DE3630866A1

DE3630866A1 - Verfahren und vorrichtung zur aufbringung von fluessigkeit auf einer duennen probe

Info

Publication number: DE3630866A1
Application number: DE19863630866
Authority: DE
Inventors: David John Brigati
Original assignee: Allied Corp
Current assignee: Fisher Scientific Co LLC
Priority date: 1985-09-13
Filing date: 1986-09-11
Publication date: 1987-03-26
Anticipated expiration: 2006-09-12
Also published as: US4731335A; GB2180647B; US4777020A; JPH0511857B2; GB8622191D0; JPH05240748A; DE3630866C2; US4731335B1; JPS6298231A; US4798706A; GB2180647A; US4801431A; JPH0670603B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Behandlung von Proben, wie Histologie-, Zytologie- oder Hämatologieproben, die auf einer geeigneten ebenen Oberfläche, wie einem Objektträger, immobilisiert sind, mit Flüssigkeiten, wie 1. chemischen Färbelösungen oder 2. gelösten Reagenzien, wie a) Antikörpern oder b) markierten DNA- oder RNA-Sonden, wobei solche Reagenzien jeweils für das Feststellen von Antigenen oder Nucleinsäuresequenzen, die in der immobilisierten Probe vorhanden sind, verwendet werden.

In der heutigen Histologie, Zytologie und Hämatologie verwenden die meisten klinischen Laboratorien oder Forschungslaboratorien manuelle Färbemethoden, die viele Stunden Technikerzeit zur Durchführung erfordern. Diese Verfahren sind gewöhnlich kostenwirksam, da große Ansätze von Objektträgern gleichzeitig in einer einzigen Folge von Anfärbungen von einem einzelnen Techniker gefärbt werden können. Sowohl manuelle als auch automatisierte Systeme, die derzeit verwendet werden, tauchen einen Halter, der parallele Objektträger mit Gewebe oder Zellabstrichen, die auf einer ebene Fläche eines jeden Objektträgers immobilisiert sind, nacheinander in eine identische Reihe von flüssigen Reagenzien, wie von wäßrigen Reagenzien oder organischen Lösungen von Farbstoffen oder Färbemitteln routinemäßig oder programmiert ein. Beispiele manueller Färbesysteme für Histologie-, Zytologie- und Hämatologieproben sind dem Histologen und Zytopathologen bekannt, und Protokolle über ihre Leistung findet man in jedem Laboratorium, das immobilisierte Proben anfärbt. Beispiele automatisierter Systeme sind etwa jene, die von den Firmen Technicon Instruments, Shandon Southern und Fisher Scientific verkauft werden (siehe Seiten 426 und 427 des Fisher-Kataloges 86 für eine Beschreibung des Fisher Histomatic® Slide Stainer Modsel 172).

Kapillarwirkung wurde in dem folgenden Patent in einem Versuch verwendet, in Masse automatisierte Objektträgeranfärbeverfahren zu entwickeln. Die US-PS 41 99 613 (1980) beschreibt ein System, bei dem ein Stapel paralleler Objektträger nahe ihren beiden Enden von einer Reihe allgemein paralleler Abstandshalter gehalten werden. Die Abstandshalter liegen zwischen entsprechenden Enden benachbarter parallel gestapelter Objektträger, so daß die ebene Oberflächen benachbarter Objektträger um die Dicke der Abstandshalter voneinander beabstandet sind. Eine solche Dicke (z. B. 0,2 mm) ergibt einen Abstand zwischen solchen einander gegenüberliegenden ebenen Flächen benachbarter Objektträger, der für Kapillarfluß ausreichend ist. Bei der Verwendung wird ein Satz von Objektträgern (z. B. 50) in einem vertikalen Stapel gehalten, und ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom (z. B. Anfärbelösung) fließt über benachbarte Kantenabschnitte der Objektträger (beginnend mit dem obersten Objektträger in dem vertikalen Stapel) und füllt nach und nach die dünnen Spalte zwischen benachbarten Objektträgern. Das Füllen erfolgt durch Kapillarfluß in horizontaler Richtung. Überschüssige Flüssigkeit gegenüber jener, die erforderlich ist, um die dünnen Spalte zu füllen, fließt von dem untersten Objektträger ab. Dieses System ist dazu bestimmt, eine Vielzahl von Objektträgern mit einer identischen Reihe von Reagenzien anzufärben, was das gleiche Vorgehen ist, wie es in den oben erwähnten manuellen und automatisierten Anfärbeverfahren verwendet wird.

Auf dem Gebiet des Einschließens von Flüssigkeitsproben in einem mikroskopischen Betrachtungsraum, welches nicht als analog mit der Behandlung immobilisierter Proben mit flüssigen Färbemitteln und Reagenzien angesehen werden kann, wird auch oft Kapillarfluß angewendet. Wie in den US-Patentschriften 45 01 496 (1985) und 39 61 346 (1975) beschrieben ist, wird allgemein eine flüssige Probe auf einer Bodenplatte eingeführt und wandert durch Kapillarfluß in einen dünnen Spalt, der von einer Betrachtungsfläche der Bodenplatte und einer darüberliegenden klaren Platte gebildet wird. In der US-Patentschrift 43 08 028 (1981) dagegen wird eine als Streifen bezeichnete Einrichtung in vertikaler Erstreckung in eine Probe, wie eine zentrifugierte Urinprobe, in einer Röhre eingetaucht. Wie in Spalte 4, Zeile 53 bis Spalte 5, Zeile 14 (siehe Fig. 6 und 7 der US-PS 43 08 028) beschrieben ist, fließt ein an feinteiligen Stoffen reicher Anteil von der Bodenfraktion der Probe durch Kapillarwirkung in eine Kammer (als 14 in den Figuren der US-Patentschrift identifiziert). An einer anderen Stelle dieser US-Patentschrift ist die Konstruktion des Streifens durch Laminierung mehrerer Schichten beschrieben (eine Mittelschicht ist kurz und von definierter Dicke, wenigstens eine andere Schicht ist lang und transparent). Spalte 7, Zeilen 3 bis 45. Bei der Betrachtung des Verfahrens wird die Probe in der Kammer 14 mit etwa der definierten Dicke ungefärbt und unbehandelt, wie durch Fig. 22 der US-PS 43 08 028 gezeigt ist, durch einen Teil einer langen transparenten Schicht betrachtet, die sich über das Ende der kurzen Mittelschicht hinaus erstreckt.

In der Zeichnung haben die Figuren folgende Bedeutung:

Fig. 1A ist eine Seitenansicht einer Objektträgeranordnung nach einer ersten Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 1B ist eine Vorderansicht entlang der Linie 1 B-1 B in Fig. 1A.

Fig. 1C ist eine Vorderansicht, entlang der Linie 1 C-1 C in Fig. 1A geschnitten.

Fig. 2A ist eine Seitenansicht des auseinandergenommenen Objektträgerpaares nach einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Fig. 2B ist eine Ansicht ähnlich Fig. 2A des gleichen zusammengefügten Objektträgerpaares in einem Halterabschnitt unter Bildung eines Objektträgerzusammenbaus.

Fig. 2C ist eine Draufsicht auf den Objektträgerzusammenbau in einem Halter, geschnitten entlang der Linie 2 C-2 C in Fig. 2B.

Fig. 2D ist eine Darstellung ähnlich Fig. 2B einer auseinandergenommenen Objektträgeranordnung nach einer dritten Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 2E ist eine Darstellung ähnlich Fig. 2B der Objektträgeranordnung von Fig. 2D in einem Halter.

Fig. 3A ist eine Seitenansicht, geschnitten entlang der Linie 3 A-3 A in Fig. 3B, eines Satzes von Objektträgeranordnungen oberhalb einer Tröpfchenhaltereinrichtung jeweils nach der zweiten Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 3B ist eine Draufsicht auf die Tröpfchenhaltereinrichtung, die im Schnitt in Fig. 3A gezeigt ist, entlang der Linie 3 B-3 B in Fig. 3A.

Fig. 3C ist eine vergrößerte Darstellung einer Objektträgeranordnung in Berührung mit einem Tröpfchen aus einem Winkel ähnlich dem von Fig. 3A und zeigt, wie Flüssigkeit vertikal in den dünnen Spalt durch Kapillarfluß nach den Methoden der vorliegenden Erfindung gezogen wird.

Fig. 3D ist eine Ansicht ähnlich der von Fig. 3C, wobei Flüssigkeit vertikal aus dem dünnen Spalt durch Kapillarfluß in ein Absorbensmaterial gezogen wird.

Fig. 4 ist eine Vorderansicht im Schnitt ähnlich jener von Fig. 1C und zeigt eine Objektträgeranordnung gemäß einer vierten Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 5 ist eine perspektivische Darstellung eines umgekehrten Objektträgerhalters, teilweise gefüllt mit Objektträgerpaaren, nach einer fünften Ausführungsform der Erfindung. Diese unterscheidet sich von der in Fig. 2A, 2B, 3A, 3B, 3C und 3D gezeigten Ausführungsform nur dadurch, daß der Satz drei Reihen von jeweils 10 Objektträgerpaaren statt fünf Reihen von jeweils 5 Objektträgerpaaren aufweist.

Fig. 6 ist eine Draufsicht auf eine Anordnung von Stationen entweder für ein manuelles oder für ein automatisiertes mehrstufiges Verfahren unter Verwendung der Objektträgerpaaranordnung von Fig. 5.

Fig. 7 ist eine perspektivische Darstellung eines teilweise gefüllten Tröpfchenhalters nach der Ausführungsform der Fig. 5 und 6.

Die verschiedenen Methoden und Vorrichtungen nach der Erfindung ermöglichen eine mehrstufige Behandlung einer dünnen Probe oder von Material, die auf einer flachen Oberfläche immobilisiert sind, mit dem Vorteil einer Einsparung teurer Flüssigkeiten, einer Flexibilität im Variieren der Behandlungsflüssigkeiten für gleichzeitig behandelte Proben oder Materialien, einer Minimierung gegenseitiger Verschmutzung von Proben, einer sicheren Verhinderung, daß toxische Reagenzien mit Laborpersonal in Berührung kommen, oder einiger Kombinationen dieser Faktoren. Bei dem vorliegenden Verfahren erreicht man einen solchen Vorteil oder solche Vorteile durch die Verwendung eines dünnen Kapillarspaltes vor der die immobilisierte Probe enthaltenden Oberfläche, besonders wenn der Spalt sich vertikal erstreckt, durch Berührung einer Kante des Spaltes mit einem vereinzelten oder gesonderten Anteil der Behandlungsflüssigkeit, besonders an der Basis des sich vertikal erstreckenden Spaltes, oder durch die anschließende Entfernung der Flüssigkeit durch Berührung einer Kante des Spaltes mit einem Absorbensmaterial, besonders der Bodenkante eines sich vertikal erstreckenden Spaltes, oder besonders durch Kombinationen dieser Merkmale. Solche Merkmale bieten besondere Vorteile gegenüber dem Verfahren der US-PS 41 99 613, die nicht im Verbund einzelne Objektträger mit einzelnen Reagenzien behandeln kann und die im Gegenteil einen horizontal sich erstreckenden Spalt verwendet, Flüssigkeit als kontinuierlichen Strom einführt und Flüssigkeit durch Drehen der gesamten Objektträgeranordnung entfernt.

