DE3887771T3 - Immunoassays und Vorrichtungen dafür. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Assays, die sich einer spezifischen Bindung bedienen, insbesondere Immunoassays, und Geräte dafür.
- Die Erfindung betrifft insbesondere analytische Testgeräte, die zur Verwendung zu Hause, in der Klinik oder in der Arztpraxis geeignet sind und in kurzer Zeit ein Analysenergebnis liefern sollen, wobei nur ein Minimum an Geschicklichkeit und Arbeitsaufwand seitens des Benutzers gefordert wird. Die Verwendung von Testgeräten im privaten Bereich zur Feststellung einer Schwangerschaft oder der Empfängnisbereitschaft (Ovulation) ist inzwischen üblich, und es ist eine Vielzahl von Testgeräten und Testsätzen im Handel erhältlich. Ohne Ausnahme erfordern alle kommerziell erhältlichen Geräte, daß der Benutzer eine Folge von Arbeitsschritten durchführt, bevor das Testergebnis ablesbar ist. Diese Arbeitsschritte erfordern notwendigerweise Zeit und führen eine Fehlerquelle ein.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Testgerätes, das von einer ungeübten Person leicht benutzt werden kann und vorzugsweise nur erfordert, daß ein gewisser Teil des Gerätes mit der Probe (z. B. einem Urinstrahl im Fall eines Schwangerschafts- oder Ovulationstests) in Kontakt gebracht wird, worauf vor der Feststellung eines Analysenergebnisses keine weiteren Arbeitsschritte vom Benutzer mehr nötig sind. Idealerweise sollte das Analyseriergebnis innerhalb von Minuten, z. B. 10 min oder weniger, nach Probenauftrag ablesbar sein.
- Die Verwendung von mit einem Reagenz imprägnierten Teststreifen bei spezifischen Bindungsassays, z. B. Immunoassays, ist bereits vorgeschlagen worden. Dabei wird eine Probe auf einen Teil des Teststreifens aufgetragen, so daß sie durch das Streifenmaterial dringen kann, und zwar gewöhnlich mit Hilfe eines eluierenden Lösungsmittels, wie Wasser. Dadurch bewegt sich die Probe in oder durch die Nachweiszone im Teststreifen, in dem ein spezifisches Bindungsreagenz für eine in der Probe vermutete Nachweissubstanz immobilisiert ist. Die in der Probe vorliegende Nachweissubstanz kann daher innerhalb der Nachweiszone gebunden werden. Das Maß, bis zu welchem die Nachweissubstanz in dieser Zone gebunden wird, kann mit markierten Reagenzien bestimmt werden, die dem Teststreifen ebenfalls einverleibt sind oder anschließend darauf aufgebracht werden. Beispiele früherer Vorschläge, die sich dieser Prinzipien bedienen, sind in Thyroid Diagnostics Inc. GB 1 589 234, Boots-Celltech Diagnostics Limited
EP 0 225 054 , Syntex (USA) Inc. EP 0 183 442 und Behringwerke AG EP 0 186 799 angegeben. - Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Anpassung und Verbesserungen der bekannten Techniken, wie sie z. B. in den obigen Veröffentlichungen angegeben sind, zur Bereitstellung diagnostischer Testgeräte, die insbesondere für den privaten Gebrauch geeignet sind, die schnell und bequem zu handhaben sind und nur möglichst wenige Arbeitsschritte seitens des Benutzers erfordern.
- Die EP-A-191 640 und WO 86/04683 offenbaren beide immunochromatographische Geräte unter Verwendung markierter Komponenten, insbesondere Enzyme, die die aufeinanderfolgende Zugabe von Substrat zur Verdeutlichung eines Testergebnisses erfordern.
- Die EP-A-7654 und EP-A-32270 offenbaren kolloidale Farbstoffteilchen bzw. metallische Sol(Gold)-teilchen als in Immunoassays verwendbare Markierungsstoffe, sie ziehen jedoch nicht eine solche Verwendung im Zusammenhang mit immunochromatographischen Geräten in Betracht.
- WO-A-86/03839 beschreibt ein Festphasendiffusionsassay, das in Kit-Form ausführbar ist, wobei eine Probe, die eine zu testende Nachweissubstanz enthält, zunächst mit einer markierten Bindungssubstanz gemischt wird, dann auf einen Bereich eines unlöslichen Trägers, der immobilisierte adsorbierende Molküle enthält, aufgetragen und darin diffundieren gelassen wird. Das Diffusionsmuster wird sichtbar gemacht und gemessen. Um auf den Punkt des Auftrags der Probe zu fokussieren, schlägt dieses Dokument vor, eine Kunststoffolie oder ein Band mit einem kleinen Loch auf dem Träger zu plazieren. Im Hinblick auf die markierende Substanz bezieht sich dieses Dokument auf eine Anzahl von Möglichkeiten, einschließlich Farbstoffpartikel, wie kolloidales Gold oder Silber, die ein direktes Sichtbarmachen des Ergebnisses erlauben sollen. Die letztere Ausgestaltung wird in Beispielen IX bis XIII exemplifiziert, wobei das Beispiel X repräsentativ für einen besonderen Schwangerschaftstest ist.
- Die Erfindung schafft ein an analytisches Testgerät, umfassend einen trockenen porösen Träger (
10 ), unmarkiertes spezifisches Bindungsreagenz für einen Analyten, welches unmarkierte Reagenz auf dem porösen Träger in einer Nachweiszone (14 ) permanent immobilisiert und daher in feuchtem Zustand nicht beweglich ist, und in trockenem Zustand in einer Zone (12 ) stromaufwärts von der Nachweiszone ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz für dieselbe Nachweissubstanz, welches markierte spezifische Bindungsreagenz innerhalb des porösen Trägers in feuchtem Zustand frei beweglich ist, so dass die Flüssigkeitsprobe, die dem Gerät zugeführt ist, das markierte Reagenz aufnehmen und danach in die Nachweiszone eindringen kann, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Träger und das markierte spezifische Bindungsreagenz innerhalb eines hohlen Gehäuses (30 ) enthalten sind, das aus feuchtigkeitsundurchlässigem, festem Material aufgebaut ist, der poröse Träger direkt oder indirekt mit dem Äußeren des Gehäuses derart in Verbindung steht, dass flüssige Testprobe auf den porösen Träger aufgebracht werden kann, das Gehäuse Mittel (32 ) zum Feststellen des Ausmaßes (sofern gegeben) beinhaltet, bis zu dem das markierte Reagenz in der Nachweiszone gebunden ist, der Markierungsstoff ein teilchenförmiger Direktmarkierungsstoff ist, das markierte Reagenz in einer ersten Zone (12 ) des trockenen porösen Trägers enthalten ist und das unmarkierte Reagenz in einer von der ersten Zone räumlich getrennten Nachweiszone immobilisiert ist, wobei die beiden Zonen derartig angeordnet sind, dass eine auf den porösen Träger aufgebrachte Flüssigkeitsprobe über die erste Zone in die Nachweiszone dringen kann. - Das erfindungsgemäße Gerät umfaßt ein poröses Festphasenmaterial, das in einer ersten Zone ein markiertes Reagenz trägt, das in der ersten Zone zurückgehalten wird, während sich das poröse Material in trockenem Zustand befindet, das jedoch frei durch das poröse Material wandert, wenn dieses befeuchtet wird, z. B. durch Aufbringen einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe, die möglicherweise die Nachweissubstanz enthält, wobei das poröse Material in einer zweiten Zone, die räumlich von der ersten Zone getrennt ist, ein unmarkiertes spezifisches Bindungsreagenz mit Spezifität für die Nachweissubstanz enthält, das mit dem markierten Reagenz entweder an einer "Sandwich"-Reaktion oder einer kompetitiven Reaktion teilnehmen kann, wobei das unmarkierte spezifische Bindungsreagenz auf dem porösen Material fest immobilisiert ist, so daß es nicht frei wandern kann, wenn sich das poröse Material in feuchtem Zustand befindet.
- Die Erfindung stellt auch ein analytisches Verfahren zur Verfügung, bei dem ein Gerät, wie es im vorhergehenden Absatz beschrieben ist, mit einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe, die vermu teterweise die Nachweissubstanz enthält, in Kontakt gebracht wird, so daß die Probe durch Kapillarwirkung durch das poröse Festphasenmaterial über die erste Zone in die zweite Zone wandert, wobei das Vorliegen einer Nachweissubstanz in der Probe durch Beobachtung des Ausmaßes (sofern gegeben) bestimmt wird, bis zu welchem das markierte Reagenz in der zweiten Zone gebunden wird.
- In einer Ausführungsform der Erfindung ist das markierte Reagenz ein spezifischer Bindungspartner für die Nachweissubstanz. Das markierte Reagenz, die Nachweissubstanz (falls vorhanden) und das immobilisierte unmarkierte spezifische Bindungsreagenz wirken in einer "Sandwich"-Reaktion zusammen. Dadurch wird das markierte Reagenz in der zweiten Zone gebunden, falls eine Nachweissubstanz in der Probe vorliegt. Die beiden Bindungsreagenzien müssen Spezifitäten für unterschiedliche Epitope auf der Nachweissubstanz haben.
- In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das markierte Reagenz entweder die Nachweissubstanz selbst, die mit einem Markierungsstoff konjugiert wurde, oder das markierte Reagenz ist ein Analog zur Nachweissubstanz, d.h. eine chemische Einheit mit den identischen spezifischen Bindungscharakteristiken wie die Nachweissubstanz, die in ähnlicher Weise mit einem Markierungsstoff konjugiert wurde. Im letzteren Fall wird es bevorzugt, daß die Eigenschaften der der Nachweissubstanz analogen Substanz, die die Löslichkeit oder Dispergierbarkeit in einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe und die Fähigkeit, durch das feuchte poröse Festphasenmaterial zu wanden, beeinflussen, identisch mit denen der Nachweissubstanz selbst oder zumindest ganz ähnlich sind. In dieser zweiten Ausführungsform wandert die markierte Nachweissubstanz oder das Analog der Nachweissubstanz durch das poröse Festphasenmaterial in die zweite Zone und bindet mit dem immobilisierten Reagenz. Jede in der Probe vorliegende Nachweissubstanz konkurriert mit dem markierten Reagenz in dieser Bindungsreaktion. Eine solche Konkurrenz führt zu einer verminderten Menge des in der zweiten Zone bindenden markierten Reagenzes und zu einer damit einhergehenden Intensitätsverminderung des in der zweiten Zone beobachteten Signals, verglichen mit dem Signal, das bei Abwesenheit einer Nachweissubstanz in der Probe auftritt.
