	95
	RDP - Substanz	30	18	100	19	100
		100	20		20
	Kontrolle		η		η
	(Salzlösung)
L. mono.				40		40
SB-οΊΊΓ		10	8	60	8	60
•	RDP- Substanz^.	30	12	50	12	50
		100	10	10

CD O K) CO

/s-

Aus den Ergebnissen der Tabelle V ist zu ersehen, daß die Verabreichung der RDP-Substanz in einer Dosis von 10 bis 100 mg/kg vor der Infektion sehr starke Wirts-Abwehr-Aktivitäten gegenüber der Infektion durch E. coli und auch signifikante Aktivitäten gegenüber der,Infektion durch L. monocytogenes hervorrief.

Im'Hinblick darauf, daß die RDP-Substanz untoxisch ist, ist zu erwarten, daß diese Substanz ein sehr wertvolles Wirtsabwehrmittel gegen Infektionserkrankungen ist.

Die akute Toxizität der RDP-Substanz wird nachstehend näher beschrieben.

10 fünf Wochen alte SD-CRJ-Ratten (männlich, Gewicht 120 bis 150 g) wurden in der Kontrollgruppe bzw. in der Testgruppe verwendet. Die RDP-Substanz wurde einmal in der physikalisch maximalen Dosis von 15 g/kg an die Testgruppe verabreicht und an die Kontrollgruppe wurde nur eine Salzlösung verabreicht. Keine Ratte starb. Die Zunahme des Gewichts der Testgruppe war gleich derjenigen der Kontrollgruppe. Außerdem wurde sowohl in bezug auf das Aussehen als auch in bezug auf die Nekropsie keine Abnormität festgestellt. Es wird daher angenommen, daß die LD der erfindungsgemäßen Substanz größer als 15 g/kg ist und daß die Substanz keine akute Toxizität aufweist.

Erfindungsgemäß kann die Polysaccharid-RDP-Substanz, die, wie vorstehend beschrieben, eine verbesserte Antitumor-, Immunomodulierungs- und Wirts-Abwehraktivität gegenüber Infektionserkrankungen aufweist, in großer Menge hergestellt werden, wie die weiter unten beschriebenen Beispiele zeigen werden, durch eine Kombination von verhältnismäßig einfachen Verfahrensmaßnahmen. Die vorliegende Er-Bindung hat daher einen sehr hohen praktischen Wert auf dem Gebiet der ^kommerziellen Herstellung eines Polysaccharids aus Reiskleie mit ausgezeichneten biologischen Aktivitäten.

Da die erfindungsgemäße RDP-Substanz außerdem, wie festgestellt wurde, eine Interferon induzierende Fähigkeit hat, ist anzunehmen, daß sie einen Verhinderungs- oder Behandlungseffekt gegenüber Viruserkrankungen, wie z.B. Herpes

5 und Influenza, hat.

Da die RDP-Substanz sowohl oral als auch nicht-oral verabreicht werden kann, ist anzunehmen, daß sie ein sehr wertvolles Antitumor-, Immunomodulierungs- oder Infektionserkrankungen-Verhinderungs- oder -Behandlungsmittel darstellt.

In der praktischen Form eines Arzneimittels kann die RDP-Substanz einzeln oder in Kombination mit Adjuvantien (wie z.B. Wasser, einer Salzlösung, Polyethylenglykol, Glycerogelatine, Stärke, Dextrin, Lactose und dgl.) in Form beispielsweise eines flüssigen Arzneimittels, in Form von Pellets, Tabletten, eines Pulvers und Suppositorien und dgl., formuliert werden.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläu tert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

125 1 Leitungswasser wurden zu 25 kg handelsüblicher Reiskleie zugegeben, die von Reisbruchstücken und dgl. durch Passieren durch ein Sieb abgetrennt worden war. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 120⁰C und 5 Stunden lang

30 bei 100^eC unter konstantem Rühren extrahiert.

