DE3414539C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorbehandlung eines biologischen Materials gemäß dem Oberbegriff von Patentanspruch 1 und eine Vorrichtung zur Vorbehandlung eines biologischen Ma­ terials zur Durchführung dieses Verfahrens gemäß dem Oberbe­ griff von Patentanspruch 5.

Es ist bekannt, daß für eine Beobachtung von Proben biologi­ scher Materialien mit Rasterelektronenmikroskopen die Oberflä­ che der Probe mit Primärelektronen bestrahlt wird, um aus der Oberfläche Sekundärelektronen mit einer Energie von weniger als 100 eV zu erzeugen, und daß die auf diese Weise erzeugten Se­ kundärelektronen als Informationsquelle des rasterelektronenmi­ kroskopischen Bildes verwendet werden. Da biologische Materia­ lien elektrische Isolatoren sind und dazu neigen, bei der Be­ strahlung mit den Primärelektronen aufgeladen zu werden, ist es jedoch möglich, daß das erhaltene Bild fehlerhaft ist und daß die Sekundärelektronen nicht in ausreichendem Maße emittiert werden, wodurch eine hohe Auflösung unmöglich gemacht wird.

Um dies zu vermeiden, wird die Probe des biologischen Materials nach dem Fixieren, Entwässern und Trocknen durch Vakuumaufdamp­ fung eines Metalls wie z. B. Gold oder Platin auf die Oberfläche der Probe beschichtet. Dadurch wird eine ausreichende Emission von Sekundärelektronen gewährleistet, indem eine Aufladung der Probe verhindert wird, und eine hohe Auflösung erzielt. Wenn auf der Oberfläche einer Probe eine Metallschicht mit einer Dicke von mehreren zehn Nanometern abgeschieden wird, ist es jedoch wegen des Vorhandenseins der Metallschicht schwierig, sehr feine Teile der Probe zu beobachten. Ferner werden die Be­ schichtungskosten hoch, wenn für die Vakuumaufdampfung Gold oder Platin eingesetzt wird. Mit Wolfram ist das Emissionsver­ mögen für Sekundärelektronen hoch, was mit einer hohen Auflö­ sung verbunden ist, jedoch bringt Wolfram das Problem mit sich, daß ein biologisches Material, das eine geringe Wärmebeständig­ keit hat, wegen des hohen Schmelzpunkts von Wolfram dazu neigt, sich durch die Anwendung von Wärme bei der Vakuumaufdampfung zu zersetzen.

Aus "Optik" 7 (1950), Heft 4/5, Seiten 294 bis 302, ist die Kathodenzerstäubung als Hilfsmittel zur Beobachtung mikroskopi­ scher Objekte bekannt, wobei Platin im Vakuum in Form einer dünnen Schicht auf eine Probe des zu beobachtenden Objekts auf­ gedampft wird. Platin wird verwendet, weil es sich besonders gut zerstäuben läßt. Mit der dünnen Platinschicht kann eine Emission von Sekundärelektronen erfolgen, wenn das beschichtete Objekt mit einem Elektronenstrahl bestrahlt wird. Obwohl mit der bekannten Kathodenzerstäubung dünne Platinschichten in ei­ ner Dicke von einigen zehn Nanometern aufgedampft werden kön­ nen, können feine Teile der Probe nur schwierig mit einem Ra­ sterelektronenmikroskop beobachtet werden. Bei der Behandlung von biologischem Material tritt ferner das Problem auf, daß es eine geringe Wärmebeständigkeit hat, so daß bei der Vakuumauf­ dampfung des Platins infolge der dabei auftretenden Wärme eine unerwünschte Veränderung des biologischen Materials erfolgen kann. Ferner ist Platin sehr teuer.

Aus "Zeitschrift für Physik" 129 (1951), Seiten 491 bis 503, ist es bekannt, Proben eines biologischen Materials für die Be­ obachtung mit einem Rasterelektronenmikroskop zur Kontrastver­ stärkung mit einer dünnen, durch Elektronen- oder Ionenbeschuß in einer Vakuumatmosphäre aus Kohlenwasserstoff wie z. B. Benzol gebildeten Schicht aus einem Polymerisationsprodukt zu verse­ hen, wobei durch Anlegen einer Hochfrequenzleistung Ionen er­ zeugt werden, um damit die Oberfläche des biologischen Materi­ als zu behandeln. Schichten aus einem Polymerisationsprodukt sind insofern nachteilig, als sie isolierende Eigenschaften ha­ ben und daher bei Bestrahlung mit Primärelektronen leicht auf­ geladen werden können.