Obwohl die vorliegende Erfindung für Massenanfärbung verwendet werden kann, bei der eine Vielzahl von Objektträgern in Reihe einer einzelnen Sequenz flüssiger Reagenzien ausgesetzt wird, ist es gegenüber dem Stand der Technik besonders vorteilhaft, wenn man die Erfindung für einen separaten Analysator verwendet, in welchem einzelne Objektträger ihre eigene Reihe von Reagenzien haben, die im Verbund auf sie aufgebracht werden.

Demnach liefert die vorliegende Erfindung in einer Form ein Verfahren zur Aufbringung von Flüssigkeit auf eine dünne Probe auf einer ersten Oberfläche, indem man
a) eine zweite Oberfläche im wesentlichen parallel zu der ersten Oberfläche und in einem ersten Abstand von dieser hält und so einen Schlitz zwischen der ersten und zweiten Oberfläche bekommt, und
b) eine Kante des Spaltes mit einem separaten Flüssigkeitsanteil in Berührung bringt,
wobei der erste Abstand ausreichend klein ist, um die Flüssigkeit dazu zu bringen, durch Kapillarwirkung in den Spalt in Berührung mit der dünnen Probe zu wandern.

Die Erfindung liefert weiter in einer zweiten Form ein Verfahren zur Behandlung einer dünnen Probe auf einer ersten Fläche mit einer Reihe von Behandlungsflüssigkeiten, indem man
a) eine erste Behandlungsflüssigkeit durch Kapillarfluß in einen Spalt zwischen einer eine Probe tragenden ersten Oberfläche und einer zweiten Oberfläche eines gegenüberliegenden Elementes bis wenigstens zu der Position der Probe, die auf der die Probe tragenden ersten Oberfläche immobilisiert ist, einzieht,
b) die erste Behandlungsflüssigkeit durch Kapillarwirkung in dem Spalt in Berührung mit der Probe hält,
c) die erste Behandlungsflüssigkeit aus dem Spalt durch Kapillarfluß entfernt und
d) eine zweite Behandlungsflüssigkeit durch Kapillarfluß in den Spalt bis wenigstens zu der Position der Probe einzieht.

Die Erfindung liefert weiterhin in einer dritten Form eine Vorrichtung zur Behandlung einer dünnen Probe auf einer ersten Oberfläche mit
a) Eingriffmitteln, die ein erstes Teil mit einer eine Probe tragenden ersten Oberfläche in einem feststehenden Abstand von einer zweiten Oberfläche eines gegenüberliegenden Elementes halten, wobei die erste Oberfläche und die zweite Oberfläche im wesentlichen parallel gehalten werden und die erste und zweite Kante der beiden Oberflächen sich parallel erstrecken und im wesentlichen in dem ersten Abstand voneinander getrennt sind, und
b) Kontakteinrichtungen, die den Raum zwischen der ersten und zweiten Kante mit einem separaten Anteil einer Flüssigkeit in Berührung bringen,
wobei der erste Abstand ausreichend klein ist, damit Flüssigkeit aus dem Raum durch Kapillarwirkung zwischen der ersten und zweiten Oberfläche in Berührung mit der Probe wandert.

Die Erfindung liefert in einer vierten Form eine Vorrichtung zur Behandlung eines dünnen Materials auf einer ebenen Oberfläche mit
a) Eingriffmitteln, die eine materialtragende ebene Oberfläche in einer vertikal sich erstreckenden Stellung in einem Abstand von einer Oberfläche eines gegenüberliegenden Elementes halten, wobei die Eingriffsmittel eine gegenseitige Ausrichtung der beiden zueinanderblickenden ebenen Flächen derart aufrechterhalten, daß die Unterkanten der das Material tragenden ebenen Fläche und die gegenüberliegende ebene Oberfläche sich horizontal und im wesentlichen parallel erstrecken, und
b) Kontakteinrichtungen, die den Raum zwischen den Unterkanten der das Material tragenden ebenen Oberfläche und der gegenüberliegenden ebenen Oberfläche mit Flüssigkeit in Berührung bringen,
wobei der erste Abstand zwischen der materialtragenden ebenen Oberfläche und der gegenüberliegenden ebenen Oberfläche ausreichend klein ist, so daß die Flüssigkeit aufwärts durch Kapillarwirkung zwischen die einander gegenüberliegenden ebenen Oberflächen bis wenigstens zur Höhe des dünnen Materials wandert.

In jeder der ersten vier Formen der vorliegenden Erfindung kann die zweite Oberfläche (oder Oberfläche des gegenüberliegenden Elementes) auch eine dünne Probe oder Material tragen, die bzw. das durch die gleiche Behandlungsflüssigkeit wie die dünne Probe oder das Material auf der ersten Oberfläche (oder Material tragenden ebenen Oberfläche) behandelt wird. Außerdem oder alternativ kann ein Satz von Objektträgeranordnungen
a) mehrere vertikal sich erstreckende Objektträger, von denen jeder eine vertikal sich erstreckende Oberfläche hat,
b) mehrere sich vertikal erstreckende Deckteile, von denen jedes eine sich vertikal erstreckende Oberfläche hat und jede Oberfläche eines vertikal sich erstreckenden Objektträgers in einem ersten Abstand von weniger als 0,5 mm von einer Oberfläche eines sich vertikal erstreckenden Deckteils beabstandet ist, und
c) Eingriffeinrichtungen zum Halten der vertikal sich erstreckenden Objektträger und der vertikal sich erstreckenden Deckteile nahe ihren oberen Enden in einem ortsfesten Satz, wobei die Probenoberfläche eines jeden Objektträgers einen ersten Abstand von einer im wesentlichen parallelen Fläche eines vertikal sich erstreckenden Deckteils hat und die Unterkante eines jeden Objektträgers sich horizontal erstreckt und von einer im wesentlichen parallelen, horizontal sich erstreckenden Unterkante eines Deckteils um den ersten Abstand entfernt ist und wobei der Raum zwischen den horizontal sich erstreckenden Unterkanten offen ist, haben.

Die Erfindung liefert weiterhin in einer sechsten Form eine Einrichtung zum Halten eines horizontalen Satzes einzelner Anteile von Behandlungsflüssigkeit mit
a) einer horizontal sich erstreckenden starren Unterlage,
b) einem horizontal sich erstreckenden elastomeren Teil mit einer im wesentlichen ebenen horizontal sich erstreckenden oberen Fläche und
c) einer Vielzahl von Ausnehmungen in dem elastomeren Teil, wobei jede Ausnehmung sich zu der horizontal sich erstreckenden oberen Fläche hin öffnet
und wobei das elastomere Teil auf seiner oberen Oberfläche ein mit der Behandlungsflüssigkeit ausreichend unverträgliches Material hat, damit ein separater Anteil Behandlungsflüssigkeit in einer Ausnehmung eine konvexe Form einnimmt, die sich über die ebene der benachbarten oberen Oberfläche des elastomeren Teils erstreckt.

Wo die oben beschriebenen Systeme, wie jenes von Johnson, in der Lage sind, eine spezielle Sequenz identischer Reagenzien auf einen Satz ebener Oberflächen, wie von Objektträgern, aufzubringen, haben solche bekannten Systeme nicht die Flexiblität, im Verbund einzelne Objektträger mit eigenen Reagenzien zu behandeln. Außerdem sind die Volumina, die erforderlich sind, um die Objektträger in einen Behälter wäßriger oder organischer Anfärbemittel einzutauchen, zu groß, um spezielle Stufen komplizierterer Analysen von gewebe- oder zellgebundenen Antigenen oder genetischen Sequenzen durch auf Antikörper gerichtete Ermittlungstechnologie bzw. Nucleinsäure-Hybridisierungs-Methodologien durchzuführen. Jedes mehrstufige Verfahren, das solche speziellen Stufen einschließt, kann nur durch die bekannten Systme automatisiert werden, indem man die anderen Stufen durchführt, den Objektträgerzusammenbau auseinandernimmt, um die speziellen Stufen manuelle durchzuführen, und dann den Objektträgerzusammenbau wieder zusammenfügt, um die anschließenden Stufen automatisch durchzuführen. Solches Auseinandernehmen und Zusammensetzen macht die Vorteile einer Automation für solche komplizierten Analysen nichtig. Daher besteht ein Bedarf, der durch die vorliegende Erfindung gedeckt wird, entweder für manuelle oder für automatisierte Methoden, gleichzeitig mehrere und separate Analysen mit Geweben oder Zellabstrichen, die auf einzelnen Objektträgern immobilisiert sind, unter Verwendung nur von Mikroliter Mengen teurer Antikörper oder Nucleinsäuresonden durchzuführen.

Solche Methoden hätten ein weites Spektrum von Anwendungen sowohl in klinischen Laboratorien als auch in Forschungslaboratorien, die derzeit die Analyse getrennter oder separater Antigeninformation oder genetischer Information durch einzelne manuelle Verfahren durchführen.

Eine erste Ausführungsform einer Objektträgerpaaranordnung ist in den Fig. 1A, 1B und 1C gezeigt. In Fig. 1A hat der die Probe tragende Objektträger 10 eine probetragende Vorderfläche 12, eine erste Unterkante 14, eine Rückfläche 16 und eine Oberkante 18. Eine dünne Probe 20, wie eine 5 bis 10 µmdicke histologische Probe, wird auf einem unteren Teil der Vorderfläche 12 aufgebracht. Angenommen, daß der Objektträger 75 mm hoch, 25 mm breit und 1 mm dick ist (Standardabmessungen für Objektträger), kann die Probe ein 20 mm × 20 mm großes Quadrat sein, das wenigstens 1,0 mm (z. B. 10 mm) oberhalb der ersten Unterkante 14 angeordnet ist.

Angefügt an den oberen Teil der Vorderfläche 12 des ersten Objektträgers 10 ist ein Abstandshalter 22, der in dieser ersten Ausführungsform als beidseitig haftender Klebstreifen einer Dicke von 0,2 mm (200 µm)gezeigt ist. Eine klebrige Seite 24 des Abstandshalter 22 haftet an dem oberen Teil der Vorderfläche 12 des ersten Objektträgers 10. Die gegenüberliegende klebrige Seite 26 des Abstandshalters 22 haftet an der Oberfläche 32 des gegenüberliegenden Elementes oder Objektträgers 30. Bei dieser Ausführungsform ist der gegenüberliegende Objektträger 30 auch ein mikroskopischer Objektträger von 75 mm × 25 mm × 1 mm. Der Abstandshalter 22 hält den gegenüberliegenden Objektträger 30 in Ausrichtung mit dem ersten Objektträger 10, so daß die gegenüberliegende ebene Fläche 32 des gegenüberliegenden Objektträgers parallel zu der Vorderfläche 12 und von dieser um die Dicke des Abstandshalters 22 (200 µm) beabstandet ist, die zweite Unterkante 34 des gegenüberliegenden Objektträgers 30 koplanar mit der ersten Unterkante 14 des ersten Objektträgers 10 ist, die Hinterfläche 36 des gegenüberliegenden Objektträgers 30 parallel zu den Flächen 32, 12 und 16 ist und die Oberkante 38 des gegenüberliegenden Objektträgers 30 koplanar mit der Oberkante 18 des ersten Objektträgers 10 ist.

