DE3631229A1 - Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung - Google Patents
Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendungInfo
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Description
Monoklonale Antikörper gegen humanen Tumornekrosefaktor (TNF). Die
Erfindung betrifft Hybridomzellinien, die hochspezifische monoklonale
Antikörper (mAK) gegen TNF synthetisieren, monoklonale Antikörper gegen
TNF, Verfahren zur Herstellung solcher Hybridomzellinien und Antikörper
sowie die Verwendung der monoklonalen Antikörper zum Nachweis von TNF.
Die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen von immunisierten Mäusen
(Köhler und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)) war der erste Hinweis
für die Möglichkeit, kontinuierliche Zellinien zu erhalten, die
einheitliche (sog. "monoklonale") Antikörper produzieren. Seitdem sind
zahlreiche Versuche unternommen worden, verschiedene Hybridzellen
(sogenannte: Hybridome) herzustellen und die Antikörper, die von ihnen
gebildet werden, für unterschiedliche wissenschaftliche Untersuchungen
einzusetzen.
Durch seine biologischen Eigenschaften scheint sich TNF als interessantes
und vielversprechendes Mittel bei der Behandlung von Tumorerkrankungen
einsetzen zu lassen. Eingehende Untersuchungen scheiterten zunächst an der
äußerst geringen Konzentration an TNF in natürlichen Zellen. Erst mit der
Entwicklung der Gentechnologie und der Möglichkeit, humanes Protein in
niederen Organismen klonieren zu können, war es möglich, auch TNF in
Mikroorganismen zu exprimieren. Dieser rekombinante TNF (rTNF) zeigt in
hochgereinigter Form die gleichen Wirkungen wie natürlicher TNF (nTNF).
Wissenschaftliche Untersuchungen, ebenso wie die therapeutische Anwendung,
lassen das Bedürfnis entstehen, nicht nur die Aktivität des TNF, sondern
das Protein TNF selbst, nachzuweisen. Die Bestimmung der biologischen
Aktivität ist nur mühsam und aufwendig durchzuführen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue monoklonale
Maus-Antikörper gegen humanen natürlichen und rekombinanten TNF gemäß den
Patentansprüchen 7 bis 10, welche für den immunologischen Nachweis dieser
Proteine und deren Reinigung in immunaffinitätschromatographischen
Verfahren sehr gut geeignet sind, die sie produzierenden Hybridzellinien
gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, Verfahren zu ihrer Herstellung gemäß
Ansprüchen 11 bis 14 und deren Verwendung gemäß Ansprüchen 15 und 16.
Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgte in Anlehnung an
bekannte Methoden (Monoclonal Antibodies, Kennet et al., Plenum Press
1980, S. 363-419).
Durch wiederholte Injektion einer geringen Menge des gereinigten,
rekombinanten TNf′s aus E. coli wurden BALB/c-Mäuse immunisiert. Sobald im
Serum genügend Antikörper nachweisbar waren, wurden die Milzzellen dieser
Tiere mit Myelomzellen fusioniert und die Hybride kultiviert.
Die einzelnen Kulturen wurden auf ihren Gehalt an spezifischen Antikörpern
gegen TNF mit Hilfe eines Screening-Tests untersucht.
Von geeigneten Hybridomen wurde nach der Methode des "limiting dilution
cloning" Kolonien isoliert, die sich von Einzelzellen ableiten. Auf
diese Weise erhielt man vier Hybridzellinien, die sich durch die Sekretion
monoklonaler Antikörper mit unterschiedlichen Eigenschaften aufzeichneten,
nämlich die Hybridzellinien AM-1, AM-114, AM-195 und AM-199.
Zur Vermehrung dieser Hybridzellen wurden sie sowohl in vitro als auch in
vivo kultiviert. Die hohe Vermehrungsrate in vivo machte dieses
Kulturverfahren besonders günstig. Dazu wurden mit Pristan®
vorbehandelten BALB/c-Mäusen Zellen der einzelnen Hybridstämme
intraperitoneal injiziert. Der sich bildende Ascitestumor wurde nach ca. 8
bis 10 Tagen abgeerntet.
