DE3912226C2

DE3912226C2 - Reagens für die Analyse von Triglyceriden und Analysenmethode für Triglyceride

Info

Publication number: DE3912226C2
Application number: DE3912226A
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Imamura; Mamoru Takahashi; Hideo Misaki; Kazuo Matsuura
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1988-04-15
Filing date: 1989-04-13
Publication date: 1996-05-09
Anticipated expiration: 2009-04-14
Also published as: FR2630129B1; JP2647684B2; IT8912472A0; JPH01265899A; FR2630129A1; DE3912226A1; IT1232776B; US5126246A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein nützliches Reagens für die Analyse von Triglyceriden sowie eine Analysenmethode für die Bestimmung von Triglyceriden.

Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Reagens, welches Lipasen in Kombination mit Monoglycerid lipasen enthält, wobei eine Monoglyceridlipase verwendet wird, die aus dem Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus, Stamm H-165 (FERM-BP-1673) erhältlich ist, und welches Reagens sich für die schnelle quantitati ve Analyse von Triglyceriden eignet, insbesondere solchen, wel che im Blutserum enthalten sind, und außerdem bezieht sich die Erfindung auf eine Analysenmethode für die Bestimmung von Tri glyceriden unter Verwendung dieses Reagens.

Das in Proben enthaltene Triglycerid, insbesondere in Körper flüssigkeiten enthaltene Triglycerid, ist bisher derart analy siert worden, daß man das Triglycerid unter Verwendung von Lipasen hydrolytisch bis zum Glycerin und zur Fettsäure abbau te, wobei als Zwischenprodukte das Diglycerid und dann das Monoglycerid gebildet wurden. Anschließend hat man das freigesetzte Glycerin oder die freigesetzte Fettsäure mittels enzymatischer oder chemischer Reaktionen bestimmt. Eine solche Bestimmung kann beispielsweise in einfacher Weise unter Verwendung von Elektroden oder Indikatoren er folgen.

Um eine wirksame Analyse von im Blutserum enthaltenem Triglycerid durchführen zu können, hat man proteolytische Enzyme, wie Proteasen und Lipoproteinlipasen verwendet, um zunächst das Triglycerid von daran gebundenen Proteinen zu befreien. Anschließend wurde dann das Triglycerid ana lysiert. Die Japanische Patentveröffentlichung Nr. 9518/1979 (Japanische Patentanmeldung Nr.114493/1978) hat für diesen Zweck sowohl Lipasen als auch Proteasen vorgeschlagen. Zu sätzlich sind zwecks Förderung der Hydrolysereaktion der Triglyceride unter Bildung von Glycerin eine Kombination der verschiedensten Lipasen, welche unterschiedliche Eigen schaften aufweisen, sowie ein Zusatz oberflächenaktiver Mittel oder chemischer Reagenzien zu der Probelösung vor geschlagen worden. Beispielsweise ist eine Hydrolyse un ter Verwendung einer Kombination von Lipasen mit unter schiedlichen Eigenschaften aus den folgenden Veröffentli chungen bekannt: Japanische Offenlegungsschrift Nr. 25694/ 1977, Japanische Patentveröffentlichung Nr. 29/1981 und Japanische Patentveröffentlichung Nr. 28276/1982. Eine Hydrolyse unter Verwendung einer Kombination aus Lipasen und Cholesterinesterasen wird in der Japanischen Patent veröffentlichung Nr. 46799/1981 beschrieben. Eine Hydroly se unter Verwendung einer Kombination aus Lipasen und ober flächenaktiven Mitteln ist aus der Japanischen Patent veröffentlichung Nr. 39 158/1982 bekannt. Die Verwendung einer Kombination aus Lipasen, oberflächenaktiven Mitteln und Phenol- oder Anilinderivaten für die Hydrolysereaktion ist aus der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 5677/1983 bekannt. Die Hydrolyse unter Verwendung einer Kombination aus Lipasen, Carboxyesterasen, welche aus Schweineleber stammen, und Alkalimetall- oder Erdalkalimetallalkylsulfa ten wird in der Japanischen offengelegten Patentanmel dung Nr. 64 495/1974 beschrieben. Schließlich wird die Hydro lyse gemäß der Japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 11987/1977 unter Verwendung einer Kombination aus Lipasen, Pankreas-Lipasen und Salzen der Gallensäure durchgeführt.