Dann wurde die Mischung filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck auf 40 1 eingeengt. Das auf diese Weise 'eingeengte· Filtrat wurde mit Natriumhydroxid auf pH 6,7 eingestellt und danach wurden 500 mg einer tf-Amylase (hergestellt von der Firma Nagase Sangyo Co., Ltd.) zugegeben und es wurde eine Enzymbehandlung eine Stunde lang bei 7O⁰C durchgeführt. Nach der Enzymbehandlung wurde das

-vt-

Enzym durch Erhitzen bis auf 10O⁰C inaktiviert und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Bis zur Endkonzentration von 30 Vol./Vol.-% wurde Ethanol zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt. Dieser Niederschlag wurde in Wasser wieder aufgelöst, um die unlöslichen Bestandteile zu entfernen. Der lösliche Teil wurde lyophilisiert und man erhielt 508 g eines hellgelben Pulvers. 4 g dieses Pulvers wurden in mit einem Ionenaustauscher behandeltem Wasser wieder aufgelöst und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Der lösliche Teil wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sepharose CL-6B (hergestellt von der Firma Pharmacia Chemicals AB) unterworfen und die in das Leervolumen eluierten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 1 g eines weißen Pulvers erhielt. Dieses weiße Pulver wurde in 100 ml mit Ionenaustauscher behandeltem Wasser wieder aufgelöst und zusammen mit 20 ml Chloroform und 4 ml n-Butanol in einen Scheidetrichter gegeben. Die Mischung wurde 60 min lang geschüttelt und dann bei einer niedrigen Geschwindigkeit zentrifugiert, wobei eine weiße Schicht von denaturiertem Protein zwischen einer Wasserschicht und einer Chloroformschicht gebildet wurde. Der Wasserschichtanteil wurde aus dem Scheidetrichter entnommen. Es wurde eine Chloroform/-n-Butanol-Mischung in dem gleichen Verhältnis wie oben zugegeben und die resultierende Mischung wurde geschüttelt. Diese Operation wurde etwa 30 mal wiederholt, bis keine weiße Schicht des denaturierten Proteins mehr auftrat. Der Wasserschichtanteil wurde lyophilisiert, wobei man 800 mg eines weißen deproteinisierten Pulvers erhielt.

Beispiel 2

25 kg handelsübliche Reiskleie wurden durch Erhitzen unter Rückfluß mit 100 1 Hexan entfettet und dann getrocknet. Die entfettete Reiskleie wurde dann auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man 450 g eines hellgelben Pulvers erhielt. 4 g dieses Pulvers wurden auf die

gleiche Weise wie. in Beispiel 1 behandelt, wobei man 750 mg eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 3 5 .

3 kg handelsübliche entfettete Reiskleie wurden mit 20 1 Wasser gemischt und die Mischung wurde dann 2 Stunden lang unter konstantem Rühren bei 120⁰C extrahiert. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 5 1 einer konzentrierten Lösung erhielt. Dann wurden 0,3 g einer ot -Amy la se zu der Lösung zugegeben und diese wurde 5 Stunden lang bei 60⁰C gehalten. Danach wurde die Mischung auf 100⁰C erhitzt und zentrifugiert, wobei man 4,9 1 einer überstehenden Flüssigkeit erhielt. Zu der Endkonzentration von 40 Vol.-/Vol.-% wurde Ethanol zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt und dann lyophilisiert, wobei man 88 g eines hellgelben-braunen Pulvers erhielt. 4 g dieses Pulvers wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man 720 mg eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 4

20 kg handelsübliche Reiskleie wurden durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,60 mm (30-mesh) passiert, um Verunreinigungen, wie z.B. Reisbruchstücke, zu entfernen, und dann wurden sie mit 100 ml Wasser, das mit einem Ionenaustauscher behandelt worden war, gewaschen. Danach wurden 50 1 destilliertes Wasser zu der gewaschenen Reiskleie zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden lang unter konstantem Rühren bei 110⁰C extrahiert. Die Mischung wurde filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und zentrifugiert, wobei man 10 1 einer überstehenden Flüssigkeit erhielt. Dann wurden 250 mg einer U-Amylase zugegeben und 24 Stunden lang bei 65⁰C gehalten. Die Mischung wurde auf 100⁰C erhitzt. Dann wurde Ethanol bis auf die Endkonzentration von 30 Vol.-/Vol.-% zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt. Dieser Niederschlag wurde in 3 1 Wasser wieder aufgelöst und die unlöslichen

-24-

1 Anteile wurden entfernt und erneut auf 1 1 eingeengt

und zentrifugiert, wobei man eine überstehende Flüssigkeit erhielt. Diese überstehende Flüssigkeit wurde 2 Tage lang in fließendem Wasser dialysiert und zentrifugiert, wobei man 1 1 einer überstehenden Flüssigkeit erhielt. Eine Mischung von 200 ml Chloroform und 40 ml n-Butanol wurde zu 1 1 der überstehenden Flüssigkeit zugegeben. Danach wurden eine Deproteinisierung und eine Lyophilisierung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei man 402 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 5

