DE3751585T3

DE3751585T3 - Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen neue Mucin-Epitope produzieren.

Info

Publication number: DE3751585T3
Application number: DE3751585T
Authority: DE
Inventors: Peter S. Linsley; Diane Horn; Joseph P. Brown
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1986-11-19
Filing date: 1987-11-17
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2007-11-18
Also published as: EP0268279B1; CA1340815C; EP0268279B2; ES2080717T5; DE3751585T2; HK1007766A1; PT86180A; DE3751585D1; JPS63279784A; KR900007951B1; GR3018093T3; IL84475A; AU8099487A; NZ222509A; JP2597372B2; NO874796D0; NO175944C; EP0268279A2; US5849876A; ATE130029T1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridomzellinien, welche neue monoklonale Antikörper produzieren, die mit Mucinen reagieren, insbesondere gereinigte Mucine, und vor allem monoklonale Antikörper, die überwiegend neue Epitope auf Mucinen aus malignem Gewebe erkennen und zur Detektion und Behandlung von menschlichen Krebsformen, insbesondere Brustkrebs, brauchbar sind.
Hintergrund der Erfindung
Mucine, sind stark glykosilierte Glykoproteine mit hohem Molekulargewicht, die einen Kohlehydratanteil von bis zu 80% aufweisen und von seroviskosem Gewebe in Mund, Lungen, Cervix und Intestitinum sekretiert werden. Mucine wurden als Tumor-assoziierte Antigene identifiziert und wurden aus Serum und Ascitesflüssigkeit von Krebspatienten, einschließlich solcher mit Brustkrebs, isoliert.
Die Fettkügelchen menschlicher Milch sind in einer besonderen Membran enthalten, die aus der Plasmamembran apikaler Oberflächen laktierender Zellen abgeleitet sind. Das Interesse an dieser Membran, die auch als "Milchfettkügelchen" (im folgenden als MFGM bezeichnet) bekannt ist, ist gestiegen, als gezeigt werden konnte, daß einige der in der MFGM gefundenen Antigene mucinähnlich und mit Tumoren, insbesondere mit Karzinomen der Brust, assoziiert sind. Antikörper gegen Epitope auf Mucinantigenen, die mit Brustkrebs assoziiert sind, wurden aus Mäusen isoliert, die mit Fragmenten menschlicher Milchfettkügelchen (HMFG) immunisiert wurden. Diese Antikörper sind aussichtsreich für die Diagnose von Brusttumoren. von besonderem Interesse sind Antikörper gegen hochmolekulare (Mr größer als 200,000) mucinähnliche Komponenten von MFGM. Antikörper gegen mucinähnliche Antigene wurden erfolgreich eingesetzt bei der Diagnose von Mikrometastasen in Biopsien, als Indikator für die Tumorprognose bei der Radio-Lokalisierung von Tumoren und bei Serum-Assays zur Überwachung der Tumorprogression. Linsley et al., Cancer Research, 46, S. 5444–5450, (1986), worauf hiermit Bezug genommen wird.
Die meisten Mucinantigene, die bisher charakterisiert wurden, liegen in Tumorgewebe und zusätzlich in normalem Gewebe vor. Verschiedene mucinähnliche Antigene aus normalen und Tumor-Quellen wurden von Burchell et al., J. Immunol., 131, S. 508 (1983) untersucht, welche Unterschiede im Verhältnis von Determinanten fanden, die von zwei monoklonalen Antikörpern (HMFG-1) und (HMFG-2), in normalen menschlichen Brustepithelzellen und in Brusttumorzellinien erkannt werden. Diese Forscher zeigten, daß die relative Bindungshäufigkeit von HMFG-1 und HMFG-2 zwischen Zellinien aus normalem und malignem Brustepithel variierte, wobei das HMFG-2 Epitop auf den Tumorzellinien stärker exprimiert wurde. Sekine et al., in J. Immunol., 135, S. 3610 (1985), verglichen mucinähnliche Antigene, die mit dem monoklonalen Antikörper DF3 reagierten, Kufe et al., Hybridoma, 3, S. 223 (1984), Antigene aus Milch und Pleuraerguß von Brustkrebspatienten. Diese Untersuchungen weisen darauf hin, daß Mucine antigene Komplexität besitzen, eine Vielzahl von Epitopen sowohl auf normalem als auch auf Tumorgeweben exprimieren und zeigen außerdem, daß Mucine bezüglich der Epitopexpression zwischen verschiedenen Gewebe-Arten variieren können. Antikörper, die mit Epitopen auf mucinähnlichen Antigenen reagieren, die in erhöhtem Maß in Serum von Brustkrebspatienten gefunden werden, wurden ebenfalls beschrieben (Linsley et al., supra, und Frankel et al.,J. Biol. Response Modifiers, 4, S. 273 (1985)). Einer dieser Antikörper, nämlich W1, reagiert mit Epitopen auf einem Mucinantigen, das mit Brustkrebszellen assoziiert ist. Der Antikörper W1 wurde in einem Test verwendet, um die verstärkte Präsenz eines Antigens im Serum von Brustkrebspatienten zu detektieren (Linsley et al., supra). Zusätzlich zum W1-Epitop können andere Epitope, wie das (Thomsen-Friedenreich) und das Tn-Mucin-Epitop, von denen bekannt ist, daß sie mit Karzinomen assoziiert sind, in Tests unter Verwendung monoklonaler Antikörper detektiert werden. Springer und Desai, Molecular Immunology, 22, S. 1303–1310 (1985); und Springer, Science 224, S. 1198–1206 (1984).
Linsley et al. (Cancer Res. 46, S. 6380–6386 (1986)) untersuchten den Mechanismus der Variabilität bei der Expression von Epitopen auf einem mucinähnlichen Antigen, definiert durch die monoklonalen Antikörper W1, W5 und W9, in der Lungenkarzinomzellinie Calu-1. Bei Immunoblotting-Experimenten wurde die Bindung dieser drei Antikörper an ein mucinähnliches Glykoprotein mit hohem Molekulargewicht durch Natriumperiodat und/oder Neuraminidase-Behandlung beeinflußt, was darauf hinweist, daß die Antikörper Kohlehydratepitope erkennen.
Die EP-A-0 160 446 offenbart zwei monoklonale Antikörper, nämlich 21DD5 und 21DD7, die gegen ein Antigen auf Brustepithelzellen gerichtet sind. Die gezeigten Resultate weisen darauf hin, daß das Antigen sowohl auf normalen als auch auf Karzinomzellmembranen auftritt.
Die WO 86/02735 offenbart monoklonale Antikörper, die mit Antigenen des menschlichen nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms reagieren, wobei die Antigene ein Molekulargewicht von 135 000 Dalton oder weniger aufweisen.
Johnson et al. (Cancer Res. 46(2), S. 850–857 (1986)) beschreiben den monoklonalen Antikörper B72.3, der an ein Tumor-assoziiertes Glykoprotein mit hohem Molekulargewicht bindet, das als TAG-72 bezeichnet wird. Dieses Glykoprotein-Antigen wird im Ausschlußvolumen eines Homogenates der menschlichen Karzinomzellinie LS-174 T bei Fraktionierung über eine Sepharose CL-4B Chromatographiesäule gefunden.
Swallow et al. (Dis. Markers 4 (4), S. 247–254 (1986)) beschreiben Antikörper gegen mucinähnliche Glykoproteine, die in normalem menschlichen Urin gefunden werden. Diese Glykoproteine wurden bereits früher durch Bindung an Lektine detektiert.
Papsidero et al. (Mol. Immunol. 21 (10), S. 955–960 (1984)) beschreiben den monoklonalen Antikörper F36/22, der an ein Antigen bindet, das im Blutkreislauf von Krebspatienten gefunden wird. Dieses Antigen weist ein Molekulargewicht von mehr als 669 000 Dalton auf, bestimmt durch Gelfiltrations-chromatographie über eine Sepharose CL-4B-Säule.
Die EP-A-0 200 464 offenbart ein Tumor-assoziiertes Antigen, das von Colonkarzinomen exprimiert wird, sowie einen monoklonalen Antikörper, CCK061, der gegen dieses Antigen gerichtet ist, wobei das Antigen durch ein Molekulargewicht von etwa 820 000 bis etwa 960 000 Dalton charakterisiert ist.
Es wäre wünschenswert, neue Antikörper zu entwickeln, die eine erhöhte Spezifität in Assays für Tumor-assoziierte Antigene besitzen, welche in Proben menschlicher Individuen vorliegen. Optimalerweise sollten solche Antikörper zur Identifizierung spezifischer Epitope auf Tumor-assoziierten Mucinantigenen befähigt sein, wobei die Epitope in stark verringertem Ausmaß auf Antigenen aus normalem Gewebe gefunden werden oder maskiert sind. Derartige Antikörper könnten dann dazu verwendet werden, um empfindlichere Tests zum Nachweis der Präsenz von Krebs durchzuführen, wobei sie vorzugsweise mit Tumor-assoziierten Antigenen in Seren von Krebspatienten reagieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt dementsprechend neue Hybridomzellinien bereit, welche monoklonale Antikörper gegen Mucinantigene produzieren, die aus normalen (nicht-tumoralen) oder Tumorgewebe-Quellen isoliert wurden. Bestimmte dieser Hybridome werden mit Hilfe von Versuchprotokollen erzeugt, die gereinigtes Mucinantigen als Immunogen verwenden. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können verwendet werden, um Serum-Assays zum Nachweis der Präsenz von Tumor-assoziierten Mucinantigenen durchzuführen. Zusätzlich können mit Hilfe dieser Antikörper Tests zum Nachweis von Mucinantigenen in biologischen Proben, einschließlich Sputum, Bronchialausbürstungen und Bronchuslavage, verwendet werden. Die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Hybridomzellinien produzierten Antikörper können somit die Diagnose und Behandlung von menschlichem Krebs, einschließlich Brust- und Lungenkrebs, fördern.
Wenigstens einer der neuen monoklonalen Antikörper, die unter Verwendung von gereinigtem Tumormucin-Antigen produziert wurden, nämlich der monoklonale Antikörper Onc-M26, zeigt die bevorzugte Erkennung von Tumor-assoziiertem Mucinantigen im Vergleich zu Antigen aus normalen Quellen. Der Antikörper Onc-M26 besitzt eine wesentlich verringerte Reaktivität mit Antigen aus normalen Quellen. Zusätzlich zeigt der monoklonale Antikörper M38 hohe Spezifität gegenüber einem speziellen Epitop auf Mucinantigenen.
Vierzehn andere neue monoklonale Antikörper, die hierin beschrieben werden, reagieren ebenfalls mit Tumor-assoziertem Mucinantigen. Zusätzlich reagieren diese Antikörper mit Anti genen, die aus normalen Individuen abgeleitet sind. Mehrere dieser neuen monoklonalen Antikörper scheinen mit anderen als den bereits identifizierten Epitopen auf dem Antigen W1 zu reagieren.
Insbesondere werden erfindungsgemäß Hybridomzellinien bereitgestellt, welche einen monoklonalen Antikörper gemäß der Definition in Anspruch 1 produzieren, sowie ein monoklonaler Antikörper, der von irgendeiner der Hybridomzellinien produziert wird. Der monoklonale Antikörper kann an eine detektierbare Markierung gekoppelt sein, die ausgewählt ist unter Enzymen, Chromophoren, Fluorophoren, Coenzymen, chemilumineszenten Materialien, Enzyminhibitoren, paramagnetischen Metallen und Radionukliden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Untersuchung auf das Vorliegen von Krebs, umfassend: wenigstens einen monoklonalen Antikörper, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; und HB 9365. Dieser Testkit kann darüber hinaus Teatreagentien und feste Träger zur Durchführung der Antigen-Antikörper-Bindung umfassen, wobei der Antikörper an den festen Träger gebunden sein kann, um Antigen aus einer Probe einzufangen.
Der Testkit kann darüber hinaus einen zweiten Antikörper für den Nachweis des Antigens umfassen, das an den fixierten Antikörper gebunden ist. Der zweite Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250 ; HB 9217 ; HB 9212 ; HB 9210; HB 9211 und HB 9365. Der zweite, zur Detektion verwendete, monoklonale Antikörper kann an eine detektierbare Markierung gekoppelt sein, die ausgewählt sein kann unter Enzymen, Chromophoren, Fluorophoren, Coenzymen, chemilumineszenten Materialien, Enzyminhibitoren, paramagnetischen Metallen und Radionukliden.
Insbesondere wird ein Testkit zur Bestimmung der Präsenz von Krebs bereitgestellt, enthaltend einen ersten monoklonalen Antikörper, produziert von der Hybridomzellinie HB 9212 und einen zweiten monoklonalen Antikörper, produziert von der Hybridomzellinie HB 9365; oder enthaltend einen ersten monoklonalen Antikörper, produziert von der Hybridomzellinie HB 9210 und einen zweiten monoklonalen Antikörper, produziert von der Hybridomzellinie HB 9365; oder enthaltend einen ersten monoklonalen Antikörper, produziert von der Hybridomzellinie HB 9212, einen zweiten monoklonalen Antikörper, produziert von der Hybridomzellinie HB 9210 und einen dritten monoklonalen Antikörper, produziert von der Hybridomzellinie HB 9365. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform davon kann der Testkit zusätzlich Testreagentien und einen festen Träger zur Durchführung der Antigen-Antikörper-Bindung umfassen.
Außerdem wird ein Verfahren zur Detektion von Krebs bereitgestellt, wobei man die Präsenz eines Mucinantigens in einer Probe aus einem Säugetier bestimmt. Bei dieser Methode wird der monoklonale Antikörper, der von irgendeiner der in Anspruch 1 definierten Hybridomzellinien produziert wird, zur Reaktion mit Mucinantigen in der Probe verwendet.
Diese Probe kann eine biologische Flüssigkeit sein, die ausgewählt ist unter Blut, Serum, Plasma, Sputum, Pleuraexsudat, Milch, Bronchialausbürstungen und Bronchuslavage.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Krebs durch Bestimmung der Präsenz von Mucinantigen in einer Säugerprobe, wobei man:

(a) zur Bindung in der Körperflüssigkeit vorhandener Mucin-antikörper an einen Einfang-Antikörper eine Probe eines Säugers mit einem Einfang-Antikörper in Kontakt bringt, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern: HB 9248;HB 9212; HB 9210; und HB 9365; wobei der Antikörper an ein Substrat gebunden ist;
(b) einen Nachweis-Antikörper, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 und HB 9365, zu dem Substrat gibt, damit er mit Mucinantigen reagiert, das an den Einfang-Antikörper gebunden ist; und
(c) den gebundenen Nachweis-Antikörper detektiert.

Gemäß besonderen Ausführungsformen ist das Mucinantigen ein Tumor-assoziiertes Antigen; der monoklonale Antikörper ist an eine detektierbare Markierung gekoppelt, welche ausgewählt sein kann unter Enzymen, Chromophoren, Fluorophoren, Coenzymen, chemilumineszenten Materialien, Enzym inhibitoren, paramagnetischen Metallen und Radionukliden; die Probe umfaßt zelluläres Material oder eine biologische Probe, ausgewählt unter Blut, Serum, Plasma, Sputum, Pleuraexsudat, Milch, Bronchialausbürstungen und Bronchuslavage; oder der Nachweisschritt umfaßt die Verwendung eines indirekten Enzym-Immunoassays.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Differenzierung zwischen normalem und abnormalem Humangewebe, wobei eine Probe, die Zellmaterial eines Menschen enthält, mit zwei oder mehreren der monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht wird, welche von der in Anspruch 1 definierten Hybridomzellinie produziert werden, wobei man mit Hilfe dieser Methode die Präsenz einer Abnormalität in dem Menschen nachweisen kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das menschliche Gewebe Brustepithelgewebe oder Lungengewebe.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis Tumor-assoziierten Antigens in einem Patienten, wobei man eine Probe, enthaltend zelluläres Material aus einem Patienten, mit zwei oder mehreren monoklonalen Antikörpern in Kontakt bringt, die von einer in Anspruch 1 definierten Hybridomzellinien produziert werden, wobei mit Hilfe dieser Methode die Präsenz von Tumoren in Patienten bestimmt werden kann. Gemäß bevorzugten Ausführungeformen umfaßt die Probe ein biologisches Material ausgewählt unter Blut, Serum, Plasma, Sputum, Pleuraexsudat und Milch; oder die Probe umfaßt Brustepithelzellen; oder die Probe ist ausgewählt unter Bronchialausbürstungen, Lavage-Proben und ausgeworfenem Sputum.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Nachweis von Lungenkarzinom und Karzinom-Metastasen in der Lunge, wobei man eine Probe, ausgewählt unter Bronchialausbürstungen, Lavage-Flüssigkeit und ausgeworfenem Sputum, mit wenigstens einem Antikörper reagieren läßt, der von der Hybridomaellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern: HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 und HB 9365. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform davon wird die Probe mit einem ersten Antikörper umgesetzt, der von der Hybridomzellinie HB 9212 produziert wird, und einem zweiten Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9365 produziert wird. Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen davon wird die Probe mit einem ersten Antikörper, der von der Hybridom-zellinie HB 9210 produziert wird und einem zweiten Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9365 produziert wird, umgesetzt.
Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Differenzierung zwischen normalen und menschlichen Tumorzellen bereitgestellt, wobei man eine Probe, die zelluläres Material aus einem Menschen enthält, mit wenigstens zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern in Kontakt bringt, die von in Anspruch 1 definierten Hybridomzellinien produziert werden, und wobei man die Präsenz oder das Fehlen einer Immunkomplex-Bildung mit den Antikörpern detektiert, die auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Tumorzellen in der Probe hinweist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform davon umfaßt das menschliche Zellmaterial Brustepithelzellen. Vorzugsweise ist eine der Hybridomzellinien ATCC-Nummer HB 9212.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Einzelheiten typischer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen beschrieben, wobei:
1 die Bindung des Antikörpers W1 an Fraktionen einer CsCl-Dichtegradienten-Reinigung von Milchmucinen zeigt.
2 eine Photographie eines SDS-PAGE-Gels der CsCl-Dichtegradienten-Reinigung von Milchmucinen zeigt;
3 eine Photographie einer SDS-PAGE-Gelanalyse von Affinitätschromatographie-gereinigten Mucinen aus Milch (Bahnen 2 bis 5) und Tumorgewebe (Bahn 6 = Probe Nr. H3300 Brusttumor-Mucin aus Peritonealerguß; Bahn 7 = Probe Nr. H3415 Brusttumormucin aus Pleuraerguß; und Bahn 8 = Brusttumorpool-Mucin);
4 die Dosis-Ansprechkurven für die Bindung von monoklonalen Antikörpern an gereinigte Mucine unter Verwendung des hierin beschriebenen Lectin-Mucin-Einfangtests zeigt, 4A: Milchmucin, 4B: Pleuralergußmucin; und
5 eine Graphik zeigt, welche den Gehalt an Mucin antigen-Epitopen veranschaulicht, die mit Hilfe des DDIA im Rahmen von Serumtests an Brustkrebspatienten und Patienten mit benigner Erkrankung der Brust unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper detektiert wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Hybridome, welche die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren, werden unter Befolgung der allgemeinen Verfahren hergestellt, die von Köhler und Milstein in Nature, 256, S. 495 (1975) beschrieben wurde, worauf hiermit Bezug genommen wird. Im Rahmen dieses Verfahrens werden Hybridome durch Fusion von Antikörper-produzierender Zellen (typischerweise Milzzellen von Mäusen, welche vorher mit einer Mucinantigen-Quelle immunisiert wurden) mit Zellen aus einer immortalen Tumorzellinie unter Verwendung somatischer Zellhybridisierungsprozeduren hergestellt. Die zur Immunisierung der Tiere verwendeten Substanzen ("Immunogene") zur Induktion der Produktion von Antikörpern gegen Mucinantigene bestehen typischerweise aus lebenden menschlichen Krebszellen, wie z.B. Brustkrebszellen oder MFGM, oder Krebszellmembranextrakten. Es kann eine Inoculation mit mehr als einem Immunogen-Typ erfolgen. Beispielsweise können Krebszellen und MFGM in getrennten Immunisierungsschritten eingeführt werden. Zusätzlich zu MFGM und Humankrebszellinien wird erfindungsgemäß Gebrauch gemacht von gereinigten Mucinen als Antigenen, einschließlich Mucinen aus Tumorquellen, die im folgenden beschrieben werden. Die Verwendung von gereinigten, Tumor-assoziierten Mucinen als Immunogen kann die Chancen für die Erzeugung von Antikörpern für bestimmte Tumor-assoziierte Epitope verbessern.
Die hierin beschriebenen neuen monoklonalen Antikörper wurden erzeugt durch Immunisierung von Mäusen mit Krebszellinien; MFGM-Präparationen; oder mit Mucinen, die aus Milch oder Pleuraerguß von Krebspatienten isoliert wurden. Dies ist in Tabelle 3, unten, zusammengefaßt. Für die Immunisierung mit gereinigtem Mucin werden die Tiere intraperitoneal und/oder subcutan wenigstens einmal mit 100 Einheiten oder mehr Immunogen inoculiert. Es können auch Inoculationen mit mehr als einem Immunogen-Typ, wie z.B. Krebszellen und MFGM, verabreicht werden. Die Tiere erhielten dann zwei- oder mehrmals Booster- Injektionen mit dem Immunogen. Die Milz wurde aus den Tieren mehrere Tage nach der letzten Booster-Injektion entnommen und es wurde eine Milzzell-Suspension für die Fusion hergestellt, wobei bekannte Fusionstechniken mit Mausmyelom-Zellen durchgeführt wurden.
Die aus dem Fusionsprozeß resultierenden Hybridome wurden vermehrt. Anschließend wurden die resultierenden Überstände unter Verwendung von Immunoassay-Prozeduren gescreent, um Antikörper nachzuweisen, die in den Überständen vorliegen und zur Bindung an spezifische Antigene befähigt sind. In einigen Fällen wurde der unten beschriebene Lectin-Einfang-Test (WGA) für ein erstes Screening verwendet, um monoklonale Antikörper zu detektieren, welche in den Überständen vorliegen und zur Bindung an gereinigtes Milch- und Pleuraerguß-Antigen befähigt sind, oder an Mucinantigene im Serum aus menschlichen Individuen mit oder ohne Krebs binden können. In anderen Fällen wurden Überstände auf ihre Fähigkeit zur Bindung an kultivierte Krebszellen oder MFGM getestet. Ein Enzymimmunoassay (ELISA) wurde zur Detektion der Bindung von Antikörpern an Lectin-gebundenes, gereinigtes Mucinantigen, an Krebszellen oder an MFGM verwendet. Weitere Arten von Screeningverfahren wurden mit den Hybridomzell-Überständen durchgeführt, einschließlich kompetitiver Bindungsassays und Bestimmung von Fluoreszenz-Bindungsmustern, wie dies in den Beispielen beschrieben ist.
Ein Doppeldeterminanten-Immunoassay (DDIA) (Linsley et al, oben), welcher auf Antikörperbindung an Epitope auf Mucinantigen, wie zum Beispiel dem W1-Epitop, testet, wurde zur Analyse der Leistungsfähigkeit der neuen monoklonalen Antikörper in Humanserum-Assays bei der Detektion von Tumor-assoziiertem Mucinantigen und zum Vergleich der neuen Antikörper mit dem Antikörper W1 und in Assays mit Bronchial-Ausbürstungen, welche bei der Bronchoskopie menschlicher Individuen gewonnen wurden, verwendet. Beim DDIA wird ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper ("Einfang"-Antikörper), der auf einem Substrat, wie z.B. einen Kunststoffträger oder einer Säule, immobilisiert ist, dazu verwendet, um Antigen einzufangen, das in einer Flüssigkeitsprobe, wie Blutserum eines Krebspatienten vorliegt. (Serum eines Patienten ohne Krebs wird als Kontrolle verwendet.) Ein zweiter Antikörper, der vorzugsweise ebenfalls ein monoklonaler Antikörper ist, wird zugesetzt und ist gegebenenfalls für den Nachweis markiert, wie z.B. mit einem Radionuklid, wie Jod-125 (¹²⁵I), oder mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) (der "Nachweis"-Antikörper). Der markierte Antikörper bindet an abgefangenes Antigen und erlaubt die Detektion und Quantifizierung von Mucin-Antigen, das im Serum vorliegt. In einigen Fällen, bei denen ein Antigen wiederkehrende Epitope aufweist, wie z.B. das W1-Epitop, kann der zweite Antikörper mit dem ersten Antikörper identisch sein. Beispielsweise können beide Antikörper W1-Antikörper sein (homologer DDIA). Bei nicht-wiederkehrenden Epitopen kann es erforderlich sein, einen zweiten Antikörper zu verwenden, der zur Bindung an ein anderes Epitop auf dem Antigen befähigt ist, beispielsweise deshalb, weil ein Epitop durch die Bindung mit dem ersten Antikörper blockiert ist. Letzteres Verfahren wird auch als heterologer DDIA bezeichnet. Jeder Test wird, entsprechend dem als Einfang-Antikörper, der zuerst aufgeführt wird und entsprechend dem als Konjugat zum Nachweis verwendeten Antikörper bezeichnet. Der "M26/M29"-Test verwendet M26 als Einfang-Antikörper und HRP-M29 als Nachweis-Antikörperkonjugat.
Optimalerweise ist es wünschenswert, neue Epitope auf Tumor-assoziierten Antigenen zu identifizieren, um die Produktion von monoklonalen Antikörpern zu ermöglichen, mit welchen Immunoassays mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität durchgeführt werden können, d.h. die zu einem Test führen, der besser unterscheiden kann zwischen Proben aus Personen mit Krebs und Proben aus Personen ohne Krebs, und wobei ein Auftreten falsch-positiver Ergebnisse verringert wird. Falsch-positive Resultate treten auf, wenn der Test das Vorliegen von Krebs anzeigt, obwohl der Patient keinen Krebs hat, weil der Antikörper an Epitope auf Mucin-Antigen aus normalen Quellen bindet. Darüber hinaus kann die Empfindlichkeit eines Tests durch Verwendung von Antikörpern mit höherer Spezifität für Mucin-Antigene, insbesondere für Epitope auf Tumor-assoziierte Antigenen, gesteigert werden. Kleine Mengen an Antigen werden gebunden, so daß frühere Krebsstadien in Patienten nachgewiesen werden können.
Die folgenden Beispiele veranschlaulichen die vorliegende Erfindung und unterstützen den Fachmann bei der Durchführung und Anwendung der Erfindung. Es ist nicht beabsichtigt, daß die Offenbarung oder der Schutzumfang des erteilten Patentes durch die Beispiele eingeschränkt wird.
Beispiel I
Reinigung von Mucin-Antigenen aus Tumoren und normalen Quellen
Qellen für Mucin-Antigien
Die zur Erzeugung erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper verwendeten Mucin-Quellen wurden ausgewählt, indem man verschiedene Proben aus Milch, Pleuraexsudat und Tumoren von menschlichen Individuen auf Antigen-Aktivität testete. Antigen-Aktivität wurde unter Verwendung eines kompetitiven Zellbindungstest detektiert, der von Linsley et al, oben, beschrieben wurde. Dieser Test wurde außerdem zur Überwachung der Mucin-Reinigung, wie im folgenden beschrieben, verwendet. Bei der Selektions-Prozdur wurden Proben auf ihre Fähigkeit zur Inhibition der Bindung von ¹²⁵I-markiertem oder HRP-konjugiertem W1-Antikörper an W5-6-Zellen getestet. W5-6 ist eine Zellinie, die Mucin-Antigene in erhöhter Menge enthält. Diese wurde aus Calu-1-Lungenkarzinomzellen, wie im folgenden beschrieben, abgeleitet. Eine Einheit inhibierender Aktivität wurde definiert als die Menge an Material, die eine 50%-ige Reduktion der Bindung von ¹²⁵I-markiertem oder HRP-konjugiertem W1-Antikörper (zugesetzt in einer Konzentration von 0,4 μg/ml) zu 3 × 10⁴ W5-6-Zellen bewirkt. Die Bindung von ¹²⁵I-markiertem W1-Antikörper wurde unter Verwendung eines Gamma-Zählers detektiert und gebundener HRPkonjugierter W1-Antikörper wurde unter Verwendung eines ELISA-Assays detektiert. HRP wurde mit Hilfe einer Modifikation des Verfahrens von Nakani und Kawoi, J Histochem. Cytochem., 22. S. 1084 (1974) direkt konjugiert. Das Konjugat wies ein molares Verhältnis von HRP zu Antikörper von etwa 1:1 auf. Gebundene HRP-W1-Antikörperkonjugate wurden durch Zugabe einer Lösung von ortho-Phenylendiamin (OPD) (100 μl) (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA) in einer Konzentration von 0,5 μg/ml in 100 mM Natiumcitrat bei pH 5,0, enthaltend 0,0075 (Volumen/Volumen) H₂O₂ detektiert. Eine aus der Reaktion von Substrat mit Enzym resultierende gelbe Färbung ließ man bis zum Erreichen maximaler Extinktionswerte von 0,4 bis 1,5 (optische Dichteeinheiten oder O.D.) bei 490 nm, bestimmt mit Hilfe eines Spektrophotometers, entwickeln (diese Werte liegen innerhalb des optimalen Bereichs für den ELISA). Die Enzym-Substrat-Farbreaktionen wurden durch Zugabe von 50 μl 1,3 N H₂SO₄ beendet. Die Extinktion bei 490 nm wurde unter Verwendung eines Mikrotiter-Plattenlesegeräts (Genetic Systems Corp., Seattle, WA) gemessen. Der Antikörper W1 wurde aufgrund seiner bekannten Reaktivität mit Mucinantigenen verwendet. Im wesentlichen identische Werte wurden unter Verwendung anderer Tests erzielt.
Bei Befolgung obiger Prozeduren wurde festgestellt, daß normale menschliche Milch, die aus Brustepithelium abgeleitete Proteine enthält, sowie Exsudat-Flüssigkeit aus Krebspatienten eine hohe W1-inhibierende Aktivität aufweisen (größer als 1000 Einheiten/ml). Aufgrund der Möglichkeit individueller Variationen zwischen nicht-malignen Proben wurden Mucine aus vier verschiedenen Milch-Proben und zwei Pleuraexsudat-Proben gereinigt. Ein Pool aus Säure-Ethanol-extrahierten Brusttumoren einer großer Anzahl von Individuen wurde ebenfalls als Quelle für die Reinigung von Mucinen verwendet. Die Mucin-Reinigung aus diesen Quellen ist im folgenden beschrieben.
Gewinnung von Milch und Pleuraexsudat-Flüssigkeiten
Milch wurde aus vier Krebs-freien Donoren erhalten und die Proben wurden mit Milch 1, Milch 2, Milch 7 und Milch 11 bezeichnet. Die Proben wurden innerhalb von 5 bis 10 Minuten nach der Gewinnung eingefroren. Ursprünglich wurden sowohl lösliche als auch MFGM-assoziierte Formen W1-bindender Mucine in den Milchproben gefunden. Zur Maximierung der Mucin-Gesamtausbeute wurde die Analyse nicht auf die MFGM-assoziierte Form des Milch-Antigens beschränkt.
Das verwendete Exsudat enthielt überwiegend eine lösliche Mucin-Form. Pleuraexsudat wurde von Brustkrebspatienten am Virginia Mason Hospital in Seattle, WA, erhalten. Eine Probe, (Nr. H3300) bestand aus Peritonealflüssigkeit und wurde einem Patienten entnommen, für den metastatisierender lobulärer Brust krebs diagnostiziert wurde. Probe Nr. H3422 bestand aus Pleuraexsudat eines Patienten, für den ursprünglich ein inflammatorischer Brustkrebs diagnostiziert wurde und welcher anschliessend ein moderates bis wohl-differenziertes infiltrierendes ductales Adenokarzinom entwickelte. Eine andere Probe (Nr. H3415) bestand aus Pleuraexsudat von Patienten mit diagnostiziertem inflammatorischem Brustkrebs. Die Exsudat-Flüssigkeiten wurden bei –20°C eingefrogen und aufbewahrt.