- Ein wichtiges bevorzugtes Merkmal der Erfindung ist die Wahl von Nitrocellulose als Trägermaterial. Dieses ist von beträchtlichem Vorteil gegenüber konventionellen Streifenmaterialien, wie Papier, weil es eine natürliche Fähigkeit zum Binden von Proteinen ohne vorher nötige Sensibilisierung hat. Spezifische Bindungsreagenzien, wie Immunoglobuline, können direkt auf Nitrocellulose aufgebracht und dort immobilisiert werden. Keine chemische Behandlung ist nötig, die die wesentliche spezifische Bindungsaktivität des Reagenzes stören könnte. Nichtverbrauchte Bindungsstellen auf der Nitrocellulose können danach durch Verwendung einfacher Materialien, wie Polyvinylalkohol, blockiert werden. Ferner ist Nitrocellulose in einem Bereich von Porengrößen leicht verfügbar, was die Wahl eines Trägermaterials zur Anpassung an spezielle Forderungen, wie z. B. Fließgeschwindigkeit der Probe, erleichtert.
- Ein anderes wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Verwendung sogenannter "Direktmarkierungsstoffe", die an eines der spezifischen Bindungsreagenzien gebunden sind. Direkte Markierungsstoffe, wie Goldsole und Farbsole, sind bereits per se bekannt. Sie eignen sich zur Produktion eines sofortigen Analysenergebnisses, ohne daß weitere Reagenzien zur Entwicklung eines ablesbaren Signals zugefügt werden müssen. Sie sind robust und stabil und können daher leicht in einem analytischen Testgerät verwendet werden, das in trockenem Zustand gelagert wird. Ihre Freisetzung nach Kontakt mit einer wäßrigen Probe kann z. B. durch die Verwendung löslicher Glasuren gesteuert werden.
- Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Wahl technischer Merkmale, die die Verwendung eines direktmarkierten spezifischen Bindungsreagenzes in einem analytischen Testgerät auf Trägerbasis erlauben, z. B. einem Gerät in Form eines Streifens, um ein schnelles und klares Ergebnis zu liefern. Idealerweise sollte das Analysenergebnis mit dem Auge ablesbar sind, und um dies zu erleichtern, muß der Direktmarkierungsstoff in der Nachweiszone konzentriert werden. Hierzu sollte das direktmarkierte Reagenz durch die Entwicklerflüssigkeit leicht und schnell transportierbar sein. Ferner wird es bevorzugt, daß die Gesamtmenge der Entwicklungs-Probenflüssigkeit durch eine vergleichsweise kleine Nachweiszone geführt wird, damit die Wahrscheinlichkeit der Erzielung eines ablesbaren Ergebnisses erhöht wird.
- Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines direktmarkierten spezifischen Bindungsreagenzes auf einem Nitrocellulose umfassenden Trägermaterial. Die Nitrocellulose hat vorzugsweise eine Porengröße von mindestens 1 μm. Vorzugsweise hat die Nitrocellulose eine Porengröße von nicht mehr als etwa 20 μm. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Direktmarkierungsstoff ein gefärbtes Latexteilchen von kugeliger oder fast kugeliger Form und mit einem Höchstdurchmesser von nicht mehr als etwa 0,5 μm. Ein idealer Größenbereich solcher Teilchen liegt zwischen 0,05 und etwa 0,5 μm.
- In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der poröse Festphasenträger an ein poröses Aufnahmeelement gebunden, auf das die Flüssigkeitsprobe aufgebracht werden und von dem die Probe in den porösen Festphasenträger eindringen kann. Der poröse Festphasenträger ist vorzugsweise innerhalb eines feuchtigkeitsundurchlässigen Gehäuses enthalten, und das poröse Aufnahmeelement, mit dem der poröse Festphasenträger verbunden ist, erstreckt sich aus dem Gehäuse heraus und kann als Mittel dienen, um den Eintritt einer Flüssigkeitsprobe in das Gehäuse und das Durchdringen des porösen Festphasenträgers zuzulassen. Das Gehäuse sollte mit Mitteln, z. B. entsprechend angeordneten Öffnungen, versehen sein, wodurch die zweite Zone des porösen Festphasenmaterials (die das immobilisierte unmarkierte spezifische Bindungsreagenz trägt) von der Außenseite des Gehäuses beobachtbar ist, so daß das Ergebnis des Assays beobachtet werden kann. Falls gewünscht, kann das Gehäuse auch mit weiteren Mitteln versehen sein, durch welche eine weitere Zone des porösen Festphasenmaterials von der Außenseite des Gehäuses beobachtet werden kann, wobei die weitere Zone Kontrollreagenzien um faßt, die die Anzeige darüber ermöglichen können, ob das Testverfahren beendet ist. Das Gehäuse ist vorzugsweise mit einer entfernbaren Kappe oder Bedeckung versehen, die das vorstehende poröse Aufnahmeelement während der Lagerung vor der Verwendung schützen kann. Auf Wunsch kann die Kappe oder Bedeckung nach Probenaufbringung wieder über das vorstehende poröse Aufnahmeelement aufgesetzt werden, während das Testverfahren abläuft.
- Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein Schwangerschaftstestgerät, umfassend ein längliches Hohlgehäuse, das einen trockenen porösen Nitrocelluloseträger enthält, der indirekt mit der Außenseite des Gehäuses über ein saugfähiges Urinaufnahmeelement in Verbindung steht, das aus dem Gehäuse herausragt und als Reservoir dienen kann, aus dem Urin in den porösen Träger freigesetzt wird, wobei der Träger in einer ersten Zone einen hochspezifischen Anti-hCG-Antikörper enthält, der einen gefärbten "Direkt"-Markierungsstoff trägt, wobei der markierte Antikörper innerhalb des porösen Trägers frei beweglich ist, wenn sich dieser in feuchtem Zustand befindet, und in einer zweiten Zone in räumlichem Abstand von der ersten Zone einen hochspezifischen unmarkierten Anti-hCG-Antikörper enthält, der permanent auf dem Trägermaterial immobilisiert ist und in feuchtem Zustand nicht beweglich ist, wobei die markierten und unmarkierten Antikörper Spezifitäten für unterschiedliche hCG-Epitope haben, wobei die beiden Zonen so angeordnet sind, daß eine auf dem porösen Träger aufgebrachte Urinprobe über die erste Zone in die zweite Zone vordringen kann und wobei das Gehäuse aus opakem oder durchscheinendem Material mit mindestens einer Öffnung konstruiert ist, durch welche das Analyseriergebnis beobachtet werden kann, zusammen mit einer entfernbaren und wiederaufsetzbaren Bedeckung für das vorstehende saugfähige Urinaufnahmeelement. Ein Ovulationstestgerät, im wesentlichen wie oben beschrieben, wobei jedoch die Nachweissubstänz LH ist, ist eine wichtige Alternative.
- Derartige Geräte können als zur privaten Benutzung geeignete Bausätze bzw. Kits vorgesehen sein, die eine Mehrzahl (z. B. zwei) von Geräten umfassen, die individuell in einer feuchtigkeitsundurchlässigen Hülle eingehüllt und zusammen mit entsprechenden Anweisungen für den Benutzer verpackt sind.
- Das poröse Probenaufnahmeelement kann aus jedem saugfähigen porösen oder faserigen Material hergestellt sein, das Flüssigkeit schnell absorbieren kann. Die Porosität des Materials kann in eine Richtung (d.h. mit Poren oder Fasern, die insgesamt oder vorherrschend parallel zu einer Achse des Elementes verläufen) oder in viele Richtungen verlaufen (in alle Richtungen, so daß das Element eine amorphe schwammartige Struktur hat). Poröse Kunststoffmaterialien, wie Polypropylen, Polyethylen (vorzugsweise mit sehr hohem Molekulargewicht), Polyvinylidenfluorid, Ethylen-Vinylacetat-Copolymerisat, Polyacrylnitril und Polytetrafluorethylen, können verwendet werden. Es kann von Vorteil sein, das Element während der Herstellung mit einem oberflächenaktiven Mittel vorzubehandeln, weil dies jegliche inhärente Hydrophobie im Element verringern und daher seine Fähigkeit zur schnellen und wirksamen Aufnahme und Abgabe einer feuchten Probe verbessern kann. Poröse Probenaufnahmeelemente können auch aus Papier oder anderen Cellulosematerialien, wie Nitrocellulose, hergestellt sein. Materialien, die derzeit in den Spitzen sogenannter Faserschreibstifte verwendet werden, sind besonders geeignet, und derartige Materialien können in einer Vielzahl von Längen und Querschnitten entsprechend dem Kontext der Erfindung geformt oder extrudiert werden. Das das poröse Aufnahmeelement darstellende Material sollte vorzugsweise so gewählt werden, daß das poröse Element innerhalb von Sekunden mit einer wäßrigen Flüssigkeit gesättigt werden kann. Das Material bleibt in feuchtem Zustand vorzugsweise robust; aus diesem Grund werden Papier und ähnliche Materialien in irgendeiner Ausführungsform, in der das poröse Aufnahmeelement aus einem Gehäuse vorsteht, weniger bevorzugt. Danach muß die Flüssigkeit frei aus dem porösen Probenaufnahmeelement in das poröse Festphasenmaterial vordringen.
- Die fakultative "Kontroll"-Zone kann einfach aufgebaut sein, um dem Benutzer ein Signal zu geben, daß das Gerät, gearbeitet hat. Die Kontrollzone kann z. B. mit einem Antikörper beladen sein, der an den markierten Antikörper aus der ersten Zone bindet, z. B. einen "Anti-Maus"-Antikörper, wenn der markierte Körper ein solcher ist, der durch Verwendung eines Murinhybridoms abgeleitet wurde, um zu bestätigen, daß die Probe den Teststreifen durchdrungen hat. Alternativ kann die Kontrollzone ein wasserfreies Reagenz enthalten, daß nach Befeuchten eine Farbveränderung oder Farbbildung bewirkt, z. B. wasserfreies Kupfersulfat, das nach Befeuchten mit einer wäßrigen Probe blau wird. Als weitere Alternative kann eine Kontrollzone eine immobilisierte Nachweissubstanz enthalten, die mit überschüssigem markierten Reagenz aus der ersten Zone reagiert. Da es der Zweck der Kontrollzone ist, dem Benutzer anzuzeigen, daß der Test beendet ist, sollte die Kontrollzone stromabwärts von der zweiten Zone angeordnet sein, in der das gewünschte Testergebnis aufgezeichnet ist. Ein positiver Kontrollindikator zeigt daher dem Benutzer an, daß die Probe über den nötigen Abstand durch das Testgerät gedrungen ist.