In der U.S.-Patentschrift 4 056 442 wird die Verwendung einer aus zwei Triglyceridlipasen bestehenden Zusammensetzung im Rahmen eines Triglyceridassays gelehrt. Im Rahmen der dort offenbarten Zusammensetzung wirken zwei spezielle Triglyce ridlipasen in synergistischer Weise zusammen.

Wie vorstehend bereits erläutert, werden die üblichen analytischen Methoden derart durchgeführt, daß man zu nächst das Triglycerid von daran gebundenen Proteinen abtrennt und dann die hydrolytische Spaltung des Trigly cerids unter Bildung von Glycerin in Gang setzt. Die Hydrolysegeschwindigkeit ist jedoch relativ gering, so daß für die Durchführung der Analyse eine beträchtliche Zeitspanne erforderlich ist, denn obwohl fast alle in solchen Analysenmethoden verwendeten Lipasen prinzipiell dazu geeignet sind, um das Triglycerid bis zum Glycerin zu hydrolysieren, sind sie nicht aktiv genug, um das während der Hydrolyse des Triglycerids gebildete β-Mono glycerid schnell weiter zu spalten und daher verläuft die Hydro lyse dieses Monoglycerids bis zum Glycerin sehr langsam. Es wäre daher sehr erwünscht, die Hydrolysereaktion des Monoglycerids zu beschleunigen, um das Glycerin in kürzerer Zeit zu bilden und dadurch die für die Analyse insgesamt erforderliche Zeit zu verkürzen.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung isolierten nun einen Mikroorganismus, welcher ein H-165-Stamm des Genus Bacillus ist, aus dem Erdreich in der Nähe der heißen Quelle des Badeorts Kirishima, Kagoshima-ken, Japan, welcher überraschenderweise eine Monoglyceridlipase erzeugt, wel che dazu geeignet ist, um die Hydrolyse eines Monoglycerids bis zum Glycerin zu katalysieren. Die Monoglycerid-Lipase wird gemäß der Japanischen Patentanmeldung Nr. 80299/1987 durch Züchtung dieses Bacillus-Stammes gewonnen. Die Er finder haben weiterhin festgestellt, daß die so zugängliche Monoglycerid-Lipase eine sehr starke Wirkung auf ein α- oder β-Monoglycerid ausübt, ganz im Gegensatz zu den bisher bekannten Lipasen, welche diesbezüglich nur eine schwache Aktivität haben. Darüberhinaus wurde gefunden, daß diese Monoglycerid-Lipase einen Optimum- pH-Wert bei etwa 5 hat, einen isoelektrischen Punkt von 4,6 aufweist und ein niedriges Molekulargewicht von 27000 hat. Das Aktivitäts-Maximum liegt bei einer optimalen Temperatur von 75°C und die Lipase zeigt eine ausgezeichne te thermische Beständigkeit, so daß sie bei 70°C noch kaum desaktiviert wird und selbst nach einer Behandlung bei 90°C immer noch 20% ihrer ursprünglichen Aktivität beibehält.

Aufgrund weiterer intensiver Studien haben die Erfinder festgestellt, daß es durch die kombinierte Anwendung die ser neuen Monoglycerid-Lipase und anderen Lipasen möglich ist, die für die Analyse von Triglycerid, welches in einer Probelösung enthalten ist, erforderliche Zeit wesentlich zu verkürzen, weil die Monoglycerid-Lipase spezifisch auf das aus dem Triglycerid über das durch die Wirkung von Lipase gebildete Diglycerid weiterhin gebildete Monoglycerid sehr stark einwirkt. Hierdurch wird die gesamte Hydrolyse reaktion, welche vom Triglycerid bis zum Glycerin führt, sehr stark beschleunigt.

Aufgrund dieser Forschungsergebnisse wird erfindungsgemäß ein Reagens für die Analyse von Triglycerid zur Verfügung ge stellt, welches Lipase(n) in Kombination mit Monoglycerid- Lipase(n) enthält, wobei eine Monoglyceridlipase verwendet wird, die aus dem Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus, Stamm H-165 (FERM BP 1673) erhältlich ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ent hält das erfindungsgemäße Reagens für die Analyse von Tri glycerid außer Lipase(n) und Monoglycerid-Lipase(n) auch noch Reagentien zur Bestimmung des freigesetzten Glycerins.

