DE3645226C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von vernetzten Gelen und unlöslichen Filmen unter Verwendung einer chemisch modifizierten Hyaluronsäurezubereitung, die sich durch neuartige chemische, physikalisch- chemische und rheologische Eigenschaften auszeichnet.

Hyaluronsäure, die nachfolgend einfach als HA bezeichnet wird, ist ein natürlich vorkommendes Glucosaminoglycan von hohem Molekulargewicht mit einer sich wiederholenden Disaccharideinheit von D-Glucuronsäure und N-Acetylgluco­ samin-2-acetamid-2-desoxy-D-glucose, die durch β(1→3)- glucosidische Bindung vereinigt sind. Die Disaccharide sind durch β(1→4)-glucosidische Bindungen so vereinigt, daß sie eine unverzweigte, unvernetzte Polysaccharid­ kette bilden.

HA tritt in tierischem Gewebe, beispielsweise in Nabel­ schnur, Glaskörper- und Gelenkflüssigkeit, Hahnenkämmen, Haut auf. Es gibt Berichte, daß das Molekulargewicht gereinigter HA im Bereich von 50 000 bis 8 000 000 liegt, je nach der Quelle, der Isolationsmethode und dem Verfah­ ren zur Bestimmung des Molekulargewichts (Balazs, E.A., Fed. Proceed. 17, 1086-1093 (1958)).

In der DE-OS 36 07 897, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich als Teil der Beschreibung Bezug genommen wird, ist ein Verfahren zur Herstellung einer chemisch modifizierten Hyaluronsäure beschrieben. Die nach diesem Verfahren gewonnene Hyaluronsäure bzw. Hyaluronsäure- Zubereitung, die auch als HY bezeichnet wird, zeichnet sich durch besondere neuartige chemische, physikalisch- chemische und rheologische Eigenschaften aus.

Es wurde nun gefunden das die, gemäß dem zuvor be­ schrieben Verfahren gewonnene, chemisch modifizierte Hyaluronsäure auch als Ausgangsstoff für neue Substanzen und produkte besonders geeignet ist.

Die Erfindung betrifft daher Ihre Verwendung zur Her­ stellung von Gelen und Filmen. Dabei wird erfindungs­ gemäß durch eine zusätzliche chemische Modifizierung mittels Divinylsulfon die HY im alkalischen weiter vernetzt und auf diese Weise ein Gel erhalten.

Hierbei han­ delt es sich um ein stark gequollenes Gel. Die Konzentra­ tion des Polymerisats in dem Gel hängt von der Zusammen­ setzung der flüssigen Phase ab, bei der es sich um Wasser oder Lösungen in Wasser von verschiedenen Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Elektrolyten handeln kann. Im Fall einer physiologischen Salzlösung (0,15 M NaCl in Wasser) kann die Polymerisatkonzentration im Bereich von 0,15 bis 0,40 Gew.% liegen. Dieser Stoff hat sehr inte­ ressante rheologische Eigenschaften (Fig. 1, 2 und 3). So ist die elastische Komponente der komplexen dynamischen Moduli (G′) höher als die Verlustmoduli (G′′) bei allen untersuchten Frequenzen. Gleichzeitig verhält sich der Stoff wie ein pseudoplastischer Körper bei niedrigen Schergeschwindigkeiten, mit anderen Worten, er hat eine wesentliche Viskosität, die mit der Schergeschwindigkeit abnimmt. Der Stoff zeichnet sich auch durch eine sehr lange Relaxationszeit aus. Es wird stark vermutet, daß es sich um eine einmalige Struktur von Lösungen von er­ findungsgemäß erhaltenem HY handelt, die es möglich macht, das vorstehend genannte gallertartige Produkt mit diesen speziellen rheologischen Eigenschaften zu erhalten. An­ ders ausgedrückt, die chemischen Änderungen in HA, die in dem erfindungsgemäßen Gewinnungsverfahren auftreten, beeinflussen nicht nur die Struktur und Eigenschaften von HY sondern auch die Eigenschaften von daraus erhaltenen Produkten. So wurde festgestellt, daß bei Verwendung von gemäß bekannter Verfahren erhaltener HA, nämlich durch Proteinentfernung mit Chloroformextraktionen als Ausgangs­ stoff für die Vernetzung mit Divinylsulfon ein unlösliches Material erhalten wurde, dessen rheologische Eigenschaf­ ten wesentlich schlechter waren als die gemäß der Erfin­ dung.

Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand von Kurven näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 eine graphische Darstellung der Verteilung der Äquivalentkugeldurchmesser (ESD) für eine 1 Gew.%- Lösung von HA (GrenzviskositätszahL 3 562 cm³/g) in wässrigem 0,15 M NaCl;

Fig. 2 eine graphische Darstellung der gegenseitigen Ab­ hängigkeit von Viskosität und Schergeschwindigkeit bei einem gallertartigen Produkt gemäß der Erfindung;

Fig. 3 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Schwingungstests an einem gallertartigen Produkt gemäß der Erfindung (V=Viskosität, F=Phasenwinkel, G′=dynamische Speichermoduli, G′′=Verlustmoduli);

Es sei darauf hingewiesen, daß durch zusätzliche Modifi­ zierung des erfindungsgemäß erhaltenen Produktes viele weitere modifizierte Stoffe erhalten werden können, z. B. stark vernetzte Gele, unlösliche Filme, Beschichtungen.

Die nachfolgenden Beispiele geben bevorzugte Ausführungs­ beispiele der Erfindung wieder, ohne diese jedoch zu be­ schränken.

Beispiel 1

Hahnenkämme wurden ausgiebig mit einer 1 %igen Lösung von Cetylpyridinchlorid in Wasser und dann mit entionisiertem Wasser gewaschen und schließlich gefroren. Die gefrorenen Kämme wurden in einer Schnitzelmaschine in Stücke mit einer Dicke von ca. 1-2 mm geschnitten. Es wurde ein Ge­ misch aus 1000 g Azeton, 100 g eines 37%igen Formalin und 50 g Natriumacetat zubereitet und diesem 1000 g ge­ schnitzelte Kämme hinzugefügt. Das Gemisch aus Kämmen und Behandlungsflüssigkeit (pH 6,7) wurde unter langsamem Rühren 24 Stunden auf einer Temperatur von ca. 20°C ge­ halten. Dann wurde die Flüssigkeit durch Filtrieren durch ein Nylonsieb von den Kämmen getrennt. Die behandelten Kämme wurden dann mit 500 g Azeton gewaschen und an Luft auf ein endgültiges Gewicht von 500 g getrocknet. Die ge­ trockneten Kämme wurden mit 2,5 l entionisiertem Wasser gemischt und eine Extraktion 72 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20° C unter langsamem Rühren durchge­ führt. Die Kämme wurden vom Extrakt durch Filtrieren durch eine Nylonmaschenware getrennt, und der Extrakt wurde zusätzlich durch zellulosehaltiges Filtermaterial filtriert (Micro-media®, M70). Die HA-Konzentration dieses ersten Extraktes betrug 0,92 mg/ml. Dann wurden 2 l dieses Extraktes mit 4 l Azeton und 20 g Natriumacetat gemischt. Dabei bildete sich eine weiße, fasrige Abscheidung, die gesammelt, mit Azeton gewaschen und in einem Vakuumofen bei 35°C getrocknet wurde. Als Produkt wurde 1,75 g erhalten. Das Verhältnis Hexosamin:Hexuronsäure für das Produkt erwies sich als 1 ± 0,05. Der Formaldehydgehalt im Produkt war 0,0150%. Das Produkt wurde so als Hylan identifiziert. Der Protein­ gehalt des Produktes betrug 0,35% und die Grenzviskosi­ tätszahl war 4 320 cm³/g.