- Der Markierungsstoff ist ein teilchenförmiger Direktmarkierungsstoff, d.h. eine Einheit, die in ihrem natürlichen Zustand entweder mit dem bloßen Auge oder mit Hilfe eines optischen Filters und/oder einer angelegten Stimulation, z. B. W-Licht zum Hervorrufen von Fluoreszenz, leicht sichtbar ist. So sind z. B. winzige gefärbte Teilchen, z. B. Farbsole, Metall-Sole (z. B. Gold) und ge färbte Latexteilchen sehr geeignet. Hiervon werden gefärbte Latexteilchen am meisten bevorzugt. Konzentrationen des Markierungsstoffes in einer kleinen Zone oder in kleinem Volumen sollten zu einem leicht ablesbaren Signal führen, z. B, zu einem stark gefärbten Bereich. Dies kann mit dem Auge oder, falls gewünscht, durch Instrumente festgestellt werden.
- Das Kuppeln des Markierungsstoffs an das spezifische Bindungsreagenz kann, falls gewünscht, durch kovalente Bindung oder durch hydrophobe Bindung erfolgen. Diese Techniken sind im Stand der Technik üblich und bilden keinen Teil der vorliegenden Erfindung. Im vorliegenden Fall, wo der Markierungsstoff ein Direktmarkierungsstoff, z. B. ein gefärbtes Latexteilchen, ist, wird die hydrophobe Bindung bevorzugt.
- Bei allen Ausführungsformen der Erfindung ist es wesentlich, daß das markierte Reagenz mit der Flüssigkeitsprobe wandert, während diese zur Nachweiszone läuft. Vorzugsweise geht der Fluß der Probe über die Nachweiszone hinaus, und genügend Probe wird auf der poröse Material aufgebracht, damit dies der Fall sein kann und damit jegliches überschüssiges markiertes Reagenz aus der ersten Zone, das an der Bindungsreaktion in der zweiten Zone nicht teilnimmt, durch diesen fortdauernden Fluß aus der Nachweiszone weggespült wird. Falls gewünscht, kann eine Absorptionsmittel-"Falle" am distalen Ende des Trägermaterials vorgesehen sein. Die Absorptionsmittelfalle kann z. B. Whatman 3MM® Chromatographiepapier umfassen und sollte eine genügende Absorptionskapazität haben, damit jegliches ungebundenes Konjugat aus der Nachweiszone ausgewaschen werden kann. Als Alternative zu einer solchen Falle kann es genügen, daß sich das poröse Festphasenmaterial in ausreichender Länge über die Feststellungszone hinaus erstreckt.
- Das Vorliegen oder die Intensität des Signals aus dem Markierungsstoff, der in der zweiten Zone gebunden wird, kann eine qualitative oder quantitative Messung der Nachweissubstanz in der Probe liefern. Eine Mehrzahl von in Reihe auf dem porösen Festphasenmaterial angeordneten Nachweiszonen, durch die die wäßrige Flüssiakeitsprobe fortschreitend laufen kann, kann ebenfalls für eine quantitative Messung der Nachweissubstanz verwendet werden, oder die Nachweiszonen können individuell mit unterschiedlichen spezifischen Bindungsmitteln beladen sein, um ein Testgerät für mehrere Nachweissubstanzen zu ergeben.
- Das immobilisierte spezifische Bindungsreagenz in der zweiten Zone ist vorzugsweise ein hochspezifischer Antikörper, insbesondere ein monoklonaler Antikörper. In der die Sandwich-Reaktion beinhaltenden Ausführungsform der Erfindung ist das markierte Reagenz auch vorzugsweise ein hochspezifischer Antikörper, und insbesondere ein monoklonaler Antikörper.
- Das Trägermaterial liegt vorzugsweise in Form eines Streifens oder einer Folie vor, auf den oder die die Reagenzien in räumlich getrennten Zonen aufgebracht sind, und man läßt die Flüssigkeitsprobe von einer Seite oder einem Ende zum anderen durch die Folie oder den Streifen wandern.
- Falls gewünscht, kann das Gerät gemäß der Erfindung zwei oder mehrere diskrete Körper von porösem Festphasenmaterial, z. B. getrennte Streifen oder Folien, beinhalten, die jeweils bewegliche und immobilisierte Reagenzien tragen. Diese diskreten Körper können parallel angeordnet sein, z. B. damit eine einzige Aufbringung von Flüssigkeitsprobe auf das Gerät den gleichzeitigen Probenfuß in den diskreten Körpern auslöst. Die auf diese Weise bestimmbaren getrennten Analysenergebnisse können als Kontrollergebnisse verwendet werden; oder, falls unterschiedliche Reagenzien auf unterschiedlichen Trägern eingesetzt werden, kann die gleichzeitige Bestimmung einer Mehrzahl von Nachweissubstanzen in einer einzigen Probe durchgeführt werden. Alternativ können mehrere Proben individuell auf eine Anordnung von Trägern aufgebracht und gleichzeitig analysiert werden.
- Das die poröse Festphase darstellende Material ist vorzugsweise Nitrocellulose. Diese hat den Vorteil, daß der Antikörepr in der zweiten Zone ohne vorherige chemische Behandlung fest immobilisiert werden kann. Wenn das poröse Festphasenmaterial Papier umfaßt, bedarf z. B. die Immobilisierung des Antikörpers in der zweiten Zone der Durchführung einer chemischen Kupplung, wobei z. B. CNBr, Carbonyldiimidazol, oder Tresylchlorid verwendet wird.
- Nach der Aufbringung des Antikörpers auf die Nachweiszone sollte der Rest des porösen Festphasenmaterials behandelt werden, um alle anderswo verbleibenden Bindungssstellen zu blockieren. Das Blockieren kann durch Behandlung mit Protein (z. B. Rinderserumalbumin oder Milchprotein) oder mit Polyvinylalkohol oder Etha nolamin oder z. B. mit irgendeiner Kombination dieser Mittel erfolgen. Das markierte Reagenz für die erste Zone kann dann auf den trockenen Träger aufgebracht werden und wird im Träger, wenn dieser sich in feuchtem Zustand befindet, frei beweglich. Zwischen jedem dieser verschiedenen Verfahrensschritte (Sensibilisierung, Auftragen von unmarkiertem Reagenz, Blockieren und Aufbringen des markierten Reagenzes) sollte das poröse Festphasenmaterial getrocknet werden.
- Um die freie Beweglichkeit des markierten Reagenzes bei Befeuchtung des porösen Trägers zu unterstützen, wird das markierte Reagenz vorzugsweise als Oberflächenschicht auf den Träger aufgebracht, statt über die Dicke des Trägers imprägniert zu werden. Dies kann eine Wechselwirkung zwischen dem Trägermaterial und dem markierten Reagenz minimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Träger mit einem Glasurmaterial in dem Bereich vorbehandelt, auf den das markierte Reagenz aufgebracht werden soll. Das Glasieren kann z. B. durch Abscheiden einer wäßrigen Zucker- oder Celluloselösung, z. B. von Saccharose oder Lactose, auf den Träger im relevanten Abschnitt und durch Trocknen erfolgen. Das markierte Reagenz kann dann auf den glasierten Abschnitt aufgebracht werden. Der Rest des Trägermaterials sollte nicht glasiert sein.
- Das poröse Festphasenmaterial ist vorzugsweise eine Nitrocellulosefolie einer Porengröße von mindestens etwa 1 μm, insbesondere von mehr als etwa 5 μm und ganz besonders von etwa 8 bis 12 μm. Eine sehr zweckmäßige Nitrocellulosefolie einer nominalen Porengröße von bis zu etwa 12 μm ist von der Schleicher und Schüll GmbH im Handel erhältlich.
- Die Nitrocellulosefolie ist zur Verbesserung ihrer Handhabungsfestigkeit vorzugsweise mit z. B. einer Kunststoffolie "verstärkt". Sie kann leicht hergestellt werden, indem man eine dünne Schicht Nitrocellulose auf einer Folie als Verstärkungsmaterial bildet. Die tatsächliche Porengröße der Nitrocellulose in der so verstärkten Form ist möglicherweise kleiner als die des entsprechenden unverstärkten Materials.
- Alternativ kann die vorgebildete Folie aus Nitrocellulose zwischen zwei Trägerfolien aus festem Material, z. B. Kunststofffolien, in dichter Sandwichweise angeordnet sein.
- Es wird bevorzugt, daß die Fließgeschwindigkeit einer wäßrigen Probe durch das poröse Festphasenmaterial so bemessen ist, daß die wäßrige Flüssigkeit im unbehandelten Material mit einer Geschwindigkeit von 1 cm in nicht mehr als 2 min wandert, auf Wunsch können jedoch auch langsamere Fließgeschwindigkeiten gewählt werden.
- Die räumliche Trennung zwischen den Zonen und die Fließgeschwindigkeitseigenschaften des porösen Trägermaterials können so gewählt werden, daß angemessene Reaktionszeiten ermöglicht werden, während derer die nötige spezifische Bindung erfolgen kann, und damit das markierte Reagenz in der ersten Zone sich in der Flüssigkeitsprobe dispergieren und durch den Träger wandern kann. Eine weitere Steuerung dieser Parameter kann man durch Einbeziehen von Viskositätsmodifizierungsmitteln (z. B. Zuckern und modifizierten Cellulosen) in die Probe erreichen, um die Reagenzwanderung zu verlangsamen.
- Das immobilisierte Reagenz in der zweiten Zone ist vorzugsweise durch die gesamte Dicke das Trägers in der zweiten Zone (z. B. durch die Dicke der Folie oder des Streifens, wenn der Träger in dieser Form vorliegt) imprägniert. Diese Imprägnierung kann das Maß verstärken, bis zu welchem das immobilisierte Reagenz eine in der wandernden Probe vorliegende Nachweissubstanz einfangen kann.
- Die Reagenzien können auf verschiedene Weise auf das Trägermaterial aufgebracht werden. Verschiedene "Druck"-Techniken sind bereits zur Aufbringung flüssiger Reagenzien auf Träger vorgeschlagen worden, z. B. Mikrospritzen, Federn mit Meßpumpen, Direktdruck und Tintenstrahldruck, und jede dieser Techniken kann im vorliegenden Zusammenhang angewendet werden. Zur leichteren Herstellung kann der Träger (z. B. Folie) mit den Reagenzien behandelt und dann in kleine Abschnitte unterteilt werden (z. B. kleine schmale Streifen, die jeweils die erforderlichen reagenzhaltigen Zonen aufweisen), um eine Vielzahl identischer Trägereinheiten zu ergeben.
- Nur als Beispiel werden nun bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung im Detail mit Bezug zu den beiliegenden Zeichnungen beschrieben.