Die erfindungsgemäße Analysenmethode zur Bestimmung von Tri glycerid besteht darin, daß man eine Probelösung, welche Tri glycerid enthält, mit einem System in Berührung bringt, wel ches die Monoglycerid-Lipase enthält, wodurch Glycerin und Fettsäure freigesetzt wird und dann Komponenten, welche in einer Reaktion zur meßtechnischen Bestimmung des Gehaltes an Glycerin oder Fettsäuren verbraucht oder gebildet werden, meßtechnisch auswertet.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen kurz erläutert.

Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung für die benötigte Reaktionszeit in Anwesenheit oder Abwesenheit der Mono glycerid-Lipase (0,2 U/ml);

Fig. 2 zeigt eine Kurve für den optimalen pH-Wert der erfindungsgemäß verwendeten Monoglycerid-Lipase.

Fig. 3 zeigt eine in graphischer Darstellung eine Kurve für die optimale Temperatur des in Fig. 2 verwendeten En zyms.

Fig. 4 zeigt in graphischer Darstellung eine pH-Stabili tätskurve für das in Fig. 2 verwendete Enzym.

Fig. 5 zeigt eine thermische Stabilitätskurve für das in Fig. 2 verwendete Enzym.

Fig. 6 zeigt eine bei der Reinigung des in Fig. 2 verwen deten Enzyms sich ergebende Eluierungskurve.

Fig. 7 zeigt in graphischer Darstellung eine Eichkurve für ein Monoglycerid.

Fig. 8 zeigt die Wirkung einer verkürzten Reaktionszeit bei der Analyse von in Seren enthaltenem Triglycerid in Anwesenheit der Monoglycerid-Lipase und

Fig. 9 zeigt den Unterschied in den Eichkurven für Tri glycerid in Anwesenheit und Abwesenheit der Monoglycerid- Lipase (0,2 U/ml).

Die Art der im Rahmen der Erfindung verwendeten Mono glycerid-Lipase ist nicht besonders beschränkt, sofern diese zumindestens die Reaktion in hohem Ausmaß kataly siert, gemäß welcher Glycerin und Fettsäure aus einem β-Monoglycerid gebildet wird, und welche gleichzeitig praktisch nicht oder nur sehr schwach auf das Triglycerid und das Diglycerid einwirkt.

Eine der erfindungsgemäß eingesetzten Monoglycerid-Lipasen ist erhältlich, wenn man den Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus H-165 (FERM BP-1673) in einem geeigne ten Nährmedium züchtet.

Die Erfindung wird nachstehend im einzelnen unter Be zugnahme auf die Monoglycerid-Lipase erläutert, welche unter Verwendung des Bacillus stearothermophilus H-165- Stamm (FERM BP-1673) erhältlich ist.

(1) Wirkungsweise

Monoglycerid + H₂O → Glycerin + Fettsäure (bei dem Monoglycerid kann es sich entweder um ein α- oder um ein β-Monoglycerid handeln).

(2) Molekulargewicht

27 000 ± 2700 (bestimmt unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus einem Polyvinylgel "TSK 3000 SW" (Handelsbezeichnung; Produkt der Toyo Soda Manufac turing Co.Ltd.), unter Verwen dung eines 50 mM Phosphatpuffers (pH 6,5), welcher 0,2 M NaCl ent hält, als mobile Phase).

(3) Optimaler pH-Wert

Es wird die nachstehend beschriebene Meßmethode für die enzymatische Aktivität verwendet. Man läßt Mono laurin und das Enzym 10 Minuten lang miteinander re agieren, wobei man getrennt einmal ein Dimethylglutarat puffer (pH 4-7; Kurve -⚫-, Fig. 2) und zum anderen einen Tris-HCl-Puffer(pH 7-9,5; Kurve -∆- in Fig. 2) verwendet. Die Reaktionsmi schung wird jeweils 2 Minuten gekocht, um das Enzym zu inaktivieren und dadurch die Reaktion abzubrechen. Die Reaktionsmischung wird anschließend bei 37°C in kubiert und dann erfolgt eine enzymatische Bestimmung der Menge an gebildetem Glycerin. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 wiedergegeben. Der optimale pH-Wert liegt demgemäß bei etwa 5.

(4) Optimale Temperatur

Unter Verwendung eines PIPES-NaOH-Puffers (pH 7,3) wer den einzelne Reaktionen bei den in Fig. 3 angegebenen Temperaturen durchgeführt. Die Reaktionsmischungen wer den im Anschluß an die entsprechenden Reaktionen gekocht. Entsprechend der nachstehend beschriebenen Meßmethode werden die Mengen an gebildetem Glycerin getrennt be stimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 angegeben, und danach liegt die maximale Aktivität bei einer Tempera tur von 75°C.

