DE3730059A1 - Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrinInfo
- Publication number
- DE3730059A1 DE3730059A1 DE19873730059 DE3730059A DE3730059A1 DE 3730059 A1 DE3730059 A1 DE 3730059A1 DE 19873730059 DE19873730059 DE 19873730059 DE 3730059 A DE3730059 A DE 3730059A DE 3730059 A1 DE3730059 A1 DE 3730059A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- fibrin
- fibrinogen
- species
- body fluid
- binding partner
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims abstract description 58
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 57
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims abstract description 56
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 26
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 42
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 41
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 41
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 241000282941 Rangifer tarandus Species 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 12
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 8
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 5
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 2
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 2
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027490 Antagosan Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 235000011890 sandwich Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 201000009482 yaws Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
- G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/821—Chemistry: analytical and immunological testing involving complement factors or complement systems
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von
"löslichem" Fibrin in einer Körperflüssigkeit einer
Spezies, unter Verwendung eines an eine Festphase gebun
denen bioaffinen Bindungspartners für dieses Fibrin und
eines markierten anderen bioaffinen Bindungspartners für
dieses Fibrin, wobei dieser andere Bindungspartner so
ausgewählt ist, daß er mit dem ersten nicht kreuzrea
giert.
In der klinischen Diagnostik ist der Nachweis einer
Aktivierung des Gerinnungssystems von Wichtigkeit. So
kann zum Beispiel nach einer Operation eine Aktivierung
der Gerinnung eintreten, die zu einer Thrombose führt.
Eine Thrombose ist ein Ereignis, für deren Vorhersage es
bisher keine zuverlässigen diagnostischen Kriterien gibt.
In allen Fällen ist anzunehmen, daß vor diesem Ereignis
eine latent ablaufende Gerinnung bereits stattfindet, die
aber durch gegenläufige Regulation des Organismus (z.B.
durch fibrinolytische Prozesse) noch unter Kontrolle
gehalten wird. In dieser Phase besteht ein Bedürfnis nach
diagnostischen Kriterien zur Erkennung dieser bedrohli
chen Situation.
Ein möglicher Meßparameter ist das Fibrin, das aus
Fibrinogen durch Einwirkung von Thrombin gebildet wird.
Fibrin ist das Material, das bei einer Thrombose den
Gefäßverschluß verursacht. In niedrigen Konzentrationen,
wie es in der oben beschriebenen Phase des "präthrombo
tischen Zustand" vorkommt, ist es jedoch löslich und kann
durch geeignete Nachweisverfahren zur Diagnose eines
präthrombotischen Zustands herangezogen werden.
Die gültige Vorstellung ist, daß Fibrin sich an Fibrino
gen anlagert und dadurch in Lösung gehalten wird. Wird
ein bestimmtes Verhältnis von Fibrin zu Fibrinogen
überschritten, so bildet sich unlösliches Fibrin, das
Material für den thrombotischen Gefäßverschluß.
Aufgabe eines Verfahrens zum Nachweis löslichen Fibrins
ist es daher, Fibrin in Anwesenheit eines mehr oder
weniger großen Überschusses an Fibrinogen spezifisch
nachzuweisen.
Im allgemeinen macht man sich dabei Methoden zunutze, die
die Löslichkeit des Fibrins herabsetzen: Gebräuchlich ist
zum Beispiel der sogenannte Äthanol-Gelierungstest nach
Breen und Tullis (Ann.Intern.Med. 69, 1197-1206, 1968)
und der Protaminsulfattest nach Niewiarowski und Gurewich
(J.Lab.Clin.Med. 77, 665-676, 1971). Neuere Methoden
bedienen sich der Eigenschaft des Fibrins, die enzyma
tische Wirkung der Plasminogen-Aktivatoren zu verstärken
(B. Wimann und M. Ranby, Thromb.Haemostas. 55, 189-193,
1986).In einer anderen Näherungsweise wurden Antikörper
erzeugt, die die geringen strukturellen Unterschiede
zwischen Fibrinogen und Fibrin erkennen können (U.