Isolation von Mucinen aus Milch und Exsudat-Flüssigkeiten
Die zur Mucin-Reinigung aus Milch und Exsudat-Flüssigkeiten verwendete vorbereitende Technik entsprach einer Modifikation der Verfahren von Creeth et al, Biochem. J., 167, S. 557 (1977), worauf hiermit Bezug genommen wird, und wurde beschrieben von Linsley et al, oben. Dieses Verfahren erlaubte die vorbereitende Reinigung von MFGM-assoziierten und löslichen Mucinen und vermied ein Überladen der für die abschließende Reinigung verwendeten Affinitätschromatographiesäulen. Gesamtmilch und Exsudat-Flüssigkeiten wurden aufgetaut und Guanidin-HCl (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) wurde bis zu einer Endkonzentration von 6 M zugesetzt. Das Gemisch wurde bis zum Klarwerden gerührt. Eine Gleichgewichtssedimentation in Caesiumchlorid (CsCl) Dichtegradienten wurde durchgeführt. CsCl (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) wurde zu 0,6 g/ml (Originalvolumen) zugesetzt und die Dichte wurde auf 1,33 bis 1,35 g/ml (gravimetrisch bestimmt) eingestellt. Die Proben wurden in einem Beckmann 50.2-Rotor bei 40,000 Upm (145,500 × g durchschnittlich) 60 bis 65 Stunden bei 21°C zentrifugiert. Die Fraktionen wurden über den Boden des Glases gewonnen und die Dichten wurden gemessen. Die Fraktionen wurden gegen H₂O dialysiert und anschließend wurde die W1-inhibierende Aktivität wie oben beschrieben, bestimmt. Für die aus Exsudat-Flüssigkeiten abgeleiteten Mucine wurden Peak-Fraktionen gepoolt und einer zweiten Zentrifugation in einem CsCl-Gradienten, enthaltend 0,2 M Guanidin-HC1, unterzogen.
Affinitätschromatographie
Für die abschließende Reinigung der Mucine wurde eine Af finitätschromatographie durchgeführt. Die Peak-Fraktionen mit inhibitorischer W1-Aktivität aus den CsCl-Gradienten wurden vermischt mit Antikörper W9 (Dr. D. Ring, Cetus Corp, Emeryville, CA), konjugiert an Sepharose 4B (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in einem Verhältnis von 200–3500 Einheiten/mg Antikörper in einer Lösung aus 50 mM NaCl, gepuffert auf pH 6,5 mit 20 mM HEPES. Der Antikörper W9 wurde ausgewählt, da die W9-Epitope auf dem gleichen Molekül wie die W1-Epitope gefunden wurden, und da die Elution von gebundenem Mucin unter Verwendung von W9 bei niedrigerem pH als bei Verwendung des Antikörpers W1 erreicht wurde. Gebundenes Antigen wurde, wie früher bereits von Linsley et al, Biochemistry, 25, S. 2978 (1986) beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird, eluiert. Proteinkonzentrationen wurden, wie von Markwell et al, Anal. Biochem., 87, S. 206 (1979), worauf hierin Bezug genommen wird, bestimmt.
Tumorpool-Mucin
Pools aus Tumor-Mucin wurden aus Säure-Ethanol-extrahierten Brusttumoren gewonnen, die von Dr. J. Rowe (Oncogen, Seattle, WA) bereitgestellt wurden. Chirurgische Proben, wovon ein Großteil aus Brusttumorgewebe unterschiedlicher histologischer Klassifikation bestand, wurde gepoolt und eingefroren bei –70°C aufbewahrt. Tumorgewebeproben (jeweils 45 g) wurden in einem Volumen von 250 ml Extraktionspuffer (95% Ethanol, 100 mM HCl, Phenylmethylsulfonylchlorid (32 μg/ml), Aprotinin ( 2 mg/ml)) aufgetaut und das Gemisch wurde 16 Stunden bei 4°C gerührt. Unlösliches Material wurde durch 30-minütige Sedimentation bei 10000 × g und 4°C gewonnen, in H₂O in einer Konzentration von etwa 4 g/ml (Gewicht/Volumen) resuspendiert und Guanidin-HCl wurde in einer Endkonzentration von 6 M unmittelbar zugesetzt. Man homogenisierte das Gemisch kräftig und ließ es über Nacht bei 4°C stehen. Anschließend wurde 10 min. bei 1000 × g sedimentiert und der Überstand wurde nach einer Entfernung der Lipidphase gewonnen. Eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation und eine Affinitätsreinigung wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Natriumdodecylsulfat-Polyamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur Bestimmung der Reinheit wurde eine SDS-PAGE mit Proben der CsCl-Gradienten-Fraktionen der Mucine, die W1-inhibierende Aktivität zeigten, durchgeführt. Bei diesem Verfahren wurden Polyacrylamidgele mit einer Gradienten von 5 bis 20% zusammen mit einem 4%-igen Sammelgel, wie von Linsley et al, Biochemistry, oben, beschrieben, verwendet. Die Proben wurden unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Gele wurden unter Verwendung von Coomassie Brilliant Blue gefärbt, entfärbt, mit 0,2%-iger Perjodsäure 40 min. bei 4°C behandelt und anschliessend erneut unter Verwendung von Schiff'schem Reagens (Sigma Chemical Co.) 40 min. bei 4°C gefärbt.
Aminosäureanalyse
Eine Aminosäureanalyse der durch Anffinitätsreinigung wie oben beschrieben erhaltenen Mucine wurde unter Verwendung der Standardtechniken von Lowell H. Ericson (AAA Laboratories, Seattle, WA) im Anschluß an eine 20-stündige Hydrolyse in 6 N HCl bei 115°C durchgeführt.
ERGEBNISSE
Biochemische Analyse von gereinigten Mucinen
Mucine aus Milch, die zur Bindung des Antikörpers W1 ( 1) befähigt sind, ergaben in CsCl-Gradienten eine Bande bei einer Gleichgewichtsdichte von 1,38 ± 0,01 (Standardabweichung), errechnet aus insgesamt 7 Experimenten. Dies ergab eine annähernd 10-fache Mucin-Anreicherung bei einer Ausbeute von etwa 40%. Die CsCl-Dichtegradientenzentrifugation von Mucinen aus menschlicher Milch gemäß obigem Verfahren ist in 2 gezeigt. Milch-Mucine ergeben eine Bande bei höherer Gleichgewichtsdichte als die große Masse anderer Milchproteine, was aus der SDS-PAGE Elektrophorese ersichtlich ist. Eine ähnliche Reinigung erzielt man mit Mucinen aus Pleuraexsudat und den gepoolten Säure-Ethanol-Extrakten aus Brusttumoren.
Die Affinitätsreinigung von Milch-Mucin führte zu einer etwa 52%-igen Isolierung der Mucinantigenaktivität aus den gepoolten CsCl-Fraktionen (4 Experimente) im Eluat, und zu einer etwa 400-fachen Reinigung der Aktivität bezogen auf Gesamtmilch. Für Pleuraexsudat wurden ähnliche prozentuale Aktivitäten im Affinitätssäulen-Eluat gefunden, wobei man eine etwa 2300-fache Gesamtanreicherung bei einer Gesamtausbeute von etwa 26% erzielte.
Die SDS-PAGE-Elektrophorese der affinitätsgereinigten Mucin-Präparate aus Milch und Tumor (Probe Nr. H3300 Exsudat, Probe Nr. H3415 Exsudat, gepoolte Extrakte aus Brusttumoren) ist in 3 gezeigt. Die Hauptkomponenten in allen drei Mucin-Präparaten wanderten langsam und stellten PAS-färbende Spezies dar, welche den Antikörper W1 in Immunoblotting-Experimenten banden. Zusätzlich enthielten alle Präparate niedermolekulare Kontaminanten in unterschiedlicher Menge und unterschiedlichen Molekulargewichts, die jedoch nicht mit dem Antikörper W1 reagierten. Mucine aus sämtlichen der drei Tumor-abgeleiteten Quellen enthielten Spezies, welche in Form von diffusen Banden mit einem Mr von etwa 400,000 wanderten. (Die angegebenen Molekulargewichte sind als Schätzungen zu betrachten, da sie außerhalb des Bereichs der verwendeten Standards lagen, sowie aufgrund des hohen Glykosylierungsgrades dieser Moleküle.) Präparate aus der Probe H3300 und des Tumorpools wurden jeweils in zwei Komponenten mit Mr = 350,000 und 420,000 bzw. 370,000 und 435,000 aufgelöst. Mucine, die aus verschiedenen Milchproben gewonnen wurden, zeigten eine beträchtliche Variabilität bei ihrer Wanderung durch SDS-PAGE. Die verschiedenen Komponenten dieser Milchpräparate, die bei diesen verschiedenen Geschwindigkeiten wanderten, zeigten keinen signifikanten Unterschied bezüglich der Immunoreaktivität mit irgendeinem der hierin verwendeten Antikörper.
Die Milchpräparate Nr. 2 und 7 ernthielten zwei diffuse Spezies mit relativen Molekulargewichten von Mr = 335,000 und 480,000 für Präparat Nr. 2 bzw. 400,000 und 500,000 für Präparat Nr. 7. Die Präparate Nr. 1 und Nr. 11 enthielten jeweils nur einzelne diffuse Spezies mit Mr = 450,000 bzw. 380,000. Es konnten keine signifikanten Unterschiede für die Immunoreaktivität der schneller oder langsamer wandernden Komponente mit irgendeinem der verwendeten Antikörper beobachtet werden.
Die Aminosäurezusammensetzung von gereinigten Mucinen aus Milch (Präparat Nr. 2) und Exsudat (Probe Nr. H3300, H3415 und H3422) ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Aminosäurezusammensetzung des Glykoproteins PAS-O, beschrieben von Shimizu et al, J. Bio chem. Tokyo, 91, S. 515 (1982), ist in Tabelle 1 als Vergleich aufgeführt (die bestimmten Werte für Serin und Threonin wurden um 10% bzw. 5% korrigiert, um deren Zerstörung während der Hydrolyse zu kompensieren.)
TABELLE 1 AMINOSÄUREZUSAMMENSETZUNG VON GEREINIGTEN MUCINEN
Wie Tabelle 1 zu entnehmen ist, sind die Aminosäurezusammensetzungen beider Präparationen untereinander und der Zusammensetzung von PAS-O ziemlich ähnlich, obwohl einige Unterschiede in der Zusammensetzung zu beobachten sind. Die Aminosäuren Alanin, Glyzin, Prolin, Serin und Threonin umfassten einen Anteil von 59 bzw. 66% für das Milchpräparat Nr. 2 und die Exsudat-Probe Nr. H3300. Dies ist vergleichbar mit einem Wert von 65% für die gleichen Aminosäuren, bestimmt für PAS-O.
Beispiel II
Erzeugung monoclonaler Antikörper gegen Mucine
Gereinigte Mucine, die wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden zur Erzeugung von Hybridomen für die Produktion monoclonaler Antikörper gegen Mucine und für die Charakterisierung der Mucine verwendet.
Zellen
Verschiedene menschliche Krebszellinien wurden ebenfalls als Immunogene zur Erzeugung von mit Mucinen reaktiven monoklonalen Antikörpern verwendet. Calu-1 Lungenkarzinomzellen, welche Mucinantigene produzieren (verfügbar bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, Nr. HTB54) zeigten ein charakteristisches, heterogenes Färbemuster, wenn Fluoreszenzmarkierte Antikörper, welche Mucinantigen erkennen, an die Zellen binden. Die Calu-1-Zellen wurden verwendet, um die neuen klonalen Zellinien W5-6, angereichert bezüglich Mucinantigen, und US-5, welche geringe Mengen Mucinantigen produziert, wie beschrieben in Linsley et al, Cancer Research, oben, abzuleiten. Calu-1-Zellen wurden in Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium ("DMEM", GIBCO, Grand Island, NY), supplementiert mit 10% fetalem Kälberseum (FCS), gehalten. Die Zellklonierung wurde durch limitierende Verdünnung in Mikrotest-Vertiefungen durchgeführt. Es wurde sorgsam darauf geachtet, Klone zu selektieren, die aus Vertiefungen abgeleitet waren, welche nur Einzelzellen enthielten. Dies wurde mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops bestimmt. Die abgeleiteten Zellinien zeigen den gleichen Isozym-Phänotyp wie die Calu-1 Zellinie, was vom Cell Culture Laboratory (Children's Hospital, Detroit Medical Center, Detroit, MI) bestimmt wurde. Der monoklonale Antikörper W5 (beschrieben von Frankel et al, oben) wurde verwendet, um die Derivate der Calu-1-Zellen durch Clonierung mit Hilfe von Fluoreszenz-Färbetechniken unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsorters (FACS) zu isolieren. Zellen, welche aufgrund der Bindung des Antikörpers W5 gefärbt wurden, wurden durch Analyse der Zellen mit Hilfe des FACS aussortiert und die leuchtendsten Zellen wurden unter sterilen Bedingungen gesammelt (etwa 10% von 100-500,000 Zellen). Die Zellinie W5-6 (Klon 6) wurde durch limitierende Verdünnungsanalyse der Zellen W5S2 abgeleitet, eine Zellpopulation, die man durch zweimaliges Sortieren von Zellen er hielt, die von Calu-1-Zellen abgeleitet waren, welche nach Bindung des Antikörpers W5 gefärbt wurden. Die Zellinie US5 wurde abgeleitet aus unsortierten Calu-1-Zellen (nicht angereichert). Die Zellinie W5-6 zeigte eine erhöhte Bindungsrate für die Antikörper W1, W5 und W9 im Vergleich zur Fähigkeit der parentalen Calu-1-Population, diese Antikörper zu binden. Die hierin beschriebene Zellinie W5-6 ist somit in bezug auf das Mucinantigen angereichert. Im Gegensatz dazu zeigte die Zellinie US5 eine stark verringerte Bindung der Antikörper W1, W5 und W9 in Vergleich zu W5-6 oder zur parentalen Calu-1-Population. Die hierin beschriebene Zellinie W5-6 wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. CRL 9267 hinterlegt. Die US5-Zellen wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Immunogen in einem Versuch verwendet, um Mäuse gegenüber nicht-Mucinantigenen tolerant zu machen und um die Reaktivität der hierin produzierten monoklonalen Antikörper gegen Mucinantigene zu erhöhen.
MCF-7, eine Brustkarzinom-Zellinie, wurde von Dr. Marc Lippman (National Institute of Health, Bethesda, MD) bezogen und verwendet, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, welche mit Brustgewebe-assoziierten Mucinantigenen reagierten.
Monoklonale Antikörper
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen neuen monoklonalen Antikörpern, wurden bereits früher beschriebene monoklonale Antikörper in den folgenden Verfahren zu Vergleichszwecken mit den neuen monoklonalen Antikörpern verwendet. Diese Antikörper wurden aufgrund ihrer Variabilität und ihrer bereits früher gezeigten Reaktivität mit Mucinen aus Brusttumor oder anderen malignen Geweben ausgewählt. Diese Antikörper sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
TABELLE 2 Bekannte Monoklonale Antikörper
Die Antikörper W1 und W9 (Linsley et al, Cancer Research, oben; und früher bezeichnet als 2G3 und 245E7 von Frankel et al, J. Biol. Response Modifiers, 4, S. 273–286 (1985) wurden von Dr. David Ring (Cetus Corporation, Emeryville, CA) bezogen. Die Antikörper HMFC-1 und HMFG-2 (Taylor-Papadimitriou et al, Int. J. Cancer, 28, S. 17 (1981) wurden bezogen von Unipath Limited (Bedford, England). Die Antikörper B72.3 (Colcher et al, PNAS (USA9 78, S. 3199 (1981)) und DUPAN-2 (Methgar et al, PNAS (USA), 81, S. 5242 (1984)) wurden von Dr. Jeffrey Schlom (NIH) bzw. Richard Metzgar (Duke University, Raleigh, NC) bezogen. Der Antikörper CA 19-9 (Koprowski et al, Somatic Cell Genetics, 5, S. 957 (1979)), der Antikörper CO-51.4 (Blaszczyk et al, Hybridoma, 2, S. 240 (1983)) und der Antikörper CO-30.1 (Id.) wurden von der ATCC bezogen. Die Antikörper L15 und L17 (Hellstrom et al, Cancer Research 46, S. 3917–3923 (1986) wurden von Dr. I. Hellstrom (Oncogen, Seattle, WA) bereitgestellt. Der Antikörper C6 (Fenderson et al, Mol. Immunology, 23, S. 747 (1986)) wurde von Dr. Bruce Fenderson und Dr. S. Hakomori (Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC), Seattle WA) bereitggestellt. Der Antikörper DF3 wurde von Dr. D. Jufe (Harvard University, Cam bridge, MA) bezogen.