(5) pH-Stabilität

Es werden Lösungen (1,0 U/ml) des Enzyms getrennt her gestellt unter Verwendung von 10 mM-Dimethylglutar säure-NaOH-Puffer(pH 4-7; Kurve -○- in Fig. 4), in Tris-HCl-Puffer(pH 8-9; Kurve -⚫- in Fig. 4) und in Glycin-NaOH-Puffer (pH 9 - 10; Kurve -∆- in Fig. 4). Nachdem man die einzelnen Lösungen 10 Minuten lang bei 75°C inkubiert hat, wird die Restaktivität gemäß der nachstehend beschriebenen Meßmethode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität festgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 wiedergegeben. Die enzyma tische Aktivität bleibt danach in einem pH-Wert-Bereich von 7 bis 8 stabil.

(6) Thermische Stabilität

Es wird eine Lösung des betreffenden Enzyms (1,0 U/ml) in 10 mM Tris-HCl-Puffer(pH 7,5) hergestellt. Nachdem man die Lösung 10 Minuten lang bei den in Fig. 5 angege benen einzelnen Temperaturen inkubiert hat, wird die Restaktivität gemäß der nachstehend beschriebenen Be stimmungsmethode für die enzymatische Aktivität fest gestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 wiedergegeben, danach bleibt die enzymatische Akivität bis zu Tempera turen von 70°C stabil.

(7) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt liegt bei einem pH-Wert von 4,6 ± 0,4 (nachdem man einen Strom bei einer konstanten Spannung von 700 V 40 Stunden lang bei 4°C unter Verwen dung eines Ampholyts als Trägermaterial im Rahmen einer isoelektrischen Fokussierungselektrophorese zur Einwir kung gebracht hat, wird die enzymatische Aktivität jeder Fraktion bestimmt).

(8) Substratspezifität

Die Substratspezifität der Monoglycerid-Lipase wird unter den Bedingungen festgestellt, wie sie nachstehend für die Bestimmungsmethode der enzymatischen Aktivität der Mono glycerid-Lipase beschrieben sind. Das Ergebnis dieser Mes sungen ist in Tabelle I zusammengestellt. Danach wird die maximale Aktivität bei dem Monoglycerid α- Monolaurin festgestellt. Die Monoglycerid-Lipase zeigt keine Wirkung bei Verwendung eines Diglycerids oder Triglycerids als Substrat, weil in Anwesenheit der Monoglycerid-Lipase dann kein Glycerin aufgefunden wird, welches durch Hydro lyse aus den betreffenden Substraten gebildet werden könn te. Die betreffenden Diglyceride stammen aus Eigelb-Leci thin bzw. es handelt sich um 1,2-Dilinolein und 1,3-Dilino lein. Als Triglyceridsubstrat wird Triolein eingesetzt.

Die Wirkung der Monoglycerid-Lipase auf ein β-Monoglycerid- Substrat zeigt eine hohe Spezifität, wie sie sich aus dem Folgenden ergibt:

1) Bestätigung, daß Fettsäure aus α-Linoleoyl-β- oleoyl diglycerid als Substrat freigesetzt wird,mittels Hoch leistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC):
- i) 50 µl Pankreas-Lipase werden zu 1,0 ml einer Reak tionsmischung der folgenden Zusammensetzung hinzu gesetzt: 0,5 mg α-Linoleoyl-β-oleoyl-Diglycerid, 1 ,8 mg eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels ("Triton X-100", Handelsbezeichnung; ein Produkt der Sigma Chemical Co), 3,8 mg Desoxycholin säure, 20 U Colipase, 0,15 mg Calciumchlorid und 200 µl einer 0,1 M N-Tri(hydroxymethyl)methyl-3-ami no-propansulfonsäure(TAPS)-NaOH (pH 8,3). Man läßt diese Reaktionsmischung 10 Minuten lang bei 37°C reagieren, worauf die Reaktion beendet wird. Eine Anteilsmenge von 15 µl dieser Reaktionsmischung wird auf eine Kolonne aufgegeben und dann wird ei ne Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
  Säule: "Zorbox ODS" (Handelsbezeichnung; 4,6 mm⌀ × 25 cm).
  Lösungsmittel: Acetonitril : H₂O (96 : 4)
  Erkennungsmethode: Ultraviolettabsorption bei 205 nm Durchflußgeschwin digkeit: 1,2 ml/min.
  Es konnte keine Oleinsäure aufgefunden werden, aber nach einer Retentionszeit von 23 Minuten wurde Linol säure festgestellt. Dieses Feststellen des Vorkommens von Linolsäure, welche an die f-Stellung gebunden war, bestätigt ,daß Pankreas-Lipase nur auf die α-Stellung eines α,β-Diglycerid-Substrats einwirkt und dieses unter Bildung eines β-Oleoyl-Monoglycerids hydrolysiert.
- ii) Zu einer Reaktionslösung der gleichen Zusammensetzung, wie vorstehend angegeben, werden 0,5 U Monoglycerid-Li pase zugesetzt und man läßt die enzymatische Reaktion in der entsprechenden Weise ablaufen, wie vorstehend angegeben. Auch in diesem Fall erfolgt die Analyse der freigesetzten Fettsäuren mittels Hochleistungs- Flüssigchromatographie und in diesem Fall wurden Linol säure und Ölsäure nach Retentionszeiten von 23 Minu ten bzw. 31 Minuten aufgefunden. Dieses Ergebnis be stätigt, daß die Monoglycerid-Lipase auf das β- Monoglycerid-Substrat einwirkt, welches aus dem α,β- Diglycerid durch die Pankreas-Lipase gebildet worden war, wobei die in der α-Position gebundene Linolsäure frei gesetzt worden war. Außerdem wird das aus dem α,β-Digly cerid gebildete Glycerin aufgefunden.
2) Substratspezifität der Monoglycerid-Lipase bei Verwen dung eines α,β-Diglycerids als Substrat:
- i) Pankreas-Lipase und die Monoglycerid-Lipase läßt man auf die nachstehend beschriebenen α,β-Diglycerid-Sub strate einwirken. Deren α-Stellungen werden durch die Pankreas-Lipase hydrolysiert und dann kann die Mono glycerid-Lipase auf die gebildeten β-Monoglyceride zur Einwirkung kommen, worauf schließlich das so freige setzte Glycerin analysiert wird. Glycerid wird dabei im Hinblick auf die nachstehenden Substrate aufgefunden: α-Oleyl-β-palmitoyl-diglycerid, α-palmitoyl-β-oleoyldi glycerid und α,β-Dilinoleylglycerid. Im Gegensatz hierzu wird jedoch kein Glycerin festgestellt, wenn die Reaktions mischung nur Pankreas-Lipase enthält.

(9) Wirkung eines Zusatzes von oberflächenaktiven Mitteln und Metallionen

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß die Aktivität in hibiert wird, wenn ein oberflächenaktives Mittel wie "Triton X-100"(Handelsbezeichnung) und Cholsäure in ho hen Konzentrationen zugesetzt werden. Die Aktivität der Monoglycerid-Lipase wird jedoch nicht durch den Zusatz zweiwertiger Metallionen, wie Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, beeinträch tigt.

Tabelle I

Substratspezifität der Monoglyceridlipase

Tabelle II

Wirkung von oberflächenaktiven Stoffen und Metallionen auf die Monoglyceridlipase

Bestimmungsmethode der enzymatischen Aktivität von Mono glyceridlipase

Zu 0,4 ml einer Lösung der vorstehend angegebenen Zusammen setzung setzt man 50 µl einer 10mM-Lösung von Monolaurin (0,5prozentige wäßrige Lösung von "Triton X-100") hinzu. Diese Mischung unterwirft man 2 bis 3 Minuten lang bei 37°C einer Vorinkubation und setzt dann 50 µl einer Enzymlösung hinzu, um die Reaktion in Gang zu setzen. Genau 10 Minuten später setzt man 2,5 ml einer 5prozentigen Lösung von Natriumdodecylsulfat hinzu, um die Reaktion abzubrechen. Anschließend mißt man die Extinktion der Lösung bei 550 nm. Bezüglich der enzymatischen Aktivität wird diese für die Er zeugung von 1 µMol Glycerin je Minute als eine Einheit (1 U) definiert. Die nachstehende Gleichung wird zur Berechnung der enzymatischen Aktivität verwendet:

in welcher
ΔA 550: die Extinktion bei einer Wellenlänge von 500 nm,
2.95: das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung (ml),
18.0: den millimolaren Extinktionskoeffizient von Wasser stoffperoxid (cm²/µMol),
50: das Volumen der verwendeten Enzymlösung (µl) und
10: die Reaktionszeit (min)
bedeutet.