- Ausführungsform 1
- Die
1 und2 stellen einen typischen Streifen von porösem Festphasenmaterial zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Test dar und veranschaulichen das zugrundeliegende Prinzip, nach welchem die Erfindung arbeitet. - In
1 wird der Teststreifen10 als rechteckiger Streifen gesehen, dessen Längsachse (für den Zweck dieser Beschreibung) senkrecht verläuft. Angrenzend an das untere Ende11 des Streifens10 ist ein schmales Band oder eine Zone12 vorgesehen, die sich über die gesamte Streifenbreite erstreckt. Eine kleine Region13 des Streifens10 liegt senkrecht unterhalb der Zone12 . Oberhalb der Zone12 gibt es eine zweite Zone14 , die in einem bestimmten Abstand weiter oben auf dem Streifen10 liegt und sich ebenfalls über die gesamte Streifenbreite erstreckt. Die Region15 des Streifens10 zwischen den Zonen12 und14 kann eine beliebige Höhe haben, solange die beiden Zonen voneinander getrennt sind. Eine weitere Region16 des Streifens erstreckt sich oberhalb der Zone14 , und am oberen Ende des Streifens bei 17 gibt es ein fest mit dem Streifen verbundenes, poröses Kissen18 , so daß das Kissen18 als "Falle" für jegliche Flüssigkeitsprobe dienen kann, die durch Kapillarwirkung durch den Streifen10 aufsteigt. - Die Zone
12 ist mit einem ersten Antikörper beladen, der einen sichtbaren ("direkten") Markierungsstoff (z. B. gefärbte Latexteilchen, Farbsol oder Gold-Sol) trägt. Dieses Reagenz kann in Gegenwart einer Flüssigkeitsprobe frei durch den Streifen wandern. In Zone14 ist der Streifen mit einem zweiten Antikörper mit Spezifität für unterschiedliche Epitope auf der gleichen Nachweissubstanz wie der erste Antikörper imprägniert. Der zweite Antikörper ist fest auf dem Streifen immobilisiert. -
2 veranschaulicht, was bei Verwendung des Teststreifens in einem analytischen Verfahren geschieht. Das untere Ende11 des trockenen Streifens wird mit einer (nicht gezeigten) Flüssigkeitsprobe in Kontakt gebracht, die die zu bestimmende Nachweissubstanz enthalten kann. Kapillarwirkung verursacht ein Aufsteigen der Flüssigkeit durch den Streifen, worauf schließlich das Kissen18 erreicht wird. Dabei durchquert die Probe die Zone12 , und der markierte Antikörper dispergiert sich in der Probe und. wandert mit dieser durch den Streifen. Während der Wanderung in Richtung zur Zone14 kann der markierte Antikörper an jede in der Probe vorliegende Nachweissubstanz binden. Nach Erreichen der Zone14 sollte jedes Molekül der Nachweissubstanz an den zweiten Antikörper gebunden werden, wodurch das so gebildete markierte "Sandwich" immobilisiert wird. Wenn eine signifikante Konzentration der zu bestimmenden Nachweissubstanz in der Flüssigkeitsprobe vorliegt, erscheint in kurzer Zeit eine Akkumulierung des sichtbaren Markierungsstoffs in Zone14 . - Als Analysenbeispiel, auf das diese Ausführungsform angewendet werden kann, kann die Nachweissubstanz hCG sein, die Reagenzien in Zone
12 und14 können monoklonale Antikörper für hCG sein, die an einer "Sandwich"-Reaktion mit hCG teilnehmen, und der Markierungsstoff kann eine teilchenförmige Farbe, ein Gold-Sol oder gefärbte Latexteilchen sein. - Obgleich das obige Ausführungsbeispiel mit Bezug auf eine "Sandwich"-Reaktion beschrieben wurde, erkennt der Fachmann leicht, daß diese auf Wunsch zu einer "Konkurrenz"-Reaktion (kompetitiven Reaktion) modifiziert werden kann, wobei das markierte Reagenz in Zone
12 die Nachweissubstanz oder ein Analog der Nachweissubstanz ist. - Ein auf den obigen Prinzipien beruhender Test kann durch die Wahl geeigneter spezifischer Bindungsreagenzien zur Bestimmung vieler verschiedener Nachweissubstanzen verwendet werden. Die Nachweissubstanzen können z. B. sein: Proteine, Haptene, Immunoglobuline, Hormone, Polynukleotide, Steroide, Arzneimittel oder Drogen, Infektionskrankheitserreger (z. B. bakteriellen oder viralen Ursprungs), wie Streptococcus, Neisseria und Chlamydia. Sandwichassays können z. B. auf Nachweissubstanzen, wie hCG, LH und Infektionskrankheitserreger, durchgeführt werden, während kompetitive Assays z. B, für Nachweissubstanzen, wie E-3-G und P-3-G, durchgeführt werden können.
- Die Bestimmung des (möglichen) Vorliegens von mehr als einer Nachweissubstanz in der Probe kann von signifikantem klinischen Wert sein. So kann z. B. das Verhältnis der Konzentrationen der Apolipoproteine A1 und B ein Anzeichen einer Anfälligkeit für eine koronare Herzerkrankung sein. In ähnlicher Weise kann das Verhältnis der Konzentrationen von glyciertem Hämoglobin (HbA) zu unglyciertem (HbAo) oder Gesamthämoglobin (Hb) bei der Behandlung von Diabetes nützlich sein. Ferner ist es möglich, Tests zum gleichzeitigen Messen von zwei Steroiden, z.B. E-3-G und P-3-G, zu erstellen. Beispielsweise kann ein dualer Nachweissubstanz-Test auf Apolipoproteine A1 und B konzipiert werden, indem man als zwei räumlich getrennte Zonen den für Apolipoprotein A1 spezifischen Antikörper über eine erste Zone abscheidet und einen für Apolipoprotein B spezifischen zweiten Antikörper über die zweite Zone einer porösen Trägermatrix abscheidet. Nach der Aufbringung der beiden Antikörper auf ihre jeweiligen Zonen durch ein geeignetes Aufbringverfahren (z. B. Tintenstrahldrucken, durch Meßpumpenstift oder Luftbürste) sollte der Rest des porösen Materials mit einem Reagenz, z. B. Rinderserumalbumin, Polyvinylalkohol oder Ethanol, behandelt werden, um alle anderswo verbleibenden Bindungsstellen zu blockieren. Ein einen Markierungsstoff tragendes. drittes und viertes Reagenz können dann in einer oder mehreren Zone nahe einem Ende des Streifens aufgebracht werden, wobei man den Streifen zwischen den Aufbringungen der beiden Reagenzien auf die gleiche Zone trocknen läßt. Das Reagenz
3 und Reagenz4 können Konjugate von Anti-Apolipoprotein A1-Antikörper bzw. - Anti-Apolipoprotein B-Antikörper umfassen. Diese beiden Konjugate werden in und auf dem Träger in feuchtem Zustand beweglich. Die Reagenzien
3 und4 können mit dem Lösungsmittelfluß wandern, wenn eine wäßrige Probe auf das erste Ende des Trägerstreifens aufgebracht wird. Während der weiteren Wanderung entlang des Streifens in Richtung auf die beiden Zonen kann das Reagenz3 alles in der Probe vorliegende Apolipoprotein A1 binden, und das Reagenz4 kann alles in der Probe vorliegende Apolipoprotein B binden. Nach Erreichen der ersten Zone des zweiten Antikörpers (Anti-Apolipoprotein A1-Antikörper-Zone) sollten die Anti-Apolipoprotein A1-Moleküle an den zweiten Antikörper gebunden werden, wodurch das so produzierte markierte "Sandwich" immobilisiert wird. Keine markierten Apolipoprotein-B-Moleküle binden an diese erste Zone. Nach Erreichen der zweiten Zone des zweiten Antikörpers (Anti-Apolipoprotein B-Antikörper-Zone) sollten jegliche Apolipoprotein B-Moleküle an den zweiten Antikörper (Festphasenantikörper) gebunden werden, was das so produzierte markierte "Sandwich" immobilisiert. Keine markierten Apolipoprotein A1-Moleküle binden an die zweite Zone. Eine Akkumulierung jedes der Direktemarkierungsstoffe kann an beiden oder an einer der Zonen in mehr oder weniger starken Ausmaß erfolgen, was zu einem sichtbaren Signal in einer oder beiden Festphasenantikörperzonen führt. Überschüssiges ungebundenes Konjugat (sowohl von Reagenz3 als auch von Reagenz4 ) kann frei über die beiden Antikörperzonen laufen und wird in das distale Ende des Streifens hineingewaschen. - Die Entwicklung einer quantifizierbaren Farbe in beiden Zonen des zweiten Antikörpers kann mit geeigneten Instrumenten bestimmt werden, die ein Verhältnis der Farbdichte zwischen den beiden Stellen liefern.
- Die Bestimmung des Vorliegens von mehr als zwei (d.h. mehreren) Nachweissubstanzen in irgendeiner Probe kann von signifikantem klinischen Wert sein. Der Nachweis des Vorliegens mehrerer unterschiedlicher Serotypen eines Bakteriums oder der Nachweis des Vorliegens von löslichen serologischen Markierungsstoffen beim Menschen kann wertvoll sein. So kann beispielsweise ein multip ler Test für den Nachweis des Vorliegens unterschiedlicher Serotypen von Streptococcus für die Gruppen A, B, C und D erstellt werden. Ein Cocktail aus jeweils für verschiedene pathologisch wichtige Gruppenserotypen spezifischen monoklonalen Antikörpern oder eines polyklonalen Antiserums gegen eine spezielle Streptococcus-Gruppe kann auf einem porösen Trägerstreifen als Linie aufgebracht werden, die sich über die Breite des Streifen von etwa 1 mm Zonenlänge erstreckt. Mehrere Linien können in räumlich getrennten Zonen aufgebracht werden, wobei jede Zone eine oder mehrere immunochemisch reaktive Komponente(n) enthält, die die interessierende Nachweissubstanz binden können. Nach Aufbringung der mehrfachen Zonen durch ein geeignetes Aufbringungsverfahren (z. B. Tintenstrahldrucken, Meßpumpe und Stift, Luftbürste), sollte der Rest des porösen Materials mit einem Reagenz (z. B. Rinderserumalbumin, Polyvinylalkohol, Ethanolamin) behandelt werden, um alle anderswo verbleibenden Bindungsstellen zu blockieren. Konjugate des Markierungsstoffs, z. B. ein Farbsol, und jede immunochemisch reaktive Komponente, die für jede Bakteriengruppe spezifisch ist, können dann entweder auf eine einzelne Zone am unteren Ende des Streifens proximal zur Probenaufbringzone oder als eine Reihe getrennter Zonen aufgebracht werden.