Die Isolierung der monoklonalen Antikörper gegen TNF erfolgte durch die
Aufreinigung von entweder von Überständen der in vitro Zellkultur oder der
Ascitesflüssigkeit. Die Reinigung erfolgte in Anlehnung an die Methode von
Bruch et al. (J. Immunol. Methods 1982, Vol 53, 313-319).
Die Charakterisierung der molekularen Eigenschaften der Antikörper ergab:
- - Das Molekulargewicht der gereinigten Antikörper beträgt größer/gleich 150 000 Dalton (Bestimmung durch Polyacrylamidgelelektrophorese).
- - Die Antikörper AM-1, AM-114 und AM-199 sind vom Typ IgG1, wobei die schwere Kette gamma 1 ist. Der Antikörper AM-195 ist vom Typ IgG3, wobei seine schwere Kette gamma 3 ist. Die leiche Kette ist bei allen Antikörpern kappa (Bestimmung durch subtypenspezifische Antikörper in einem ELISA).
Die relative Lage der Bindungsstellen für die einzelnen Antikörper auf dem
TNF Molekül wurde durch kompetitive Bindung der Antikörper untersucht.
TNF wurde auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Ein mit
Biotin-markierter Antikörper wurde mit nicht markierten anderen
Antikörpern inkubiert. Es wurde untersucht, bei welcher Konstellation die
Antikörper für ähnliche Bindungsstellen auf TNF sich gegenseitig
beeinflussen. Der Antikörper AM-195 bindet an ein anderes Epitop wie AM-1
und AM-199. Bei AM-114 war eine leichte Kompetition zu beobachten.
Die Aktivität von TNF wurde in einem üblichen cytotoxischen Test bestimmt.
Rekombinanter und nativer TNF wurden mit einem Überschuß an Antikörpern
inkubiert. Die cytotoxische Aktivität beider TNF-Präparate wurde nur durch
den Antikörper AM-195 neutralisiert. Bei AM-114 wurde eine schwächere
Neutralisation beobachtet. Dieser Befund läßt sich durch die Annahme
erklären, daß sich auf dem Antigen unterschiedliche Regionen befinden, die
mit den verschiedenen Antikörpern unterschiedlich reagieren: nur der AM-195
monoklonale Antikörper reagiert mit einer für die biologische Aktivität
verantwortlichen Region.
Die Ergebnisse hinsichtlich der Antikörperbindung und TNF-Neutralisation
lassen erkennen, daß mindestens drei verschiedene Epitope von TNF durch
die Kollektion der monoklonalen Antikörper erkannt und definiert werden
können.
Sollen Antikörper zum Nachweis eines bestimmten Antigens dienen, sind im
Prinzip zwei Testanordnungen möglich. In beiden muß, wenn es keinen
natürlichen Marker im Antigen gibt, eine Markierung einer der Komponenten
vorgenommen werden. Entweder erfolgt diese am Antigen, z. B. durch ein
radioaktives Marker-Isotop, dann wird meist ein kompetitiver
Verdrängungsassay benutzt wie der bekannte Radio-Immuno-Assay (RIA) oder
die Markierung erfolgt am Antikörper, wobei der bevorzugte Testtyp ein
Immuno-Radiometrischer-Assay (IRMA) oder ein Enzyme-Linked-Immunosorbant-
Assay (ELISA) ist.
Eine andere Möglichkeit, die auch zu einer höheren Empfindlichkeit des
Nachweises führen kann, besteht in der Kopplung mit niedermolekularen
Haptenen an Antikörper, die ihrerseits durch eine zweite Reaktion
spezifisch nachgewiesen werden können. Gebräuchlich sind z. B. Biotin
reagierend mit Streptavidin. Alle erfindungsgemäßen Antikörper wurden
daher mit long chain-Biotin markiert und in einem Nachfolgeschritt mit
Streptavidin-Meerrettichperoxidas-Komplex sichtbar gemacht.
Der hier beschriebene Test stellt einen Festphasensandwich-ELISA dar. Ein
nicht markierter Antikörper (AM-1 oder AM-199) wurde an eine Oberfläche,
z. B. Mikrotiterplatten, passiv adsorbiert oder kovalent gebunden und die
Oberfläche in bekannter Weise gegen unspezifische Bindung blockiert.