1 1 einer überstehenden Flüssigkeit, wie sie durch Dialyse und Zentrifugieren in Beispiel 1 erhalten worden war, wurden unter Verwendung von CM Sepharose, einem Kationenaustauschergel, und DEAE Sepharose, einem Anionenaustauschergel, einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen. Die nicht adsorbierten Fraktionen wurden gesammelt und auf 1 1 eingeengt. Danach wurden eine Deproteinisierung und eine Lyophilisierung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei man 358 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 6

10 g Aktivkohle wurden zu 1 1 einer überstehenden Flüssigkeit zugegeben, die durch Dialyse und Zentrifugieren in Beispiel 1 erhalten worden war. Nach 30 min wurde die Mischung zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde der gleichen Deproteinisierungs- und Lyophilisierungsbehandlung wie in Beispiel 4 unterworfen, wobei man 365 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 7 35

Eine 20 ml-Portion von 1 1 einer überstehenden Flüssigkeit, wie sie durch Dialyse und Zentrifugieren in Beispiel 4 erhalten worden war, wurde unter Verwendung von Sepharose

30-

CL-6B einer Gelfiltration unterworfen und die Lehrvolumen-Fraktionen wurden gesammelt zur Auffüllung auf 100 ml. Diese Flüssigkeit wurde der gleichen Deproteinisierungs- und Lyophilisierungsbehandlung wie in Beispiel 1 unterwor-

5 fen, wobei man 70 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 8

Der durch die Ethanol-Ausf ällung nach einer ex. -Amylasebehandlung in Beispiel 1 erhaltene Niederschlag wurde in 10 1 Wasser wieder aufgelöst. Die Lösung wurde einer Ultrafiltration unterworfen, um den niedermolekularen Teil mit einem Molekulargewicht von weniger als 80 000 zu entfernen, und auch um eine Einengung auf 3 1 zu erzielen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt, wobei man 2,8 1 überstehende Flüssigkeit erhielt. Diese überstehende Flüssigkeit wurde der gleichen Deproteinisierungs- und Lyophilisierungsbehandlung wie in Beispiel 1 unterworfen, wobei man 400 g eines weißen Pulvers erhielt. 20

Beispiel 9

Der Lösung, die der oC-Amylasebehandlung und der anschließenden Inaktivierung des Enzyms bei 100⁰C für 1 Stunde in Beispiel 1 unterworfen worden war, wurde Aceton bis auf eine Endkonzentration von 40 Vol./Vol.-% zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wurde in 10 1 Wasser gelöst. Danach wurde das gleiche Verfahren einschließlich der Behandlung unter Verwendung eines Ultrafilters wie in Beispiel 8 an-

30 gewendet, wobei man 412 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 10

Der Lösung', die der c*.-Amylasebehandlung und der anschließenden Inaktivierung des Enzyms bei 100⁰C für 1 Stunde in Beispiel 1 unterworfen worden war, wurde Ammoniumsulfat bis zu einem Grad der Sättigung von 70 % zugesetzt, um eine Aussalzung zu erzielen. Der gebildete Niederschlag

wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 3 1 Wasser gelöst und gegen fließendes Wasser 2 Tage lang dialysiert. Der Lösung wurde Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 7 % zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde erneut gegen fließendes Wasser 2 Tage lang dialysiert. Das dabei erhaltene Dialysat wurde lyophilisiert, wobei man 503 g eines hellgelben Pulvers erhielt. 4 g des Pulvers wurden in Wasser, das mit einem Ionenaustauscher behandelt worden war, gelöst und über eine Sepharose

CL-6B-Säule laufen gelassen. Die Leervolumenfraktionen wurden ο gesammelt und lyophilisiert, wobei man 1,5g eines weißen Pulvers erhielt.