Der Abstand von 200 µm ist im wesentlichen konstant zwischen den inneren Kanten der Oberkanten 18 und 38 entlang den vertikalen Längen der Vorderfläche 12 und der gegenüberliegenden Fläche 32 und bis zu den inneren Kanten der ersten und zweiten Unterkanten 14 und 34. Angenommen, daß der Klebstreifen 25 mm hoch ist (seine Breite kann die vollen 25 mm Breite der Objektträger 10 oder 30 oder weniger sein, wie beispielsweise 22 mm, wie gezeigt), dann wird ein Spalt 40 zwischen der Vorderfläche 12 und der gegenüberliegenden Fläche 32 gebildet. Dieser Spalt 40, der 50 mm hoch, 25 mm breit und 0,2 mm (200 µm) dick ist, ist der Kapillarspalt, der in dem Unterende 42 endet. Die Probe 20, die nur 5 bis 10 µm dick ist, hat keinen wesentlichen Einfluß auf die Dicke des Spaltes 40, selbst in der Höhe der Probe 20. Ähnlich haben andere Unvollkommenheiten, eingeschlossene Teilchen, eine Winkelstellung der beiden Objektträger gegenüber der parallelen oder andere Faktoren, die die Spalte 40 um weniger als 20% beeinflussen (d. h. bewirken, daß der 200 µm dicke Spalt bei einer Dicke zwischen 160 und 240 µm bleibt) keinen nachteiligen Einfluß, und selbst größere Variationen würden ihn nicht wesentlich nachteilig beeinflussen. Obwohl die Grund- oder Durchschnittsdicke des Spaltes in dieser ersten Ausführungsform 0,2 mm (200 µm) ist, sind weiterhin Spalte so klein wie 0,05 mm (50 µm) oder so groß wie 0,5 mm (500 µm) zulässig, wobei die übrigen Abmessungen (wie die Höhe) entsprechend der nachfolgenden Beschreibung im Zusammenhang mit Fig. 4 eingestellt werden. Unter geeigneten Umständen kann die Dicke des Spaltes von weniger als 50 µm oder mehr als 500 µm auch geeignet sein.

Fig. 1B zeigt die gleiche Objektträgerpaaranordnung von vorn. Der gegenüberliegende Objektträger 30 mit seiner Rückfläche 36 vorn bedeckt den ersten Objektträger 10 vollständig von der Oberkante 38 bis zur Unterkante 34 der Fläche 30. Die klebrige Seite 26 des Abstandshalters 22 kann unter dem oberen Teil des gegenüberliegenden Objektträgers 30 gesehen werden; und die Probe 20, die auf dem Probenobjektträger 10 immobilisiert ist, kann unter dem unteren Teil des gegenüberliegenden Objektträgers 30 zentriert gesehen werden. Die genaue vertikale Ausrichtung, die in Fig. 1B gezeigt ist, bei der keine Seite des ersten Objektträgers 10 über die entsprechende Seite des gegenüberliegenden Objektträgers 30 hinausragt, ist nicht kritisch. Fehlausrichtung in einer solchen Richtung von 2 mm oder selbst 5 mm ist ohne wesentlichen nachteiligen Einfluß. Außerdem brauchen, wie oben ausgeführt, die Breiten nicht alle gleich zu sein (z. B. 25 mm).

Fig. 1C zeigt die gleiche Vorderansicht wie Fig. 1B, aber nun im Schnitt, so daß man hinter den gegenüberliegenden Objektträger 30 sieht. Die Vorderfläche 26 des Abstandshalters 22 nimmt 25 mm im oberen Teil der sichtbaren Oberfläche ein. Der untere Teil, 50 mm × 25 mm, der Vorderfläche 12 des ersten Objektträgers 10 (unter dem Unterende 44 des Abstandshalters 22) ist nun sichtbar. Es sind diese 50 mm × 25 mm, die den Kapillarschlitz 40 ergeben. Die Probe 20 nimmt einen mittigen Teil von 10 × 10 mm innerhalb dieses Abschnittes von 50 mm × 25 mm der eine Probe tragenden Oberfläche 12 ein. Die Höhe des Schlitzes kann durch Verwendung kürzerer oder längerer Stücke von Klebestreifen als Abstandshalter eingestellt werden: z. B. 25 mm langer und 20, 30, 40 oder 50 mm langer (hoher) Klebestreifen.

Die Fig. 2A, 2B und 2C erläutern eine zweite Ausführungsform einer Objektträgerpaaranordnung. Der erste Objektträger 10 mit einer ersten Unterkante 14, Vorderseite 12 und Probe 20 darauf ist identisch mit entsprechenden Elementen in Fig. 1A. Der gegenüberliegende Objektträger 130 ist auch ein mikroskopischer Objektträger von 75 mm × 25 mm × 1 mm mit der gegenüberliegenden Oberfläche 132 und der zweiten Unterkante 134, doch ist nun der Abstandshalter 122 ein Deckglas von 40 mm × 25 mm (oder 22 mm) × 0,15 mm mit einem unteren Ende 144. Die erste Oberfläche 124 von 40 mm × 25 mm des Abstandshalters 122 liegt zu dem oberen Abschnitt der Vorderfläche 12 des ersten Objektträgers 10 (und liegt beim Zusammenbau gemäß Fig. 2B an diesem an). Die zweite Oberfläche 126 von 40 mm × 25 mm des Abstandshalters 122 ist auf den oberen Abschnitt der gegenüberliegenden Fläche 132 des gegenüberliegenden Objektträgers 130 geklebt.

Entlang der Hinterfläche 136 des gegenüberliegenden Objektträgers 130 sind obere und untere elastomere Vorsprünge 146 und 148 in der Form eines O-Ringes, zusammenpreßbarer flacher Federn oder Rollen oder fester Schrauben vorgesehen, die (nicht gezeigte) abgeschrägte obere Abschnitte haben können.

In Fig. 2B ist das Objektträgerpaar von Fig. 2A zusammengebaut, indem die Objektträger 10 und 130 parallel zusammengelegt sind und ihre oberen Enden in eine Ausnehmung mit Abmessungen von 30 mm Höhe, 26 mm Breite und 2,4 mm Dicke, die in einem Halter 150 ausgebildet ist, eingeführt sind. Die Ausnehmung öffnet sich nach unten und hat an ihrer Spitze eine sich vertikal erstreckende Ausrichtfläche 156. Die Oberkanten 18 und 138 des ersten Objektträgers 10 und das gegenüberliegende Element 130 stoßen an die Ausrichtfläche 156 an. Vorsprünge 146 und 148 greifen in einen vertikal sich erstreckenden, nach abwärts sich öffnenden Schlitz 152 in der Rückwand der im Halter 150 gebildeten Ausnehmung ein, um so den oberen Abschnitt des gegenüberliegenden Elementes 130 und den gesamten Abstandshalter 122 gegen den oberen Abschnitt des ersten Objektträgers 10 zu pressen. Diese Kombination von Eingriffeinrichtungen bewirkt, daß der erste Objektträger 10 und der gegenüberliegende Objektträger 130 parallel ausgerichtet werden mit einem Schlitz mit der Dicke des Abstandshalters 122 (0,15 mm), der Breite der Objektträger 10 und 130 (25 mm) und der Höhe (35 mm), die nicht von dem Abstandshalter 122 bedeckt ist. Die Unterkanten 14 und 134 liegen in der gleichen Höhe und sind voneinander von im wesentlichen den gleichen Abstand wie die Dicke des Abstandshalters 122, d. h. 0,15 mm, beabstandet.

Fig. 2C ist eine Draufsicht entsprechend Fig. 2B entlang der Linie 2 C-2 C in Fig. 2B. In dieser Schnittdarstellung sieht man den Vorsprung 148 im Inneren des Schlitzes 152, der in den Objektträgerhalter 150 als ein nach unten offener Schlitz in der Vertiefung geschnitten ist. Der Vorsprung 148 preßt gegen den Schlitz 152 und preßt den Abstandshalter 122 zusammen, der auf die Gegenseite des gegenüberliegenden Elementes 130 geklebt ist. Dies seinerseits übt Druck auf den oberen Bereich des ersten Objektträgers 10 aus, der an seiner Stelle durch den Halter 150 gehalten wird. Auf diese Weise werden der obere Abschnitt des gegenüberliegenden Objektträgers 130 und des ersten Objektträgers 10 in Berührung miteinander gehalten und vertikal nach unten aufgehängt. Da der Schlitz 152 nach unten offen ist, kann der gegenüberliegende Objektträger 130 und der erste Objektträger 10 leicht in die Ausnehmung in dem Halter 150 durch die Führungswirkung des Schlitzes 152 auf die Vorsprünge 146 und 148 leicht eingeführt und aus diesem entfernt werden.

Fig. 2D und 2E erläutert eine dritte Ausführungsform, die sich von derjenigen der Fig. 2A dadurch unterscheidet, daß die Vorsprünge 146′ und 148′ nun im Inneren der Vertiefung in dem Halter 150′ statt auf der Hinterfläche 136 des gegenüberliegenden Elementes 130 liegen.

In der Fig. 2D blickt die probentragende Vorderfläche 12 des eine Probe tragenden mikroskopischen Objektträgers 10 zu einem zweiten eine Probe tragenden mikroskopischen Objektträger 130′ und dessen probetragender Oberfläche 132′. Eine dünne Probe 20 auf dem eine Probe tragenden mikrospischen Objektträger 10 ist gegenüber der Probe 120′ auf dem gegenüberliegenden probetragenden Objektträger 130′ vorhanden.

Gemäß Fig. 2E werden die probetragenden Objektträger 10 und 130′ an ihrer Stelle in der Ausnehmung im Halter 150′ durch den Druck der elastomeren Vorsprünge 146′ und 148′ gehalten, die gegen ihre oberen Abschnitte drücken. Der Abstandshalter 122′ liegt sandwichartig zwischen ihren oberen Abschnitten. Die Probe 120′, die auf der probetragenden Oberfläche 132′ des zweiten probetragenden Objektträgers 130′ immobilisiert ist, wird in dem Schlitz 40, der durch das enge Beieinanderliegen der probetragenden Oberflächen gebildet ist, an ihrer Stelle auf der von der Probe 20 gegenüberliegenden Seite des Schlitzes 40 durch den Druck von Vorsprüngen 146′ und 148′ und den Halter an den oberen Abschnitten der beiden probetragenden Objektträger 10 und 130′ gegen den Abstandshalter 122′ gehalten.