- Die
3 ,4 und5 der beiliegenden Zeichnungen veranschaulichen ein vollständiges Gerät unter Verwendung eines soeben beschriebenen porösen Streifens.3 zeigt ein von vorn gesehenes vollständiges Gerät,4 ist ein Teilschnitt des gleichen Geräts, um Details des Streifens im Inneren zu zeigen, und5 zeigt die Unterseite des Gerätes. - In
3 umfaßt das Gerät einen flachen rechteckigen Körper30 , dessen Vorderseite31 von einem kreisförmigen Loch oder Fenster32 durchbrochen ist, das den porösen Teststreifen10 innerhalb der Körpers zeigt. Der durch das Fenster32 sichtbare Bereich des Teststreifens10 beinhaltet eine schmale horizontale Zone14 . - In
4 umfaßt die Gerät einen trockenen rechteckigen Teststreifen10 aus porösem Material, der sich von unteren Ende33 des Körpers30 innerhalb des Körpers zwischen der Vorderseite31 und der Rückseite34 des Körpers erstreckt. Nahe beim unteren Ende11 des Streifens10 befindet sich eine horizontale Zone12 , die ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz für eine Nachweissubstanz trägt, wobei das Bindungsreagenz im Teststreifen in feuchtem Zustand beweglich ist. weiter oben am Teststreifen befindet sich die schmale horizontale Zone14 , die durch das Fenster32 sichtbar ist. Am oberen Ende17 vom Teststreifen10 gibt es eine poröse "Falle" 18, die jegliche Flüssigkeitsprobe absorbieren kann, die aufwärts durch den Streifen gewandert ist. - In
5 weist die Unterkante35 des Körpers30 eine seitliche Öffnung auf, in welcher das untere Ende11 des Streifens liegt. - Beim Gebrauch wird das untere Ende
33 des Körpers30 in eine Flüssigkeitsprobe (z. B. Urin) eingetaucht, so daß letztere durch das untere Ende11 des Teststreifens20 absorbiert werden kann . und durch Kapillarwirkung zum oberen Ende17 des Streifens und in die Falle18 aufsteigt. Dabei läuft die Flüssigkeitsprobe durch die Zone12 zur Zone14 . Spezifische Bindungsreaktionen erfolgen wie oben beschrieben, und das Testergebnis ist dem Benutzer durch das Fenster32 sichtbar. - Ausführungsform 2
- Die
6 und7 der beiliegenden Ziechnungen veranschaulichen ein anderes erfindungsgemäßes Testgerät.6 zeigt das vollständige Gerät von vorn gesehen, und7 stellt das gleiche Gerät in teilweisem Schnitt dar, um Einzelheiten des innerhalb des Gerätekörpers enthaltenen porösen Teststreifens freizulegen. - In
6 umfaßt das Gerät einen länglichen Körper200 , der an seinem unteren Ende201 in einem kleinen integralen Aufnahmebehälter202 endet, der ein vorherbestimmtes Volumen einer Flüssigkeitsprobe, z. B. Urin, aufnehmen kann. Die Vorderseite203 des Körpers200 weist zwei quadratische kleine Öffnungen oder Fenster204 und205 auf, die übereinander angeordnet sind. - In
7 ist der längliche Abschnitt des Körpers200 hohl und enthält einen Teststreifen206 , der sich über fast die gesamte Höhe des Körpers erstreckt. Dieser Teststreifen hat eine ähnliche Konstruktion wie der unter Ausführungsform 1 beschriebene und weist nahe seinem unteren Ende207 eine horizontale Zone208 auf , die ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz trägt , das im Streifen in feuchtem Zustand frei wandern kann. Angrenzend an die Fenster204 und205 und durch diese sichtbar gibt es zwei kreisförmige Zonen209 und210 . Der Streifen endet an seinem oberen Ende211 in einer porösen Falle212 . Am unteren Ende201 des Geräts steht ein Aufnahmebehälter202 mit dem Hohlkörper über eine seitliche Öffnung213 in Verbindung. - Bei der Verwendung wird eine Flüssigkeitsprobe auf das untere Ende des Gerätes aufgebracht, und ein vorherbestimmtes Volumen der Probe füllt den Aufnahmebehälter
202 . Aus dem Aufnahmebehälter202 steigt die Flüssigkeitsprobe durch Kapillarwirkung durch den Teststreifen206 aufwärts und führt das markierte Reagenz von Zone208 zu den beiden kreisförmigen Zonen209 und210 . Es erfolgt eine Reihe spezifischer Bindungsreaktionen, wie sie oben mit Bezug auf Ausführungsform 1 beschrieben sind. Bei dieser Ausführungsform kann die zweite kreisförmige Zone210 als Kontrolle dienen (wobei z. B. ein Farbsignal erzeugt wird, ungeachtet davon, ob die Probe die zu bestimmende Nachweissubstanz enthält oder nicht), und die Bestimmung der Nachweissubstanz erfolgt in der ersten kreisförmigen Zone209 . Der Benutzer kann durch Vergleichen des in den beiden Zonen erzeugten Signals feststellen, ob die Nachweissubstanz in der Probe vorliegt. - Wenn z. B. der Test im Verlauf eines Schwangerschaftstests verwendet wird, um das Vorliegen von hCG im Urin nachzuweisen, dann kann die kreisförmige Kontrollzone
210 immobilisiertes hCG ent halten, das einen markierten Antikörper bindet, der durch die wandernde Flüssigkeitsprobe aus der Zone208 nach oben geführt wird. Der gleiche markierte Antikörper kann mit hCG in der Probe an einer Sandwich-Reaktion teilnehmen und wird in der ersten kreisförmigen Zone209 durch einen anderen spezifischen Anti-hCG-Antikörper gebunden, der darin immobilisiert wurde. Alternativ kann die "Kontroll"-Zone auf Wunsch auch konzipiert sein, um dem Benutzer einfach ein unspezifisches Signal zu vermitteln, daß das Gerät gearbeitet hat. Beispielsweise kann die zweite kreisförmige Zone mit einem Antikörper beladen sein, der an den markierten Antikörper aus Zone208 bindet, z. B. mit einem "Anti-Maus"-Antikörper, wenn der markierte Antikörper ein unter Verwendung eines Murinhybridoms abgeleiteter ist, um zu bestätigen, daß die Probe den Teststreifen durchlaufen hat. - Ausführungsform 3
-
8 der beiliegenden Zeichnungen zeigt eine isometrische Darstellung eines erfindungsgemäßen Testgerätes, und9 ist ein seitlicher Querschnitt des in8 gezeigten Gerätes. - In
8 umfaßt das Gerät ein Gehäuse500 von länglicher rechteckiger Form mit einem Abschnitt502 von vermindertem Querschnitt an einem Ende501 . Eine Kappe503 kann auf den Abschnitt502 aufgesetzt werden und gegen die Schulter504 am Ende501 des Gehäuses anschlagen. Die Kappe503 ist vom Gehäuse500 getrennt gezeigt. Ein poröses Element506 erstreckt sich über das Ende505 des Abschnitts502 hinaus. Wenn die Kappe503 auf den Abschnitt502 des Gehäuses aufgesetzt ist, bedeckt sie das poröse Element506 . Die obere Seite 507 des Gehäuses500 weist zwei Öffnungen 508 und 509 auf. - Aus
9 ist ersichtlich, daß das Gehäuse500 hohl ist. Das poröse Element506 erstreckt sich in das Gehäuse500 hinein und berührt einen Streifen von porösen Trägermaterial510 . Das poröse Element506 und der Streifen510 überlappen, um sicherzustellen, daß es einen angemessenen Kontakt zwischen diesen beiden Materialien gibt und daß eine auf das Element506 aufgebrachte Flüssigkeitsprobe das Element506 durchdringen und in den Streifen510 weiterlaufen kann. Der Streifen510 erstreckt sich weiter in das Gehäuse500 . Der Streifen510 ist von einem Trägerstreifen511 "verstärkt", der aus durchsichtigem feuchtigkeitsundurchlässigen Kunststoffmaterial besteht. Der Streifen510 erstreckt sich über die Öffnungen508 und509 hinaus. Innerhalb des Gehäuses500 sind durch Stege512 und513 Mittel vorgesehen, um den Streifen510 fest an seinem Ort zu halten. Hierbei sind Einzelheiten der inneren Konstruktion des Gehäuses kein signifikanter Aspekt der Erfindung, solange der Streifen innerhalb des Gehäuses an seinem Platz festgehalten ist und das poröse Element506 im Gehäuse fest gesichert ist und ein angemessener flüssigkeitsdurchlässiger Kontakt zwischen dem Element506 und dem Streifen510 aufrechterhalten wird. Der durchsichtige Verstärkungsstreifen511 liegt zwischen dem Streifen510 und den Öffnungen508 und509 und kann als Dichtung wirken, um den Feuchtigkeitseintritt von außen über diese Öffnungen in das Gehäuse zu verhindern. Auf Wunsch kann der restliche Raum514 innerhalb des Gehäuses ein feuchtigkeitsabsorbierendes Material, wie Silicagel, enthalten, damit der Streifen510 während der Lagerung in trockenem Zustand gehalten wird. Die reagenzhaltigen Zonen im Streifen510 sind in8 nicht dargestellt, aber die erste Zone, die das markierte Reagenz enthält, das beweglich ist, wenn der Streifen befeuchtet wird, liegt innerhalb des Bereiches zwischen dem porösen Element506 und der Öffnung508 . Die das immobilisierte unmarkierte Reagenz enthaltende zweite Zone liegt in dem durch die Öffnung508 freigelegten Bereich, so daß bei Verwendung des Gerätes in einem Assay das Ergebnis durch die Öffnung508 beobachtet werden kann. Die Öffnung509 bietet die Möglichkeit, eine Kontrollzone, die weitere Reagenzien enthält, die das angemessene Hindurchdringen der Probe durch den Streifen ermöglichen können, zu beobachten. - Bei der Verwendung wird die Schutzkappe
503 vom Halter entfernt, und das Element506 wird einer Flüssigkeitsprobe ausgesetzt, z. B. indem es im Fall eines Schwangerschaftstests in einen Urinstrahl gehalten wird. Nachdem das Element506 eine ausreichende Dauer der Flüssigkeitsprobe ausgesetzt wurde, um sicherzustel len, daß das Element506 mit der Probe gesättigt ist, kann die Kappe503 erneut aufgesteckt werden, und das Gerät wird vom Benutzer für eine genügende Zeit (z. B. 2 oder 3 min) beiseite gestellt, während die Probe den Teststreifen510 durchdringt, um das Analysenergebnis zu liefern. Nach der entsprechenden Zeit kann der Benutzer den Teststreifen durch die Öffnungen508 und509 beobachten und durch Beobachtung der Kontrollzone durch die Öffnung509 feststellen, ob der Assay beendet ist; zur Feststellung des Testergebnisses wird die zweite Zone durch die Öffnung508 beobachtet. - Während der Herstellung kann das Gerät einfach aus z. B. Kunststoffmaterial zusammengebaut werden, wobei das Gehäuse