TNF-haltige Proben und ein mit Biotin-markierter Antikörper (AM-195)
wurden hinzu pipettiert und inkubiert. Es konnte gezeigt werden, daß TNF
mit einer Empfindlichkeit von 0,02 ng/ml in Proben von 0,1 ml nachzuweisen
ist. rTNF hat eine spezifische Aktivität von 8,0 × 106 U/mg im Maus L929
Test, so daß mit diesem ELISA 0,2 U TNF/ml nachgewiesen werden können.
Durch Wester-Blotting konnte gezeigt werden, daß die Antikörper mit
keiner Komponente im menschlichen Serum kreuzreagieren. Die
erfindungsgemäßen Antikörper können zur Bestimmung von TNF im Serum von
TNF behandelten Patienten verwendet werden. Sie sind somit für aktuelle
diagnostische Zwecke, z. B. zur Überprüfung des TNF-Serumspiegels,
einsetzbar.
Treten bei Krankheiten erhöhte Konzentrationen an TNF auf, die für den
Organismus möglicherweise schädlich sind, könnte durch eine Immuntherapie
mit z. B. Antikörper AM-195 die Wirkungen von TNF neutralisiert werden.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Weibliche BALB/c-Mäuse wurden intraperitoneal (i. p.) mit 30 µg rTNF
in 0,5 ml komplettem Freund Adjuvant immunisiert. 14 Tage später
erhielten die Tiere erneut 30 µg des Antigens intraperitoneal in
inkomplettem Freund Adjuvant. Zwei weitere Immunisierungen erfolgten
intraperitoneal in 14tägigen Abständen mit jeweils 30 µg Antigen. Drei
Tage nach der letzten Antigengabe wurden die Milzen von 2 Tieren
entnommen.
Aus den entnommenen Milzen wurde eine Zellsuspensionen hergestellt, in
dem die Organe durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl (Porenweite 100 µm)
gepreßt wurden. Die Zellen wurden in Dulbecco Minimal Essential Medium
(DMEM), das mit 4,5 g/l Glucose, 10 mM Glutamin, 1000 Einheiten/ml
Penicilin, 100 µg/ml Streptomycin und 15% foetales Kälberserum
supplementiert war, überführt. Die Zellen wurden dreimal mit Medium
gewaschen und dann in gewünschter Konzentration in demselben Medium
resuspendiert. Im allgemeinen wurden etwa 5 bis 10 × 10⁷ Zellen pro
Milz gewonnen.
Als Fusionspartner wurden die Myelomzellen Sp2/0-Ag14 (ATCC No. CRL
8287) verwendet. Die Zellen sind gegen 20 µg/ml 8-Azaguanin resistent
und können im Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT)
enthält, nicht mehr wachsen. Sie wurden in DMEM, das mit 4,5 g/l
Glucose, 10 mM Glutamin, 1000 Einheiten/ml Penicilin, 100 µg/ml
Streptomycin und 15% foetales Kälberserum supplementiert war,
kultiviert (komplettes Medium). Zur Fusion wurden die Zellen in der
logarithmischen Wachstumsphase verwendet.
Die Milzzellsuspensionen wurden mit den Myelomzellen im Verhältnis
5 : 1 gemischt und in serumfreien DMEM gewaschen. Die gewaschenen
Zellen wurden in 30 ml serumfreien DMEM resuspendiert und in einem
50 ml konischen Polypropylen-Röhrchen bei 800 U/min 5 Minuten
zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig abgesaugt. Auf das
Pellet wurde ganz vorsichtig 0,5 ml einer 50%igen
Polyethylenglykollösung (PEG, Boehringer) vom Molekulargewicht 2000
gegeben. das Zellpellet durch leichtes Klopfen mit PEG vermischt, und
anschließend bei 1000 U/min drei Minuten zentrifugiert. Daraufhin
wurden 10 ml DMEM zugegeben, das Zellpellet vorsichtig gelöst und
anschließend drei Minuten bei 2000 U/min abzentrifugiert. Das
Zellpellet wurde in HAT-Medium in einer Konzentration von 2 × 10⁶
Zellen/ml resuspendiert und in 0,2 ml Anteilen auf Mikrotiterplatten
verteilt. In die Näpfchen waren am Tag zuvor 50 000 peritoneale
mononucleare Zellen, vornehmlich Makrophagen als Fütterzellen, gegeben
worden.