15 Beispiel 11

Die der öt-Amylasebehandlung in Beispiel 1 unterworfene Lösung wurde auf 4O⁰C abgekühlt und dann wurden 600 mg einer Proteinase (Pronase E, hergestellt von der Firma Kaken Kagaku Co., Ltd.) zugegeben und 24 Stunden lang reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang auf 100⁰C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde Ethanol bis auf die Endkonzentration von 30 Vol./Vol.-% zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und dann in 10 1 Wasser gelöst. Danach wurde das gleiche Verfahren einschließlich der Behandlung unter Verwendung eines ultrafilters wie in Beispiel 8 angewendet,

30 wobei man 413 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 12

Zu 3 1 der überstehenden Flüssigkeit, die durch die Behandlung unter Verwendung eines Ultrafilters in Beispiel 8 erhalten-worden war, wurde eine Mischung von Chloroform und n-Butanol in dem gleichen Verhältnis wie in Beispiel 1 zugegeben zur Durchführung einer Deproteinisierungsbehand-

lung. Ein wasserlöslicher Anteil wurde sprühgetrocknet, wobei man 420 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 13 5

Zu dem wasserlöslichen Anteil, wie er bei Anwendung der Deproteinisierungsbehandlung in Beispiel 12 erhalten worden war, wurde Ethanol bis auf die Endkonzentration von 40 Vol./Vol.-% zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt, gewaschen und 3 mal mit -j Ethanol entwässert und dann im Vakuum getrocknet, wobei man 405 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 14 15

Zu 2 g eines weißen Pulvers, wie es in Beispiel 5 erhalten worden war, wurden 100 ml· einer Mischung von 2 % Schwefelsäure und Ameisensäure zugegeben und 4 Stunden lang bei 6O⁰C gehalten, um es zu hydrolysieren. Die Lösung wurde durch Zugabe von Bariumcarbonat neutralisiert und zentrifugiert und es wurde eine überstehende Flüssigkeit erhalten.

Eine Hälfte des Volumens der überstehenden Flüssigkeit wurde'auf Sepharose CL-2B aufgegeben und die Fraktion F-(Molekulargewicht> 20 000 000), die in das Leervolumen eluiert wurde, und die Fraktion F₂ (Molekulargewicht etwa 1 000 000) wurden gesammelt. Eine weitere Hälfte des Volumens der überstehenden Flüssigkeit wurde auf Sephadex G-200 (hergestellt von der Firma Pharmacia Chemicals AB) aufgegeben und die Fraktion F₃ (Molekulargewicht etwa 100 000) und die Fraktion F₄ (Molekulargewicht etwa 10 000) wurden gesammelt. Durch Lyophilisieren jeder Lösung erhielt man weiße Pulver: F₁: 412 mg, F₂' 248 mg, F-: 295 mg und F₄; 263 mg.

35

Die biologischen Aktivitäten jeder Fraktion wurden unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens getestet.

3 4 O S O 2

Alle vier Fraktionen zeigten ebenso starke Aktivitäten wie die RDP-Substanz vor der Hydrolyse. Die Ergebnisse sind nachstehend im Detail wiedergegeben.

5 1) Antitumoraktivitäten

Die Aktivitäten gegenüber einem syngenetischen Tumor, Meth-A, bei oraler Verabreichung sind in der Tabelle VI angegeben.

	Dosis (mg/kg)	Tabelle VI	Inhibierungsrate	43
Fraktion	-	durchschnittliches Tumorgewicht (g)	■	40
Kontrolle (Salzlösung)	30	8.60	38
^Fl	η	4.90	38
^F2	η	5.16
F₃	H	5.33
^F4	5.30

2) Immunomodulierungsaktivitäten

a) Kohlenstoff-Entfernungs-Test (CCT)

Die Aktivitäten unter Verwendung von Tumor-tragenden Mäusen

sind in der folgenden Tabelle VII angegeben.

	Tabelle VII	Relativwert (%)
Fraktion Dosis (mg/kg)	ßiagocyten-Index	100
Kontrolle (Salzlösung) -	in ^xl0~³	138
F₁ 30	153	140
F₂	155	142
F₃	158	135
F₄ ^	150

1 b) Plaque-Bildungs-Zellen-Test (PFC)

Die Aktivitäten bei Verwendung von normalen Mäusen, die am 4. Tage durch rote Schafs-Blutkörperchen sensibilisiert wurden, sind in der folgenden Tabelle VIII angegeben.

	Dosis (mg/kg)	Tabelle VIII	• Relativwert
Fraktion	-	Plaque-Anzahl in der Milz	100
Kontrolle (Salzlösung)	30	2.6^xl°⁴	231
^Fl	η	6.0	212
*^F2	η	5.5	200
^F3	η	5.2	192
14	5.0

c) Hypersensibilisierungsreaktion vom verzögerten Typ (DHR) Die Aktivitäten bei Verwendung von Tumor-tragenden Mäusen sind in der folgenden Tabelle IX angegeben.