500 in zwei Teilen (z. B. den oberen und unteren Hälften515 und516 ) geformt wird, die sicher miteinander befestigt werden (z. B. durch Ultraschallschweißen), nachdem das poröse Element und der Teststreifen in eine der Hälften eingebracht und dann in Sandwichweise zwischen den beiden Hälften angeordnet wurden. Der Herstellungsvorgang dieser Sandwichkonstruktion kann angewendet werden, um das poröse Element und den Teststreifen "zusammenzupressen", um den genügenden Kontakt zwischen den beiden Elementen sicherzustellen. Die Kappe503 kann als getrenntes vollständiges Bauteil geformt werden. Auf Wunsch können die Öffnungen508 und509 mit durchsichtigen Einsätzen versehen werden, die eine größere Sicherheit gegen den Eintritt von Fremdfeuchtigkeit von der Außenseite des Gehäuses gewährleisten. Aufgrund der dichten Passung zwischen dem Ende505 des Gehäuses500 und dem vorstehenden porösen Element506 erfolgt bei der Aufbringung der Probe auf das vorstehende Element kein direkter Eintritt der Probe in das Gerät, und das Element506 wird nicht umgangen. Daher bietet das Element506 der Probe den einzigen Zugang zum Streifen innerhalb des Gehäuses, und es kann die Probe in geregelter Weise an den Streifen abgeben. Das Gerät als ganzes vereinigt daher die Funktionen des Probenehmens und Analysierens. - Durch Verwendung der im folgenden beschriebenen Teststreifenmaterialien und Reagenzien kann ein Gerät entsprechend den
8 und9 hergestellt werden, das zum Einsatz als Schwanger schaftstestkit oder als 0vulationszyklustestkit zum Gebrauch zu Hause oder in der Klinik besonders geeignet ist. Der Benutzer braucht nur eine Urinprobe auf das freigelegte poröse Element aufzubringen und kann dann (wahlweisse nach Aufsetzen der Kappe) innerhalb weniger Minuten das Testergebnis durch die Öffnung508 beobachten. - Obgleich mit besonderem Bezug auf Schwangerschaftstests und Ovulationszyklustests beschrieben, kann das soeben beschriebene Gerät selbstverständlich auch eingesetzt werden, um das Vorliegen einer sehr großen Vielfalt von Nachweissubstanzen zu bestimmen, wenn in den Teststreifen entsprechende Reagenzien eingebracht werden. Ferner ist die Öffnung
509 selbstverständlich fakultativ und kann weggelassen werden, wenn der Teststreifen keine Kontrollmittel enthält. Ferner können die allgemeine Form von Gehäuse und Kappe sowohl bezüglich ihrer Länge, ihres Querschnittes und anderer physikalischer Merkmale erheblichen Variationen unterzogen werden, ohne vom Geist der Erfindung abzuweichen . -
10 der beiliegenden Zeichnungen zeigt eine vergrößerte Ansicht des porösen Aufnahmeelementes und Teststreifens in dem in8 und9 dargestellten Gerät. - Das poröse Aufnahmeelement
506 ist an dem porösen Teststreifen510 befestigt, der durch die durchsichtige Kunststoffolie511 verstärkt ist, so daß Flüssigkeit in der durch die Pfeile angezeigten Richtung durch das poröse Aufnahmeelement und in den porösen Streifen fließen kann. Die Testzone517 umfaßt das immobilisierte spezifische Bindungsreagenz, und die Kontrollzone518 enthält ein Reagenz, das anzeigt, daß die Probe einen genügenden Abstand des Teststreifens durchwandert hat. Ein Abschnitt der Teststreifenoberfläche gegenüber dem Verstärkungsstreifen511 und angrenzend an das poröse Aufnahmeelement506 trägt eine Glasur 519, auf der eine Schicht520 von markiertem spezifischen Bindungsreagenz abgeschieden ist. Die Dicke dieser beiden Schichten gemäß Darstellung in10 ist zur Verdeutlichung stark übertrieben. Selbstverständlich bildet die Glasur in der Praxis möglicherweise keine echte Oberflächenschicht, und das Glasurmaterial durchdringt in gewissem Maß die Dicke des Streifens. In ähnlicher Weise kann auch das anschließend aufgebrachte markierte Reagenz in den Streifen eindringen. Dennoch wird der wesentliche Zweck einer verminderten Wechselwirkung zwischen dem markierten Reagenz und dem den Streifen bildenden Trägermaterial erreicht. Eine in das Aufnahmeelement506 gegebene wäßrige Probe kann aus diesem den Streifen510 entlangfließen; hierbei löst sie die Glasur519 , mobilisiert das markierte Reagenz und führt es entlang des Streifens und durch die Zone517 . - Ausführungsform 4
- Die
11 und12 zeigen eine andere Ausführungsform der Erfindung, die in Draufsicht in11 und im Schnitt in12 gezeigt ist, wobei der Schnitt entlang der Linie A von11 verläuft. - In
11 umfaßt das Testgerät ein flaches rechteckiges Gehäuse600 , das eine zentral angeordnete rechteckige Öffnung601 in der Nähe des linken Endes602 und zwei weitere Öffnungen603 und 604 in der Nähe der Mitte des Gerätes aufweist, die so angeordnet sind, daß die Öffnungen601 ,603 und604 auf der zentralen Längsachse der Gerät entsprechend der Linie A liegen. Obgleich alle drei Öffnungen als rechteckig dargestellt sind, ist ihre tatsächliche Form nicht kritisch. - Bei dem in
12 gezeigten Schnitt ist die Gerät hohl und umfaßt in seinem Inneren ein poröses Probenaufnahmeelement, in der Nähe des Endes602 des Gehäuses600 , das, unmittelbar unterhalb der Öffnung601 liegt. Ein Teststreifen von ähnlichem Auf bau, wie er mit Bezug auf Ausführungsform 4 beschrieben ist, der einen durch eine durchsichtige Kunststoffolie607 verstärkten porösen Streifen606 umfaßt, befindet sich ebenfalls innerhalb des Gehäuses600 und erstreckt sich vom porösen Aufnahmeelement602 , mit dem der poröse Träger in füssigkeitsdurchlässigem Kontakt steht, zum äußeren anderen Ende des Gehäuses. Die durchsichtige Verstärkungsfolie607 steht in festem Kontakt mit der unteren inneren Oberfläche608 des Gehäuses600 und ergibt eine Dichtung gegen die Öffnungen603 und604 , um den Eintritt von Feuchtigkeit oder Probe in das Gehäuse zu verhindern. Obgleich dies in den Zeichnungen nicht gezeigt wird, umfaßt der poröse Teststreifen606 ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz, eine Testzone und eine Kontrollzone, die in entsprechender Relation zu den Öffnungen603 und604 in analoger Weise zur Beschreibung in Ausführungsform 3 angeordnet sind. - Beim Gebrauch kann eine wäßrige Probe durch Öffnung
601 , z. B. mittels einer Spritze, aufgebracht werden, um das poröse Aufnahmeelement605 zu sättigen. Danach kann die wäßrige Probe den Teststreifen durchlaufen, und nach einer angemessenen Zeit kann das Testergebnis durch die Öffnungen603 und604 festgestellt werden. - Nur als Beispiel werden nun bestimmte bevorzugte Teststreifenmaterialien, Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben.
- 1. Wahl des flüssigkeitsleitenden Materials
- Repräsentative Beispiele flüssigkeitsleitender Materialien umfassen Papier, Nitrocellulose und Nylonmembranen. Wesentliche Merkmale des Materials sind seine Fähigkeit zum Binden von Protein, die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsleitung und, falls nötig nach Vorbehandlung, seine Fähigkeit, die Passage markierter Antikörper entlang des Streifens zuzulassen. Wenn es sich um einen Direktmarkierungsstoff handelt, kann es wünschenswert sein, daß das Material den Fluß von Teilchen einer Größe von bis zu einigen μm (gewöhnlich weniger als 0,5 μm) erlaubt. Beispiele der mit verschiedenen Materialien erhaltenen Fließge schwindigkeiten sind unten angegeben:
- Die Geschwindigkeit eines Testverfahrens wird durch die Fließgeschwindigkeit des verwendeten Materials bestimmt, und obgleich jedes der obigen Materialien verwendet werden kann, ergeben einige schnellere Tests als andere.
- Nitrocellulose hat den Vorteil, keine Aktivierung zu erfordern, und sie immobilisiert Proteine stark durch Absorption. "Immunodyne" ist voraktiviert und erfordert keine chemische Behandlung, Papiere, wie Whatman 3MM, erfordern zum erfolgreichen Immobilisieren des Antikörpers eine chemische Aktivierung mit z. B. Carbonyldiimidazol.
- 2. Markierungsstoff
- Herstellung der Markierungsstoffe
- Eine Auswahl verwendbarer Markierungsstoffe wird im folgenden beschrieben, wobei diese Liste nicht erschöpfend ist.
- A) Goldsolherstellung
- Zur Verwendung in Immunoassays können Gold-Sole aus kommerziell erhältlichem kolloidalen Gold und einem Antikörperpräparat, z. B. Anti-alpha-Humanchoriongonadotropin, hergestellt werden. Metall-Solmarkierungsstoffe werden z. B. in der europäischen Patentschrift
EP 7654 - So wird z. B. kolloidales Gold G20 (20 nm Teilchengröße, geliefert von Janssen Life Sciences Products) mit 0,22 μm filtriertem 0,1 M K2CO3 auf pH 7 eingestellt, und 20 ml werden in einen sauberen Glasbecher gegeben. 200 μm Anti-alpha-hCG-Antikörper, hergestellt in 2 mM Boraxpuffer pH 9 bei 1 mg/ml und 0,22 μm filtriert, werden zum Goldsol zugefügt, und die Mischung wird 2 min ständig gerührt. 0,1 M K2CO3 wird zur Einstellung des pH-Wertes der Antikörper-Gold-Sol-Mischung auf 9 verwendet, und es werden 2 ml 10-%iges (Gew./Vol.) RSA zugefügt.