Nach der Zellfusion wurden die Zellen im HAT-Medium nach Littlefield
(Science 1964 Vol. 145, 709-712) bei 37°C mit 5% CO₂ in einer
feuchten Atmosphäre kultiviert. Die Kulturen werden zweimal in der
Woche durch Ersetzen des halben Mediums durch frisches HAT-Medium
gefüttert. Nach einigen Wochen wurden Überstände von Hybridomzellkulturen
auf das Vorhandensein von Anti-human-Tumornekrosefaktoraktivität
untersucht. Diejenigen Hybridome, die positive Resultate im
Screening-Test zeigten, wurden zum Klonieren ausgewählt. Dabei wurden
die Hybridome einer "Limiting-Dilution"-Technik unterworfen, bei der
in 96 Mikrotitervertiefungen im Mittel 0,5 Zellen/Näpfchen ausgesät
wurden, wobei 10⁵ Mäusethymocyten als "Feeder-Zellen" zugegeben
wurden. Die nach diesem Klonierungsverfahren selektionierten
Antikörper-produzierenden Zellen wurden vermehrt, eingefroren und in
flüssigem Stickstoff in komplettem Medium, das 10% foetales
Kälberserum sowie 10% Dimethylsulfoxid enthielt, aufbewahrt.
rTNF wurde in PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung, bestehend aus 0,8%
NaCl und 0,02 molar Natriumphosphat, eingestellt mit HCl oder NaOH auf
pH 7,4) auf 3⁵ g/ml verdünnt. Näpfchen von Mikrotiterplatten® wurden
mit je 0,1 ml dieser Lösung beschickt. Nach zwei Stunden bei
Raumtemperatur wurde der Überstand abgesaugt und die Näpfchen mit
0,3 ml einer 1%igen Caseinhydrolysatlösung (Merck) mindestens 30
Minuten behandelt. Danach wurde der Überstand verworfen. Überstände
von wachsenden Hybridomzellinien, die ungefähr 20-30% konfluent
waren, oder Serumverdünnungen von immunisierten Mäusen wurden für
mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Näpfchen
wurden mit 0,3 ml PBS mehrfach gewaschen. Dann wurde mit 0,1 ml einer
geeigneten Konzentration an Anti-Maus-Immunglobulin Antikörpern
(Miles) für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese
Antikörper waren mit dem Enzymmarker Peroxidase gekoppelt. Näpfchen
mit positiver Peroxidasereaktion zeigten Antigen-spezifische
Antikörper an.
Von 360 angelegten Urnäpfchen zeigten 80% Zellbewuchs. Von diesen
zeigten 12 positive Ergebnisse im rTNF-Screening-Test. Von diesen
wurden 11 wiederholt positiv verwertet. Vier verschiedene monoklonale
Hybridome wurden für die vorliegende Erfindung weiterverfolgt: AM-1,
AM-195, AM-114, AM-199.
Etwa 2 × 10⁷ Zellen wurden in Zellkulturflaschen mit 175 cm²
Wachstumsfläche ausgesät. Der zellfreie Überstand enthielt nach drei
Tagen die von den Zellen sekretierten monoklonalen Antikörper im
Bereich von 5 bis 10 µg/ml.
BALB/c-Mäuse erhielten zur Konditionierung des Peritoneums 0,5 ml i. p.
Pristan®. Innerhalb eines Zeitraumes von 1 bis 2 Wochen wurde den
vorbehandelten Tieren eine Suspension von 5 bis 10 × 10⁶ Hybridoma in
PBS pro Tier i. p. appliziert. Nach 8 bis 10 Tagen wurde mit einer
Kanüle das Peritoneum angestochen und die zellhaltige
Ascitesflüssigkeit gesammelt.
Von der entnommenen Ascitesflüssigkeit wurden die zellulären
Bestandteil durch Zentrifugation abgetrennt (5000 rpm, 5 Minuten).
Der Überstand, der die monoklonalen Antikörper enthielt, wurde in
Aliquots bei -70°C eingefroren oder chromatographisch bis zu
mindestens 90% gereinigt, wie durch Natriumdodecylsulfat-
polyacrylamid Gelelektrophorese beurteilt wurde (DE-OS 33 30 160).