Die Fig. 3A und 3B zeigen, wie ein Satz von 25 Objektträgerpaaren gemäß der voriegenden Erfindung ausgerichtet und verwendet werden kann. In Fig. 3A ist eine Reihe von fünf Objektträgerpaaren gezeigt. In jedem Paar ist ein erster Objektträger (10 a, 10 b, 10 c, 10 d, 10 e) von einem zweiten oder gegenüberliegenden Objektträger (230 a, 230 b, 230 c, 230 d und 230 e) durch einen Abstandshalter beabstandet. Vertikale Ausrichtung erhält man durch die Oberkanten (256 a, 256 b, 256 c, 256 c, 256 d und 256 e) von fünf Vertiefungen, die in der Hinterfläche des Haltes 250 ausgebildet sind.

So sind vertikal sich erstreckende Schlitze mit der Dicke des Abstandshalters in jedem Objektträgerpaar ausgebildet, wie oben in Bezug auf die Fig. 2A und 2B beschrieben ist, und diese enden in unteren Räumen 42 a, 42 b, 42 c, 42 d und 42 e jeweils zwischen fluchtenden ersten und zweiten Unterkanten der ersten und gegenüberliegenden Objektträger 10 a/ 230 a, 10 b/230 b, 10 c/230 c, 10 d/1230 d und 10 e/230 e. Alle Sätze von Unterkanten sind in einer gemeinsamen horizontalen Ebene in einem festliegenden Abstand unterhalb der Unterfläche des Halters 250.

Ein Tröpfchenhalter ist unterhalb dieser horizontalen Ebene angeordnet und besteht aus einem starren Unterteil 62 und einem horizontal sich erstreckenden elastomeren Teil 64. Wie in Fig. 3A gezeigt ist, sind in dem elastomeren Teil 64 und durch dieses hindurchgehend fünf Löcher 66 a bis 66 e ausgebildet, und diese Löcher sind mit getrennten Anteilen oder Tröpfchen 68 a bis 68 e jeweils von definiertem Volumen, wie 150 µl, gefüllt. Wie nachfolgend eingehender beschrieben, ragt jedes Tröpfchen 68 a bis 68 e über die obere Fläche des elastomeren Teils 64 hinaus. Die Ausrichtung ist so, daß, wenn der Objektträgerhalter 250 gesenkt wird, die unteren Räume 42 a bis 42 e in Berührung mit den oberen Bereichen der Tröpfchen 66 a bis 66 e treten. Die Tröpfchen werden normalerweise von oben (z. B. mit einer Mikropipette) eingeführt, können aber auch von unten mit Hilfe eines engen Durchgangs, der in dem starren Unterteil 62 ausgebildet ist, eingeführt werden. Eine perspektivische Darstellung eines analogen Tröpfchenhalters ist in Fig. 7 gezeigt. Gemäß Fig. 3B kann die Oberseite des elastomeren Teils 64 mit fünf Doppelreihen von Tröpfchen 68 a bis 68 y und 69 a bis 69 y ausgebildet sein. Blickt man auf die Profile von Objektträgern 10 a bis 10 e mit gegenüberliegenden Objektträgern 230 a bis 230 e, so kann man sehen, daß sie in Berührung mit den Tröpfchen 68 a bis 68 e und 69 a bis 69 e stehen, wobei beispielsweise der untere Raum 42 a die Tröpfchen 68 a und 69 a nahe den beiden Enden des unteren Raumes 42 a berührt.

Gerade wenn die eine Reihe von Objektträgerpaaren 10 a/230 a bis 10 e/230 e die Tröpfchen 68 a bis 68 e und 69 a bis 69 e berühren, können vier weitere Reihen von fünf Objektträgerpaaren jeweils in dem Halter 250 ausgerichtet werden, um: 2. Tröpfchen 68 f bis 68 j und 69 f bis 69 j, 3. Tröpfchen 68 k bis 68 o und 69 k bis 69 o, 4. 68 p bis 68 t und 69 p bis 69 t bzw. 5. 68 z bis 68 y und 69 u bis 69 y zu berühren. Da die Unterkanten aller ersten Objektträger, gegenüberliegenden Objektträger und somit die unteren Räume in genauer Ausrichtung in einer gemeinsamen horizontalen Ebene gehalten werden können und das elastomere Teil 64 den gesamten Satz von Tröpfchen in genauer Ausrichtung in einer gemeinsamen horizontalen Ebene hält, kann man reproduzierbar jeden unteren Raum zwischen einer ersten und einer zweiten Unterkante eines ersten bzw. gegenüberliegenden Objektträgers mit zwei Tröpfchen in Berührung bringen. Außerdem ermöglicht, wie nachfolgend diskutiert, die Vereinzelung oder Trennung der Tröpfchen 68 a bis 68 y und 69 a bis 69 y eine Flexibilität bei den Behandlungsproben auf jedem ersten Objektträger entweder ähnlich oder verschieden gegenüber jedem anderen ersten Objektträger bezüglich der aufgebrachten Behandlungsflüssigkeit.

In Fig. 3C kann die Wirkung des Raumes 42 a (zwischen der ersten Unterkante 14 a und der zweiten Unterkante 234 a der Objektträger 10 a und 230 a), der in Berührung mit einem Tröpfchen in dem Loch 66 a gebracht wird, gesehen werden. Eine Kapillarsäule von Flüssigkeit 70 a steigt in dem Kapillarschlitz 240 (ähnlich dem Schlitz 40 in Fig. 1A) durch Kapillarwirkung hoch. Diese Wirkung wird durch die relative Unverträglichkeit der Flüssigkeit mit der Oberfläche des elastomeren Teils 64 verstärkt, d. h. da das wäßrige Tröpfchen von der hydrophoben Oberfläche des elastomeren Teils 64 abgewiesen wird. Solche Unverträglichkeit (ersichtlich durch die Tröpfchenbildung der Behandlungsflüssigkeit, wenn man sie auf eine flache Oberfläche des für das Teil 64 verwendeten Elastomermaterials gibt) bewirkt auch, daß die Tröpfchen über der oberen Fläche des Teils 64 stehen.

Nachdem die Kapillarsäule 70 a so weit gestiegen ist, wie die Kapillarwirkung dies zuläßt (typischerweise etwa 30 bis 40 mm in dem gezeigten Schlitz von 0,15 mm), kann die Objektträgeranordnung mit dem Halter 250 von dem Elastomerteil 64 weg angehoben werden. Jedes Objektträgerpaar (z. B. 10 a/ 230 a) erhält durch Kapillarwirkung die von den Tröpfchen (z. B. 68 a und 69 a), mit denen ihr unterer Raum (z. B. 42 a) in Berührung gebracht wurde, aufgenommene Behandlungsflüssigkeit. Nachdem die Flüssigkeit in dem Spalt während einer erwünschten Zeitdauer geblieben ist, wird nun die Objektträgeranordnung auf ein Absorbensmaterial 72 gesenkt, wie in Fig. 3D gezeigt ist. Da die Flüssigkeit mit dem Absorbensmaterial 72 verträglicher als mit den Oberflächen der Objektträger 10 a und 230 a ist, fällt nun die Kapillarsäule 70 a, wobei sich die Behandlungsflüssigkeit nach unten und außen als eine Flüssigkeitsfront 74 a in dem Absorgensmaterial 72 ausbreitet. Innerhalb von Sekunden ist das Objektträgerpaar im wesentlichen vollständig von Flüssigkeit durch solche Kapillarwirkung befreit, vielleicht mit Ausnahme von kleinsten Mengen, die an der Probe oder anderen hygroskopischen Oberflächen entlang dem Objektträgerspalt 42 oder an Unterkanten 14 a und 234 a anhaften können. Wenn die Flüssigkeit aus dem Objektträgerspalt 240 entfernt ist, kann nun das Objektträgerpaar zu einem anderen Tröpfchenhalter oder zu einem Bogen oder Bad von Behandlungsflüssigkeit für die nächste Stufe bewegt werden.

Fig. 4 erläutert in ähnlicher Darstellung wie in Fig. 1C eine Ausführungsform der Erfindung, bei der drei vertikal sich erstreckende Proben tragende Oberflächen auf einem Objektträger von 75 mm × 25 mm ausgebildet sind. Der Objektträger erstreckt sich horizontal mit seiner Unterkante 314 von 75 mm. Zwei äußere Abstandshalter 322 von 25 mm Höhe, 2 mm Breite und 0,25 mm Dicke erstrecken sich vertikal auf der Vorderfläche (75 mm × 25 mm). Zwei innere Abstandshalter 322′ haben ähnliche Messungen von 25 mm × 2 mm × 0,25 mm und sind gleichermaßen von den Endabstandshaltern 322 beabstandet und parallel zu diesen. Solche Abstandshalter 322 und 322′ können durch Aufbringung eines hitzehärtbaren Materials (wie Epoxy- oder Siliconharz) auf der Fläche eines Glasobjektträgers ausgebildet werden. Die unbedeckten und isolierten Flächen sind daher 312 a, 312 b und 312 c, von denen sich jede von einer Unterkante 314 aus 25 mm aufwärts erstreckt und etwa 22,33 mm breit ist. Ein Gegenobjektträger kann über diesen ersten Objektträger gelegt werden, so daß Spalte von 0,25 mm Dicke, 25 mm Höhe und 22,33 mm Breite über Flächen 312 a, 312 b und 312 c gebildet werden. Durch Inberührungbringen des unteren Raumes einer jeden solchen Fläche, die nahe der Unterkante 314 ist, durch eine Behandlungsflüssigkeit und dann durch ein Absorbensmaterial kann flüssiges Reagenz, wie oben beschrieben, in jeden Spalt und aus jedem Spalt gezogen werden. Ein solches Objektträgerpaar kann auf Tröpfchen oder einem Bad oder einer Fläche von Behandlungsflüssigkeit manuell aufgebracht werden.

Stattdessen kann eine Reihe solcher horizontal sich erstreckender Objektträgerpaare, jedes mit drei vertikal sich erstreckenden Kapillarspalten, in einem Halter beispielsweise unter Verwendung des in Fig. 1 der US-PS 41 99 613 gezeigten Objektträgerrahmens mit einer solchen Abwandlung gehalten werden, wie sie erforderlich ist, um die Unterkanten 314 eines jeden für eine Berührung von Tröpfchen oder Flächen von Behandlungsflüssigkeit verfügbaren probetragenden Objektträgers zu entlassen. Die "Abstandshalter" nach dieser US-Patentschrift in dieser Ausführungsform wären nicht zwischen einem Probenobjektträger und seinem Gegenobjektträger angeordnet, um die Bildung des Kapillarspaltes zwischen ihnen zu unterstützen, sondern sie wären eher an beiden seitlichen Enden und auf der Außenfläche der probentragenden Objektträger angeordnet, indem man sie durch Zusammenpressen des Gegenobjektträgers und des probentragenden Objektträgers gegen oben beschriebene Abstandshalter 322 preßt. Bei dieser Ausführungsform wären die Abstandshalter 322 und 322′ in Fig. 4 die einzigen Teile, die den ersten Abstand des Kapillarspaltes zwischen dem Gegenobjektträger und dem probetragenden Objektträger definieren.