Die Antikörper B72.3 und DUPAN-2 wurden in Form von Ascites-Flüssigkeit verwendet. Die Antikörper CA 19-9 und C6 wurden in Form von Kulturüberständen verwendet. Sämtliche anderen Antikörper wurden aus Ascites-Flüssigkeit isoliert.
Neue monoklonale Antikörper
Neue Hybridome, welche monoklonale Antikörper produzierten, die mit gereinigten Mucinen reagierten und wenigstens einen Antikörper produzierten, der vorzugsweise Tumor-abgeleitete Mucine erkannte, wurden unter Verwendung mehrerer Immunisierungsprotokollen und Screening-Verfahren, die im folgenden beschrieben werden, hergestellt.
Die zur Immunisierung verwendeten Mäuse wurden bezogen von FHCRC oder Jackson Laboratories, Bar Harbour, Maine. Nach intraperitonialer (i.p.) oder subkutaner (s.c.) Immunisierung mit MFGM, MCF-7, W5-6-Zellen, US-5-Zellen oder gereinigten Mucinen, wie im folgenden beschrieben, erhielten die Mäuse Booster-Injektionen und drei Tage nach der Booster-Injektion wurde die Milz der Mäuse entfernt. Milzzellen wurden isoliert und mit NS-1-Myelomzellen (Genetic Systems, Seattle, WA) mit Hilfe bekannter Fusionsverfahren zu Hybridomen fusioniert. Sämtliche Hybridome wurde durch limitierende Verdünnung kloniert. In einigen Fällen wurde eine Subklonierung durchgeführt, um stabilere Hybridomzellen zu erhalten. Die Hybridome wurden bei der ATCC hinterlegt. Ihnen wurden die in folgender Tabelle 3 gezeigten Hinterlegungsnummern zugeordnet.
Immunisierungsprotokolle
Hybridome, welche den monoklonalen Antikörper Onc-M8 produzieren
Balb/c Mäuse wurden i.p. und s.c. mit einer Injektion von 225 μg MFGM in kompletten Freund'schem Adjuvans (CFA) immunisiert. Zwei Wochen später wurden 270 μg MFGM ohne Adjuvants i.p. injiziert. Zwanzig Tage später wurden 135 μg MFGM mit inkomplettem Freund'schem Adjuvans (IFA) s.c. injiziert. Zwei Monate später wurden 200 μg MFGM ohne Adjuvans i.p. injiziert. Die immunisierten Mäuse erhielten eine Booster-Injektion mit 900 Einheiten gereinigtem Milchmucin i.p. acht Tage später.
Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper Onc-M10, Onc-M11, Onc-M12 und Onc-M15 produzieren
Balb/c-Mäuse wurden mit 1.2 × 10⁷ MCF-7-Zellen unter Verwendung von CFA i.p. immuniziert. 28 Tage später wurden 1.2 × 10⁷ MCF-7-Zellen ohne Adjuvans i.p. injiziert. 14 Tage später wurden 1,3 × 10⁷ MCF-7-Zellen i.p, ohne Adjuvans injiziert. 24 Tage später wurden 1,2 × 10⁷ MCF-7-Zellen ohne Adjuvans i.p. injiziert. Die immunisierten Mäuse erhielten vor der Fusion etwa 4 Monate später eine Booster-Injektion von 4 × 10⁶ MCF-7-Zellen und 100 μg MFGM i.p.
Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper Onc-M16. Onc-M21 und Onc-M25 produzieren
(C57-B1/6 × Balb/c)F1 Hybridmäuse (Onc-M16 und Onc-M25 wurden aus derselben Maus erhalten; Onc-M21 wurde aus einer getrennt immunisierten Maus erhalten) wurden i.p. und s.c. mit 10⁷ W5-6-Zellen (Oncogen, Seattle, WA) ohne Adjuvans immunisiert. 17 Tage später erfolgte die i.p. und s.c. Verabreichung einer Injektion von 5 × 10⁶ W5-6-Zellen ohne Adjuvans. Anschließend wurden 33 Tage später 5 × 10⁶ W5-6 Zellen i.p. und s.c. ohne Adjuvans injiziert. Die Mäuse erhielten eine Booster-Injektion von 10⁷ MCF-7-Zellen und 100 μg MFGM ohne Adjuvans i.p. 34 Tage nach der letzten Injektion.
Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper Onc-M22 und Onc-M23 produzieren
Balb/c-Mäuse wurden i.p. mit 6,5 × 10⁶ MCF-7-Zellen unter Verwendung von CFA immunisiert. 20 Tage später wurden 3,5 × 10⁶ MCF-7-Zellen i.p. unter Verwendung von IFA und 125 μg MFGM injiziert. 18 Tage später wurden 5 × 10⁶ MCF-7-Zellen ohne Adjuvans i.p. injiziert. Die immunisierten Mäuse erhielten vor der Fusion eine Booster-Injektion mit 160 μg MFGM-Zellen i.p.
Hybridome, welche den monoklonalen Antikörper Onc-M26 produzieren
Balb/c-Mäuse wurden i.p. mit 250 Einheiten Pleuraexsudat- Mucin (CsCl-Gradient) immunisiert und 25 Tage später mit 150 Einheiten affinitätsgereinigtem Pleuraexsudat-Mucin aus einem Patienten mit Brustkrebs (Probe Nr. H3300) i.p. und s.c. immunisiert. Zusätzlich erfolgte eine s.c. Injektion von 8 × 10⁶ W5-6-Zellen 33 Tage nach den ersten beiden Pleuraexsudat-Injektionen. CFA wurde bei der ersten Injektion von Pleuraexsudat-Mucin verwendet und IFA wurde bei den folgenden Injektionen von Pleuraexsudat-Mucin verwendet. Kein Adjuvans wurde für die Injektion von W5-6-Zellen verwendet. Die immunisierten Mäuse erhielten 30 Tage später eine Booster-Injektion mit 1000 Einheiten eines mit Hilfe eines SDS-PAGE-Gels gereinigten Pleuraexsudat-Mucins i.p. (die Mucinbande wurde aus dem Polyacrylamidgel zur Injektion herausgeschnitten) zusammen mit IFA. Anschließend wurden 24 Tage später 500 Einheiten von CsCl-Gradient-Mucin, gefolgt von 1000 Einheiten CsCl-gereinigtem Mucin 25 Tage später i.p. verabreicht.
Hybridom, das den monoklonalen Antikörper Onc-M27 produziert
NZB-Mäuse wurde i.p. und s.c. ohne Adjuvans mit drei Injektionen von 8,5 × 10⁶ bis 10⁷ W5-6-Zellen in dreiwöchigem Abstand immuniziert. Eine Booster-Injektion von 3 × 10⁶ W5-6-Zellen und 200 μg MFGM wurde 23 Tage später i.p. und s.c. ohne Adjuvans verabreicht.
Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper Onc-M29 und Onc-M30 produzieren
Neonatale Balb/c-Mäuse (von Balc/b-Mäusen, bezogen von FHCRC) wurden ohne Adjuvans mit einer Injektion von 10⁷ US-5-Zellen i.p. immunisiert. Anschließend erfolgten drei Injektionen von 10⁷ bis 2 × 10⁷ W5-6-Zellen i.p. ohne Adjuvans in einwöchigem Abstand zwischen jeder Injektion, gefolgt von einer i.p. Injektion von 10⁷ W5-6-Zellen ohne Adjuvans zweieinhalb Monate später und 310 Einheiten CsCl-Gradient-gereinigtem Milch-Mucin s.c. 55 Tage später erfolgte eine Booster-Injektion von 5 × 10⁶ W5-6-Zellen und 1000 Einheiten von CsCl-Grandient-gereinigtem Milch-Mucin i.p. und s.c. vor der Fusion.
Hybridom, welches den monoklonalen Antikörper Onc-M38 produziert
Balb/c-Mäuse wurde dreimal in dreiwöchigen Intervallen mit 800 Einheiten affinitätsgereinigtem Pleuraexsudat-Mucin aus einem Patienten mit Brustkrebs (Probe Nr. H3415) s.c. immunisiert. Das Mucin war vor der Injektion in die Mäuse an Poly-L-lysinbeschichteten Silica-Kügelchen (O,007 μ, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gebunden worden. 18 Tage nach der dritten Immunisierung mit affinitätsgereinigtem Exsudat-Mucin erhielten die Mäuse eine Booster-Injektion mit 4000 Einheiten affinitätsgereinigtem Mucin i.p. verabreicht.
Die Hybridome, welche diese neuen monoklonalen Antikörper produzieren, sind in Tabelle 3 aufgelistet und bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA 20851 hinterlegt. Die Immunisierungsprotokolle für die neuen Antikörper, die hierin entwickelt und oben beschrieben wurden, sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Außerdem sind die hinterlegten Hybridom-Zellinien und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper in Tabelle 3 angegeben.
TABELLE 3 BESCHREIBUNG DER NEUN ANTIKÖRPER
Screening
Verschiedene Screening-Verfahren wurden zur Isolierung von Hybridomen verwendet, welche monoklonale Antikörper produzierten, die zur Bindung an gereinigte Mucinantigene befähigt sind. Zur Detektion von Antikörpern, die in Hybridom-Überständen vorliegen und die zur Bindung an wie oben beschrieben erhaltene, gereinigte Mucine befähigt sind, wurde ein WGA-Einfangtest entwickelt. Bei diesem Verfahren wurden gereinigte Mucine aus Pleuraexsudat oder Milch auf Polystyrol-Microtiterplatten (96 Vertiefungen, Flachboden) (Immulon II, Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) unter Verwendung von Tritium vulgaris Lectin (Weizenkeimagglutinin "WGA" von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) immobilisiert. Die Microtiterplatten wurden durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung einer 20 μg/ml Lösung von WGA in 50 mM Tris-HCl, enthaltend CaCl₂ und 10 mM MgCl₂ bei pH 8,0, präpariert. Nach 2-stündiger Inkubation bei 25°C zur Beschichtung der Platten mit WGA wurde die Lösung abgesaugt. Nach Affinitätschromatographie wurden gereinigte Mucine (1,0 Inhibitoreinheiten (Inhibition der Bindung des Antikörpers W1 an das Antigen W1) pro Vertiefung, wenn keine anderen Angaben gemacht werden) in 50 mM Tris-HCl bei pH 8, enthaltend 1 mM CaCl2 und 1 mM MgCl2, zugegeben. Die Platten wurden anschließend über einen Zeitraum von 1 bis 4 Stunden bei 25°C inkubiert und unter Verwendung von gepufferter PBS und 2% FCS gewaschen.
Zur Durchführung des Tests wurden bereits früher identifizierte monoklonale Antikörper in Sättigungskonzentrationen (1 μg/ml) im Falle von gereinigten Antikörpern oder als 1:50-Verdünnung bei Ascitesflüssigkeiten zugesetzt. Für Tests mit neuen Antikörpern wurden Überstände aus Hybridomkulturen in unverdünnter Form den Platten zugesetzt.
Die Leistungsfähigkeit des WGA Assays wurde mit steigenden Mengen an gereinigter Milch und Mucin-Exsudat in einem in 4 gezeigten Experiment getestet. Dosis-Ansprechkurven für die Bindung eines W1-Antikörpers verliefen sowohl für Milch- als auch für vom Tumorpool abgeleiteten Mucine über einen Bereich von mehr als 10 Inhibitor-Einheiten/Vertiefung linear, wobei jedoch die Kurve für die Tumor-Probe steiler und nach rechts verschoben war. Weitere getestete Antikörper zeigten Dosis-Ansprechkurven welche parallel zu den Kurven für die W1-Antikörper verliefen, deren relative Positionen jedoch in Abhängigkeit von der speziellen Mucinquelle verschoben waren. Diese Resultate zeigen, daß Epitope, die von den Antikörpers erkannt werden, auf Mucinen von normalen und Tumorquellen in verschiedener relativer Dichte exprimiert werden.
Ein indirekter Enzymimmunoassay (ELISA) wurde verwendet, um die Antikörperbindung an gereinigte Mucinantigene, die mit Hilfe von WGA immobilisiert worden waren, zu detektieren. (Dieses Verfahren wird im weiteren als "WGA-Einfanganalyse" bezeichnet.) Kurz gesagt, die Bindung der wie oben beschrieben hergestellten, neuen monoklonalen Antikörper durch die Zugabe von Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugiertem Ziege-Anti-Maus-Immunoglobulin (CAPPEL, Melvern, PA) (HRP) oder mit Hilfe von IgG-spezifischen Ziege-Anti-Maus-Antikörpern (Southern Biotek, Birmingham, AL) gemessen, um die Anzahl von erhaltenem IgM-Antikörpern zu reduzieren.
Zum vorläufigen Screenen der Onc-M8-Hybridomzellen wurden die Überstände 9 Tage nach Fusion an die Bindung an gereinigtes Pleuraexsudatmucin getestet, wobei die oben beschriebene WGA-Einfanganalyse verwendet wurde. Für die Hybridomzellen, deren Test auf Bindung positiv war, wurde eine zweite Kompetitionsbindungsanalyse durchgeführt, wobei Pools von normalem und Tumorserum verwendet wurden.
Die Onc-M10, Onc-M11, Onc-M12 und Onc-M15 Hybridomzellüberstände wurden zuerst gescreent, indem in einer ELISA-Analyse auf die Bindung an lebende (nicht fixierte) MCF-7-Zellen getestet wurde. Für Hybridomzellüberstände mit positiven Test wurden zwei Sekundär-Screening-Verfahren durchgeführt. Zuerst wurde eine Kompetitionsbindungsanalyse unter Verwendung von lebenden MCF-7-Zellen ausgeführt, in der jeder Hybridomzellüberstand auf Antikörper mit der Fähigkeit, an diese Zellen zu binden, getestet wurde. Zweitens wurden die Überstände gescreent, um die Bindung an gereinigtes Milchmucin, welches unter Verwendung von Polylysin an Platten gebunden war, zu detektieren.
Zum vorläufigen Screening der Onc-M16 und Onc-M25-Hybridomzellen wurden die Überstände aus der Fusion von Myelomzellen mit Milzzellen immunisierter Mäuse auf die Bindung an Paraformalde hyd-fixierter W5-6-Zellen getestet. Die Bindungsanalyse wurde auf Paraformaldehyd-fixierten Zelleinzelschichten durchgeführt, wie von Linsley et al in Biochemistry, oben, beschrieben. Für Hybridomzellen mit einem positiven Test wurde ein zweites Screening-Verfahren durchgeführt, in dem das Fluoreszenzfärbemuster für die Bindung von Antikörpern an Calu-1-Zellen beobachtet wurde.
Die Onc-M2l-Hybridomzelle wurde vorläufig gescreent, indem auf die Bindung an Polylysin-fixierte MFGM unter Verwendung des ELISA-Assays getestet wurde. Für Hybridomzellen mit positivem Test wurde ein zweites Screening-Verfahren durchgeführt, wobei die WGA-Einfanganalyse verwendet wurde, um Bindung unter Verwendung von normalen und Tumorseren zu detektieren.
Für die Onc-M22- und Onc-M23-Hybridomzellen wurden die Überstände aus der Fusion von Myelomzellen mit Milzzellen immunisierter Mäuse 11 und 13 Tage nach der Fusion vorläufig gescreent. Die WGA-Einfanganalyse wurde verwendet, um in dem Hybridomzellüberstand vorhandene Antikörper, die in der Lage sind, bevorzugter an Tumor- als an Normalserumproben zu binden, zu detektieren.
Für die Onc-M26-Hybridomzelle wurde der Überstand aus der Fusion von Myelomzellen mit Milzzellen immunisierter Mäuse 7 Tage nach der Fusion durch Bindung an gereinigtes Pleuraexsudatmucin, welches durch Lectin abgefangen wurde, unter Verwendungder WGA-Bindungsanalyse vorläufig getestet. Falls eine Bindung detektiert wurde, wurde dann die WGA-ELISA-Analyse verwendet, um die Bindungsfähigkeit des Hybridomzellüberstandes an WGA-abgefangenes Mucin im Serum von Tumor-Patienten mit Tumoren gegenüber Normalserum zu vergleichen.