	Dosis (mg (kg)	Tabelle IX	Relativwert (%)
Fraktion	-	Zunahme der Dicke des Ohrs (im)	100
Kontrolle (Salzlösung)	•30	0.90 ^x10"²	230
*1	N	2.07	245
" *2 ·	n	2.21	210
^<F3	m	. 1.89	200
^F4 ■	1.80

3) Wirts-Abwehr-Aktivitäten gegen Infektionserkrankungen Die Aktivitäten bei subkutaner Verabreichung einen Tag vor der Infektion sind in der folgenden Tabelle X angegeben.

Tabelle X

Eraktion

Kontrolle (Salzlösung)

Dosis (ng/kg)

30

E.

*2)

L. mono

Anzahl der Schutzeffekt Anzahl der Schutz-Überlebenden (%) überlebenden effekt

20 18 17 17

100
90
85
85

12

10

L·. coil* ¹* : Escherichia coli SB-OOl

L. mono. \ Listeria monocytogenes SB-OlO

25 30 35

Si

- Leerseite -

Claims

Patentansprüche 10

1. / Polysaccharid-RDP-Substanz, dadurch g e k e η η zeichnet , daß sie

a) die folgenden Eigenschaften aufweist: 15 sie passiert eine Dialysemembran nicht;

sie ist in Alkohol, Aceton, Hexan, Benzol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Ligroin, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Äther unlöslich und in Wasser löslich; eine 1-%ige wäßrige Lösung ist neutral;

20 si⁶ enthält nicht mehr als 5 % Mineralien;

sie reagiert positiv in den folgenden Reaktionen: Molisch-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion und Carbazol-Schwefelsäure-Reaktion; und sie reagiert negativ in den folgenden Reaktionen: Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folin-Reaktion, Elson-Morgan-Reaktion und Stärke-Jod-Reaktion; sie weist ein Ültraviolett-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, ein Infrarot-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, und ein C-NMR-Spektrum, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, auf;

b) sie enthält Glucose als einzige Zuckerkomponente und ist aufgebaut aus einer o<-1,6-Glucosid-Bindung als einer Hauptkette und enthält ferner eine o(-1,4-Glucosid-Bindung.

2. Verfahren zur Herstellung einer Polysaccharid-RDP-Substanz, insbesondere einer solchen nach Anspruch 1,

1 die

a) die folgenden Eigenschaften aufweist: sie passiert eine Dialysemembran nicht; sie ist in Alkohol, Aceton, Hexan, Benzol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Ligroin, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Äther unlöslich und in Wasser löslich; eine 1 %ige wäßrige Lösung ist neutral; sie enthält nicht mehr als 5 % Mineralien; sie reagiert positiv in den folgenden Reaktionen: Molisch-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion und Carbazol-Schwefelsäure-Reaktion; und sie reagiert negativ in den folgenden Reaktionen: Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folin-Reaktion,

Elson-Morgan-Reaktion und Stärke-Jod-Reaktion; sie weist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie es

in Fig. 1 dargestellt ist, ein Infrarot-Absorptionsspektrum,wie es in Fig. 2 dargestellt ist, und ein C-NMR-Spektrum,wie es in Fig. 3 dargestellt ist, auf;

b) sie enthält Glucose als einzige Zuckerkomponente und ist aufgebaut aus einer «-1,6-Glucosid-Bindung als einer Hauptkette und enthält ferner eine &-1,4-Glucosid-Blndung, dadurch gekennzeichnet, daß man
Reiskleie mit heißem Wasser behandelt, um die Polysaccha-

rid-RDP-Substanz in Wasser zu extrahieren,.