Die Dicke der Seitenwände der Vertiefung in dem Halter würde dann einen zweiten Abstand definieren, der parallele Paare von Gegenobjektträgern und probetragenden Objektträgern trennt. Dieser zweite Abstand ist nicht für Kapillarwirkung bestimmt und trennt Sätze von Objektträgerpaaren so, daß flüssige Reagenzien in sie über den Kapillarspalt von separaten Tröpfchen wie in den Fig. 3A und 3B aufwärts gezogen werden können. Dieser zweite Abstand kann von irgendeiner Dicke größer als 2 mm sein, was wesentlich dicker als die 200 µ der Abstandshalter gemäß der obigen US-Patentschrift oder der in diesem Patent beschriebenen Abstandshalter ist. Die bevorzugte Länge dieses zweiten Abstandes und daher die bevorzugte Dicke der die Grenzen einer nach unten offenen Objektträgervertiefung in dem Objektträgerhalter bildenden Seitenwände liegt im Bereich von 5 bis 7 mm. Bei Verwendung dieses Bereiches kann die größte Zahl von Objektträgern in einen Objektträgerhalter zum Zweck des Hochziehens, Inkubierens und Entfernens flüssiger Reagenzien aus den Kapillarspalten zwischen benachbarten Objektträgerpaaren eingefügt werden.

Dieser Bereich des zweiten Abstandes erlaubt es, daß benachbarte Kapillarspalte, wie 42 a und 42 b in Fig. 3A, 7 bis 9 mm voneinander entfernt gehalten werden. In diesem Abstand können einzelne Tröpfchen in dem Tröpfchenhalter, wie 68 a und 68 b sowie 69 a und 69 b, die in Fig. 3B abgebildet sind, ohne gegenseitige Verunreinigung durch unbeabsichtigtes Überwinden der Unverträglichkeit der Oberfläche des Elastomerteils 64 und der einzelnen Tröpfchen in dem Tröpfchenhalter voneinander beabstandet gehalten werden. Ein solcher Vorteil wäre nicht möglich mit dem Objektträgergestell gemäß der US-PS 41 99 613, wo 200 µ zu nahe sind, um einander benachbarte Reagenztröpfchen auf dem Tröpfchenhalter beständig getrennt zu halten. Daher müßte dieser Objektträgerhalter gegenüber seiner ursprünglichen Beschreibung vollständig und wesentlich verändert werden, um die Vorteile der Erfindung zu erreichen.

Um zu bewirken, daß die Flüssigkeit 15 bis 20 mm über die Unterkante 314 steigt, kann der Spalt (Dicke des Abstandshalter 322 und 322′) dicker als die Dicke von 0,15 bis 0,20 mm sein, die in den vorherigen Ausführungsformen am meisten bevorzugt ist, wo Flüssigkeit 25 bis 45 mm über die Unterkante 14 steigen soll. Durch Routineexperimente kann der Spalt so eingestellt werden (durch Verändern der Abstandshalterdicke), daß man das erwünschte vertikale Ansteigen von Flüssigkeit für irgendeine probetragende Objektträgeroberfläche bekommt.

Fig. 5 zeigt einen teilweise mit Objektträgerpaaren gefüllten Halter nach einer fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Diese unterscheidet sich von der zweiten Ausführungsform, die besonders in den Fig. 3A und 3B gezeigt ist, dadurch, daß drei Reihen von 10 Objektträgerpaaren statt fünf Reihen von fünf Objektträgerpaaren vorgesehen sind.

Der Hauptkörper 450 des in Fig. 5 gezeigten Objektträgerhalters ist wie ein rechteckiger Körper mit, wie nachfolgend beschrieben, einer Reihe von Schlitzen geformt, die in seiner unteren Fläche zur Aufnahme von Objektträgerpaaranordnungen ausgebildet sind.

Alternativ können die Objektträgerpaare in einem Halter gehalten werden, wo die Reihe von an seiner unteren Fläche gebildeten Schlitzen zusammenfallbar ist und auf den oberen Bereichen der Objektträgerpaaranordnungen abgedichtet werden kann, indem man beispielsweise eine wesentliche Abwandlung des Objektträgergestelles nach Fig. 1 der US-PS 41 99 613 verwendet, in welcher die "Abstandshalter" wesentlich dicker sind und verwendet werden, um Objektträgerpaaranordnungen zu trennen und nicht Kapillarwirkung zu erzeugen.

Da der Objektträgerhalter in Fig. 5 gegenüber seiner Verwendung umgedreht ist, um die Objektträgerpaare einzusetzen, erscheint die Bodenfläche oben. In der folgenden Beschreibung werden die relativen Positionen bei der Verwendung (z. B. Schlitze in der Bodenfläche) beschrieben.

Eine Platte 451 ist oberhalb des Hauptkörpers 450 (als ein Flansch) in beiden horizontalen Richtungen so, daß sie einen größeren rechteckigen Querschnittsbereich als der rechteckige Querschnittsbereich des Hauptkörpers 450 bedeckt. Ein Arm 476 erstreckt sich vertikal aufwärts von einer Seite der Platte 451 mit zwei angewinkelten Abschnitten 478 und 480. Ein ähnlicher Arm 476 mit angewinkelten Abschnitten 478 und 480 erstreckt sich vertikal aufwärts von der entgegengesetzten Seite der Platte 451, ist aber den Blicken verborgen. Eine horizontale Stange 482 verbindet die beiden Arme 476.

In die Bodenfläche des Hauptkörpers 450 eingeformt sind zehn lange Schlitze, von denen sich jeder vertikal und in einer horizontalen Richtung 90° bezüglich des horizontalen Stabes 482 erstreckt. Diese zehn langen Schlitze sind jeweils durch Trennwände in drei Schlitze, insgesamt also 30 Schlitze, unterteilt. Die nächsten drei Schlitze sind mit 455 j, 455 t und 455 dd in Fig. 5 bezeichnet, wobei ein jeder solcher Schlitz an den nahen Ende einer Reihe von zehn Schlitzen liegt. Eine Probe tragende Objektträger 10 a, 10 k und 10 u erstrecken sich aus den Schlitzen an dem abgelegenen Ende jeder der drei Reihen heraus. Wie durch den Gegenobjektträger 430 u erläutert ist, ist ein Gegenobjektträger mit jedem eine Probe tragenden Objektträger in einem gemeinsamen Schlitz eingesetzt. Die Bodenkanten eines jeden probentragenden Objektträgers und die benachbarten Gegenobjektträger definieren ein unteres Ende eines Spaltes, das als unteres Ende 442 a, 442 k und 442 u für die Objektträger 10 a, 10 k bzw. 10 u gezeigt ist. Jedes einzelne Objektträgerpaar erscheint im Querschnitt im wesentlichen, wie in Fig. 2B gezeigt ist.

Wenn 30 probetragende Objektträger zu behandeln sind, dann werden die in Fig. 5 gezeigte Schlitze (bis zu den Schlitzen 455 j, 455 t und 455 dd) gefüllt, und der gesamte Objektträgerhalter wird umgedreht. Um die Bedeutung der verschiedenen Objektträger zu behalten, können visuell oder maschinell lesbare Indices vorhanden sein oder aufgebracht werden (z. B. auf einem vereisten Abschnitt eines jeden Objektträgers an einer von der Probe entfernten Stelle), um so vor und nach der Behandlung gelesen zu werden, oder (wenn die Indices geeignet angebracht sind, wie gerade oberhalb der Probenstelle) auch während die Objektträger sich in dem Halter befinden. Außerdem kann der Halter mit Indexnummern versehen werden, um die Lokalisierung der einzelnen Objektträger zu erleichtern, ohne sie aus dem Halter zu nehmen, und um die Reagenzhandhabung zu erleichtern, indem man entsprechende Nummern hat, die die speziellen Löcher in dem Tröpfchenhalter, der in den Fig. 3B und 7 abgebildet ist, bezeichnen, womit jeweils eine Objektträgerpaaranordnung zusammenwirkt.

Der Halter wird dann in einer Klammer mit der Breite des horizontalen Stabes 482 entlang abgewinkelter Abschnitte 478 von Armen 476 gesenkt, bis die Objektträgeranordnung von dem Eingriff der Klammer mit dem horizontalen Stab 482 und den Armen 476 gehalten und ausgerichtet (vertikal und horizontal) ist. Die Maschine kann nun die Anordnung durch eine Reihe von Stationen führen, wie nachfolgend beschrieben ist. Alternativ kann der horizontale Stab 482 des Halters manuell in Eingriff gebracht und dabei vorgerückt werden.

Fig. 6 zeigt eine Draufsicht auf das Innere eines automatisierten Systems für die Durchführung der vorliegenden Erfindung. Sie ähnelt dem Inneren eines Histomatik® Slide Stainer (Modell 172), wie er auf Seite 426 des Fisher 86-Kataloges (Fisher Scientific 1985) erläutert ist.

Fig. 6 erläutert eine Gruppe von Stationen, in die der Objektträgersatz von Fig. 5, wenn er einmal vollständig zusammengebaut ist, nacheinander, wie nachfolgend beschrieben ist, eingetaucht werden kann. Die Stationen 1 bis 6 (Bezugszeichen 501 bis 506) enthalten in dieser Anordnung Anfärbebehälter der allgemeinen Art, wie sie bisher mit dem Histomatic® Slide Stainer, Modell 172 (115 V, 60 Hz) verwendet wurde. Siehe Fisher 86-Katalog, Seite 426 und 427 (Fisher Scientific 1985). Jeder Behälter enthält einen Flüssigkeitsvorrat (Xylol, Ethanol, Ethanol/Wasser-Gemische oder destilliertes Wasser, wie angegeben), wobei der obere Querschnitt größer als die Gruppe der Unterkanten von Objektträgerpaaren in Fig. 5 ist. Eine solche Geometrie gestattet, daß die Gruppe mit jedem Flüssigkeitsvorrat in Berührung kommt, ohne eine Behälterkante zu berühren. Ähnlich enthalten die Stationen 8 (Bezugszeichen 508), 10 (Bezugszeichen 510), 12 (Bezugszeichen 512) und 17 (Bezugszeichen 517) Anfärbebehälter mit der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung.