Die Onc-M27-, Onc-M29- und 0nc-M30-Hybridomzellüberstände wurden 7 Tage nach Fusion durch Bindung an CsCl-gereinigtem Milchmucin getestet, welches, wie oben beschrieben, unter Verwendung der WGA-Einfanganalyse erhalten wurde. Die Hybridomzellüberstände mit positivem Test wurden noch einmal auf die Affinität zu gereinigtem Milchmucin unter Verwendung des WGA-ELISA-Tests analysiert. Die Hybridomzellüberstände wurden auch gescreent, indem die Bindung an IgG- und IgM-spezifischer Ziege-Anti-Maus-Antikörper vergleichen wurde; diejenigen, die sich als spezifisch für IgG herausstellten, wurden im allgemeinen für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
Der Onc-M38-Hybridomzellüberstand wurde auf die Anwesenheit von Antikörper durch Bindung an gradientengereinigtes, durch Lectin abgefangenes Pleuraexsudatmucin unter Verwendung der WGA-Bindungsanalyse gescreent. Die Hybridomzellüberstände mit positivem Test wurden noch einmal in der WGA-Bindungsanalyse unter Verwendung von gradienten- und affinitätsgereinigtem Pleuraexsudatmucin getestet.
Hybridomzellüberstände, die monoklonale Antikörper produzieren, welche an Mucinantigene (gereinigtes oder Zell-assoziiertes Antigen) wie oben beschrieben banden, wurden in Pristansensibilisierte Mäuse injiziert, um die Ascitesflüssigkeit herzustellen, aus der die monoklonalen Antikörper unter Verwendung von bekannten Reinigungsverfahren isoliert wurden. Nach Ammoniumsulfatfällung wurden die IgG-Antikörper durch Ionenaustausch auf DEAE-Sephacel-Säulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt und der IgM-Antikörper (M26) unter Verwendung von Größenfaktionierung auf einer Sephacryl S-300-Säule (Pharmacia) gereinigt. Die Isotyp-Bestimmung (Immunglobulinunterklassen der Antikörper) von gereinigten Antikörpern erfolgte durch einen Enzymimmunoassay (unten beschrieben) unter Verwendung von Klassen-spezifischen Antikörpern (Southern Biotek).
Beispiel III
Charakterisierung von neuen monoklonalen Antikörpern
Die wie oben isolierten, neuen Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit getestet, an alle gereinigten Mucine unter Verwendung der oben beschriebenen WGA-Bindungsanalyse zu binden. Eine Einzel-Konzentration von 1,5 inhibitorischen Einheiten des Antigens wurde pro Vertiefung verwendet und Sättigungskonzentrationen des Antikörpers (1 μg/ml) wurden benutzt. Die Substratinkubation wurde beendet, wenn die maximalen O.D.-Werte für jede Probe im Bereich von 0,4 bis 1,4 lagen.
Mehrere zusätzliche Verfahren wurden verwendet, um zu zeigen, daß die neuen Antikörper das Mucinantigen, welches auch den W1-Antikörper band, erkannten. Diese Verfahren waren die Immun präzipitation (IP) von Tumorzellextrakten, die entweder mit ³H-Glucosamin oder ³H-Threonin markiert waren; sowie Immunoblots (IB) mit gereinigten Mucinen oder Zellmembranpräparaten, wie von Linsley et al in Biochemistry, 25, S. 2978 (1986) beschrieben wurde. Ein Doppelbestimmungsimmunoassay (DDIA) wurde auch verwendet, worin die Antikörper auf ihre Fähigkeit getestet wurden, Mucine abzufangen, welche an HRP-konjugierten W1-Antikörper (Tabelle 3) banden.
Die neuen Antikörper wurden auch auf Bindung an Paraformaldehyd-fixierten, kultivierten, W5-6 Zellinien getestet, wie von Linsley et al, Biochemistry, 25, S. 2978 (1986) beschrieben wurde.
ERGEBNISSE
Antikörperbindung an gereinigtes Mucinantigen
Die hier hergestellten, monoklonalen Antikörper reagieren mit Mucinen aus menschlicher Milch, Tumorzellinien, Pleuraexsudat und Tumoren, wie durch die WGA-Bindungsanalyse und die DDIA-Bindungsanalysen oben beschrieben, bestimmt wurde. Die meisten der hier beschriebenen, neuen Antikörper reagierten mit Mucinen, wie unter Verwendung von mehr als einem Verfahren bestimmt wurde; allerdings wurde für den Antikörper Onc-M30 allein das DDIA-Verfahren verwendet. Da die gereinigten Mucine das W1-Epitop enthalten (siehe Tabelle 4) reagieren somit die neuen Antikörper entweder mit dem W1-Epitop oder mit scheinbar neuen Epitopen auf den Mucinantigenen. Diese Antikörper können auch an zusätzliche Epitope auf Mucinantigenen bilden, wie die T- und Tn-Epitope.
TABELLE 4 ANTIKÖRPERBINDUNG AN GEREINIGTE MUCINE¹ MUCINQUELLE: BRUSTTUMORE
Wie aus Tabelle 4 entnommen werden kann, lieferten einige monoklonale Antikörper (Onc-M8, Onc-16, W1 und W9) hohe Extinktionswerte (≥ 0,1), wobei sie an die Mehrzahl der Proben von Milch- und Tumorquellen banden; bestimmte Antikörper (Onc-M15, Onc-M22, Onc-M23, Onc-M25 und Onc-M27, HMFG-1 und HMFG-2 lieferten hohe Extinktionswerte (≥ 0,1), wobei sie an die Mehrzahl von Milchmucinen aber nicht an die Tumor-abgeleiteten Proben banden; und andere Antikörper (Onc-M10, Onc-M11, Onc-M12, Onc-M21, Onc-M29, Onc-30 und B72.3 DUPAN-2, CA19-9) lieferten Extinktionswerte < 0,1, wobei sie nicht an die Mehrzahl Proben von Milch- oder von Tumorquellen banden. Der Antikörper Onc-M26 band stark an Pleuraexsudatmucin (Probe H3300), jedoch schwach an alle von Milch abgeleiteten Mucinproben. Obwohl bestimmte Antikörper nicht signifikant an Pleuraexsudat- oder Brusttumormucine in der direkten Bindungsanalyse banden, ist zu beachten, daß die Bindung von allen Antikörpern an Mucinepitope auf der Pleuraexsudatmucinprobe H3300 durch den sensitiveren DDIA detektiert wurde. Onc-M38 wurde in dieser Analyse nicht getestet, gab aber in einem gesonderten Experiment hohe Extinktionswerte für die Bindung sowohl an Milch- als auch an Exsudatmucin.
Es wurde gefunden, daß die aus Milch von verschiedenen Spendern gereinigten Mucine ähnliche Antigen-Eigenschaften aufwiesen, was darauf schließen läßt, daß die getesteten Antikörper keine polymorphen Antigen-Determinanten, wie die Bluttgruppenantigene (z.B. ABO und Lewis), detektieren. Obwohl 80% der Bevölkerung Lewis-positiv sind (und es wurde durch einen Speicheltest gezeigt, daß zwei der Milchspender, 1 und 7, Lewis-positiv waren) besaß keines der von Tumor abstammenden Mucine Lewisantigen-Spiegel, die durch die Bindungsanalyse detektierbar waren. Keine der Milchmucinpräparationen (einschließlich der Proben 1 und 7) besaßen detektierbaren Lewis b (Antikörper CO-30.1)- oder Lewis y (Antikörper L15)-Spiegel, während drei von ihnen (einschließlich der Proben 1 und 7) detektierbare, wenn auch niedrige Lewis a (Antikörper CO 51.4)- und Lewis x (Antikörper L17)-Spiegel besaßen. Dies läßt darauf schließen, daß die Lewis Antigene nur schwach in Milchmucinen, und sehr wenig, wenn überhaupt, in den Mucinen aus Brustkarzinomen exprimiert werden. Dagegen sind diese Epitope auf Mucinantigenen von Dickdarmkar zinomen detektiert worden. Magnani et al, Cancer Research, 43, S. 5489 (1983) und Johnson et al, Cancer Research, 46, S. 850 (1986) .
Im Vergleich zu den Milchmucinen, wiesen die Tumorabgeleiteten Mucine recht unterschiedliche Antikörperbindungprofile auf. Die Daten lassen darauf schließen, daß monoklonale Antikörper, die neue Mucinepitope erkennen, unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert wurden. W1-Antikörper banden an alle Tumor-abgeleiteten Proben in relativ höherem Maße als die anderen getesteten Antikörper, d.h. relativ zu W1 war die Bindung aller anderen Antikörper reduziert.
Einer der hier beschriebenen, neuen Antikörper, Onc-M26, welcher von die Hybridomzellinie ATCC Nr. HB9212 produziert wird, detektierte das "tumorspezifischste" Epitop. Dieses Epitop wurde auch auf den anderen Tumor-abgeleiteten Proben detektiert, wenn höhere Mucin-Konzentrationen in der Analyse verwendet wurden, jedoch in viel geringerem Ausmaß auf Mucinen aus Milchproben. Onc-M26 gibt also Aussicht auf einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, zwischen der Anwesenheit von normalen und Krebsgewebe-assoziierten Mucinen im Serum von menschlichen Personen analytisch zu unterscheiden, um Krebs zu detektieren.
Diese Daten belegen, daß die Spezifität der meisten neuen Antikörper von jener der früher beschriebenen Antikörpern verschieden ist. Allerdings konnten die Epitope auf den Antikörpern Onc-M21 und Onc-M29 nicht von jenen anderer Antikörper, wie B72.3 und DUPAN 2, aufgrund dieser Daten unterschieden werden, weil sie in der Analyse nicht signifikant an die gereinigten Mucinquellen banden. Die W5-6-Zellbindungsexperimente zeigten, daß Onc-M21 und Onc-M29 vorzugsweise im Vergleich zu den bekannten Antikörpern an die W5-6-Zellinie banden, wodurch die einzigartige Spezifität dieser Antikörper demonstriert wurde.
Diese Resultuate zeigen, daß sich die von Tumorquellen abstammenden, gereinigten Mucine unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren immunologisch von in Milch vorhandenen Mucinen aus normalem Brustepithel unterscheiden. Diese Daten lassen auch darauf schließen, daß die auf Mucinen aus normalem Brustepithelgewebe vorhandenen Antigen-Epitope durch andere Determinanten maskiert werden können, oder auf aus Tumoren erhal tenen Mucinen in verringerter Menge vorhanden sein können. Dies wiederum weist darauf hin, daß Tumormucine Epitope enthalten können, die nicht auf Mucinen aus normalen Quellen gefunden werden. Deshalb können gereinigte Mucine, einschließlich der Tumorabgeleiteten Mucine, ein verbessertes Immunogen zur Entwicklung von monoklonalen Antikörpern darstellen, die in der Lage sind, Mucinantigene zu erkennen, insbesondere jene Antikörper, die in der Lage sind, verglichen mit Mucinen aus normalen Quellen, vorzugsweise mit von Tumor abstammenden Mucinen zu reagieren.
BEISPIEL IV
Serumanalyse unter Verwendung der monoklonalen Antikörper M26 und M29
Um die Brauchbarkeit der hier beschriebenen Antikörper zu zeigen, wurde ein DDIA unter Verwendung der monoklonalen Antikörper Onc-M26 und Onc-M29 durchgeführt, welche, wie in Beispiel II beschrieben, erhalten wurden. Der W1-Antikörper wurde als Vergleich verwendet.
Immulon-II-Platten wurden mit 50 μl/Vertiefung (10 μg/ml) Onc-M26- oder 0nc-M29-Antikörper in 50 mM Tris-Puffer bei pH 8,0 1 Stunden inkubiert, um die Platten mit Antikörper zu beschichten ("Einfangantikörper"). Die Platten wurden dann abgesaugt und unter Verwendung 350 μl/Vertiefung Blockierungspuffer (0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 5% Sucrose und Tris-Puffer) zwischen 1 Stunde und einer Nacht blockiert. Die Platten wurden dann wieder abgesaugt und unter Verwendung von Papier über Nacht geblottet. Die Platten wurden trocken in einem Plastikumschlag bei Raumtemperatur gelagert. Seren, die von Patienten abstammen, bei denen Krebs diagnostiziert worden war, und Kontrollseren (von normalen Patienten) wurden unter Verwendung von fetalem Kälberserum (FCS) verdünnt. Wenn die Analyse unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Onc-M26 und des Antikörpers W1 zur Detektierung des Antikörpereinfangs ausgeführt wurde, wurden sowohl Serum als auch Kontrollen in einem Verhältnis von 1:8 verdünnt. Für die Analyse unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers M29 und des Antikörpers W1 wurden Serum und Kontrollen in einem Verhältnis von 1:50 verdünnt. Die Extinktionsstandards für den monoklo nalen Antikörper Onc-M26 wurden hergestellt, indem eine Pleuraexsudatprobe (Nr. H3375), die wie oben beschrieben hergestellt wurde, volumetrisch in einem Gemisch gepoolter Seren und FCS verdünnt wurde. Extinktionsstandards für den Onc-M29-Antikörper wurden hergestellt, indem die Probe Nr. H3375 in FCS verdünnt wurde. Die Extinktionsstandards wurden kalibriert, indem den gesammelten Seren ein Wert von 20 Extinktionseinheiten pro ml zugeordnet wurden. Die Kontrollen bestanden aus gepoolten Seren von Oncogenen-Angestellten und aus zwei Brust-Pleura-Mischungen. Sowohl die Standards als auch die Kontrollen wurden portioniert und bei –70°C gelagert.
50 μl der verdünnten Seren, Kontrollen und Standards wurden auf zweifach beschichteten Vertiefungen pipettiert. Die Platten wurden mit Plattenversiegeler verschlossen und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Die Platten wurden manuell unter Verwendung von 2%-igem FCS in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zweimal ausgespült. 50 μl einer geeigneten Verdünnung des HRP-konjugierten Antikörpers W1 wurde zu den Platten gegeben. Für die M26-Analyse wurde eine Konzentration von 0,5 μg/ml von W1-HRP verwendet. Es wurde gefunden, daß für die M29-Analyse 0,1 μg/ml des W1-HRP-Konjugats ein optimaler Wert war. Alle Konjugate wurden in 2% FCS und PBS verdünnt. Die Platten wurden dann wieder verschlossen und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden darauf dreimal unter Verwendung von PBS-Puffer manuell ausgespült. 100 μl des OPD-Substrats wurden zu den Platten gegeben, welche dann im Dunkeln 1 Stunde inkubiert wurden. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 50 μl einer 1,5 N Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktion bei 490 nm wurde abgelesen. Duplikate, die mehr als 10 Einheiten/ml auseinander lagen (oder zwei Einheiten/ml, falls weniger als 10 Einheiten/ml) wurden wiederholt. Proben, die hohe Resultate ergaben, wurden verdünnt und noch einmal getestet. Die Analysen wurden in bezug auf ihre Fähigkeit, zwischen den beiden Gruppen von Patienten (mit und ohne Krebs) zu unterscheiden, vergleichen. Cutoff-Werte (Einheiten/ml) wurden ausgewählt, um ungefähr 90%-ige Spezifität (d.h. 90% der Kontrollgruppe mit negativem Test), zu ergeben. Die Resultate sind in Tabelle 5 dargestellt.