Scheefers-Borchel et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 82, 7091-
7095, 1985).
Alle genannten Verfahren haben mehr oder weniger große
Nachteile, die teils in der zu geringen Empfindlichkeit
und teils in der nicht ausreichenden Spezifität begründet
oder auch in der klinischen Routine zu aufwendig sind.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß von der bekannten
Eigenschaft des Fibrins an Fibrinogen zu binden, Gebrauch
gemacht werden kann, um ein neues und überraschend
einfaches Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin
zur Verfügung zu stellen. Es verbindet eine funktionelle
Eigenschaft des Fibrins, nämlich die der spezifischen
Bindung an Fibrinogen mit einem immunologischen Verfah
ren, ohne daß dazu ein spezieller spezifischer Antikörper
gegen Fibrin erforderlich ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Be
stimmung von "löslichem" Fibrin in einer Körperflüssig
keit einer Spezies, dadurch gekennzeichnet, daß dieser
Körperflüssigkeit mit einem an eine Festphase gebundenen
bioaffinen Bindungspartner für das Fibrin in Kontakt
gebracht wird, daß die Körperflüssigkeit abgetrennt wird,
daß die Festphase mit einem markierten anderen bioaffinen
Bindungspartner für das Fibrin in Kontakt gebracht wird,
wobei dieser andere Bindungspartner so ausgewählt ist,
daß er mit dem ersten nicht kreuzreagiert, daß der Über
schuß dieses anderen Bindungspartners abgetrennt wird und
daß aus der Menge der an die Festphase gebundenen Markie
rung die Menge "löslichen" Fibrins bestimmt wird.
Bevorzugt ist ein Verfahren, worin der Bindungspartner an
der Festphase Fibrinogen einer anderen Spezies und der
markierte Bindungspartner ein Antikörper ist, der mit
Fibrin reagiert und durch Immunisieren einer Spezies,
vorzugsweise dieser anderen Spezies, mit Fibrinogen oder
Fibrin der Spezies, von der die Körperflüssigkeit stammt,
gewonnen und markiert wurde.
Möglich ist aber auch eine Verfahrensweise, worin der
Bindungspartner an der Festphase ein Antikörper gegen
Fibrin ist, der durch Immunisieren mit Fibrinogen oder
Fibrin gewonnen wurde, und der markierte Bindungspartner
ein markiertes Fibrinogen einer anderen Spezies ist als
der, deren Fibrin bestimmt werden soll.
Vorzugsweise stammt die Körperflüssigkeit von der Spezies
Mensch.
Es ist zweckmäßig, die Bindungspartner so zu wählen, daß
der eine Bindungspartner ein Fibrinogen einer anderen
Spezies ist als der, aus der die Körperflüssigkeit
stammt, und der andere Bindungspartner ein gegen Fibrin
gerichteter Antikörper aus dieser anderen Spezies ist, um
die Möglichkeit einer Kreuzreaktion zu vermindern.
Falls an die Festphase ein Fibrinogen einer anderen
Spezies als der, aus der die Körperflüssigkeit stammt,
gebunden ist, kann die Körperflüssigkeit in Gegenwart von
zusätzlichem Fibrinogen dieser anderen Spezies mit der
Festphase in Kontakt gebracht werden.
Als Markierung ist besonders ein Enzym geeignet.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung von
Fibrinogen einer Art zur Bestimmung von "löslichem"
Fibrin in einer Körperflüssigkeit einer anderen Art.
Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Fibrinogen, das
an einen festen Träger gebunden ist. Als fester Träger
kann eine Kunststoffoberfläche, wie sie für die Festpha
sen-Immuntests (ELISA) verwendet werden, dienen, zum
Beispiel Mikrotitrationsplatten, Polystyrolröhrchen oder
Kunststoffkugeln. Die Beschichtung mit Fibrinogen kann
sowohl adsorptiv als auch kovalent erfolgen. Im besonde
ren sind Polystyroloberflächen geeignet, die durch
Imprägnierung mit einer Fibrinogenlösung beschichtet
werden können. Die für die Beschichtung einzusetzende
Fibrinogenlösung wird im allgemeinen in einer Konzentra
tion von mehr als 1 mg/l angewendet, wobei die exakte
Konzentration nicht entscheidend ist, da die Adsorption
mehr von der Bindungkapazität der Oberfläche als von der
Konzentration der Lösung abhängt. Das für die Beschich
tung einzusetzende Fibrinogen darf mit dem im Test
verwendeten Antikörper gegen Fibrin nicht kreuzreagieren.
Am einfachsten wird dies dadurch erreicht, daß Fibrinogen
derselben Spezies verwendet wird, die für die Herstellung
der markierten Antikörper gegen das zu bestimmende Fibrin
dient. Solchermaßen mit Fibrinogen beschichtete Oberflä
chen sind nun in der Lage, "lösliches" Fibrin aus einer
eingebrachten Körperflüssigkeit zu adsorbieren. Die
Flüssigkeit wird abgetrennt und die Oberfläche gewaschen.
Nun kann mit einem Antikörper das aus der Probe heraus
adsorbierte Fibrin nachgewiesen werden. Die Eigenschaften
dieses Antikörpers sind nun so auszuwählen, daß er mit
dem Fibrin der Probe reagiert, nicht aber mit dem für die
Beschichtung der Kunststoffoberfläche verwendeten Fibri
nogen. Wenn man lösliches Fibrin in menschlichem Blut
plasma bestimmen will, so ist ein Antikörper gegen
Humanfibrinogen oder gegen dessen Spaltprodukte geeignet.
Es ist unwesentlich, ob es sich um einen polyklonalen
oder monoklonalen Antikörper handelt. Wichtig ist nur,
daß er nicht mit dem Fibrinogen, das für die Beschichtung
der Festphase verwendet wurde, kreuzreagiert. Am einfach
sten wird diese Bedingung dadurch erfüllt, daß Antikörper
und Beschichtungsfibrinogen von derselben Spezies verwen
det werden, da gegen körpereigene Proteine keine Antikör
per gebildet werden. Die Antikörper können markiert sein,
besonders mit einem Radioisotop oder vorzugsweise einem
Enzym, um in bekannter Weise den Bindungnachweis zu
führen. Ebenso kann in einer nachfolgenden Reaktion ein
markierter Antikörper gegen den ersten Antikörper ("Sand
wich-Assay") verwendet werden.
In einer speziellen Ausführungsform kann dem Inkubations
medium Fibrinogen zugesetzt werden. Damit werden unter
schiedliche Fibrinogengehalte der Untersuchungsproben
ausgeglichen. Da lösliches Fibrin durch Fibrinogen in
Lösung gehalten wird, ist denkbar, daß unterschiedliche
Gehalte von Fibrinogen in der Probe einen Einfluß auf das
Meßergebnis haben könnten. Dieser Einfluß kann daher
durch Hinzufügen von Fibrinogen aufgehoben werden. Es ist
nicht zweckmäßig, hierzu Humanfibrinogen zu verwenden,
wenn lösliches Humanfibrin bestimmt werden soll, da
gereinigtes Humanfibrinogen Spuren von löslichem Fibrin
enthalten kann, was eine Störung des Nachweisverfahrens
bedeuten würde. Zweckmäßig ist daher die Verwendung von
Fibrinogen der Tierart, die zur Gewinnung des verwendeten
Antikörpers dient, zum Beispiel Kaninchenfibrinogen, um
bei vorhandener Verunreinigung des Fibrinogens mit lös
lichem Fibrin keine Kreuzreaktion mit Anti-Fibrinogen zu
erhalten.
Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele erläu
tert.
Kaninchen-Fibrinogen (Herstellung nach R.M. Huseby und
N.Bang: Fibrinogen, in Thrombosis and Bleeding Disorders,
Thieme-Verlag Stuttgart, N.Bang, F.Beller, E.Deutsch und
E.Mammen (Eds.) S. 222-247, 1971) 20 mg/l wurde in 0,01
mol/l Phosphatpuffer, pH 7,4 gelöst und je 0,25 ml in
Polystyrolröhrchen (Fa. Greiner) gefüllt. Nach Inkubation
über Nacht wurde mit 0,05 mol/l Tris/Zitronensäure-Puf
fer, pH 7,4 mehrmals gewaschen und die Röhrchen im
Trockenschrank über Kieselgel bei Raumtemperatur getrock
net. Nach dem Trocknen wurden sie in Aluminiumbeutel bis
zur späteren Verwendung luft- und feuchtigkeitsdicht ver
schlossen.
Antiserum gegen Humanfibrinogen vom Kaninchen (Behring
werke, Produkt-Nr. ORCH) wurde mit dem gleichen Volumen
gesättigter Ammoniumsulfatlösung gemischt und das Präzi
pitat abzentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen mit
50%iger Ammoniumsulfatlösung wurde das Präzipitat in
wenig 0,2 mol/l Na-Phosphat, pH 8,2 gelöst und gegen
denselben Puffer dialysiert. Diese Antikörperlösung wurde
dann mit Peroxidase (Boehringer Mannheim, Bestell-Nr.
108090) in bekannter Weise gekuppelt. Vorschrift siehe S.
Avrameas, Immunochemistry 6, 43 (1969). Das so herge
stellte Konjugat wurde auf eine für den Test geeignete
Verdünnung vorverdünnt und portionsweise bei -70°C
eingefroren.
Human-Citratplasma, zum Beispiel Standard-Human-Plasma
(Behringwerke, Bestell-Nr. ORKL) wurde mit 0,05 IU/ml
Thrombin, zum Beispiel Testthrombin (Behringwerke,
Bestell-Nr. ORHT) versetzt und nach bestimmten Zeiten 0,2
ml Aliquote zum Abstoppen der Thrombinreaktion in 0,02 ml
einer Mischung aus Hirudin 10 E/ml und Heparin 20 E/ml
pipettiert. Als Vergleich diente eine Plasmaprobe, die
mit physiologischer Kochsalzlösung anstelle von Thrombin
versetzt wurde.
Die nach Beispiel 3 hergestellten Proben wurden vor dem
Test mit einem Tris-Puffer (0,05 mol/l, pH 7,4, enthal
tend RTween 80 0,5%, EDTA 5 mmol/l und Antagosan 70
KIE/ml) 1:100 verdünnt. In die nach Beispiel 1 herge
stellten, mit Kaninchen-Fibrinogen beschichteten Röhrchen
wurden nacheinander 0,2 ml der vorverdünnten Proben
pipettiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde abgesaugt und dreimal mit Puffer (z.B.
Enzygnost-Waschpuffer der Behringwerke, Bestell-Nr. OSNK)
gewaschen.
Es wurde nun in jedes Röhrchen je 0,2 ml des nach Bei
spiel 2 hergestellten Antikörper-Konjugats pipettiert und
2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde wiederum
dreimal gewaschen und je 0,2 ml Substratlösung (z.B.
Substratlösung O-Phenylendiamin, Behringwerke, Bestell-
Nr. OSNK) eingefüllt. Nach 10 min bei Raumtemperatur
wurde die Reaktion mit je 1 ml 2 normale Schwefel
säure abgestoppt und die Extinktion der Proben bei 492 nm
in einem Photometer gemessen. Man erhielt die in der
nachfolgenden Tabelle aufgeführten Extinktionswerte, die
zeigen, daß lösliches Fibrin in Plasma durch die Ein
wirkung von Thrombin entstand und daß die Menge des
löslichen Fibrins von der Dauer der Einwirkung des
Thrombins abhängt.