Die Station 7 (Bezugszeichen 507) ist eine Naßkammer, die mit einem elektrischen Standarderhitzer auf 37°C ± 5°C (einmal eingeschlossen, wie nachfolgend beschrieben) und mit Wasserdampf gesättigt gehalten wird, da ein Wasservorrat in der Kammer unter der Höhe angeordnet ist, die durch die unterste horizontale Fläche der Objektträgergruppe erreicht wird. Das obere Ende der Naßkammer hat horizontale Abmessungen (rechteckig oder quadratisch) größer als die Objektträgergruppe in Fig. 5, aber kleiner als der Flansch 451 in Fig. 5. Wenn demnach die Objektträgergruppe 450 in Fig. 5 in die Naßkammer in der Station 7 (Bezugszeichen 507) gesenkt wird, vervollständigt der Flansch 451 (in Fig. 5 gezeigt) die Einfassung der Naßkammer.

Die Stationen 9 und 11 enthalten trockene Löschblätter, wie aus Papier, Baumwolle oder einem Superabsorbens-Gazekissen mit genügend hohen Oberflächen und Anordnungshöhen, um gleichzeitig in Berührung mit den unteren Räumen (siehe 42 a in Fig. 2D) der Objektträgergruppe zu stehen, wenn die Gruppe in die geeignete Station gesenkt wird. Die Objektträgergruppe kann in einem solchen Fall das saugfähige Material oder Löschblattmaterial über einen kurzen Abstand zusammenpressen.

Die Stationen 13, 14, 15 und 16 (Bezugszeichen 513, 514, 515 und 516) enthalten Tröpfchenhalter ähnlich den Elementen 62 und 64 in den Fig. 3A und 3B mit der Ausnahme, daß die Löcher und Tröpfchen in drei Doppelreihen von jeweils 10 angeordnet sind. So berührt in der Station 13 (Bezugszeichen 513) die obere Reihe von zehn Objektträgern gleichzeitig Tröpfchen 468 a bis 468 j und 469 a bis 469 j in der oben für die Tröpfchen 68 a bis 68 e und 69 a bis 69 e beschriebenen Weise, wie in den Fig. 3A und 3B. Die zweite Doppelreihe, die mit den Tröpfchen 468 k und 469 k beginnt, wird gleichzeitig von den unteren Räumen der zweiten Reihe von zehn Objektträgerpaaren berührt. Die dritte Doppelreihe, die mit den Tröpfchen 468 u und 469 u beginnt und mit den Tröpfchen 468 dd und 469 dd endet, wird gleichzeitig von der dritten Reihe der zehn Objektträgerpaare berührt, wenn die Objektträgerpaargruppe in die Station 13 (Bezugszeichen 513) gesenkt wird.

In ähnlicher Weise enthalten die Stationen 14 (Bezugszeichen 514), 15 (Bezugszeichen 515) und 16 (Bezugszeichen 516) jeweils einen Tröpfchenhalter, von denen jeder in genauer Ausrichtung drei Doppelreihen von zehn Tröpfchen (60 Tröpfchen in jeder Station) hält. Die untere Reihe in Fig. 6 ist als Tröpfchen 569 u bis 569 dd in Station 14, 669 u bis 669 dd in Station 15 und 769 u bis 769 dd in Station 16 identifiziert. Die Station 18 (Bezugszeichen 518) ist in der in Fig. 6 gezeigten Gruppe leer. Wenn zusätzlich Behandlungsstufen erwünscht sind, können sie einen Anfärbebehälter, einen Tröpfchenhalter oder ein Temperaturbad, wenn zweckmäßig, ähnlich der oben beschriebenen anderen Station enthalten.

Der Wäscher 519 ist eine Standardeinrichtung zum Waschen von Objektträgergruppen, der bei dem Histomatik® Slide Stainer Modell 172 vorgesehen ist. Er ist entweder für einmaligen Durchgang von Spülflüssigkeit oder Rückführung von Behandlungsflüssigkeit ausgestattet. Die letztere Weise wird allgemein bei der vorliegenden Erfindung verwendet. Beim tatsächlichen Arbeiten wird diese Einrichtung durch ein Solenoid modifiziert, um einen Rückführfluß von Spülflüssigkeit nur dann zu bekommen, wenn die Objektträgergruppe in dem Wäscher sich befindet, und um statt eines kontinuierlichen Ablaufs keinen Ablauf zu bekommen, wenn die Maschine im Durchfluß arbeitet. Der Trockner 520 ist eine Station, die bei der vorliegenden Erfindung allgemein nicht verwendet wird (wegen der Verwendung der Aufsaugstationen 509 und 511), doch ist er vorzugsweise vorhanden, so daß das Instrument auch für herkömmliches Anfärben von Objektträgern verwendet werden kann, die vertikal sich erstreckend und durch einen Abstand größer als 0,5 mm (z. B. 2,0 mm) voneinander getrennt angeordnet sind, wenn man einen Standardobjektträgerhalter mit 40 Stellen benutzt, wie er mit dem obigen Modell 172 Slide Stainer im Handel angeboten wird.

Die Flexibilität der Erfindung wird durch die Tatsache erläutert, daß alle Anfärbebehälter, Tröpfchenhalter und Naßkammern nach Wunsch des Verwenders vollständig entfernbar und austauschbar sind. Daher können beispielsweise die Tröpfchenhalter der Station 13, 14, 15 und 16 (Bezugszeichen 513, 514, 515 und 516 von Fig. 6) leicht ersetzt werden, selbst wenn das Instrument läuft, und zwar durch eine flache übliche Reagenzwanne, um alle Objektträgerpaaranordnungen mit einem identischen Reagenz zu behandeln, oder durch ein zusätzliches Aufsaugmaterial, um sie zu entleeren, oder durch eine Naßkammer, um sie zu inkubieren. Die Flexibilität des vorliegenden Verfahrens wird weiter durch die folgende erläuternde Methode zum Anfärben von Gewebeabschnitten bezüglich antigener Stellen für Antikörper erläutert. Die folgende Versuchsaufzeichnung des Anfärbeverfahrens bezieht sich auf die Bezugszeichen in Fig. 6, wie sie oben beschrieben sind. Auf die Versuchsaufzeichnung folgt eine Diskussion der verschiedenen Einzelstufen und eine Diskussion, wie das Verfahren modifiziert würde, um drei unterschiedliche Markierungstypen zu verwenden. Avidin-biotinbehandelter Meerrettichperoxidasekomplex, alkalische Phosphatase, vernetzt, um Antimausantikörper anzuzeigen, und als Anfangssonde, entweder ein primär biotinbehandelter heterologer pimärer Antikörper, ein unmarkierter monoclonaler Antikörper oder ein DNA- oder RNA-Strang, vernetzt mit Biotin in der Weise gemäß EPA 63, 879 oder PCT 84/04970. Sie auch Proc. Nat. Acad. Sci., Band 80, Seiten 4045 bis 4049 (1983); Virology, Vand 126, Seite 32 bis 36 (1983).

Das Anfärbeverfahren beginnt mit dünnen (z. B. 5 µm dick) Gewebescheiben, die von Gewebeblöcken geschnitten werden, die mit Formalin fixiert und dann in Wachs eingebettet wurden, wie mit dem Histomatik® Modell 266 MP Tissue Processor (Fisher Scientific) (see US-PS 41 41 312). Für jeden Fall ist nachfolgend die Zahl, die Station (und das entsprechende Bezugszeichen in Fig. 6), die Zeit und Lösung oder andere Behandlung angegeben.

*) Für jede angegebene Aufsaugstufe wurden 0,6 min (36 sec) infolge der Maschinenbegrenzung verwendet. Mit dem Programmieren werden die meisten Aufsaugstufen auf 12 bis 18 sec reduziert.

**) Stufen 13A bis 14B sind nur in den Verfahren erforderlich, wo eine Proteinaufschlußstufe (z. B. mit Pronase, Trypsin oder Pepsin, jeweils mit geeigneten Puffern und Kofaktoren) erforderlich ist, um die erwünschten antigenen Stellen des Gewebes freizulegen. Bei der Arbeit mit dünnen Gewebeproben wurden solche Stufen nicht allgemein benötigt, und daher wurden diese Stufen weggelassen, und der Tropfenhalter in Station 13 wurde durch eine flache Pfanne ersetzt, die 1%iges Rinderserum Albumin in 0,1 M TrisHCl, pH 7,6 mit 0,1 M NaCl enthielt.

Bei Betrachtung des obigen Gesamtverfahrens schließen die Fälle 1 bis 7 und 9 bis 12 eine Entfernung des Wachses und eine Umwandlung in ein wäßriges gepuffertes Medium ein. In jenen Fällen, bei denen gefrorene Proben in Scheiben zu dünnen Proben geschnitten wurden, sind die Stufen 1 bis 7 und 9 unnötig (da kein Wachs vorhanden ist). Das oberflächenaktive Mittel wurde in den Stufen 10, 11 und 12 eingeschlossen, um den Kapillarfluß der viskoseren Flüssigkeiten, die folgen, zu erleichtern. Die Stufe 8 ist die Stufe, die verwendet wurde, um die Aktivität von endogener alkalischer Phosphatase in dem Gewebe zu blockieren. Wenn ein anderes Enzym verwendet wurde (d. h. in Stufe 20), würde eine andere Behandlung zum Blockieren von endogenem Enzym verwendet. Für Peroxidase als das Enzym in der Stufe 20 könnte absolutes Methanol mit 0,9% Wassertoffperoxid als die Lösung in der Station 18 für Stufe 8 benutzt werden. Saurer Alkohol in der Station 12 würde auch in der Stufe 29 benutzt werden. Zur Verarbeitung gefrorener Abschnitte werden die Scheiben zunächst 10 min in kaltem Aceton fixiert und dann 0,01%igem Triton X-100 in destilliertem Wasser 0,6 min (Station 10) ausgesetzt, 0,6 min (Station 11) wird aufgesaugt, sodann wird mit saurem Alkohol behandelt, um die Aktivität von endogenem alkalischem Phosphataseenzym zu blockieren (Station 12), und dann wird das restliche Anfärbeprogramm durchgeführt, das oben aufgezeichnet ist, beginnend mit Stufe 13.

Wie bereits gesagt, werden die Stufen 13 und 14 allgemein für die meisten Antigene von Interesse im Gewebe nicht benötigt, würden aber für schwer zugängliche Antigenmarkierungen, wie gewebegebundene Immunoglobuline, Keratin, Viralantigene, wie Cytomegalovirus-, Adenovirus- und Hepatitis-B- Virus-Oberflächen- und Kernantigene und für Verfahren unter Verwendung von Nucleinsäuresonden benutzt werden.

Die Stufe 15 umfaßt die Aufbringung eines allgemeinen Proteins, um an den nichtspezifischen proteinbindenden Stellen zu haften, die sich in den meisten Gewebeproben finden. Wenn es nicht möglich ist, diese Stellen zu blockieren, so gibt dies einen unerwünschten Hintergrund infolge des nichtspezifischen Anhaftens des primären Antikörpers oder von Avidin- oder Biotin-Enzymkonjugat in den Stufen 17 und 20. Wenn ein sekundärer Antikörper in der Stufe 20 verwendet wird (z. B. mit alkalischer Phosphatase konjugierter Ziegen-Anti- Maus-Immunoglobulin-Antikörper in Fällen, wo der primäre Antikörper unmarkierter monoclonaler Maus-Antikörper ist) anstelle eines Komplexes von Avidin-Biotin-alkalischer Phosphatase, kann die Blockierwirkung nichtspezifischer Proteine, wie von Gelatine, in der Stufe 15 unzureichend sein, um nichtspezifische Bindung des sekundären Antikörpers auszuschließen. Demnach kann man normales (unsensibilisiertes) Serum der gleichen Art wie der sekundäre Antikörper, der in Stufe 20 verwendet wird, benutzen (d. h. unsensibilisiertes Ziegenserum in dem erläuterten Fall). Für DNA-Sondenarbeit kann es erwünscht sein, nichtspezifischen DNA sowie Protein in Stufe 15 aufzubringen.