TABELLE 5 Serumanalyse % über dem Cutoff
Tabelle 5 zeigt die Resultate des DDIA-Assays unter Verwendung von Seren von Krebspatienten mit dem monoklonalen Antikörper W1 und den monoklonalen Antikörpern Onc-M26 und Onc-M29. Die Testspalte zeigt an, welche monoklonalen Antikörper mit dem mo noklonalen Antikörper W1 im DDIA, wie oben beschrieben, verwendet werden. Im W1-Test (homologer DDIA) wurde der monoklonale Antikörper W1 als Einfangantikörper immobilisiert, um das im Serum einer menschlichen Person vorhandene Mucinantigen zu binden. Der in diesen Test verwendete zweite Nachweis-Antikörper war der HRP konjugierte Antikörper W1. Im M26-Test wurde Onc-M26 als immobilisierter Antikörper und im M29-Test wurde Onc-M29 als immobilisierter Antikörper verwendet. Die der Antikörperbezeichnung folgenden Ziffern in der Cutoff-Spalte zeigen den Antigenspiegel in Einheiten/ml an, bei dessen Überschreiten die Analyse als positiv in bezug auf die Anwesenheit von Tumorassoziiertem Mucin eingestuft wurde. Die Spalten 0 bis 6 zeigen den Prozentsatz von Patienten des jeweiligen Krebstyps an, für die ein W1-Epitopspiegel über dem in der Cutoff-Spalte angezeigten Spiegel gefunden wurde, was unter Verwendung der angegebenen Antikörper bestimmt wurde. Die Kontrollspalte gibt den Prozentsatz an Analysen von Kontrollsera (von Patienten ohne Krebs) mit positiver Reaktion an (d.h. Nachweis des in der Cutoff-Spalte angegebenen Antigen-Levels, sogenannte "falsch-positive" Resultate). Die Anzahl von Patienten in jeder Kategorie von Seren (0–6) und die in diesen Patienten vorhandenen Krebsform ist ebenfalls in Tabelle V angegeben. In den Fällen, in denen Onc-M26 der Einfangantikörper war, wurden ungefähr 43% von 116 Patienten, die einen metastasierenden Krebs hatten, mit einem Cutoff-Antigenspiegel von mehr als 95 Einheiten/ml unter Verwendung des Onc-M26-Einfangantikörpers und des W1-Nachweisantikörpers analytisch als Krebs habend identifiziert. Nur 0,5% der Kontrollen wurden fälschlicherweise als Krebs habend detektiert (falsch-positive). Die Verwendung des Antikörpers Onc-M29 ergab 66% korrekt identifizierte Patienten mit 4% falsch-positiver Identifizierung. Bei Verwendung des Antikörpers W1 als primärer und sekundärer Antikörper in der Analyse wurden ungefähr 58% von 116 Patienten als Krebs habend indentifiziert, wobei jedoch 4% falsch-positiv identifiziert wurden.
Die Verwendung des Antikörpers Onc-M29 im DDIA identifiziert somit auf korrekte Art und Weise die Anwesenheit von Krebs in einem größeren Anteil von Krebs-Patienten als der Antikörper W1, was auf eine erhöhte Sensitivität von Onc-29 bei Verwendung als Einfangantikörper im Vergleich zum Antikörper W1 schließen läßt. Die Verwendung des Antikörpers Onc-M26 führt zu einer geringfügig weniger sensitiven Assay als die Verwendung des Antikörpers Onc-M29. Im Vergleich zum Antikörper W1 wird allerdings eine sehr viel geringere Anzahl von falsch-positiven Werten (0,5%) beobachtet. Der Test ist somit spezifischer. Die Bewertung der positiven Resultate für die M26- oder M29-Tests erlaubt eine sensitivere Anzeige des Vorliegens von Krebs, als die Verwendung der Resultate entweder des M26- oder M29-Tests allein (z.B. liegen 75% der Patienten mit metastasierendem Krebs als positiv eingestuft). Diese Resultate zeigen die potentielle Brauchbarkeit der monoklonalen Antikörper Onc-M26 und Onc-M29 zum Nachweis von Krebs in Humanseren.
BEISPIEL V
Kreuzkompetitionsanalyse der Mucinantikörperbindung
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper wurden ferner durch Kreuzkompetitionsstudien charakterisiert, deren Resultate in der folgenden Tabelle 6 angegeben sind. Diese Studien ermittelten die Konzentration von nicht-markiertem Mucinantikörper, die zur halbmaximalen (50%)Inhibierung der Bindung einer Standardkonzentration (0,5 μg/ml) eines ¹²⁵I-markierten Mucinantikörpers führte. Eine Kreuzkompetitionsanalyse wurde zwsichen jedem der in Tabelle 6 angegebenen markierten (¹²⁵I)-Antikörper und jedem der in der oberen Zeile von Tabelle 6 bezeichneten, unmarkierten Antikörper durchgeführt. Die kompetitive Bindung der Antikörper M8, M15, M16, M22, M23, M25, M27, W1, W9 und M38 wurde an Caesiumchlorid-gereinigten, aus Milch stammendem Mucin gemessen, während die Bindung der Antikörper M10, M11 und M12 an die Zellinie MCF7 bestimmt wurde. Die Bindung von Onc-M21 und Onc-M29 wurde für die Zellinie W5-6 bestimmt. Die Bindung eines ¹²⁵I-markierten Antikörpers wurde bei 0,5 μg/ml in Gegenwart steigender Mengen nicht-markierter Antikörper (bis zu 50 μg/ml) gemessen (der Antikörper M26 wurde in diese Analyse nicht einbezogen, da er nach Radiomarkierung schwach an immobilisiertes Mucin band) .
In Tabelle 6 bedeutet die Angabe "++++", daß halbmaximale Inhibition bei einer Konzentration eines unmarkierten Antikörpers von weniger als 3,2 μg/ml erfolgt; die Angabe "+++" bedeutet, daß die zur halbmaximalen Inhibition benötigte Menge von nicht-markiertem Antikörper zwischen 3,2 und 15,8 μg/ml lag; die Angabe "++" bedeutet, daß die zur halbmaximalen Inhibition der Bindung von markiertem Antikörper benötigte Menge von nichtmarkiertem Antikörper zwischen 16 und 31 μg/ml lag; die Angabe "+" bedeutet, daß die zur halbmaximalen Inhibition der Bindung von markiertem Antikörper benötigte Konzentration eines nichtmarkierten Antikörpers zwischen 32 und 50 μg/ml lag; und die Angabe "-" bedeutet, daß die zur halbmaximalen Inhibition der Bindung von markiertem Antikörper benötigte Konzentration von nichtmarkiertem Antikörper größer als 50 μg/ml war.
TABELLE 6 Kreuzkompetitionsanalyse der Mucinantikörperbindung
Wie die in Tabelle 6 angegebenen Resultate der Kreuzkompetitionsanalyse veranschaulichen, zeigen mehrere Antikörper eindeutige Kreuzkompetitions-Muster, was darauf schließen läßt, daß sie an verschiedene Epitope binden. Das eindeutigste Kreuzkompetitions-Muster erhielt man von den Antikörpern M21 und M29, welche gegenseitig um die Bindung konkurrierten, aber nicht mit den anderen getesteten Antikörpern im Wettbewerb standen. Diese Antikörper erkennen daher entweder die gleichen oder räumlich in Beziehung stehenden Epitope, welche sich von denjenigen unterscheiden die durch die anderen Antikörper erkannt werden.
Keiner der anderen Antikörper konkurrierte mit den Antikörpern W1 und M38, jedoch konkurrierten diese wiederum um die Bindung von vieler anderer Antikörper. Dies lässt darauf schließen, daß die Epitope für diese Antikörper verschieden sind, aber entweder sturkturell ähnlich sind oder räumlich in Beziehung stehen zu jenen anderer Antikörper. Mehrere andere Antikörper konkurrierten mit dem Antikörper M10, dieser konkurrierte aber wiederum nur um die Bindung von ¹²⁵I-M10, was darauf schließen läßt, daß auch er an ein anderes Epitop band, welches strukturell oder räumlich in Beziehung zu einem Epitop der Antikörper W1, M8, M16 und M38 stand. Allerdings konkurrierte der Antikörper M10 nicht signifikant um die Bindung des Antikörpers W1, sogar wenn er auf MCF7-Zellen getestet wurde, an welche dieser Antikörper am besten band.
Die übrigen Antikörper zeigten Kreuzkompetitions-Muster, welche auf strukturelle oder räumliche Beziehungen zwischen ihren jeweiligen Epitopen schließen lassen. Zum Beispiel scheinen die Epitope für die Antikörper W9, M8, M16 und M25 in Beziehung zu stehen, genauso wie jene für M11 und M12.
Die Antikörper M16, M22, M23 und M27 zeigten ebenfalls ähnliche Kreuzkompetitions-Muster, obwohl einige Unterschiede beobachtet wurden. Im allgemeinen binden diese Antikörper an Epitope, welche strukturell oder räumlich in Beziehung zueinander zu stehen scheinen. Biochemische Daten lassen darauf schließen, daß diese Antikörper Kernproteinepitope erkennen (siehe unten). Aufgrund von Kreuzkompetitionsdaten stehen die Epitope für diese vier Antikörper zu den Epitopen für den Antikörper W1 in Beziehung, und die Antikörper M22 und M23 stehen ebenfalls in Beziehung zu dem Epitop für M 38.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Kreuzkompetitions-Muster zwischen den neuen Antikörpern und W1 und W9 die Anwesenheit von mehreren Epitopen auf den Mucinmolekülen anzeigen. Die Antikörper M21 und M29 erkennen Epitope, welche entweder identisch oder in enger Beziehung stehen, und welche sich von denen, die durch andere Antikörper erkannt werden, unterscheiden. Alle anderen Antikörper erkennen Epitope, welche strukturelle Merkmale teilen oder sterisch in Beziehung zu den Epitopen für andere Antikörper stehen. Die Antikörper W1, M10 und M38 erkennen Epitope, welche zu jenen anderer Antikörper in Beziehung stehen aber nicht identisch sind. Die Antikörper M11 und M12 erkennen ein in enger Beziehung stehendes Epitop (in enger Beziehung stehende Epitope), welches (welche) auch nicht identisch zu dem ist (sind), das durch andere Antikörper erkannt wird. Der monoklonale Antikörper M38 identifiziert ein neues Epitop, welches nicht durch die anderen neuen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung oder durch die Antikörper W1 oder W9 erkannt wird. Aus dem vorher Gesagten scheint sich zu ergeben, daß der monoklonale Antikörper Onc-M38 hohe Spezifität für ein spezielles Epitop auf den Mucinantigenen aufweist und somit eine wichtige Funktion nicht nur bei Analysen zum Nachweis von Tumoren in Patienten, sondern auch bei der Behandlung solcher Tumoren unter Verwendung der oben diskutierten Techniken und Verfahren erfüllen kann.
Beispiel VI
Biochemische Charakterisierung der Epitope
Um die biochemische Natur der durch die neuen Antikörper erkannten Epitope zu bestimmen, wurden die Effekte verschiedener Behandlungen auf die Antikörperbindung an Mucine untersucht.
Um zu bestimmen, ob die Kohlehydratstrukturen zur Bindung der Antikörper nötig waren, wurden die Effekte der Natriumperiodat-Behandlung auf die Antikörperbindung untersucht (Tabelle 7). Wie oben beschrieben, wurden die Mucine auf Mikrotiterplatten mittels WGA immobilisiert und mit Natriumperiodat (NaIO₄) bei Konzentrationen von 0,2 bis 100 mM in 50 mM Natriumacetat 4,5 (pH) für eine Dauer von 30 Minuten bei 37°C behandelt. Die von Milch 2 abstammende Mucinprobe wurde unter Verwendung des Antikörpers W9 affinitätsgereinigt und die von H3300 abstammende Mucinprobe wurde CsCl-gereinigt. Mucine aus MCF7- und W5-6-Zellmembranen wurden mit einer nichtionischen Detergenslösung (TNEN, Linsley et al., Biochem, 25: 2778–2986 (1986)) solubilisiert und vor der Immobilisierung wurde unlösliches Material durch Zentrifugation (390 000 × gmin) vom Detergens abgetrennt. Die Vertiefungen wurden gründlich mit PBS gewaschen und mit NaBH₄ (100 mM in PBS) weitere 30 Minuten über 37°C behandelt. In den anschließenden Behandlungen wurden die Vertiefungen mit Bindungspuffer, beschrieben von Linsley et al, in Biochem. 25: 2978–2986 (1986), worauf hiermit bezug genommen wird, der 10 FCS enthält, blockiert, und wurden auf Antikörperbindung mittels eines indirekten ELISA-Tests überprüft. Die Konzentration von NaIO₄, die benötigt wurde, um die Bindung um 50 % zu reduzieren, wurde durch Interpolation der ermittelten Werte bestimmt.
Die Bindung eines Kontrollantikörpers (C6) an ein definiertes Kohlehydratepitop (I-Struktur) reagierte empfindlich auf die Periodat-Behandlung, wobei halbmaximale Inhibition der Bindung bei 1 mM erfolgte. Die Antikörper W1 und W9 sowie M26 reagierten empfindlicher auf die Periodat-Behandlung als der Kontrollantikörper; diese Sensitivität von W1 und W9 wurde schon vorher gezeigt, und läßt darauf schließen, daß Kohlehydrate für die Bindung an diese Antikörper erforderlich sind. Fünf weitere Antikörper (M10, M11, M12, M21 und M29) reagierten empfindlich auf Periodat, jedoch waren signifikant höhere Konzentrationen als beim Kontrollantikörper erforderlich. Die übrigen acht Antikörper waren selbst bei extrem hohen Konzentrationen (0.1 M) unempfindlich gegenüber der Periodat-Behandlung. Somit reagierten die Epitope für alle neuen Antikörper außer M26 weniger empfindlich auf die Periodat-Oxydation als diejenigen für die Antikörper W1 und W9 und den Kontrollantikörper C6.
Tabelle 7 Effekte der Periodat-Behandlung auf die Antikörperbindung
Um zu testen, ob Sialinsäure für die Antikörperbindung erforderlich war, wurden die Antikörper auf Sensitivität gegen Neuraminidase in dem in Tabelle 8 zusammengefaßten Experiment getestet. Die Mucine wurden auf Mikrotiterplatten mittels WGA immobilisiert und mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae behandelt, wie von Linsley et al., Cancer Res. 46, oben beschrieben wurde. Neuraminidase (4,5 m Einheiten/Vertiefung) wurde in 150 mM NaCl, 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 und 0,1 % CaCl2 1 Stunde bei 37°C zugegeben. Die Vertiefungen wurden dann mit Bindungspuffer, der 10 % FCS enthielt, blockiert und auf Antikörperbindung mittels eines indirekten ELISA-Tests überprüft.
Tabelle 8 Effekte der Neuraminidase-Behandlung auf die Antikörper-Bindung
Die Bindung des Kontrollantikörpers (C6) wurde in Übereinstimmung mit der bekannten Bindungspräferenz dieses Antikörpers für nicht-sialylhaltige Strukturen durch die Behandlung erhöht. Die Bindung der Antikörper M8, M16, M25, M21, M27 und M29 an Mucine aus H3300 wurde auch durch die Neuraminidase-Behandlung erhöht, was darauf schließen läßt, daß die Epitope dieser Antikörper durch Entfernung der Sialinsäure demaskiert wurde. Dagegen wurde die Bindung derselben Antikörper an Mucine aus Milch durch die Neuraminidase-Behandlung nicht beeinflußt.
Die Bindung der Antikörper W1 und W9 war Neuraminidase-sensitiv, wie vorher gezeigt wurde. Die Bindung des Antikörpers M26 war auch Neuraminidase-sensitiv, was darauf schließen läßt, daß Sialinsäure für die Bindung dieses Antikörpers erforderlich ist. Die Bindung der übrigen sieben Antikörper wurde durch die Neuraminidase-Behandlung nicht beeinflußt.
Da die Epitope der meisten Antikörper nicht Periodat- oder Neuraminidase-empfindlich waren, bestand die Möglichkeit, daß einige von ihnen Kernproteinepitope erkannten. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde die Bindung bestimmter Antikörper an aus Milch gewonnenen Mucinen, welche durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (HF) deglykosyliert worden waren, untersucht. Die aus Milch abgeleiteten Mucine wurden bis zur Homogenität durch Affinitätschromatographie gereinigt, und die Größenausschlußchromatographie wurde wie oben beschrieben durchgeführt. 200 μg des gereinigten Proteins (mittels Aminosäurezusammensetzung bestimmt) wurden unter Verwendung von wasserfreiem Chlorwasserstoff deglykosyliert, wie von Mort und Lamport, in Anal. Biochem. 82 289–309 (1977) beschrieben wurde, worauf hier Bezug genommen wird. Nach 4-stündiger Behandlung bei 23°C wurde die Probe in 50%iger Essigsäure solubilisiert, gegen 20 mM Ammoniumacetat dialysiert und lyophilisiert. Unbehandelte (3 ng Protein/Vertiefung) und deglykosylierte (10 ng/-Vertiefung) Proben wurden direkt an Polystyrol-Mikrotestvertiefungen absorbiert und auf Antikörperbindung mittels eines indirekten ELISA-Tests überprüft.