- Das Antikörper-Gold-Material wird in einer Reihe von drei Zentrifugierschritten bei 12000 g 30 min bei 4°C gereinigt, wobei nur der lose Teil des Pellets erneut zur weiteren Verwendung suspendiert wird. Das Endpellet wird in 1-%igem (Gew./Vol.) RSA in 20 mM Tris, 150 mM NaCl pH 8,2, suspendiert.
- B) Farbsolherstellung
- Farbsole (vgl. z. B. die europäische Patentschrift EP 32 270) können aus kommerziell erhältlichen hydrophoben Farbstoffen, wie Foron Blau SRP R (Sandoz) und Resolin Blau BBLS® (Bayer) hergestellt werden. Zum Beispiel werden 50 g Farbstoff in 1 1 destilliertem Wasser durch 2 bis 3 min langes Mischen mittels Magnetrührer dispergiert. Die Fraktionierung der Farbdispersion kann durch einen Anfangszentrifugierschritt bei 1500 g für 10 min bei Raumtemperatur erfolgen, um größere Solteilchen als festes Pellet zu entfernen, wobei die überstehende Suspension zum weiteren Zentrifugieren zurückgehalten wird.
- Die Suspension wird bei 3000 g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, das überstehende Material wird verworfen, und das Pellet wird erneut in 500 ml destilliertem Wasser suspendiert. Dieser Vorgang wird weitere dreimal wiederholt, wobei das Endpellet erneut in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert wird.
- Die Spektren der wie oben beschrieben hergestellten Farbsole können gemessen werden, was lambda-max-Werte von etwa 657 nm für Foron Blau® und 690 nm für Resolin Blau® liefert. Die Absorptionsfähigkeit bei lambda-max für 1 cm Weglänge wird als willkürliches Maß für die Farbsolkonzentration angenommen.
- C) Gefärbte Teilchen
- Latex(Polymer)teilchen zur Verwendung in Immunoassays sind kommerziell erhältlich. Diese können auf einem Bereich von synthetischen Polymeren, wie Polystyrol, Polyvinyltoluol, Polystyrol/ Acrylsäure und Polyacrolein, basieren. Die verwendeten Monomeren sind normalerweise in Wasser unlöslich und werden in einem wäßrigen oberflächenaktiven Mittel emulgiert, so daß Monomermyzellen gebildet werden, die durch Zugabe eines Initiators zur Emulsion zum Polymerisieren angeregt werden können. Es werden im wesentlichen kugelförmige Polymerteilchen gebildet.
- Gefärbte Latexteilchen können entweder durch Einbringen eines geeigneten Farbstoffes, wie Anthrachinon, in die Emulsion vor dem Polymerisieren oder durch Färben der vorgebildeten Teilchen hergestellt werden. Beim letztgenannten Weg sollte der Farbstoff in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Chloroform, gelöst sein, das dann zu einer wäßrigen Suspension der Latexteilchen zugefügt wird. Die Teilchen nehmen das nichtwäßrige Lösungsmittel und die Farbe auf und können dann getrocknet werden.
- Diese Latexteilchen haben vorzugsweise eine maximale Dimension von weniger als etwa 0,5 μm.
- Gefärbte Latexteilchen können mit Protein, insbesondere Antikörpern, sensibilisiert werden, um Reagenzien zur Verwendung in Immunoassays zu ergeben. So können z. B. Polystyrolkügelchen von etwa 0,3 μm Durchmesser (geliefert von Polymer Laboratories) mit Anti-alpha-Humanchoriongonadotropin im unten beschriebenen Verfahren sensibilisiert werden:
- 0,5 ml (12,5 mg Feststoffe) Suspension werden mit 1 ml 0,1 M Boratpuffer pH 8,5 in einem Eppendorf-Gläschen verdünnt. Diese Teilchen werden viermal in Boratpuffer gewaschen, wobei jede Wäsche aus einem 3 min langen Zentrifugieren bei 13000 U/min in einer MSE-Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur besteht. Das Endpellet wird erneut in 1 ml Boratpuffer suspendiert, mit 300 μg anti-alpha-hCG-Antikörper gemischt, und die Suspension wird kopfüber 16 bis 20 h bei Raumtemperatur rotiert. Die Antikörper-Latex-Suspension wird 5 min bei 13000 U/min zentrifugiert, das überstehende Material wird verworfen, und das Pellet wird erneut in 1,5 ml Boratpuffer, der 0,5 mg Rinderserumalbumin enthält, suspendiert. Nach einer Kopfüberrotation für 30 min bei Raumtemperatur wird die Suspension dreimal in 5 mg/ml RSA in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,2 durch 5 min langes Zentrifugieren bei 13000 U/min gewaschen. Das Pellet wird erneut in 5 mg/ml RSA/5% (Gew./Vol.) Glycerol in phosphatgepufferter Salzlösung . pH 7,2 suspendiert und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
- (A) Herstellung des Anti-hCG-Farbsols
- Protein kann an das Farbsol in einem sich der passiven Adsorption bedienenden Verfahren gekuppelt werden. Das Protein kann z. B. ein Antikörperpräparat, wie anti-alpha-Humanchoriumgonadotropin, sein, hergestellt in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,4 bei 2 mg/ml. Es wird eine Reaktionsmischung hergestellt, die 100 μl Antikörperlösung, 2 ml Farbsol, 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 5,8 und 15,9 ml destilliertes Wasser enthält. Nach vorsichtigem Mischen dieser Lösung wird das Präparat 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Überschüssige Bindungsstellen können durch Zugabe von z. B. Rinderserumalbumin blockiert werden: 4 ml von 150 mg/ml RSA in 5 mM NaCl pH 7,4 werden zur Reaktionsmischung zugefügt, und nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lösung bei 3000 g 10 min zentrifugiert; das Pellet wird erneut in 10 ml 0,25 %igem (Gew./Vol) Dextran/0,5-%iger (Gew./Vol.) Lactose in 0,04 M Phosphatpuffer suspendiert. Dieses Antikörper-Farbsol-Konjugat wird am besten in gefriergetrockneter Form gelagert.
- (B) Herstellung des LH-Farbsols
- Aufgrund der Strukturhomologie zwischen den alpha-Untereinheiten von hCG und LH kann alpha-hCG-Antikörper zum Nachweis von LH in einem kreuzreaktiven Immunoassay verwendet werden. So kann ein markierter Antikörper hergestellt werden, um in einem LH-Assay in identischer Weise verwendet zu werden, wie dies in Beispiel 1 unter Verwendung von Anti-alpha-hCG-Antikörper beschrieben ist.
- 3. Herstellung des Reagenzstreifens
- Zonenimprägnierung flüssiakeitsleitender Materialien
- Flüssigkeitsleitendes Material mit einer begrenzten Zone von immobilisiertem Protein, insbesondere Antikörper, kann z. B. wie folgt hergestellt werden:
- Auf einem rechteckigen Streifen (von Schleicher und Schüll) verstärkter 8 μm-Nitrocellulose von 25 cm Länge und 20 cm Breite kann eine Reaktionszone gebildet werden, indem man eine Materiallinie von etwa 1 mm Breite in 5 cm-Intervallen entlang seiner Länge, die sich über seine gesamte Breite von 20 cm erstreckt, aufbringt. Das Material kann z. B. ein entsprechend gewähltes Antikörperpräparat sein, wie Anti-beta-(Humanchoriongonadotropin) einer Affinität Ka bei 109 sein, hergestellt in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,4 bei 2 mg/ml und für Immunoassays auf Humanchoriongonadotropin unter Verwendung eines zweiten (markierten) Anti-hCG-Antikörpers in Sandwichformat geeignet. Diese Lösung kann mittels einer durch Mikroprozessor gesteuerten Mikrospritze abgeschieden werden, die genaue Volumina des Reagenzes durch eine Düse, vorzugsweise von 2 mm Durchmesser, abgibt. Nachdem das auf gebrachte Material 1 h bei Raumtemperatur trocknen konnte, werden überschüssige Bindungsstellen auf der Nitrocellulose mit einer inerten Verbindung, wie Polyvinylalkohol (1% Gew./Vol. in 20 mM Tris pH 7,4), 30 min bei Raumtemperatur blockiert, und die Folien werden gründlich mit destilliertem Wasser gespült, bevor sie 30 min bei 30°C getrocknet werden.
- Der Markierungsstoff kann in oder auf eine begrenzte Zone dispergiert/abgeschieden werden, bevor das flüssigkeitsleitende Material in Streifen geschnitten wird. Beispielsweise kann dieses Reagenz ein Farbsol oder ein Farb-Polymer-konjugierter Anti-hCG-Antikörper sein, hergestellt wie unter der Farbsolherstellung beschrieben, wobei dieses Reagenz in der Zone zurückgehalten wird, wenn sich das Material in trockenem Zustand befindet, jedoch frei durch das Trägermaterial wandert, wenn dieses befeuchtet wird, und zwar z. B. durch Aufbringen einer die zu bestimmende Nachweissubstanz enthaltenden Flüssigkeitsprobe. Diese bewegliche Reagenzzone wird z. B. wie folgt aufgebracht:
- Eine Folie (von Schleicher und Schüll) verstärkter 8 μm-Nitrocellulose von 25 cm Länge und 20 cm Breite mit Zonen von immobilisiertem Antikörper in 5 cm-Intervallen entlang ihrer Länge wird wie oben beschrieben hergestellt. Vor dem Abscheiden des farbmarkierten Antikörpers wird eine Unterschicht von z. B. 60-%iger Gew./Vol. Saccharose in destilliertem Wasser mittels Luftbürste in einem mikroprozessorgesteuerten System in 6 cm-Intervallen entlang der Folienlänge aufgebracht. Dann werden verschiedene Durchgänge (z. B. drei) von farbmarkiertem Antikörper, hergestellt in 1% Methacel KAM® (Warenzeichen für Methylcellulose von Dow Chemical Comp.) und 0,6% (Gew./Vol.) Polyvinylalkohol mittels Luftbürste oder Mikrospritze oben auf die Unterschicht aufgebracht. Dann läßt man die Folien trocknen und schneidet sie in Streifen von 5 cm Länge und 1 cm Breite, um in dem kompletten Gerät verwendet zu werden.
- Goldsole oder gefärbte Polystyrolteilchen können durch ein ähnliches Verfahren abgeschieden werden.
- Zusätzlich zur Testzone können verschiedene Möglichkeiten einer Kontrollzone konzipiert werden. So kann z. B. eine Zone von Anti-Spezies-IgG nach der Testzone abgeschieden sein.
- 4. Sandwich-Assays unter Verwendung des Streifenformates
- Zum Nachweis von Humanchoriongonadotropin (hCG) in einer Flüssigkeitsprobe kann eine Sandwich-Reaktion durchgeführt werden. Der verwendete Markierungsstoff ist ein direkter Markierungsstoff, der für das bloße Auge leicht sichtbar ist. Farbsole, Gold-Sole oder gefärbte Latexteilchen können wie oben beschrieben an den anti-hCG-Antikörper gebunden sein.