Die monoklonalen Antikörper wurden in einem ELISA-System näher
charakterisiert. Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit
rTNF (5 µg/ml) beschichtet. Nach Inkubation für 2 Stunden bei
Raumtemperatur dieser so vorbereiteten Platte mit aufgereinigten
monoklonalen Antikörpern aus Zellkultur folgte ein zweiter
Inkubationsschritt (2 Stunden bei Raumtemperatur) mit
Anti-Maus-Immunglobulin verschiedener Klassen und Subklassen sowie mit
verschiedenen Klassen leichter und schwerer Immunglobulinketten
(Miles). In einem weiteren Schritt wurde ein Peroxidase-markiertes
Ziegen-Anti-Kaninchen (Miles) Immunglobulin zugesetzt. Nach Inkubation
von einer Stunde wurde die Enzymreaktion durch Zugabe des
Farbsubstrates Tetramethylbenzidine (Miles) und Wasserstoffperoxid
gestartet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
NHS-LC-Biotin (Pierce) wurde in PBS gelöst und auf eine Konzentration
von 1 mg/ml eingestellt. 0,1 ml dieser Lösung wurden mit 0,1 ml von
aufgereinigten monoklonalen Antikörpern (0,5 mg/ml PBS) gemischt und
die Lösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß
an die Reaktion wurde die Lösung auf 1 ml mit PBS aufgefüllt und bei 4°C
gegen PBS dialysiert. Das Dialysat, das heißt, die im Dialyserohr
befindliche Lösung, wurde bis zum Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.
Für die Bindung der Antikörper an TNF (rekombinant oder nativ) wurden die
Affinitätskonstanten anhand von Daten aus einem ELISA bestimmt. Hierbei
wurden die gereinigten Antikörper gegen eine konstante Menge TNF titriert
und die Bindung der Antikörper durch Bindung von Peroxidase-markierten
Kaninchen Anti-Mais-Immunglobulin nachgewiesen. Die Bindungsdaten wurden
mit einem speziellen Programm ausgewertet.
Affinitätskonstanten der monoklonalen Antikörper
BezeichnungK a × 10⁹ l × Mol-1
des Antikörpers
AM-11,5 ± 30% AM-1140,4 ± 30% AM-1953,5 ± 30% AM-1992,0 ± 30%
AM-11,5 ± 30% AM-1140,4 ± 30% AM-1953,5 ± 30% AM-1992,0 ± 30%
Die gezeigten Assoziationskonstanten K a weisen die anti-TNF Antikörper als
hochaffine Antikörper aus.
Die biologische Aktivität von TNF in vitro wurde, wie bei Aggarwal et. al.
(J. Biol. Chem. 1985, Vol. 260, 2345-2354) beschrieben, durch Lyse der
Mauszellinie L929 (ATCC Nr. CCL1) bestimmt. Bei Versuchen zur
Neutralisation der cytotoxischen Aktivität von TNF durch die monoklonalen
Antikörper, wurde eine Konzentration an TNF gewählt, bei der mindestens
90% der Zellen lysierten. Die Antikörper wurden in komplettem Medium auf
eine Konzentration von 20 µg/ml eingestellt und in 1 : 2 Schritten in
Mikrotiterplatten verdünnt. Zu jeder Antikörperlösung (0,1 ml) wurden
0,05 ml rekombinanter oder nativer TNF (1,3 ng/ml) gegeben und zwei
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte Zugabe von
50 000 L929 Zellen in 0,05 ml Medium und nach einer Inkubation von 20 bis
24 Stunden im Brutschrank wurden die Zellen fixiert und mit
Kristallviolett gefärbt.
Der schützende Effekt des Antikörpers zeigte sich durch die Färbbarkeit
von intakten Zellen. Der cytotoxische Effekt von TNF ließ die Zellen
lysieren und damit während der Färbung abschwemmen.
Neutralisation der cytotoxischen Aktivität von TNF
mAKNeutralisation
AM-1-
AM-114+/-
AM-195+
AM-199-
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, wurden drei verschiedene Klassen von
Antikörpern im Neutralisationstest gefunden. Der monoklonale Antikörper
AM-195 neutralisierte TNF bei einer Konzentration von 0,2 µg/ml, AM-114
bei 2 µg/ml während bei AM-1 und AM-199 keine Neutralisierung bei 20 µg/ml
zu beobachten war.