ein polares organisches Lösungsmittel oder ein Aussalzungsmittel dem die extrahierte Substanz enthaltenden Wasser zugibt unter Bildung von Niederschlägen, welche die PoIysaccharid-RDP-Substanz enthalten,

die Niederschläge isoliert und die Niederschläge einer Deproteinisierungsbehandlung unterwirft.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als polares organisches Lösungsmittel ein Lösungsmittel verwendet, das ausgewählt wird aus der Gruppe Methanol, Ethanol, Propanol und Aceton.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausssalzungsmittel eine Verbindung verwendet, die ausgewählt wird aus der Gruppe Natriumchlorid, Ammoniumsulfat und Kaliumchlorid.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Deproteinisierungsbehandlung eine Behandlung anwendet, die ausgewählt wird aus einer Enzymbehandlung, einer Säurebehandlung und dem Sevag-Verfahren.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ferner eine Reinigungsbehandlung durchgeführt wird durch Anwendung einer Dialyse unter Verwendung einer Dialysemembran, einer Ionenaustauschbehandlung unter Verwendung eines Kationen- oder Anionenaustauscherharzes, einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran und einer Gelfiltration einzeln oder in Kombination miteinander.

7. Antitumormittel, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen besteht aus der Polysaccharid-RDP-Substanz, insbesondere nach Anspruch 1, oder ihrem pharmazeutisch verträglichen Vehiculura, wobei die Polysaccharid-RDP-Substanz

a) die folgenden Eigenschaften aufweist: sie passiert eine Dialysemembran nicht; sie ist in Alkohol, Aceton, Hexan, Benzol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Ligroin, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Äther unlöslich und in Wasser löslich;

30 eine 1 %ige wäßrige Lösung ist neutral;

sie enthält nicht mehr als 5 % Mineralien; sie reagiert positiv in den folgenden Reaktionen: Molisch-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure -Reaktion und Carbazol-Schwefelsäure-Reaktion; und sie reagiert negativ in den folgenden Reaktionen: Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folien-Reaktion,

409029

1 Elson-Morgan-Reaktion und Stärke-Jod-Reaktion;

sie weist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie es in Fi.g 1 dargestellt ist, ein Infrarot-Absorptionsspek-

13 trum, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, und ein C-NMR-

5 Spektrum, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, auf;

b) sie enthält Glucose als einzige Zuckerkomponente und ist aufgebaut aus einer «-1,6-Glucosid-Bindung als einer Hauptkette und enthält ferner eine c<-1,4-Glucosid-Bindung.

8. Immunomodulierungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen besteht aus einer Polysaccharid-RDP-Substanz, insbesondere nach Anspruch 1, oder ihrem pharmazeutisch verträglichen Vehiculum, wobei die PoIysaccharid-RDP-Substanz

20 eine 1 %ige wäßrige Lösung ist neutral;

sie enthält nicht mehr als 5 % Mineralien; sie reagiert positiv in den folgenden Reaktionen: Molisch-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion und Carbazol-Schwefelsäure-Reaktion; und sie reagiert negativ in den folgenden Reaktionen: Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folin-Reaktion, Elson-Morgan-Reaktion und Stärke-Jod-Reaktion;

30 sie weist ein ültraviolett-Absorptionsspektrum, wie es

in Fig. 1 dargestellt ist, ein Infrarot-Absorptionsspek-

13 trum, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, und ein C-NMR-Spektrum, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, auf; b) sie enthält Glucose als einzige Zuckerkomponente und ist aufgebaut aus einer W. -1,6-Glucosid-Bindung als einer Hauptkette und enthält ferner eine o<-1 ,4-Glucosid-Bindung.

9. Wirts-Abwehrmittel gegen Infektionserkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen besteht

409029

Ι aus der Polysaccharid-RDP-Substanz, insbesondere nach Anspruch 1, oder ihrem pharmazeutisch verträglichen Vehiculum, wobei die Polysaccharid-RDP-Substanz

a) die folgenden Eigenschaften aufweist: 5 sie passiert eine Dialysemembran nicht;

sie ist in Alkohol, Aceton, Hexan, Benzol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Ligroin, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Äther unlöslich und in Wasser löslich; eine 1 %ige wäßrige Lösung ist neutral;

10 sie enthält nicht mehr als 5 % Mineralien;

sie reagiert positiv in den folgenden Reaktionen: Molisch-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion und Carbazol-Schwefelsäure-Reaktion; und sie reagiert negativ in den folgenden Reaktionen: Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folin-Reaktion, Elson-Morgan-Reaktion und Stärke-Jod-Reaktion; sie weist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, ein Infrarot-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, und ein C-NMR-Spektrum, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, auf;

b) sie enthält Glucose als einzige Zuckerkomponente und ist aufgebaut aus einer oC-1,örGlucosid-Bindung als einer Hauptkette und enthält ferner eine OC-1 ,4-Glucosid-Bindung.