Erzeugung von Blutplasma mit definiertem Gehalt an
löslichem Fibrin und Bestimmung des Gehalts an Fibrin
5 ml humanes EDTA-Plasma (2 mg/ml EDTA, Tri-Natriumsalz)
wurde mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt
und auf 37°C gebracht. Anschließend wurden 0,167 ml einer
Thrombinlösung (30 IU/ml) zugegeben und 30 min bei 37°C
inkubiert.
Das Gerinnsel wurde auf Zellstoff abgepreßt und dreimal
mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Sodann
wurde es in 2,5 ml 3 m Harnstofflösung gelöst und die
Lösung bei 3000 xg 10 min klarzentrifugiert. Die Messung
der Extinktion bei 280 nm ergab unter Berücksichtigung
einer spezifischen Extinktion für Fibrin von 15,6 eine
Konzentration von 3,1 g/l.
Zur Inaktivierung eventuell noch vorhandenen Thrombins
wurde Hirudin (25 µl 1000 IU/ml) zugegeben.
1 ml Human-Citratplasma, enthaltend 2 IU/ml Heparin,
wurde mit der oben hergestellten Lösung von Fibrin in
Harnstoff auf einen Gehalt von 0,1 mg/ml lösliches Fibrin
eingestellt und daraus weitere Verdünnungen in geometri
scher Reihe in Heparin-haltigem Citratplasma hergestellt.
Die Konzentrationen sind aus Tabelle 2 ersichtlich.
Anschließend wurden Proben wie in Beispiel 4 beschrieben
1:100 in Puffer verdünnt und getestet.
Man erhielt die in Tabelle 2 aufgeführten Extinktionswer
te, die in Abhängigkeit von der Menge an löslichem Fibrin
zunehmen. Als Kontrollen wurden in Tabelle 2 zusätzlich
die mit reiner Harnstofflösung versetzte Citratplasma
probe sowie eine Probe, in der Puffer anstelle des
Plasmas eingesetzt wurde, eingetragen.
Claims (8)
1. Verfahren zur Bestimmung von "löslichem" Fibrin in
einer Körperflüssigkeit einer Spezies, dadurch gekenn
zeichnet, daß diese Körperflüssigkeit mit einem an
eine Festphase gebundenen bioaffinen Bindungspartner
für das Fibrin in Kontakt gebracht wird, daß die
Körperflüssigkeit abgetrennt wird, daß die Festphase
mit einem markierten anderen bioaffinen Bindungspart
ner für das Fibrin in Kontakt gebracht wird, wobei
dieser andere Bindungspartner so ausgewählt ist, daß
er mit dem ersten nicht kreuzreagiert, daß der Über
schuß dieses anderen Bindungspartners abgetrennt wird
und daß aus der Menge der an die Festphase gebundenen
Markierung die Menge "löslichen" Fibrins bestimmt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Bindungspartner an der Festphase Fibrinogen einer
anderen Spezies und der markierte Bindungspartner ein
Antikörper ist, der mit Fibrin reagiert und durch
Immunisieren einer Spezies, vorzugsweise dieser ande
ren Spezies, mit Fibrinogen oder Fibrin der Spezies,
von der die Körperflüssigkeit stammt, gewonnen und
markiert wurde.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Bindungspartner an der Festphase ein Antikörper
gegen Fibrin ist, der durch Immunisieren mit Fibrino
gen oder Fibrin gewonnen wurde, und der markierte
Bindungspartner ein markiertes Fibrinogen einer
anderen Spezies ist als der, deren Fibrin bestimmt
werden soll.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Körperflüssigkeit von der Spezies Mensch ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der eine Bindungspartner ein Fibrinogen einer anderen
Spezies ist als der, aus der die Körperflüssigkeit
stammt, und der andere Bindungspartner ein gegen
Fibrin gerichteter Antikörper aus dieser anderen
Spezies ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
an die Festphase ein Fibrinogen einer anderen Spezies
als der, aus der die Körperflüssigkeit stammt, gebun
den ist, und daß die Körperflüssigkeit in Gegenwart
von zusätzlichem Fibrinogen dieser anderen Spezies mit
der Festphase in Kontakt gebracht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Markierung ein Enzym ist.