Aus "Vakuum Technik" 1971, Heft 8, Seiten 225 bis 231, ist ein Trioden-Hochfrequenz-Zerstäubungssystem zur Herstellung dünner Schichten bekannt. Bei diesem bekannten Zerstäubungssystem kann zwar die Behandlungskammer von der Entladungskammer getrennt angeordnet werden, jedoch ist das bekannte System nicht zur Vorbehandlung eines biologischen Materials für die Beobachtung mit einem Rasterelektronenmikroskop vorgesehen.

Aus der DE-OS 29 50 454 ist ein dünner Abdruckfilm für Elektro­ nenmikroskopieverfahren bekannt, der durch Plasmapolymerisation monomerer organischer Dämpfe durch Glimmentladung auf einer zu beobachtenden Probe gebildet wird. Die Vorrichtung zur Herstel­ lung des bekannten Abdruckfilms ist so beschaffen, daß Behand­ lungskammer und Plasma-Entladungskammer in einer einzigen Kam­ mer vereinigt sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das im Oberbegriff von Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren in der Weise zu verbessern, daß eine wirksame Vorbehandlung biologischer Mate­ rialien für die Beobachtung mit Rasterelektronenmikroskopen möglich ist, ohne daß das biologische Material nachteilig ver­ ändert wird, und daß sehr feine Teile einer Probe des biologi­ schen Materials mit starker Vergrößerung beobachtet werden können und Sekundärelektronen mit einem hohen Wirkungsgrad emittiert werden, wenn die behandelten Oberflächen mit einem Elektronenstrahl bestrahlt werden.

Diese Aufgabe wird mit den kennzeichenden Merkmalen von Pa­ tentanspruch 1 gelöst.

Eine besondere Ausgestaltung der Erfindung besteht in einer Vorrichtung gemäß Patentanspruch 5 zur Vorbehandlung eines bio­ logischen Materials für die Beobachtung mit einem Rasterelek­ tronenmikroskop zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah­ rens.

Durch die besondere Bauweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird das biologische Material auch dann, wenn die Temperatur in der Plasma-Entladungskammer durch Erregung des Inertgases in unerwünschtem Maße erhöht wird, durch das erregte Inertgas nicht direkt erhitzt oder hinsichtlich seiner Be­ schaffenheit abgebaut, sondern mit einem Plasma, das niedrigere Temperaturen hat, behandelt oder aktiviert.

Die Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen davon werden nachstehend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 ist eine teilweise im Schnitt gezeigte schemati­ sche Ansicht einer Vorrichtung zur Vorbehandlung biologischer Materialien für die Beobachtung mit Rasterelektronenmikroskopen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 2 ist eine ähnliche Ansicht wie Fig. 1, zeigt jedoch eine andere Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 3 ist eine perspektivische Ansicht, die eine weitere Ausführungsform der Erfindung zeigt.

Fig. 4 ist eine ähnliche perspektivische Ansicht wie Fig. 3 und zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 5 bis 7 sind Mikrofotografien biologischer Materia­ lien, die durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt worden sind.

In den Zeichnungen sind gleiche Teile mit gleichen Bezugsziffern bezeichnet. Fig. 1 zeigt allgemein eine Vorbehandlungsvorrichtung A, die eine aus einem isolierenden Material wie z. B. Glas hergestellte Plasma-Entla­ dungskammer 1 (nachstehend als "Kammer" bezeichnet) in Form einer liegenden Flasche enthält. Die Kammer 1 weist an einer Seite davon eine Öffnung 2, einen aus einem ähnlichen isolierenden Material hergestellten Deckel 3 für die Öffnung 2 und eine Dich­ tung 4, beispielsweise aus Gummi, die eine hermetische Abdichtung zwischen der Kammer 1 und dem Deckel 3 ge­ währleistet, auf. Die Kammer 1 enthält auch einen Einlaß 5, durch den hindurch ein Inertgas aus einer (nicht gezeigten) Inertgasquelle in die Kammer 1 eingeleitet wird, und eine mit einer Vakuumpumpe P verbundene Auslaß­ öffnung 6. Ein Paar kapazitiver Elektroden 7 und 7′, die jeweils beispielsweise eine halbzylindrische Form haben, sind so angeordnet, daß die flaschenförmige Kammer 1 von ihnen umgeben ist, und mit einer Hochfrequenz- Stromquelle 8 verbunden. Das Paar kapazitiver Elektroden ist um die Plasma-Entladungskammer herum so vorgesehen, daß die kapazitiven Elektroden 7 und 7′ mit Abstand voneinander und einander gegenüberstehend angeordnet sind. Innerhalb der Kammer 1 befindet sich ein Proben­ träger 9 mit einer Probe 10 eines biologischen Materials. Die Probe wird nach der Entfernung des Deckels 3 durch die Öffnung 2 hindurch in die richtige Lage gebracht.