Die Stufe 17 liefert den primären Antikörper, der verwendet wird, um die antigenen Stellen von Interesse zu treffen. Allgemein ist er biotinmarkiert, doch wenn ein zweiter Antikörper in der Stufe 20 verwendet wird, dann kann unmarkierter Antikörper in der Stufe 17 benutzt werden. Alternativ kann der primäre Antikörper radioaktiv oder fluoreszierend markiert werden. DNA- oder RNA-Sonden (z. B. biotinmarkierte) können auch in der Stufe 17 benutzt werden, vorausgesetzt daß geeignete Vorbehandlungsstufen durchgeführt wurden. In einem solchen Fall sollte nach der Aufbringung (Stufe 17A die Objektträgeranordnung in einer Kammer bei genügend hohen Temperaturen für eine Denaturierung (z. B. 100°C) einige Minuten vor der Überführung in die Naßkammer von 37°C (Stufe 17B) für Rehybridisierung gegeben werden. Die Waschstufen, die durch die Stufen 18 und 19 in dem obigen Verfahren repräsentiert sind, können hinsichtlich der Anzahl und Dauer und der Verschiedenheit der Flüssigkeiten für DNA- Sonden ausgedehnt werden. Siehe z. B. die US-PS 45 33 628 und die darin diskutierten Druckschriften.

Die Stufe 20 umfaßt, wie gezeigt, das Vernetzen des chemisch an den primären Antikörper gebundenen Biotins mit einem zweiten chemisch an das Detektormittel, wie ein Enzym, gebundenen Biotinrest durch das vierwertige eiweißbindende Protein, Avidin. Wegen seiner verbesserten Stabilität wurde Avidin (Eiweißavidin von Vector Labs) statt Streptavdin benutzt. Vorausgesetzt, daß die geeigneten Vorbehandlungen angewendet wurden, könnten auch andere biotinmarkierte Detektorsysteme benutzt werden: z. B. Meerrettichperoxidase (HRP) oder beta-Galactosidasekonjugat mit Biotin. HRP hat den Vorteil, chromophore enzymatische Reaktionsprodukte (z. B. Polymerisationsprodukte von Diaminobenzidintetrahydrochlorid) zu erzeugen, die sicherer in dem Gewebe verankert werden als die chromophoren enzymatischen Reaktionsprodukte, die mit alkalischer Phosphatase erzeugt werden (z. B. 3-Brom-, 4-Chor-, 5-Indolylphosphat (BCIP) und entweder Jodnitrotetrazolium (INT) oder Nitroblautetrazolium (NB)). Das Anhaften der alkalischen Phosphatasechromophore kann durch Weglassen des Triton X-100 in den Stationen 6 und 10 und durch Programmierung des Instrumentes, um direkt in zwei zusätzliche Spülzyklen in destilliertem Wasser zu gehen, verbessert werden (Station 10 gefolgt von der Aufsaugstation 11). Die Objektträger werden dann zu der Station 18 überführt, wo eine flache Wanne mit Ammoniakwasser vorgesehen ist. Die Objektträger werden dann direkt in Polyvinylpyrrolidon (PVP-40) mit 400 mg je Milliliter in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, mit 0,1 M NaCl befestigt. HRP hat jedoch den Nachteil, daß die enzymatischen Reagenzien, die in den Stufen 23 bis 25 erforderlich sind, instabil gegen Licht sind und möglicherweise carcinogen sind. Wenn daher HRP verwendet wird, dann wird vorzugsweise das Programm in der Stufe 21 oder 22 angehalten, bis frisches Reagenz ergänzt und in der Station 17 angeordnet wurde. Das Programm wird dann manuell wieder begonnen. Die dadurch verlorene Zeit wird durch eine kürzere Inkubationszeit in den Stufen 24B und 25B kompensiert. Außerdem ist das enzymatische Produkt genügend unlöslich für die Objektträger nach der Stufe 31, um durch die Stationen 6, 5, 4, 3 und 2 zurückgenommen zu werden (die umgekehrte Reihenfolge der Stufen 1 bis 7 und 9), mit mehrfachen Berührungen in irgendeiner Station und einem Aufsaugen nach jeder Berührung. Die resultierenden angefärbten Proben werden nun mit Xylol überzogen und sind fertig für Trockenbefestigung, z. B. mit Permount®-Befestigungsmedium.

Man kann alternativ eine fluoreszierende Markierung in der Stufe 20 verwenden, wie beispielsweise Avidin-Fluorescein- Konjugat. In einem solchen Fall werden die Stufen 23 bis 26 nicht benötigt.

Die Stufen 23 bis 25 liefern enzymatische Reagenzien (BCIP plus INT), die geeignet sind, um unlösliche Chromagene mit der Enzymmarkierung (alkalische Phosphatase), die in der Stufe 20 eingeführt wird, zu ergeben. Die Stufen 27, 29 und 30 repräsentieren die Aufbringung und Entwicklung von Hämatoxylin als eine Gegenfärbung für die Kernsichtbarmachung des Gewebes, worin sich die markierten Antigenstellen finden.

In dem obigen Verfahren verwenden die Stufen 17 und 20 besonders kostspielige Reagenzien und werden daher mit dem Tröpfchenhalter in den Stationen 15 bzw. 16 durchgeführt. Solche Tröpfchenhalter würden normalerweise verwendet, um diese Reagenzien zu schützen, selbst wenn alle Tröpfchen die gleichen wären, um so alle Proben in dieser Stufe identisch zu behandeln. In vielen Fällen jedoch ist eine Individualisierung in diesen Tröpfchenhaltern erforderlich, besonders bezüglich des primären Antikörpers in der Stufe 15. Der teilweise gefüllte Tröpfchenhalter, der in Fig. 7 gezeigt ist, erläutert, wie unterschiedliche Flüssigkeiten als Tröpfchen in irgendeinem erwünschten Muster zugeführt werden können.

Eine starre, sich horizontal erstreckende Grundplatte 462 trägt ein horizontal sich erstreckendes Elastomerteil 464. 60 Löcher sind in dem Teil 464 in drei Doppelreihen von jeweils zehn vorgesehen. Die erste Doppelreihe ist mit 20 Tröpfchen einer ersten Behandlungsflüssigkeit gefüllt, einschließlich 468 a, 468 j, 469 a und 469 j. Die zweiten und dritten Doppelreihen von Löchern einschließlich Löchern 466 k, 466 t, 466 u und 466 dd sind leer. Sie können, wenn erwünscht, mit einer zweiten und dritten Behandlungsflüssigkeit gefüllt werden, um auf verschiedenen Objektträgerpaaren aufgebracht zu werden, während die erste Tröpfchenreihe auf einer ersten Reihe von Objektträgerpaaren aufgebracht wird.

Wenn in der Stufe 13 Enzymaufschluß verwendet wird, würde ein Tröpfchenhalter auch in der Station 13 (513 in Fig. 6) verwendet werden. Individualisierung in dieser Stufe kann verwendet werden, wo es erwünscht ist, die Aufschlußtype oder den Aufschlußgrad an diesem Punkt zu variieren (z. B. werden einige Tröpfchen ohne Pepsin, einige mit Pepsin gepuffert). Wenn teurere Blockiermittel als Gelatine in der Station 14 in Stufe 15 verwendet werden oder wenn der Grad oder die Type der Blockierung variabel erwünscht ist, dann würde ähnlich ein Tröpfchenhalter in der Station 14 verwendet werden.

Obwohl die Stationen 8 und 17 als Tröge gezeigt sind, können Tröpfchenhalter benutzt werden, um eine Individualisierung in den Stufen 23 bis 25 sowie 27 zu bekommen. Wo geeignete Objektträger und Proben verfügbar sind, kann es erwünscht sein, einen unterschiedlichen Färbegrad der durch Enzym hervorgerufenen Anfärbung und der Gegenfärbung für ein Reproduzieren äquivalenter Proben zu erreichen, um so einen Bereich von Kontrastärken zum Auswählen zu erzeugen.

Selbst in jenen Stufen, wo Tröge verwendet werden, um mäßig teure Behandlungsflüssigkeit aufzubringen (z. B. die Hämatoxylinanfärbung), benutzt die vorliegende Erfindung weniger Flüssigkeit als jene des Systems von Johnson et al (die den Hauptteil des Kapillarraumes von 75 mm × 25 mm füllt), da nur ein Teil (etwa 30 bis 40 mm × 25 mm) in dem vorliegenden Verfahren gefüllt wird. Das Ablaufen wird außerdem durch Aufsaugen statt Rotierenlassen stark erleichtert.

Es ist bevorzugt, Absorbensmaterialien von ausreichenden Absorbenskapazitäten und eine ausreichende Anzahl von Absorbensmaterialstationen (Stationen 9 (509) und 11 (511) in Fig. 6) zu benutzen, um alle der verschiedenen Flüssigkeiten zu absorbieren, die während des Gesamtverfahrens aus den Objektträgerspalten ablaufen sollen. Alternativ kann an einem bequemen Punkt in dem Verfahren (z. B. während des Falles 17B) jedes Absorbensmaterial durch ein frisches Absorbensmaterial (in den Stufen 9 und 11) ersetzt werden, oder während eine Absorbensstation in Benutzung ist (wie z. B. die Station 11 während der Stufen 9B bis 14B), kann das Absorbensmaterial in der anderen Station (Station 9) verändert werden.

Bei bevorzugten Formen der Erfindung wird der Spalt zwischen den beiden Oberflächen in der vertikalen Position gehalten, und ein einzelner Anteil von flüssigem Reagenz berührt den Raum, der zwischen den parallelen Unterkanten zweier gegenüberliegender Flächen, wie zweier mikroskopischer Glasobjektträger, gebildet wird, und fließt aufwärts durch Kapillarwirkung, um die Innenfläche des Spaltes ganz oder teilweise zu bedecken. Nach der Behandlung kann das flüssige Reagenz aus dem Raum zwischen den ebenen Flächen entfernt werden, indem man den Raum an irgendeinem Punkt mit einem absorbierenden Material in Berührung bringt. In weniger bevorzugten Formen können eine Saugapparatur oder ähnliche Flüssigkeitsextraktionssysteme verwendet werden. Eine solche Methode ist besonders brauchbar bei fortgesetzter komplexerer Behandlungsweise, die eine Behandlung einer großen Zahl von immobilisierten Proben mit einer Reihe flüssiger Reagenzien einschließt und die Aufeinanderfolge einer Aufbringung und Entfernung eines flüssigen Reagenz bei den zu analysierenden Proben erfordert, bevor die gleiche zu analysierende Probe in dem Verfahren dem nächsten flüssigen Reagenz ausgesetzt wird. Dies ist auch äußerst brauchbar, wenn es erwünscht ist, kleinste Volumina wertvoller, gefährlicher oder teurer flüssiger Reagenzien zu benutzen, wie von gelösten markierten oder unmarkierten Antikörpern, Nucleinsäuresonden, radioaktiven Materialien, biologisch gefährlichen Materialien, wo es erwünscht ist, den menschlichen Kontakt auf ein Minimum herabzusetzen.