Um zu bestätigen, daß die Behandlung Oligosaccharide entfernt hatte, wurden die Proben einer Aminosäure- und Hexosaminanalyse (AA Laboratories, Seattle, WA) unterworfen. Obwohl die Aminosäurenzusammensetzung beider Proben identisch war, besaß das HF-behandelte Mucin ein Hexosamingehalt (Glukosamin + Galaktosamin) von weniger als 2 % des Gehaltes von unbehandeltem Mucin. Diese Behandlung führt zur Entfernung von mehr als 98 des N-Acetylglukosamins und N-Acetylgalaktosamins aus dem gereinigten Präparat, aber beeinflußte nicht signifikant seine Aminosäurezusammensetzung.
Tabelle 9 Antikörperbindung an deglykosyliertes Mucin aus Milch
Wie in Tabelle 9 gezeigt ist, hob die Deglykosylierung die Bindung des Kontrollantikörpers und sechs der zehn Antikörper, welche stark an unbehandeltes Mucin banden, auf. Dagegen banden die Antikörper M15, M23 und M27 stark an immobilisiertes deglykosyliertes Mucin, was darauf schließen läßt, daß diese Antikörper an Epitope auf dem Kernprotein binden. Die Bindung des Antikörpers M22 wurde durch HF-Behandlung reduziert, jedoch war die Bindung noch signifikant. Die Antikörper M10, M11, M12, M21 und M29 wurden nicht auf die Bindung an Kernproteinepitope getestet, weil diese Antikörper schwach an Mucine aus Milch banden (Tabelle 4).
Wie in diesem Experiment zu sehen ist, banden mehrere Antikörper (M15, M22, M23 und M27) an Epitope, die gegen die Behandlung mit HF, das den Großteil der Kohlehydrate von dem Kernprotein entfernt, unempfindlich waren. Epitope dieser Antikörper bestehen somit höchstwahrscheinlich natürlicherweise aus Proteinen.
Die obigen Tests zeigen, daß Beziehungen zwischen Epitopen, die von den erfindungsgemäßen Antikörpern auf der Basis von Kreuz-kompetitions-Analysen erkannt wurden, unter dem Aspekt anderer Behandlungen, wie mit Periodat, Neuraminidase und durch Deglykosylierung, betrachtet werden sollten. Die An tikörper W9 und M8 zeigen somit ähnliche Kreuzkompetitionsmuster (Tabelle 6), jedoch können ihre Epitope auf der Basis ihrer Sensitivität gegen Periodat- und Neuraminidase-Behandlung (Tabelle 7 und 8) unterschieden werden.
Beispiel VII
Serumanalyse unter Verwendung der monoklonalen Antikörper M23, M26, M29 und M38
Ein DDIA wurde unter Verwendung der monoklonalen Antikörper Onc-M29 und Onc-M28 sowie Onc-M26 und Onc-M38, die wie in Beispiel II beschrieben erhalten wurden, durchgeführt. Eine homologe Analyse mit Onc-M23 wurde auch durchgeführt. Der kommerzielle Test CA 15-3 (Centocor, Malvern, PA) und eine homologe Analyse mit dem W1-Antikörper wurden zum Vergleich verwendet. Die Analysen wurden unter Verwendung einer Gruppe von Seren, umfassend 72 Proben von Patienten mit metastasierendem Brustkrebs (M) und 94 Proben von Patienten mit gutartiger Brusterkrankung (B), welche auf Antigenspiegel mittels DDIA, wie in Beispiel IV beschrieben, untersucht worden waren, durchgeführt, mit Ausnahme davon, daß der Antikörper Onc-M29 als Einfangantikörper mit Onc-M38 als Nachweisantikörper (M29/M38 "DDIA") und Onc-M26 als Einfangsantikörper mit Onc-M38 als Nachweisantikörper (M26/M38 "DDIA") verwendet wurden. Die Resultate dieser Analysen wurden mit denen der homologen W1-Analyse und mit dem CA15-3-Test in dem in 5 dargestellten Experiment verglichen. Die Analysen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, zwischen den beiden Patientengruppen zu unterscheiden, verglichen, wobei die Cutoff-Werte so gewählt waren, daß sie ungefähr 90%-ige Spezifität (d.h. 90% der Kontrollgruppe als negativ getestet) ergaben.
In 5 sind die erhaltenen Werte so aufgetragen, daß der Median der Kontrollgruppe für jeden Test ungefähr beim zehnten Teil einer linearen Skala mit insgesamt 100 Teilen positioniert wurde. Die gepunkteten Linien stehen für die Werte mit 90% Spezifität für jeden Test. N ist die Anzahl von getesteten Proben. Diese Untersuchung zeigte, daß die Analyse mit der besten Leistung hinsichtlich dieser Gruppe von Seren die heterologe M29/M38-Analyse war, welcher 93% der Patienten mit metastatierendem Brustkrebs detektierente (d.h. 93%-ige Sensitivität ergab). Vergleichsweise detektierten die W1-, M23-, M26/M38- und Ca 15.3-Analysen 67%, 60%, 60% bzw. 83% der Patienten mit metastatierendem Brustkrebs nach. Somit lieferten verschiedene Tests verschiedene Ergebnisse, wobei die M29/M38- und Ca 15.3-Tests eine bessere Leistung als die homologe W1-Analysen zeigten, und die M23- und M26/M38-Analysen gleiche oder schlechtere Leistung zeigten.
Von den fünf Tumorpatienten-Seren mit negativem M29/M38-Test zeigten zwei Proben positive W1-, M23- und CA 15.3-Tests, und eine dieser Proben einen positiven M26/M38-Test. Durch Kombination der M29/M38-Resultate mit einem zusätzlichen Test waren 69/72 (95%) der Tumorpatienten-Seren positiv.
Die Tests wurden auch auf ihre Fähigkeit, die mit der M29/M38-Analyse erhaltenen Resultate zu bestätigen, bewertet. Eine Anzahl von Tumor-Patienten zeigte Serum-Antigenspiegel, die dem in 5 verwendeten Cutoff entsprachen oder darüberlagen, aber innerhalb des Kontrollwertebereichs lagen. Aufgrund der Überlappung mit den für die Kontrollproben bestimmten Werten ist die Interpretation dieser Bestimmungen somit mit Unsicherheiten verbunden. Eine verbesserte Detektion dieser Patienten würde also den klinischen Nutzen der M29/M38-Analyse erhöhen.
Die vielversprechendste Analyse für diesen Zweck war die M26/M38-Analyse (Tabelle 10). Insgesamt 24 von 72 Seren von Brustkrebspatienten lieferten M29/M38-Werte, welche positiv waren, aber unterhalb des höchsten, für die Kontrollproben bestimmten Wertes (≤ 35 Einheiten/ml) lagen. Von diesen 24 Proben lieferten 8 M26/M38-Werte, welche außerhalb des normalen Bereichs (≥ 79 Einheiten/ml) lagen. Drei dieser Proben lieferten M26/M38-Werte, welche mehr als dreimal so hoch wie der höchste, für die Kontrollgruppe nachgewiesene Wert waren. Dagegen besaßen 0/24, 0/24 und 3/24 Serumproben Werte außerhalb des Normalbereichs für die W1-, M23- und CA 15.3-Analysen; in allen Fällen lag die Erhöhung für letztere Analyse bei weniger als zweifach. Obwohl die M26/M38-Analyse weniger Positive als andere Tests nachweist, sind die erhaltenen Spiegel ausreichend hoch, daß dieser Test dazu verwendet werden kann, um Krebspatienten, die keine stark erhöhten Werte mit anderen Tests zeigen, positiv zum Identifizieren.
Tabelle 10 Epitopspiegel, die durch verschiedene Tests in Seren von Patienten mit metastatisierendem Brustkarzinom nachgewiesen wurden
Beispiel VIII
Spezifität des Antikörpers Onc-M38
Um ferner die Spezifität des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers Onc-M38 zu zeigen, wurden unter Verwendung von Krebs- und normalen menschlichen Geweben immunhistologische Tests durchgeführt, wie von Hellstrom et al., Cancer Research 46; S. 3917–3923 (1986) beschrieben wurde, worauf hiermit Bezug genommen wird.
Brust-, Lungen- (Nichtkleinzellige Lungenkarzinome (NSCLC)) und Dickdarmkarzinome sowie Proben verschiedener normaler Gewebe wurden nach Operation vom Swedish Hospital Medical Center, dem Virginia Mason Hospital und Harborview Hospital in Seattle, WA entweder als operativ entfernte Biopsie oder als Pleuraexsudat erhalten.
Unmittelbar nach der Entfernung aus dne Patienten wurden die Tumor- und Normalgewebsproben in flüssigem Stickstoff eingefroren, worauf sie bei –70°C in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung gelagert wurden.
Gefrierschnitte von ungefähr 5 μm bis 6 μm Dicke wurden hergestellt und für mindestens zwei Stunden luftgetrocknet. Nach zehnminütiger Behandlung mit Aceton bei –20°C wurden sie schnell in einem Luftstrom getrocknet. Die zur immunhistologischen Färbung vorgesehenen Schnitte wurden 30 Minuten mit normalem Humanserum, welches 1:5 in PBS verdünnt worden war, vorinkubiert. Parallele Gefrierschnitte wurden hergestellt und mit Hematoxylin:Eosin zur histologischen Bewertung gefärbt. Für einen Satz Experimente wurden Paraffinschnitte aus Geweben hergestellt, welche unmittelbar nach dem Entfernen aus dem Patienten in Carnoy's Lösung fixiert, in Paraffin eingebettet und geschnitten worden waren; diese Schnitte wurden ähnlich den Gefrierschnitten gefärbt.
Die immunhistologische Färbung wurde unter Verwendung der PAP-Technik von Sternberger (In Immunocytochemistry, S. 104-169, New York, John Wiley & Sons (1979)), wie von Garrigues et al., Int. J. Cancer, 29, S. 511–515 (1982) und Hellstrom et al., J. Immunol., 130, S. 1467–1472 (1983) modifiziert), durchgeführt. Onc-M38, Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin und Maus-PAP (Sternberger Meyer Cytoimmunochemicals, Inc., Jarrettsville, MD) wurden in einer Lösung von 10%-igem normalem Mausserum und 3%-igem Kaninchenserum in PBS verdünnt. Das Färbeverfahren bestand aus den folgenden Schritten: (a) einstündige Behandlung der Schnitte entweder mit spezifischem oder Kontrollantikörperüberstand (z.B. Myelomprotein (p117), welches in der obigen Serummischung 1:2 verdünnt worden war); (b) Anwendung des 1:30 verdünnten Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulins; und (c) Einwirkenlassen von 1:80 verdünntem Maus-PAP-Komplex. Alle Antiseren wurden mit den Schnitten 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Bei der anschließenden Antikörperbehandlung wurden die Objektträger ein wenig in einem Strom von PBS gespült und dann zweimal in PBS gewaschen.
Die immunchemische Reaktion wurde durch Zugaben von frisch hergestelltem 0,05%-igem 3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid und 0,01%-igem Wasserstoffperoxyd in 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,6) 8 Minuten entwickelt. Weiteres 15-minütiges Einwirkenlassen einer 1%-igen OsO₄-Lösung intensivierte das Reaktionsprodukt. Die Schnitte wurden kurz mit Wasser gespült, in Alkohole mit ansteigender Konzentration und anschließend in Xylol gegeben, und mit Deckgläsern abgedeckt.
Alle Objektträger wurden durch den gleichen Forscher, der nicht ihre Quelle kannte, ausgewertet. Der Färbungsgrad von Tumor- (oder normalen) Zellen wurde von "+" (sehr schwach) bis "4+" (sehr stark) qualifiziert. Eine Färbung von "2+" oder mehr wurde als "positiv" und eine Färbung von "+" oder weniger als "negativ" betrachtet.
Tabelle 11 faßt die immunhistologischen Daten unter Verwendung von Tumor- und normalen Geweben zusammen. Wie in der Tabelle gezeigt ist, band Onc-M38 wenigstens an 50% der untersuchten Tumorgewebeproben (mit einer Intensität von wenigstens 2+), aber nicht an die normalen Gewebe.
Tabelle 11 Immunhistologie an Gefrierschnitten
Die in Tabelle 11 gezeigten Daten belegen, daß Onc-M38 relativ tumor-spezifische Zelloberflächenantigene auf verschiedenen Karzinomen erkennt. Da die selektive Lokalisierung von Tumoren durch monoklonale Antikörper für die Therapie erforderlich ist, läßt die Fähigkeit von Onc-M38, an mehr als einem Tumorgewebetyp zu binden, auf die Brauchbarkeit dieses Antikörpers für die Tumortherapie allein oder zusammen mit weiteren erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern schließen.
Beispiel IX
Analyse zum Nachweis einer bösartigen Lungenerkrankung unter Verwendung der monoklonalen Antikörper M26, M29 und M38
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen monoklonalen Mucinantikörper, Mucinepitope, die mit erkranktem Lungengewebe in Verbindung stehen, nachzuweisen, wurde unter Verwendung von Bronchoskopie-Proben und Seren, die von menschlichen Individuen erhalten wurden, folgendermaßen gezeigt.
Bronchialabstriche wurden während der bronchoskopischen Untersuchung von 27 Personen mit Lungenbeschwerden von Dr. Steve Springmeyer, Virginia Mason Hospital, Seattle, Washington während einer Dauer von sechs Monaten im Jahr 1987 erhalten. Die Abstriche wurden aus der linken und aus der rechten Lunge jedes Patienten in Übereinstimmung mit standardisierten Bronchoskopieverfahren entnommen, und wurden unter Verwendung von standardisierten histologischen Verfahren untersucht. Die Resultate der Bronchoskopie-Untersuchung und der histologischen Tests zusammen mit zusätzlicher Information, einschließlich Torax-Röntgenuntersuchungen und CD-Scans, wurden dazu verwendet, die Personen in drei Gruppen einzuteilen: 17 gutartige (keine bösartige Lungenerkrankung nachgewiesen) Individuen, 7 Individuen mit einem nichtkleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) und 3 Patienten mit anderem Krebs (SCLC, Prostatakarzinom und Dickdarmkarzinom). Diese letzte Gruppe wird nicht weiter diskutiert werden.
Ein DDIA wurde zum Vergleich mit den histologischen Resultaten unter Verwendung der monoklonalen Antikörper Onc-M29 und Onc-M38 sowie Onc-M26 und Onc-M38 durchgeführt, um Mucinantigenspiegel, wie in den Beispielen II und VII beschrieben, nachzuweisen. Jede Bronchoskopieabstrichprobe wurde in 0,5 ml PBS-Kochsalzlösung gelegt und eingefroren bei –70°C bis zur Verwendung gelagert. Die Probe wurde dann bei Raumtemperatur aufgetaut und 10 Minuten bei 4°C mikrozentrifugiert. Jede Probe wurde dann in einem Verhältnis von 1:11 (50 μl Probe und 500 μl Probenverdünnungsmittel) verdünnt. Zusätzlich zu den Bronchial proben wurde der DDIA auch an Blutserum von jeder Person ausgeführt.
Die durch den DDIA nachgewiesenen Epitopspiegel sind in Tabelle 12 für Bronchialabstriche und Seren der Personen, die auf Basis der bronchoskopischen Untersuchung und der histologischen Tests als gutartig und an NSCLC leidend eingestuft wurden, dargestellt.