Nach der ersten Extraktion wurden die Kämme mit 2,5 l entionisiertem Wasser gemischt und die Extraktion 48 Stunden lang bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die Kämme wurden abgesondert und der Extrakt filtriert, wie vorstehend beschrieben. Die HA-Konzentration im zweiten Extrakt betrug 0,65 mg/ml. Aus dem Extrakt wurde durch Ausfällung wie oben beschrieben 1,26 g an Produkt erhal­ ten. Diese Fraktion wurde auch als chemisch modifiziertes Natriumhyaluronat gekennzeichnet, dessen Formaldehydge­ halt 0,014% betrug. Der Proteingehalt war 0,27 und die Grenzviskositätszahl 4 729 cm³/g. Es wurden die rheologi­ schen Eigenschaften in Wasser einer 1 Gew.%-Lösung in wässriger 0,15 M NaCl-Lösung ausgewertet. Diese Daten sind in Tabelle 1 angegeben.

Es wurde auch eine dritte Wasserextraktion der Kämme wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die HA-Konzentration im dritten Extrakt betrug 0,33 mg/ml und aus diesem Ex­ trakt wurde 0,60 g HA gewonnen, dessen Proteingehalt 0,20% betrug und dessen Grenzviskositätszahl 4 830 cm³/g und der Formaldehydgehalt 0,0115% war.

Somit wurde aus 1 kg Hahnenkämmen insgesamt 3,61 g che­ misch modifiziertes Natriumhyaluronat gewonnen.

Beispiel 2

Dies Beispiel zeigt, wie ein gallertartiger Stoff aus Hylan erhalten wird. 0,88 g des aus dem zweiten Extrakt gemäß Beispiel 1 abgeschiedenen Produktes wurde mit 28,3 g wässriger 0,05 N NaOH-Lösung in Wasser gemischt und das Gemisch 60 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Zu der erhaltenen viskosen Lösung wurde ein Gemisch aus 0,26 g Divinylsulfon und 1,0 g wässrigem 0,5 N NaOH hin­ zugefügt. Das entstehende Gemisch wurde 10 Minuten ge­ rührt und dann 50 Minuten bei Zimmertemperatur stehenge­ lassen. Es wurde ein elastisches, farbloses und klares Gel erhalten, welches in 0,5 l einer 0,15 M Salzlösung gegeben und über Nacht stehengelassen wurde. Danach wur­ de von dem stark gequollenen Gel die überschüssige Flüs­ sigkeit entfernt und 0,5 l frischer Salzlösung zum Gel hinzugefügt und das Gemisch 24 Stunden lang auf einer Schüttelvorrichtung gelassen. Die überschüssige Flüssig­ keit wurde von dem aufgequollenen, unlöslichen Material abgegossen, und es wurde ein gallert- oder geleeartiger, klarer Stoff erhalten. Die HA-Konzentration im Produkt wurde mit 0,275 Gew.% bestimmt. Die rheologischen Eigen­ schaften dieses Materials sind in den Fig. 1, 2 und 3 gezeigt.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von vernetzten Gelen oder unlöslichen Filmen durch Vernetzen mittels Divinylsulfon bei Zimmertemperatur und unter alkalischen Bedingungen dadurch gekennzeichnet, daß man eine chemisch modifizierte Hyaluronsäure verwendet die dadurch erhältlich ist, daß man
   tierisches Gewebe mit einer wässrigen Behandlungslösung, die einen Aldehyd sowie ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel enthält,
   das ausgewählt ist aus aprotischen Lösungsmitteln, niederen Ketonen oder niederen Alkoholen,
   in situ chemisch modifiziert,
   überschüssige Behandlungslösung vom Reaktionsgut wieder abtrennt,
   das so behandelte tierische Gewebe mit Wasser extrahiert und aus dem wässrigen Extrakt Hyaluronsäure gewinnt.