Die Bestimmung der Assoziationskonstanten im Beispiel 2 zeigte, daß TNF
von den Antikörpern ungefähr gleich gut gebunden wurde. Eine
Klassifizierung zwischen stark, schwach und nicht-neutralisierenden
Antikörpern liefert die Information zur Unterscheidung von verschiedenen
Epitopen auf dem TNF-Molekül. Die Ergebnisse hinsichtlich der
Antikörperbindung und TNF-Neutralisation lassen erkennen, daß mindestens
drei verschiedene Epitope von TNF durch die Kollektion der monoklonalen
Antikörper erkannt und definiert werden können.
Zur Unterscheidung zwischen kompetitiver Bindung von zwei Antikörpern
an dasselbe Epitop und additive Bindung an verschiedene Epitope wurde
die Bindung der Antikörper allein und in Paaren an allen möglichen
Kombinationen an immobilisiertem TNF getestet. TNF wurde, wie in
Beispiel 1 beschrieben, gebunden. 0,1 ml von aufgereinigten
Antikörpern, beginnend mit 2000 ng/ml, wurden in 3-Schritten von 1 : 5
verdünnt und eine Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert. Anschließend
folgte eine Inkubation mit biotinyliertem Antikörper AM-195 für
weitere 90 Minuten. Die Näpfchen wurden mit PBS 0,05% Tween® 20
gewaschen, Streptavidin-Peroxidase-Komplex (BRL) hinzugegeben und für
30 Minuten inkubiert. Die Näpfchen wurden mit PBS 0,05% Tween® 20
gewaschen und 0,1 ml Peroxidase-Substrat (siehe Beispiel 4b)
hinzugegeben. Bei einer kompetitiven Bindung kommt es zu einer
Auslöschung des Signals. Wie aus Tabelle 4 zu entnehmen ist, bindet
der monoklonale Antikörper AM-195 an ein anderes Epitop von TNF wie
AM-1 oder AM-199. Bei AM-114 ist eine leichte Kompetition zu
beobachten. Aus diesem Grunde sind die weiteren Experimente mit
immobilisierten AM-1 oder AM-199 Antikörpern und Biotin-markiertem
AM-195 durchgeführt worden.
Der Antikörper AM-1 oder AM-199 wurde durch passive Adsorption oder
kovalente Bindung an einen Träger (Kügelchen, Filter, Mikrotiterplatte
aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid, Filterpapier oder anderen
Materialien) immobilisiert. Die Spezifität von monoklonalen
Antikörpern erlaubt nur dem spezifischen Antigen, hier dem TNF, durch
Immunbindung, über eine einzige molekulare Bindungsstelle des Antigens
gebunden zu werden. Die Menge des bindbaren TNF′s ist der
Konzentration und Menge des Antigen in der Lösung proportional. Das
Antigen wird durch Immunbindung des Antikörpers AM-195 an eine andere
molekulare Bindungsstelle erkannt. Der Antikörper AM-195 trägt ein
Signal. Die Menge des immobilisierbaren Signals ist damit direkt
proportional der Menge des immobilisierten Antigens und damit auch der
Konzentration des Antigens in der zu untersuchenden Lösung.
Aufgereinigte Antikörper AM-1 oder AM-199 wurden in Anhaftpuffer
(Natrium-Bicarbonatpuffer pH 9,5, 4,2 g/l = 0,05 M) auf 1 µg/ml
verdünnt. Die Näpfchen einer Mikrotiterplatte wurden mit 0,1 ml
dieser Lösung für 16 Stunden bei 4°C inkubiert.
Die gemäß 1 erhaltene Lösung wurde abgesaugt und 2mal mit PBS (2 g/l
NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l Na₂HPO₄ × 2H₂O, 0,2 g/l KH₂PO₄,
pH 7,0) gewaschen. Anschließend wurde für 30 Minuten bei
Raumtemperatur mit 1%iger Caseinhydrolysatlösung (Merck, zu 1 l
PBS wurden 10 g Caseinhydrolysat gegeben) blockiert.