Beim Betrieb wird die in der Kammer 1 enthaltene Luft mit der Vakuumpumpe P durch die Auslaßöffnung 6 hindurch evakuiert, so daß der Innendruck der Kammer 1 auf einen Wert von 0,13 bis 0,013 mbar vermindert wird. Danach wird ein Inertgas wie z. B. Argon, Krypton oder Neon vom Einlaß 5 her in einer Menge von 10 ml/min bis 150 ml/min in die Kammer 1 eingeleitet, so daß der Druck innerhalb der Kammer bei 0,4 bis 6,7 mbar gehalten wird. Unter diesen Bedingungen wird an die kapazitiven Elektroden 7 und 7′ eine Hochfrequenzspannung von dem Netzanschluß 8 angelegt, so daß das Inertgas in der Plasma-Entladungskammer 1 erregt wird, wodurch unter Bildung eines Plasmas eine Ionisierung des Inertgases hervorgerufen wird. Als Ergebnis wird die Probe 10 in der Kammer von den Ionen oder dem dissoziierten Inertgas in dem Plasma getroffen oder damit bestrahlt. Die Behandlung wird fortgesetzt, bis die Probe an ihrer Oberfläche einer sogenannten "atomaren Bearbeitung" unterzogen wird, so daß die Probe an ihren Oberflächen aktiviert wird. Das auf diese Weise aktivierte biologische Material neigt dazu, Sekundärelektronen zu emittieren, wenn die behandelten Oberflächen mit einem Elektronenstrahl bestrahlt werden. Obwohl auf der Oberfläche der Probe kein Metall durch Vakuum­ aufdampfung abgeschieden worden ist, findet auf den Oberflächen der Probe während der Beobachtung mit Rasterelektronenmikroskopen keine elektrische Aufladung durch Aufbringen von Primärelektronen statt. Ein zufrie­ denstellendes Emissionsvermögen für Sekundärelektronen ermöglicht eine starke Vergrößerung des Bildes, die der Vergrößerung ähnlich ist, die im Fall der Vakuumauf­ dampfung von Metall erzielt wird. Außerdem können sehr feine Teile einer Probe des biologischen Materials beobachtet werden, weil auf der Probe keine Metallschicht mit einer Dicke von einigen zehn Nanometern abgeschieden wird.

Obwohl die Behandlungsbedingungen in Abhängigkeit von Faktoren wie z. B. der Kapazität der Plasma-Entladungs­ kammer, dem Typ des biologischen Materials und der Hochfre­ quenzleistung variieren können, kann eine Probe innerhalb von 5 min oder mehr behandelt werden, wenn die angewandte Hochfrequenzleistung etwa 10 W beträgt und die Plasma-Entladungskammer aus einem Glasrohr mit einem Innendurchmesser von etwa 80 mm hergestellt ist. Der Temperaturanstieg innerhalb der Plasma-Entladungskammer beträgt bei einer Hochfrequenzleistung von 10 W etwa 20°C. Folglich werden in vielen Fällen bei der Probe des biologi­ schen Materials kaum Schäden hervorgerufen. Im allgemeinen beträgt die angewandte Hochfrequenz-Ausgangsleistung 5 bis 20 W und die Behandlungsdauer 5 bis 10 min.

Die in Fig. 2 gezeigte Vorrichtung ist der Vorrichtung von Fig. 1 ähnlich, jedoch ist das Paar kapazitiver Elektroden 7, 7′ durch eine induktive Spulenelektrode 11 ersetzt worden. In diesem Fall werden ähnliche Ergeb­ nisse erzielt.