- Mit Direktmarkierungsstoffen können Assays durchgeführt werden, bei denen frische Urinproben direkt aus dem Urinstrahl aufgebracht werden oder indem man ein geeignetes Volumen (z. B. 100 μl) mittels Pipette aus einem Behälter auf das absorbierende Kissen der Testvorrichtung abgibt. Man läßt jede Probe 5 min in dem Gerät laufen, und die an der reaktiven Zone gebildete Farbe wird mit dem Auge oder mittels Lichtreflektometer abgelesen.
- 5. Kompetitive Assays
- Ein kompetitiver Assay, verabschaulicht z. B. durch Östron-3-glucuronid, einen Harnmetaboliten von Östron, kann durchgeführt werden. Konjugate von Östron-3-glucuronid und Rinderserumalbumin werden wie folgt hergestellt:
- Herstellung von RSA – Östron-3-glucuronid
- Die Konjugierung von E-3-G und RSA kann durch Verwendung eines gemischten Anhydrids erreicht werden. Alle bei der Herstellung der aktivierten Spezies verwendeten Glaswaren, Lösungsmittel und Reagenzien müssen in angemessener Weise mindestens 24 h durch Verwendung eines Ofens, Exsikkators oder von Molekularsieben getrocknet sein.
- Lösungen von E-3-G (2 nM) in trockenem Dimethylformamid (DMF) und Tri-n-butylamin (TnB) (10 nM) in trockenem DMF wurden getrennt bei 4°C ins Gleichgewicht gebracht. Unter Verwendung von vorgekühlter Glasware wurden E-3-G in DMF (1,25 ml) und TnB in DMF (0,25 ml) in einen mit Magnetrührer versehenen vorgekühlten 5 ml-Reactivial-Behälter gegeben. Es wurde eine Lösung von Isobutylchlorformiat in trockenem DMF (1 nM) hergestellt, und ein Aliquot (0,25 ml) wurde auf 4°C abgekühlt und in den Reactivial-Behälter gegeben. Dessen Inhalt wurde 20 min bei 4°C gerührt, und eine Lösung von RSA (1 mg/ml) in Bicarbonatpuffer (0,5%) wurde hergestellt. Nach beendeter Inkubation des gemischten Anhydrids wurde der Reactivial-Inhalt zur RSA-Lösung (2,5 ml) zugefügt und mit einem Magnetrührer 4 h bei 4°C gerührt. Das Konjugatpräparat wurde mittels Durchgang durch eine mit Tris-Puffer ins Gleichgewicht gebrachte Pharmacia PD-10 Sephadex® G-25 Säule gereingt, zu einer bernsteinfarbenen Glaslagerflasche überführt und bei 4°C gelagert.
- Herstellung von RSA – E-3-G-Farbsol
- Eine Dispersion des Farbstoffes (5% Gew./Vol.) in destilliertem Wasser wurde durch gründliches Mischen hergestellt, und Aliquote wurden bei 3850 U/min (1500 g) 10 min in einer Tischaufsatzzentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen, und das überstehene Material wurde zurückgehalten und in Aliquoten bei 4850 U/min (3000 g) 10 min in der oben genannten Zentrifuge zentrifugiert. Das überstehende Material wurde verworfen, und das Pellet wurde erneut in der Hälfte seines ursprünglichen Volumens in destilliertem Wasser suspendiert. Dieser Schritt wurde zum Waschen des Pellets viermal wiederholt. Das Pellet wurde abschließend erneut in destilliertem Wasser suspendiert, und das Absorptionsmaß bei lambda-max wurde bestimmt.
- Lösungen von Farbol in destilliertem Wasser und E-3-G/RSA-Konjugat, in Phosphatpuffer verdünnt, wurden auf Endkonzentrationen von 10 μg/ml Konjugat (bezogen auf den RSA-Gehalt) und eine extrapolierte optische Farbsoldichte von 20 bei dem Absorptions maximum gemischt. Die Reaktionsmischung wurde 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und 15 min bei Raumtemperatur mit RSA in einer NaCl-Lösung (5 mM, pH 7,4) blockiert, um eine RSA-Endkonzentration von 25 mg/ml zu ergeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 4850 U/min (3000 g) 10 min in einer Tischaufsatzzentrifuge zentrifugiert, das überstehende Material wurde verworfen, und das Pellet wurde erneut in der Hälfte seines ursprünglichen Volumens in Dextan (0,25% Gew./Vol.)/Lactose (0,5% Gew./Vol.) Phosphatpuffer (0,04 M pH 5,8) suspendiert.
- Herstellung von E-3-G-Teststreifen
- Antikörper für E-3-G wurden wie in Beispiel 3 beschrieben abgeschieden, RSA-E-3-G-Farbsol wurde wie in 3 beschrieben auf den Streifen abgeschieden.
- Bestimmung von E-3-G
- Unter Verwendung der oben beschriebenen Reagenzien kann eine Standardkurve erstellt werden, indem man Streifen mit Proben bekannter Konzentrationen von E-3-G auswertet. Die Farbe an der unbeweglichen Zone kann z. B. mittels eines Minolta-Chromameters abgelesen werden, und die Konzentration von E-3-G wird durch Extrapolieren aus dem Reflexionswert berechnet.
Claims (22)
- Analytisches Testgerät, umfassend einen trockenen porösen Träger (
10 ), unmarkiertes spezifisches Bindungsreagenz für einen Analyten, welches unmarkierte Reagenz auf dem porösen Träger in einer Nachweiszone (14 ) permanent immobilisiert und daher in feuchtem Zustand nicht beweglich ist, und in trockenem Zustand in einer Zone (12 ) stromaufwärts von der Nachweiszone ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz für dieselbe Nachweissubstanz, welches markierte spezifische Bindungsreagenz innerhalb des porösen Trägers in feuchtem Zustand frei beweglich ist, so dass die Flüssigkeitsprobe, die dem Gerät zugeführt ist, das markierte Reagenz aufnehmen und danach in die Nachweiszone eindringen kann, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Träger und das markierte spezifische Bindungsreagenz innerhalb eines hohlen Gehäuses (30 ) enthalten sind, das aus feuchtigkeitsundurchlässigem, festem Material aufgebaut ist, der poröse Träger direkt oder indirekt mit dem Äußeren des Gehäuses derart in Verbindung steht, dass flüssige Testprobe auf den porösen Träger aufgebracht werden kann, das Gehäuse Mittel (32 ) zum Feststellen des Ausmaßes (sofern gegeben) beinhaltet, bis zu dem das markierte Reagenz in der Nachweiszone gebunden ist, der Markierungsstoff ein teilchenförmiger Direktmarkierungsstoff ist, das markierte Reagenz in einer ersten Zone (12 ) des trockenen porösen Trägers enthalten ist und das unmarkierte Reagenz in einer von der ersten Zone räumlich getrennten Nachweiszone immobilisiert ist, wobei die beiden Zonen derartig angeordnet sind, dass eine auf den porösen Träger aufgebrachte Flüssigkeitsprobe uber die erste Zone in die Nachweiszone dringen kann. - Testgerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der teilchenförmige Direktmarkierungsstoff ein Farb-Sol oder ein Gold-Sol ist.
- Testgerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass gefärbte Latexteilchen eines maximalen Durchmessers von nicht größer als etwa 0,5 μm den teilchenförmigen Direktmarkierungsstoff darstellen.
- Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse aus opakem oder durchscheinendem Material besteht und mit mindestens einer Öffnung (
32 ) versehen ist, durch die das Analysenergebnis beobachtet werden kann. - Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse aus Kunststoffmaterial geformt ist.
- Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Träger einen Streifen oder eine Folie von porösem Material umfaßt.
- Testgerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Träger einen Streifen oder eine Folie von porösem Material umfaßt, der bzw. die mit einer Schicht von durchsichtigem feuchtigkeitsundurchlässigen Material verstärkt ist, wobei die durchsichtige Schicht in der Nähe der Öffnung(en) mit der Innenseite des Gehäuses in Kontakt steht, um den Eintritt von Feuchtigkeit oder Probe zu verhindern.
- Testgerät nah Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verstärkungsmaterial ein durchsichtiges Kunststoffmaterial ist.
- Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das porose Trägermaterial Nitrocellulose ist.
- Testgerät nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nitrocellulose eine Porengröße von mindestens 1 μm hat.
- Testgerät nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Porengröße mehr als 5 μm beträgt.
- Testgerät nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Porengröße 8 bis 12 μm beträgt.
- Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in dem porösen Träger stromabwärts von der Nachweiszone (
209 ) eine Kontrollzone (210 ) aufweist, um anzuzeigen, dass die Flüssigkeitsprobe über die Nachweiszone hinausgedrungen ist, wobei die Kontrollzone ebenfalls außerhalb des Gehäuses beobachtbar ist. - Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Träger ein Streifen mit einer Absorptionsmittelfalle (
18 ) an seinem distalen Ende ist, wobei die Falle eine ausreichende Absorptionskapazität hat, damit jegliches ungebundenes markiertes Reagenz aus der Nachweiszone ausgewaschen werden kann. - Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Reagenz als Oberflächenschicht auf den porösen Träger aufgebracht ist.
- Testgerät nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Träger in dem Bereich, auf den das markierte Reagenz aufgebracht wird, mit einem Glasurmaterial vorbehandelt ist.
- Testgerät nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Glasurmaterial ein Zucker ist.
- Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das immobilisierte Reagenz in der Nachweiszone über die gesamte Dicke des Trägers in der Nachweiszone imprägniert ist.
- Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweissubstanz hCG ist.
- Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweissubstanz LH ist.
- Testgerät nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das frei bewegliche Reagenz statt als spezifisches Bindungsmittel für eine Nachweissubstanz in Gegenwart einer Nachweissubstanz an einer Konkurrenzreaktion teilnehmen kann.
- Analysenverfahren, bei dem ein Testgerät nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21 mit einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe, die vermutlich die Nachweissubstanz enthält, derartig in Kontakt gebracht wird, dass die Probe durch Kapillarwirkung durch den porösen Träger über die erste Zone in die Nachweiszone dringt und das markierte Reagenz mit ihr aus der ersten Zone in die Nachweiszone wandert, wobei das Vorliegen einer Nachweissubstanz in der Probe durch Beobachten des Ausmaßes (sofern gegeben) bestimmt wird, bis zu dem das markierte Reagenz in der Nachweiszone gebunden wird.
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8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: INVERNESS MEDICAL SWITZERLAND GMBH, ZUG, CH |
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