Die Lösung gemäß 2 wurde abgesaugt und 2mal mit PBS gewaschen.
rTNF wurde mit Puffer I (zu 1 l PBS werden 1 g Bovines
Serumalbumin gegeben, Sigma RIA grade) auf 10 ng/ml eingestellt
und in 1 : 2 Schritten verdünnt. Je 0,1 ml wurden pro Näpfchen
pipettiert. Anschließend wurden 0,05 ml von Biotin-markiertem
Antikörper AM-195 hinzugegeben. Das Konjugat, nach der Vorschrift
im Beispiel 1h) hergestellt, wurde 1 : 200 mit Puffer I verdünnt
und für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Näpfchen wurden mit Waschpuffer (zu 1 l PBS wurden 1 g
Tween® 20 gegeben) 3mal gewaschen und anschließend mit 0,1 ml
Streptavidin-Peroxidase-Komplex (BRL, verdünnt 1 : 2000 in
PBS/BSA-Puffer) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Näpfchen wurden 3mal mit Waschpuffer gewaschen,
0,1 ml/Näpfchen Peroxidasesubstrat pipettiert und 30 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mit 0,1 ml/Näpfchen
2M H₂SO₄ abgestoppt. Die Ablesung der Absorption in der
Mikrotiterplatte erfolgte innerhalb einer Stunde bei einer
Wellenlänge von 450 nm. Eine charakteristische Eichkurve ist in
Abb. 1 dargestellt. Die Nachweisgrenze für TNF liegt bei
20 pg/ml.
Peroxidasesubstrat
Peroxidasesubstrat
- - TMB-Stocklösung: 42 mM von TMB (3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin, Miles) in DMSO
- - Substratpuffer: 50 g Natriumacetat auf 1 l Wasser geben und mit 1 g Zitronensäure auf pH 4,9 einstellen.
- - 0,1 ml der TMB-Stocklösung wird langsam und unter Schütteln zu 10 ml Substratpuffer gegeben, gefolgt von 1,47 µl von 30% H₂O₂ (reinst, Merck).
Rekombinantes und/oder natives TNF wurde in Puffer I (Beispiel 4b)
oder in Humanserum auf 10 ng/ml eingestellt und in 1 : 2
Schritten unter den gleichen Bedingungen verdünnt. Je 0,1 ml
wurden pro Näpfchen pipettiert, die vorher, wie unter Beispiel 4b)
beschrieben, mit Antikörper AM-199 oder AM-1 beschichtet
wurden. Der nachfolgende Ablauf ist wie unter Beispiel 4b)
beschrieben.
Wie aus Abbildung 2 ersichtlich, stören keine Komponenten aus
Humanserum bei der Bestimmung von TNF mittels monoklonaler
Antikörper.
Der Nachweis einer möglichen Kreuzreaktion der Antikörper mit
Lymphotoxin wurde getestet. Aufgereinigtes rekombinantes
Lymphotoxin wurde auf ein Konzentrat von 10 µg/ml eingestellt
und dann in entsprechenden 1 : 2 Schritten verdünnt. Trotz einer
1000fach höheren Konzentration an Lymphotoxin gegenüber TNF,
wurde keine Kreuzreaktion der Antikörper AM-1, AM-195 und AM199
mit Lymphotoxin beobachtet.
Humanserum mit unterschiedlich zugesetzten Mengen an TNF wurde im 12,5%
Gel nach Laemmli (J. Mol. Biol. 1973, Vol. 80, 575-599)
gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Methode des Western Blotting wurde,
wie bei Burnett, W. N. (Anal. Biochem. 1981, Vol. 112, 195-203) und
Reiner, D. et. al. (J. Biol. Chem. 1985, Vol. 260, 1133-1139)
beschrieben, durchgeführt. Die Proteine des Gels wurden über Nacht auf
Nitrozellulosemembran (Schleicher und Schüll) geblottet. Die
Nitrozellulosemembran wurde für drei Stunden bei Raumtemperatur mit
1%iger Gelatinelösung (Bio-Rad, zu 1 l PBS wurden 10 g Gelatine gegeben)
inkubiert. Anschließend wurde die Nitrozellulosemembran mit 20 ml
Antikörperlösung, die auf 1⁵ g/ml in Puffer (0,1% Gelatine in PBS)
verdünnt wurde, für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der
Überstand wurde dekantiert und die Membran mehrmals gewaschen. Unter
Verwendung von Peroxidase-markiertem Anti-Maus-Immunoglobulin wurde der
TNF auf der Nitrozellulosemembran sichtbar gemacht. Die Nachweisgrenze
liegt bei 30 ng TNF. Wie aus Abbildung 2 ersichtlich ist, reagiert der
monoklonale Antikörper AM-195 mit keiner Komponente aus humanem Serum und
kann somit als spezifisch für TNF angesehen werden. Für die Antikörper
AM-1, AM-114 und AM-199 wurden gleiche Ergebnisse gefunden.