Tabelle 12 Epitopspiegel, detektiert durch DDIA in Bronchialproben und Seren normaler Individuen und solcher mit Verdacht auf Lungenerkrankung
Wie aus Tabelle 12 zu ersehen ist, ergab der M26/M38-DDIA von Bronchialabstrichen von beiden Lungenflügeln für die 17 In dividuen, für die durch histologische Untersuchung keine Bösartigkeit nachgewiesen worden war, Epitopspiegel von 100 Einheiten/ml oder weniger an. Der M29/M38-DDIA ergab 6 Einheiten/ml oder weniger. Für die sieben Individuen, für die NSCLC diagnostiziert worden war, wies der M26/M38-DDIA vier Patienten mit signifikant erhöhten Epitopspiegel in der betroffenen Lunge nach; wobei der M29/M38-DDIA drei Personen mit bösartiger Lungenerkrankung mit einem erhöhten Epitopspiegel in der betroffenen Lunge anzeigte. Bei zwei Patienten (Nummer 21 und 22} waren die M26/M38-Spiegel in der betroffenen Lunge erhöht.
Diese Resultate lassen darauf schließen, daß ein signifikanter Prozentsatz von Patienten, die sich frühen Diagnoseverfahren bei Lungenkrebsverdacht unterzogen, erhöhte Spiegel der Mucinepitopmarker aufwiesen, die durch die erfindungsgemäßen Antikörper nachgewiesen wurden. Eine Analyse, die diese Antikörper verwendet, kann sich somit als nützlich erweisen, ein Lungenkarzinom oder andere Karzinome mit Lungenmetastasen, die sich dem Nachweis durch histologische Verfahren entziehen können, früh nachzuweisen.
Was die Resultate für Seren betrifft, lagen die Epitopspiegel für benigne Individuen bei 54 Einheiten/ml oder weniger in dem M26/M38-DDIA und bei 43 Einheiten/ml oder weniger in dem M29/M38-DDIA. Für die sieben Individuen, bei denen NSCLC diagnostiziert worden war, zeigte der M26/M38-DDIA für drei Personen erhöhte Antigenspiegel und die M29/M38-Analyse ebenfalls für drei Personen erhöhte Antigenspiegel. Somit besaß ein relativ hoher Anteil der Personen mit Lungenkrebs hohe Spiegel dieser Antigene in ihren Seren, was darauf schließen läßt, daß die erfindungsgemäßen Antikörper nützlich sein können, um Lungenkrebs unter Verwendung solcher Serumanalysen früh nachzuweisen.
Zusätzlich zum Nachweis von Mucinepitopen, die mit Lungenkrebs in Bronchialabstrichen in Verbindung stehen, können andere Proben durch Analysen unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und anderer Antikörper gegen Mucinepitope getestet werden. Zum Beispiel können Proben einer Bronchialspülung oder ausgeworfenes Sputum verdünnt auf ähnliche Weise in einer Analyse getestet werden.
Die hier identifizierten, neuen Epitope können als Tumor marker zum Nachweis von Tumoren an Patienten dienen. Zusätzlich können die hier beschriebenen, neuen Epitope auf den gereinigten Tumor-assoziierten Mucinantigenen, die immunologisch mit den neuen monoklonalen Antikörpern reagieren, die Entwicklung von sensitiveren monoklonalen Antikörpern für verbesserte Immunoassays fördern. Insbesondere können sich die monoklonalen Antikörper (Onc-M8, OnC-M26, Onc-M29, Onc-M30 und Onc-M38), die unter Verwendung von gereinigtem Mucin gegen Tumor-assoziiertes Mucinantigen erzeugt wurden, als nützlich für den frühen Nachweis von Krebs und für die Durchführung von Krebsbehandlungen herausstellen. Die Antikörper Onc-M26 und Onc-M38 scheinen größere Spezifität für Epitope auf Mucinantigen aus Tumorquellen zu haben, als für Mucinantigen aus normalen Quellen. Tumorassoziiertes Mucinantigen kann in Proben von Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten, wie Sputum, Pleuraexsudat und Milch, mit zusätzlichem monoklonalen Antikörpern, die unter Verwendung von gereinigtem Mucinantigen als Immunogen erzeugt wurden, genau so wie mit bereits bekannten Antikörpern, wie die Antikörper W1- oder W9, nachgewiesen werden, indem man Immunoassays verwendet, die den monoklonalen Antikörper Onc-M26 oder M38 alleine oder in Kombination mit einem anderen, hier beschriebenen, monoklonalen Antikörper verwenden. Die erfindungsgemäßen Antikörper können in histologischen Verfahren verwendet werden, sowohl um die Anwesenheit von Tumor-assoziiertem Mucinantigen auf Zellen eines Säugetieres, als auch um Mucin, das in flüssigen Proben, wie Serum, vorhanden ist, nachzuweisen. Durch Wiederholung dieser histologischen Verfahren über einen Zeitraum hinweg kann die Fortentwicklung von Krebs in einem Patienten beobachtet werden. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Antikörper auf Bindung an Brustepithelzellen eines Patienten getestet werden, um die Anwesenheit von Tumor-assoziiertem Mucinantigen nachzuweisen, das anzeigt, daß Krebszellen vorhanden sein können.
Der monoklonale Antikörper Onc-M26, ebenso wie die anderen, hier beschriebenen, neuen Antikörper, können alleine oder zusammen mit zwei oder mehreren dieser Antikörper in Diagnosetestkits in Kombination mit geeigneten Instruktionen zur Analyse auf Anwesenheit von Tumor-assoziierten Mucinantigenen in Serum oder anderen biologischen Proben enthalten sein. Zum Beispiel kann ein Kit zur Durchführung des DDIA unter Verwendung der Antikörper Onc-M26 und Onc-M29 einen festen Träger, zum Beispiel einen Microwell-Plattenhalter (Nunc, Newbury Park, CA) mit Verschlüssen, enthalten, wobei dieser 1–8 Streifen mit einer Vielzahl von Vertiefungen enthält. Die Streifen umfassen einen monoklonalen Antikörper, mit dem jede Vertiefung beschichtet ist. Zu dem Kit gehören ebenfalls Analysereagenzien, wie Standards, die in einer geeigneten Lösung verdünntes, menschliches Antigen, zum Beispiel Antigen aus Brustkrebs-Pleuraexsudat, enthalten. Die Standards können aus variierenden Antigenkonzentrationen bestehen, so kann zum Beispiel für Onc-M29 ein erster Standard aus vier Einheiten M29-Antigen/ml und ein zweiter Standard aus 10 Einheiten/ml bestehen. Für Onc-M26 kann ein erster Standard aus 30 Einheiten M26-Antigen/ml und ein zweiter Standard aus 75 Einheiten/ml bestehen. Kontrollen werden bereitgestellt und können aus menschlichem Antigen, das in normalem Humanserum (10%-ige Lösung von M26-Antigen und 11%-ige Lösung von M29-Antigen) mit den antimikrobiellen Reagenzien verdünnt wurde, bestehen.
Falls in einigen Fällen eine Probe Antigenspiegel höher als 825 Einheiten/ml für M26 und 110 Einheiten/ml für M29 (höher als der höchste Standard) in einem ersten Analyselauf enthält, kann die Probe mit einer geeigneten Menge des Proben-Verdünnungsmittels verdünnt werden. Verdünnungen können wie folgt hergestellt werden: 1:11 – 50 μl Testprobe + 500 μl Proben-Verdünnungsmittel 1:55 – 50 μl 1:11 Verdünnung + 200 μl Proben-Verdünnungsmittel 1:275 – 50 μl 1:55 Verdünnung + 200 μl Proben-Verdünnungsmittel Konjugierter Antikörper ist ebenfalls in dem Kit enthalten. Zum Beispiel wird der Antikörper, der mit dem Enzym HRP konjugiert ist, in einem getrennten Behälter mit einem geeigneten Verdünnungsmittel geliefert. Das Substrat des Enzyms, beispielsweise Citrat-gepuffertes Wasserstoffperoxid und 3,3'5,5'-Tetramethylbenzidin in Dimethylsulfoxid (TMB-Chromogen), falls die Enzymmarkierung HRP ist, ist im Kit in einem zweiten Behälter enthalten, um den gebundenen konjugierten Antikörper nachzuweisen. Das Proben-Verdünnungsmittel und ein die Reaktion unterbrechendes Reagenz, wie 1N Schwefelsäure, können zusätzliche Komponenten des Kits sein. Eine Waschlösung (z.B. 10 × PBS) können auch bereitgestellt werden. Die Waschlösung und das Unterbrechungsreagenz werden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Alle anderen Reagenzien werden vorzugsweise bei 4°C aufbewahrt, werden aber zur Verwendung auf Raumtemperatur gebracht. Vorzugsweise werden Standards und Kontrollen doppelt getestet.
Für die Immuntherapie kann irgendeiner der hier beschriebenen Antikörper an ein Radionuklid oder eine andere nachweisbare Markierung gekoppelt werden, und in den Körper eines Säugetieres eingeführt werden, um Krebszellen abzubilden oder um eine Radiotherapie auszuführen. Somit können die gewählten Antikörper an ein Radionuklid oder ein Antitumor-medikament gekoppelt werden und in ein Säugetier unter Verwendung irgendeiner geeigneten Einführungsmethode, zu der die intravenöse Injektion gehört, eingeführt werden, um das Radionuklid oder das Medikament an diejenigen Tumorgewebe heranzubringen, die ein mit dem Antikörper reagierendes Antigen enthalten. Die nachweisbare Markierung kann ausgewählt sein unter Fluorophoren, Enzymen, Chromophoren, Coenzymen, Chemiluminiszenzmaterialien, Enzyminhibitoren, paramagnetischen Metallen wie Gadolinium, und Radionukliden, welche aus dem Stand bekannt sind.
Während die vorliegende Erfindung in Verbindung mit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird es einem Fachmann nach der Lektüre der vorhergehenden Beschreibung möglich sein, verschiedene Änderungen, äquivalente Substitutionen und Abwandlungen bezüglich der hier beschriebenen Zusammensetzungen und Methoden auszuführen.

Claims

Hybridomzellinie, welche einen monoklonalen Antikörper produziert, der gekennzeichnet ist durch immunologische Bindung an ein Mucin-Antigen, welche ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern: HB 9248, HB 9212; HB 9210; und HB 9365.
Monoklonaler Antikörper, produziert von einer der Hybridomzellinien des Anspruchs 1.
Testkit zur Untersuchung auf das Vorliegen von Krebs, umfassend: wenigstens einen monoklonalen Antikörper, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; und HB 9365.
Testkit nach Anspruch 3, zusätzlich umfassend Testreagenzien und einen festen Träger zur Durchführung der Antigen-Antikörper-Bindung.
Testkit nach Anspruch 4, wobei der Antikörper an den festen Träger fixiert wird, um Antigene in einer Probe einzufangen.
Testkit nach Anspruch 5, weiter umfassend einen zweiten Antikörper zur Detektion von an den fixierten Antikörper gebundenem Antigen.
Testkit nach Anspruch 6, wobei der zweite Antikörper ein Antikörper ist, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; und HB 9365.
Testkit nach Anspruch 7, worin der zweite detektierende, monoklonale Antikörper mit einer detektierbaren Markierung gekoppelt ist.
Testkit nach Anspruch 8, worin die detektierbare Markierung ausgewählt ist unter Enzymen, Chromophoren, Fluorophoren, Coenzymen, chemilumineszenten Materialien, Enzyminhibitoren, paramagnetischen Metallen und Radionukliden.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, der mit einer detektierbaren Markierung gekoppelt ist, die ausgewählt ist unter Enzymen, Chromophoren, Fluorophoren, Coenzymen, chemilumineszenten Materialien, Enzyminhibitoren, paramagnetischen Metallen und Radionukliden.
Verfahren zur Detektion von Krebs durch Bestimmung der Gegenwart von Mucinantigen in einer Probe eines Säugers, wobei der monoklonale Antikörper des Anspruchs 2 verwendet wird, um mit dem in der Probe vorhandenen Mucinantigen zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Probe eine biologische Flüssigkeit ist, die ausgewählt ist unter Blut, Serum, Plasma, Speichel, Pleuraexsudat, Milch, Bronchialausbürstungen und Bronchuslavage.
Verfahren zur Detektion von Krebs durch Bestimmung der Gegenwart von Mucinantigen in einer Probe eines Säugers, wobei man: (a) zur Bindung in der Körperflüssigkeit vorhandenen Mucinantigens an einen Einfang-Antikörper eine Probe eines Säugers mit einem Einfang-Antikörper in Kontakt bringt, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern HB 9248; HB 9210; HB 9212; und HB 9365, wobei der Antikörper an ein Substrat gebunden ist; (b) einen Nachweis-Antikörper, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; und HB 9365, zu dem Substrat gibt, damit er mit Mucinantigen reagiert, das an den Einfang-Antikörper gebunden ist; und (c) den gebundenen Nachweis-Antikörper detektiert.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Mucinantigen Tumor-assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der monoklonale Antikörper mit einer detektierbaren Markierung gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die detektierbare Markierung ausgewählt ist unter Enzymen, Chromophoren, Fluorophoren, Coenzymen, chemilumineszenten Materialien, Enzyminhibitoren, paramagnetischen Metallen und Radionukliden.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Probe eine biologische Probe umfaßt, die ausgewählt ist unter Blut, Serum, Plasma, Speichel, Pleuraexsudat, Milch, Bronchialausbürstungen und Bronchuslavage.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Probe Zellmaterial umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der Detektions-Schritt die Verwendung eines indirekten Enzymimmunoassays umfaßt.
Verfahren zum Differenzieren zwischen normalem und abnormalem Humangewebe, wobei eine Probe, die Zellmaterial eines Menschen enthält, mit zwei oder mehreren der monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht wird, die von der Hybridomzellinie gemäß Anspruch 1 produziert werden, wodurch das Vorliegen einer Abnormalität bei dem Menschen detektiert werden kann.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das Humangewebe Brustepithelgewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das Humangewebe Lungengewebe ist.
Verfahren zur Detektion Tumor-assoziierter Mucin-Antigene in einem Patienten wobei eine Probe, die Zellmaterial eines Patienten enthält, mit zwei oder mehreren der monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht wird, die von der Hybridomzellinie gemäß Anspruch 1 produziert werden, wodurch die Präsenz von Tumoren bei dem Patienten detektiert werden kann.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Probe eine biologische Probe umfaßt, die ausgewählt ist unter Blut, Serum, Plasma, Speichel, Pleuraexsudat und Milch.
Verfahren nach Anspruch 23, worin es sich bei der Probe um Brustepithelzellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Probe ausgewählt ist unter Bronchialausbürstungen, Lavageproben und expektoriertem Sputum.
Testkit zur Untersuchung auf das Vorliegen von Krebs, enthaltend einen ersten monoklonalen Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9212 produziert wird, und einen zweiten monoklonalen Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9365 produziert wird.
Testkit zur Untersuchung auf das Vorliegen von Krebs, enthaltend einen ersten monoklonalen Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9210 produziert wird, und einen zweiten monoklonalen Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9365 produziert wird.
Testkit zur Untersuchung auf das Vorliegen von Krebs, enthaltend einen ersten monoklonalen Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9212 produziert wird, einen zweiten monoklonalen Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9210 produziert wird, und einen dritten monoklonalen Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9365 produziert wird.
Testkit nach Anspruch 27, 28 oder 29 weiter umfassend Testreagenzien und einen festen Träger zur Durchführung einer Antigen-Antikörper-Bindung.
Verfahren zur Detektion von Lungenkarzinomen und metastatischen Lungenkarzinomen, wobei man eine Probe, die ausgewählt ist unter Bronchialausbürstungen, Lavageflüssigkeit und expektoriertem Sputum, mit wenigstens einem monoklonalen Antikörper reagieren läßt, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist unter den ATCC-Nummern: HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; und HB 9365.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Probe mit dem ersten Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9212 produziert wird, und einem zweiten Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9365 produziert wird, reagiert.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Probe mit dem ersten Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9210 produziert wird, und einem zweiten Antikörper, der von der Hybridomzellinie HB 9365 produziert wird, reagiert.
Verfahren zum Differenzieren zwischen humanen Normal- und Tumorzellen, wobei man eine Probe, die Zellmaterial von einem Menschen enthält, mit wenigstens zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern in Kontakt bringt, die von den Hybridomzellinien gemäß Anspruch 1 produziert werden, und wobei man die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Immunkomplex-Bildung mit den Antikörpern detektiert, die auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Tumorzellen in der Probe hinweist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei es sich bei dem Human-Zellmaterial um Brustepithelzellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 34, worin eine der Hybridomzellen die ATCC-Nummer HB 9212 aufweist.