8. Verwendung von Fibrinogen einer Art zur Bestimmung von
"löslichem" Fibrin in einer Körperflüssigkeit einer
anderen Art.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873730059 DE3730059A1 (de) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin |
| AT88114180T ATE106571T1 (de) | 1987-09-08 | 1988-08-31 | Verfahren zur bestimmung von ''löslichem'' fibrin. |
| DE3889818T DE3889818D1 (de) | 1987-09-08 | 1988-08-31 | Verfahren zur Bestimmung von "löslichem" Fibrin. |
| EP88114180A EP0306813B1 (de) | 1987-09-08 | 1988-08-31 | Verfahren zur Bestimmung von "löslichem" Fibrin |
| ES88114180T ES2056086T3 (es) | 1987-09-08 | 1988-08-31 | Procedimiento para la determinacion de fibrina soluble. |
| JP63222592A JP2714562B2 (ja) | 1987-09-08 | 1988-09-07 | 可溶性フイブリンの測定方法 |
| CA000576694A CA1338774C (en) | 1987-09-08 | 1988-09-07 | Method for the determination of "soluble" fibrin |
| AU21934/88A AU613083B2 (en) | 1987-09-08 | 1988-09-07 | A method for the determination of soluble fibrin |
| US07/727,387 US6048684A (en) | 1987-09-08 | 1991-07-05 | Method for the determination of "soluble" fibrin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873730059 DE3730059A1 (de) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3730059A1 true DE3730059A1 (de) | 1989-03-30 |
Family
ID=6335495
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19873730059 Withdrawn DE3730059A1 (de) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin |
| DE3889818T Expired - Fee Related DE3889818D1 (de) | 1987-09-08 | 1988-08-31 | Verfahren zur Bestimmung von "löslichem" Fibrin. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE3889818T Expired - Fee Related DE3889818D1 (de) | 1987-09-08 | 1988-08-31 | Verfahren zur Bestimmung von "löslichem" Fibrin. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6048684A (de) |
| EP (1) | EP0306813B1 (de) |
| JP (1) | JP2714562B2 (de) |
| AT (1) | ATE106571T1 (de) |
| AU (1) | AU613083B2 (de) |
| CA (1) | CA1338774C (de) |
| DE (2) | DE3730059A1 (de) |
| ES (1) | ES2056086T3 (de) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4134833A1 (de) * | 1991-09-25 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fibrin |
| DE4420742A1 (de) * | 1993-10-20 | 1995-04-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Synthetischer Standard für Immunoassays |
| FR2813395B1 (fr) | 2000-08-28 | 2003-01-24 | Stago Diagnostica | Methode de dosage in vitro de la fibrine soluble par generation de produits de degradation specifiques |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4642285A (en) * | 1975-09-29 | 1987-02-10 | Diamedix Corporation | Sandwich EIA for antigen |
| US4366241A (en) * | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
| US4722903A (en) * | 1983-11-14 | 1988-02-02 | New York Blood Center, Inc. | Monoclonal antibodies specific to in vivo fragments derived from human fibrinogen, human fiberin I or human fibrin II |
| DE3400434A1 (de) * | 1984-01-09 | 1985-09-26 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Bestimmung von fibrin mit fibrin-spezifischen antikoerpern |
| US4914040A (en) * | 1988-03-03 | 1990-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reagent and method for determination of a polyvalent substance using an immunoaggregate |
-
1987
- 1987-09-08 DE DE19873730059 patent/DE3730059A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-08-31 AT AT88114180T patent/ATE106571T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-08-31 EP EP88114180A patent/EP0306813B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-31 ES ES88114180T patent/ES2056086T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-31 DE DE3889818T patent/DE3889818D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-07 AU AU21934/88A patent/AU613083B2/en not_active Ceased