Claims (16)
1. Hybridzellinien, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Zellfusion von
Milzzellen einer mit rekombinanten humanen Tumornekrosefaktor (TNF]
immunisierten Maus mit Myelomzellen erhalten werden und monoklonale
Antikörper produzieren, die mit natürlichem und/oder rekombinantem TNF
reagieren.
2. Hybridzellinie gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als
Milzzellen die von BALB/c-Mäusen und als Myelomzellen die der Linie
Sp2/0 Ag14 verwendet werden.
3. Hybridzellinie gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß sie permanent als einzigen Antikörper den monoklonalen Antikörper
AM-1 produziert.
4. Hybridzellinie gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
das sie permanent als einzigen Antikörper den monoklonalen Antikörper
AM-114 produziert.
5. Hybridzellinie gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß sie permanent als einzigen Antikörper den monoklonalen Antikörper
AM-195 produziert.
6. Hybridzellinie gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß sie permanent als einzigen Antikörper den monoklonalen Antikörper
AM-199 produziert.
7. Monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit
natürlichem und/oder rekombinantem TNF reagieren.
8. Monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
a) ihr Molekulargewicht größer/gleich 150 000 Dalton beträgt, b) ihre
schweren Ketten gamma-1, ihre leichten Ketten kappa sind, c) sie keine
neutralisierende Wirkung auf die cytotoxische Aktivität von
natürlichem und rekombinanten TNF ausüben.
9. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
a) sein Molekulargewicht größer/gleich 150 000 Dalton beträgt, b) die
schwere Kette gamma-1, die leichte Kette kappa ist, c) er eine schwach
neutralisierende Wirkung auf die cytotoxische Aktivität von
natürlichem und rekombinantem TNF ausübt.
10. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
a) sein Molekulargewicht größer/gleich 150 000 Dalton beträgt, b) die
schwere Kette gamma-3, die leichte Kette kappa ist, c) er
neutralisierende Wirkung auf die cytotoxische Aktivität von
natürlichem und rekombinantem TNF ausübt.
11. Verfahren zur Herstellung von neuen monoklonalen Antikörpern der Maus
mit Spezifität für human-Tumornekrosefaktor gemäß Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß eine die Antikörper-produzierende Hybridzellinie
durch Zellfusion hergestellt und subkloniert wird und nach Wachstum
der Zellen die monoklonalen Antikörper mit anti-human-Tumornekrosefaktorspezifität
isoliert werden.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Zellfusion Milzzellen von gegen rTNF immunisierten Mäusen verwendet
werden.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als
Fusionspartner die Zellinie Sp2/O-Ag14 verwendet wird.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als
Milzzellen Zellen von gegen human-rTNF immunisierten BALB/c-Mäusen
verwendet werden.
15. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß den Ansprüchen 7 bis 10,
- a) zum Nachweis von natürlichem und rekombinantem TNF, wobei sowohl die TNF-Bindungen als auch die TNF-neutralisierenden Eigenschaften der Antikörper eingesetzt werden,
- b) zur Bestimmung von TNF in biologischen Flüssigkeiten.
- c) zur Herstellung von Immuntests für die Bestimmung von TNF.
- d) zur Bekämpfung von Krankheiten.
16. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß den Ansprüchen 7 bis 10,
zum Nachweis von human-Tumornekrosefaktor, wobei jeder der Antikörper
für sich allein, in Kombination mit anderen monovalenten Antikörpern
oder in Kombination mit polyvalenten Antikörpergemischen eingesetzt
werden kann.
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