Es gibt andere Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die parallelen Flächen und somit der Spalt dazwischen nicht vertikal, sondern eher aufwärts geneigt sind oder sich sogar horizontal erstrecken. In jedem solchen Fall sind die Vorteile der Erfindung entweder der Berührung einer geeigneten Kante des Spaltes mit einem gesonderten Anteil von Behandlungsflüssigkeit (was eine Individualisierung gestattet) oder der Entfernung von Flüssigkeit aus dem Spalt durch Kapillarwirkung (z. B. durch Berührung der Kante des Spaltes mit einem Absorbensmaterial, was eine mehrstufige Behandlung mit schnellem Ablaufenlassen der jeweiligen Flüssigkeit gestattet) oder beidem zuzuschreiben und können in ähnlicher Weise wie bei den oben beschriebenen Ausführungsformen erhalten werden. Ähnlich brauchen die im wesentlichen parallelen Oberflächen nicht eben zu sein, sondern können beispielsweise in zylindrischen oder kegelförmigen Abschnitten gekrümmt sein.

Sowohl die vertikalen als auch die horizontalen Ausführungsformen dieser Erfindung haben die gleichen Anwendungen und Vorteile gegenüber dem Stand der Technik in der manuellen Anfärbetechnologie, die routinemäßig in klinischen Laboratorien und Forschungslaboratorien ausgeübt wird, die derzeit die Analyse separater Antigene oder genetischer Information durch individuelle manuelle Verfahren durchführen. Diese Anwendungen schließen, jedoch nicht ausschließlich, das Auffinden von Antigenen von diagnostischer prognostischer Bedeutung bei Menschen-, Pflanzen- oder Tiergeweben, Zellabstrichen oder immobilisierten Extrakten auf festen Oberflächen, wie gläsernen mikroskopischen Objektträgern, Nitrocellulose- oder Celluloseacetatmembranfiltern oder flachen organoplastischen Trägern ein. Diese Anwendungen umfassen weiterhin das Aussondern identischer Menschen-, Pflanzen- oder Tiergewebe und Gewebeextrakte durch Nucleinsäurehybridisierungstechnologie hinsichtlich ihrer spezifischen Gene und ihrer RNA-Reproduktionen. Diese Methoden wären auch anwendbar bei speziellen Anfärbetechniken, bei denen ein Laboratorium ein einzelnes Gewebe für mehrere unterschiedliche histochemische Markierungen anfärben möchte, wie beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, mit Mucicarmin, Silber, Gram, Giemsa, Papanicolaou oder mit anderen histologischen, hämatologischen oder zytologischen Anfärbungen.

Alternativ können Gewebe von vielen verschiedenen anatomischen Stellen und Arten mit einer einzigen Reihe von Reagenzien angefärbt werden, besonders in Situationen, wo die verwendeten Reagenzien teuer oder nur in Mikrolitermengen verfügbar sind. Die geringen Volumenerfordernisse solcher Systeme, wie das Aussondern einer einzelnen Gewebetype mit monoclonalen Antikörpern aus begrenzten oben schwimmenden oder aufsteigenden Flüssigkeiten sind ideale Anwendungen für eine Methode und Apparatur, die dazu bestimmt sind, eine auf einer ebenen Oberfläche immobilisierte dünne Probe unter Verwendung von Kapillarfluß entweder in vertikaler oder horizontaler Stellung zu behandeln.

Claims

1. Verfahren zur Aufbringung von Flüssigkeit auf einer dünnen Probe auf einer ersten Oberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) eine zweite Oberfläche im wesentlichen parallel zu der ersten und in einem ersten Abstand von dieser hält und so einen Spalt zwischen der ersten und zweiten Oberfläche bildet und
b) eine Kante des Spaltes mit einem einzelnen Anteil von Flüssigkeit in Berührung bringt,
wobei der erste Abstand ausreichend klein ist, um Flüssigkeit zu veranlassen, durch Kapillarwirkung in den Spalt in Berührung mit der dünnen Probe zu wandern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und zweite Oberfläche eben sind und die in Berührung mit dem Flüssigkeitsanteil tretende Kante des Spaltes durch im wesentlichen parallele geradlinige Kanten der ersten und zweiten Oberfläche definiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die im wesentlichen parallelen geradlinigen Kanten sich horizontal erstrecken und die erste und zweite Oberfläche sich vertikal aufwärts erstrecken.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich
c) Flüssigkeit aus dem Spalt entfernt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Flüssigkeit entfernt wird, indem die Kante des Spaltes mit einem Absorbensmaterial in Berührung gebracht wird.

6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die Kante des Spaltes mit mehreren einzelnen Anteilen von Flüssigkeit in Berührung gebracht wird.

7. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen a und b mit mehreren ersten Oberflächen durchgeführt werden, von denen jede eine dünne Probe trägt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kante des Spaltes nahe jeder ersten Oberfläche gleichzeitig mit Flüssigkeit in Berührung gebracht wird.

9. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Oberfläche die Oberfläche eines eine Probe tragenden mikroskopischen Objektträgers ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Oberfläche die Oberfläche eines gegenüberliegenden mikroskopischen Objektträgers bzw. Gegenobjektträgers ist und die zweite Oberfläche eine weitere Probe trägt, die auch mit Flüssigkeit in Berührung kommt, die durch Kapillarwirkung von einem einzelnen Flüssigkeitsanteil aus wandert.

11. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man
c) Flüssigkeit aus dem Spalt entfernt und
d) die Kante des Spaltes mit einer zweiten Flüssigkeit in Berührung bringt, um zu bewirken, daß die zweite Flüssigkeit in Berührung mit der Probe in den Spalt wandert.

12. Verfahren zur Behandlung einer dünnen Probe auf einer ersten Oberfläche mit einer Reihe von Behandlungsflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) eine erste Behandlungsflüssigkeit durch Kapillarfluß in einen Spalt zwischen einer eine Probe tragenden ersten Oberfläche und einer zweiten Oberfläche eines Gegenelementes bis wenigstens zu der Position der Probe, die auf der die Probe tragenden ersten Oberfläche immobilisiert ist, zieht,
b) die erste Behandlungsflüssigkeit durch Kapillarwirkung in dem Spalt in Berührung mit der Probe hält,
c) die erste Behandlungsflüssigkeit aus dem Spalt durch Kapillarfluß entfernt und
d) eine zweite Behandlungsflüssigkeit durch Kapillarfluß in den Spalt bis wenigstens zu der Position der Probe zieht.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die die Probe tragende ebene Fläche die Oberfläche eines mikroskopischen Objektträger ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Oberfläche und die zweite Oberfläche in einer sich radial erstreckenden Richtung während der Einziehstufen a und d und während der Entfernungsstufe c gehalten werden.

15. Vorrichtung zur Behandlung einer dünnen Probe auf einer ersten Oberfläche, gekennzeichnet durch,
a) Eingriffeinrichtungen zum Halten eines ersten Teils mit einer eine Probe tragenden ersten Oberfläche in festem Abstand von einer zweiten Oberfläche eines Gegenelementes, wobei die erste Oberfläche und die zweite Oberfläche im wesentlichen parallel gehalten werden und wobei die erste und zweite Kante der beiden Oberflächen sich parallel erstrecken und durch im wesentlichen den ersten Abstand voneinander getrennt sind, und
b) Berührungseinrichtungen, die den Spalt zwischen der ersten und zweiten Kante mit einem einzelnen Anteil einer Flüssigkeit in Berührung bringen,
wobei der erste Abstand ausreichend klein ist, damit Flüssigkeit aus dem Raum durch Kapillarwirkung zwischen die erste und zweite Oberfläche in Berührung mit der Probe wandert.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und zweite Oberfläche sich vertikal nach oben erstrecken und die erste und zweite Kante Unterkanten sind, die sich horizontal erstrecken.

17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich
c) Aufsaugeinrichtungen besitzt, die die im wesentlichen parallelen ersten und zweiten Kanten mit einem Absorbensmaterial in Berührung bringen, so daß Flüssigkeit dazu gebracht wird, aus der Position der Probe wegzuwandern.

18. Objektträgersatz, gekennzeichnet durch
a) mehrere vertikal sich erstreckende Objektträger, von denen jeder eine sich vertikal erstreckende Oberfläche hat,
b) mehrere vertikal sich erstreckende Abdeckteile, von denen jedes eine vertikal sich erstreckende Oberfläche hat, wobei jede Oberfläche eines vertikal sich erstreckenden Objektträgers sich in einem ersten Abstand kleiner als 0,5 mm von einer Oberfläche eines vertikal sich erstreckenden Abdeckteils befindet, und
c) Eingriffeinrichtungen für das Halten der vertikal sich erstreckenden Objektträger und vertikal sich erstreckenden Abdeckteile nahe ihren oberen Enden in einer ortsfesten Gruppe, wobei die Probenoberfläche eines jeden Objektträgers in einem ersten Abstand von einer im wesentlichen parallelen Oberfläche eines sich vertikal erstreckenden Abdeckteils befindet und wobei die Unterkante eines jeden Objektträgers sich horizontal erstreckt und von einer im wesentlichen parallelen horizontal sich erstreckenden Unterkante eines Abdeckteils um den ersten Abstand beabstandet ist, wobei der Raum zwischen den horizontal sich erstreckenden Unterkanten offen ist.

19. Vorrichtung zum Halten einer horizontalen Gruppe von einzelen Anteilen von Behandlungsflüssigkeit, gekennzeichnet durch
a) eine sich horizontal erstreckende starre Unterlage,
b) ein sich horizontal erstreckendes elastomeres Teil mit einer im wesentlichen ebenen horizontal sich erstreckenden oberen Fläche und
c) mehrere in dem elastomeren Teil gebildete Vertiefungen, von denen jede sich zu der horizontal sich erstreckenden oberen Fläche hin öffnet, wobei das elastomere Teil an seiner oberen Fläche ein mit der Behandlungsflüssigkeit ausreichend unverträgliches Material aufweist, so daß ein einzelner Anteil Behandlungsflüssigkeit in einer Vertiefung eine konvexe Form annimmt, die sich oberhalb der Ebene der benachbarten oberen Fläche des elastomeren Teils erstreckt.