- 1988-09-07 CA CA000576694A patent/CA1338774C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-07 JP JP63222592A patent/JP2714562B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-07-05 US US07/727,387 patent/US6048684A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2056086T3 (es) | 1994-10-01 |
| EP0306813A3 (de) | 1991-01-09 |
| US6048684A (en) | 2000-04-11 |
| EP0306813A2 (de) | 1989-03-15 |
| EP0306813B1 (de) | 1994-06-01 |
| JPS6491060A (en) | 1989-04-10 |
| JP2714562B2 (ja) | 1998-02-16 |
| DE3889818D1 (de) | 1994-07-07 |
| ATE106571T1 (de) | 1994-06-15 |
| CA1338774C (en) | 1996-12-10 |
| AU2193488A (en) | 1989-03-09 |
| AU613083B2 (en) | 1991-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0019741B1 (de) | Latex-Reagenz, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung und ein das Reagenz enthaltendes Mittel | |
| DE69837015T2 (de) | Verfahren zur Stabilisierung und Messung von Troponinkomplexen | |
| DE3136579C2 (de) | ||
| DE3705686A1 (de) | Verfahren zur bestimmung von antikoerpern | |
| DE2633877A1 (de) | Verfahren zur immunpruefung auf antigene in fester phase | |
| DE69534294T2 (de) | Mess-system unter verwendung von vollblut | |
| EP0292810B1 (de) | Einschritt-Immuntest zur Bestimmung von antigen-spezifischen Antikörpern aus einer der Immunglobulin-Klassen A, M, D oder E und dazu geeignetes Mittel | |
| DE60202008T2 (de) | Verfahren zum Auffinden von Reagenzien und Festphasenkomponenten in spezifischen Bindungsassays, frei von fortgeschrittenen Glykosylierungsendprodukten | |
| EP0173916B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Fibrinmonomer in Plasma | |
| EP0039885B1 (de) | Verfahren und Reagens zum Nachweis von Fibrinmonomer | |
| CA1079166A (en) | Process for the quantitative determination of antithrombin iii | |
| US8883433B2 (en) | Method for in vitro assay of soluble fibrin by generating specific degradation products | |
| DE3730059A1 (de) | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin | |
| DE3942081A1 (de) | Mittel zur verbesserung der wiederfindung von annexinen | |
| DE3442817A1 (de) | Verfahren und reagenz zur quantitativen bestimmung von freiem thyroxin in plasma, serum oder vollblut | |
| EP0554657B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in Gegenwart eines Immunkomplexes | |
| DE4038899C2 (de) | Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Transglutaminasen (EC 2.3.2.13) | |
| EP0711839B1 (de) | Kalibrator zur Verwendung in Testverfahren zum Nachweis eines defekten Gerinnungsfaktors V | |
| EP0534444B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Fibrin | |
| EP0570355B1 (de) | Verwendung von Prothrombinfragmenten | |
| EP0781998B1 (de) | Immunologische Bestimmungsmethode | |
| DE3024270A1 (de) | Masse zur bestimmung von menschlichem erythropoietin und deren anwendung | |
| EP0313600B1 (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung von funktion und antigener konzentration eines in einer biologischen flüssigkeit enthaltenen plasminogenaktivators | |
| EP0216194A2 (de) | Verfahren und Reagenz zur Beseitigung der Störung der Analyt-Wiederfindung in Plasmaproben | |
| EP1204871B1 (de) | Verfahren zur indirekten bestimmung des blutgerinnungsstatus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8141 | Disposal/no request for examination |