Wie es vorstehend erwähnt wurde, kann die Temperatur der Plasma-Entladungskammer bei dem zum Ionisieren dienenden Anlegen einer Hochfrequenzleistung an das Inertgas mehr oder weniger ansteigen. Dieser Temperaturanstieg kann biologische Materialien, die in hohem Maße wärmeempfind­ lich sind, beschädigen. Um die Vorrichung des vorstehend beschriebenen Typs weiter zu verbessern, wird eine Probe des biologischen Materials vorzugsweise in eine Behandlungskammer gebracht, bei der es sich nicht um die Plasma-Entladungskammer handelt, was dazu führt, daß die Probe nicht direkt durch die Entladung eines Inertgases erhitzt wird und daß der Einfluß der durch die Erregung erzeugten Wärme auf ein Minimum herabgesetzt wird. Zu diesem Zweck sollten die durch die Entladung eines Inertgases erzeugten Ionen in geeigneter Weise in Richtung auf eine Behandlungskammer, in die die Probe gebracht worden ist, geführt werden. Dies wird im einzelnen in den Fig. 3 und 4 erläutert.

Fig. 3 zeigt eine Plasma-Entladungskammer 1, die ähnlich wie die Plasma-Entladungskammern der Fig. 1 und 2 aufgebaut ist, jedoch mit dem Unterschied, daß die Kammer 1 weder den Deckel 3 mit der Dichtung 4 noch den Träger 9 für die Probe 10 aufweist und so gestaltet ist, daß der Einlaß 5 und die Auslaßöffnung 6 anders angeordnet sind. Die Kammer 1 weist ähnlich wie im Fall von Fig. 1 ein Paar kapazitiver Elektroden 7, 7′ auf. Die Kammer 1 ist an ihrem unteren Ende fest oder integral mit einem zur Führung bzw. Ableitung von Plasma dienenden Abschnitt oder Hohlzylinder 20, der in der gezeigten Weise mit einem Elektrodenring 21 versehen ist, verbun­ den. Der Abschnitt 20 erstreckt sich von der Kammer 1 aus, und zwar vorzugsweise koaxial. Der Elektrodenring 21 ist mit der Hochfrequenz-Stromquelle 8 an deren geerdeter Seite verbunden. Der Abschnitt 20 weist einen Flansch 22 auf, der durch eine Gummidichtung 24 abnehmbar an einer Behandlungskammer 23 für eine biologische Probe 10 angebracht ist.

Beim Betrieb wird die Probe 10 folgendermaßen vorbe­ handelt. Die Probe 10 wird zuerst in die Behandlungskammer 23 gebracht, die von dem Abschnitt 20 entfernt worden ist, und die Kammer 23 wird dann durch die Dichtung 24 an einem Ende des Abschnitts 20 angebracht. Dann wird die in der Vorrichtung A enthaltene Luft mit der Vakuumpumpe P entfernt, um den Druck auf einen vorher festgelegten Wert zu vermindern. Als Ergebnis wird die Behandlungskammer 23 durch die Wirkung des Differenz­ druckes zwischen dem Atmosphärendruck und dem inneren, verminderten Druck dicht verschlossen. Dann wird ein Inertgas wie z. B. Argon vom Einlaß 5 her so in die Entladungskammer 1 eingeleitet, daß die Entladungskammer 1 bei einem Druck von 0,4 bis 6,7 mbar gehalten wird. Wenn an das Paar kapazitiver Elektroden eine Hochfre­ quenzspannung von der Hochfrequenz-Stromquelle 8 angelegt wird, wird das Inertgas unter Erzeugung eines Plasmas ionisiert. Ein Teil des Plasmas wird durch die Wirkung der Elektrode 21 in Richtung auf die Behandlungskammer 23 bewegt und bestrahlt die Oberfläche der Probe 10 des biologischen Materials bis die Probe 10 durch den Effekt der atomaren Bearbeitung mit den Ionen des Inertgases aktiviert ist.

Fig. 4 zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung, bei der das Paar kapazitiver Elektroden durch eine induktive Spulenelektrode 25 ersetzt ist. Die Verwendung der induktiven Spulenelektrode 25 ermöglicht es, ein Inertgas in ähnlicher Weise wie im Fall von Fig. 3 zu ionisieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung können in geeigneter Weise auf fast alle biologischen Materialien ohne Einschränkung angewandt werden.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Das Lebergewebe einer Ratte wurde in einer Vorrichtung des in Fig. 1 gezeigten Typs unter den Bedingungen eines Vakuums von 2,7 bis 1,3 mbar, einer Hochfrequenz- Ausgangsleistung von 3 bis 5 W und einer Behandlungsdauer von 10 min vorbehandelt. Das auf diese Weise behandelte Gewebe wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (HFS-2, hergestellt von Hitachi Ltd.) beobachtet. Aus der erhaltenen Mikrofotografie (62 000fach), die in Fig. 5 gezeigt ist, geht hervor, daß die Feinstruktur der Mitochondrien der Leberzellen deutlich gezeigt wird.

Beispiel 2

Epithelzellen der Luftröhrenschleimhaut einer Ratte wurden mit einer Vorrichtung des in Fig. 3 gezeigten Typs unter den Bedingungen eines Vakuums von 2,7 bis 1,3 mbar, einer Hochfrequenz-Ausgangsleistung von 3 bis 5 W und einer Behandlungsdauer von 10 min vorbehan­ delt. Die erhaltenen Zellen wurden mit einem Raster­ elektronenmikroskop, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, beobachtet. Aus den Mikrofotografien (6700fach und 12 500fach), die in Fig. 6 bzw. Fig. 7 gezeigt werden, geht hervor, daß Feinstrukturen der Zellen deutlich beobachtet werden können.

Claims (5)

1. Verfahren zur Vorbehandlung eines biologischen Materials in einer Vakuumatmosphäre für die Beobachtung mit einem Raster­ elektronenmikroskop, bei dem man durch Anlegen einer Hochfre­ quenzleistung Ionen erzeugt, um damit die Oberfläche des biolo­ gischen Materials zu behandeln, dadurch gekennzeichnet, daß man ausschließlich Inertgas in einem Druckbereich von 0,4 bis 6,7 mbar bei einer Hochfrequenz-Ausgangsleistung von 5 bis 20 W für eine Dauer ionisiert, die ausreicht, um eine Aktivierung der Oberflächen des biologischen Materials durch Bestrahlung der Oberflächen des biologischen Materials mit den Ionen her­ vorzurufen, so daß Sekundärelektronen mit einem hohen Wirkungs­ grad emittiert werden, wenn die behandelten Oberflächen mit ei­ nem Elektronenstrahl bestrahlt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Inertgas Argon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlungsdauer 5 bis 10 min beträgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man das Inertgas zur Ionisierung in einer Entla­ dungszone erregt, die von einer Zone, in der sich das biologi­ sche Material befindet, entfernt ist und einen Teil der resul­ tierenden Ionen in Richtung auf die Zone, in der sich das bio­ logische Material befindet, führt, so daß die Oberfläche des biologischen Materials mit den Ionen bestahlt wird, wodurch der Einfluß der durch die Erregung erzeugten Wärme auf ein Mi­ nimum herabgesetzt wird.

5. Vorrichtung zur Vorbehandlung eines biologischen Materials für die Beobachtung mit einem Rasterelektronenmikroskop zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Plasma-Entladungskammer, die einen Einlaß für ein In­ ertgas und eine Auslaßöffnung aufweist und bei einem vorher festgelegten Druck gehalten werden kann, einer Evakuiereinrich­ tung, mit der die Luft durch die Auslaßöffnung der Entladungs­ kammer bis zur Erzielung einer vorher festgelegten Vakuumhöhe evakuiert werden kann, und einer Erregungseinrichtung, mit der das von dem Einlaß her zugeführte Inertgas zur Ionisierung des Inertgases in der Plasma-Entladungskammer erregt werden kann, gekennzeichnet durch einen Abschnitt, der sich von der Plasma- Entladungskammer aus erstreckt und mit dieser an einem Ende da­ von in Verbindung steht und an seiner Außenseite eine Elektrode aufweist, die dazu dient, die resultierenden Ionen in Richtung auf den Abschnitt zu führen, und eine Behandlungskammer für ein rasterelektronisch zu untersuchendes biologisches Material, die durch den Abschnitt abnehmbar an der Plasma-Entladungskammer angebracht ist, wodurch die Oberfläche des biologischen Materi­ als mit den Ionen, die in der Plasma-Entladungskammer erzeugt und durch den Abschnitt hindurchbewegt werden, bestrahlt wird.