Die vorstehende Erläuterung bestätigt, daß das durch Züch ten des Bacillus stearothermophilus Stamm H-165 (FERM BP 1673) erhältliche Enzym eine hohe Substratspezifität für ein Monoglycerid aufweist und in der Lage ist, die nach stehende Reaktion zu katalysieren:

Monoglyceride + H₂O → Glycerin + Fettsäuren

Der Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus Stamm H-165 ist ein Beispiel für Mikroorganismen, welche in der Lage sind, Monoglyceridlipase zu erzeugen. Er weist die nachstehen den mycologischen Eigenschaften auf:

A. Visuelle Betrachtung Züchtung während 18 bis 44 Stunden bei 50 bis 55°C

(1) Nähragar-Schrägkultur:
Es zeigt sich ein grau-weißliches Wachstum mit gelblichem Farbeinschlag. Das Wachstum ist faserförmig. Das Wachstum ist gut und es wird kein lösliches Pigment erzeugt.
(2) Nähragar-Flachkultur:
Es zeigt sich ein graues Wachstum mit gelblichem Farbein schlag. Es wird eine kreisförmige vollständige flache Kolonie gebildet, aber kein lösliches Pigment erzeugt.
(3) Flüssiges Nährmedium:
Es wird ein gutes Wachstum beobachtet. Das Nährmedium trübt sich gleichmäßig.
(4) BCP-Milchmedium:
Das Medium bleibt unverändert.

B. Morphologische Eigenschaften

(1) Form und Gestaltung:
Es handelt sich bei dem Stamm um einen zylindrischen Bazil lus, der entweder stäbchenförmig ausgebildet ist oder an einem oder beiden Enden eine leichte Krümmung zeigt. Es handelt sich um einzelne Zellen oder diese sind je zu Zweien miteinander verbunden. Gelegentlich werden auch kurze Ketten gebildet.
(2) Größe;
0,6 bis 0,8 × 2,5 bis 4,0 µm.
(3) Mobilität:
Keine.
(4) Spore:
In einem zentralen Teil jeder Zelle oder an einer Stelle in der Nähe der Zellwandung befindet sich eine Spore in Form eines Eis oder eines länglichen Kreises. Seine Größe beträgt 0,8 bis 1,2 × 1,5 bis 2,0 µm. Die Zelle wird durch die Spore ausgeweitet.
(5) Polymorphismus:
Keiner.

C. Physiologische und biochemische Eigenschaften

Aufgrund der vorstehend beschriebenen mykologischen Eigen schaften kann der Stamm H-165 als ein thermophiles aerobisches Bakterium beschrieben werden, welches in Form eines nicht be weglichen zylindrischen Bazillus von Stäbchenform oder mit leicht gekrümmten Enden vorkommt, welcher gramposi tiv ist, eine Größe von 0.6 bis 0.8 × 2.5 bis 4.0 µm aufweist, eine einzige Spore ausbildet und dadurch eine Zellerweiterung erfährt, welcher Glucose oxidativ zersetzt und eine Säure er zeugt und bezüglich der Katalase- und Oxidaseproduktivität sich positiv verhält. Ein Stamm mit diesen verschiedenen Eigenschaf ten sollte daher zur Familie Bacillus gehören, weil es sich um ein sporenförmiges, grampositives, aerobisches und stäbchen förmiges Bakterium handelt. Andere Mikroorganismenstämme, welche die gleichen Eigenschaften wie vorstehend angegeben aufweisen, und zwar bezüglich der Acetoinproduktivität, der Indolproduktivität, der Gasproduktivität aus Glucose und der Wachstumsmöglichkeit unter anaerobischen Bedingungen sind (A) Bacillus stearothermophilus, (B) Bacillus alcalophilus, (C) Bacillus badius und (D) Bacillus firmus. Die mykologi schen Eigenschaften dieser Bakterinstämme und derjenigen des Stammes H-165 werden nachstehend miteinander verglichen. [+: positiv, -: negativ, d: unterschiedlich in Abhängigkeit vom jeweiligen Stamm, ND: keine Daten vorhanden].

Aus dem vorstehenden Vergleich ergibt sich, daß die Eigen schaften des Stammes H-165 denjenigen von Bacillus stearo thermophilus außerordentlich nahekommen, mit Ausnahme der Abbaufähigkeit für Gelatine. Daher wurde der Stamm H-165 als zu Bacillus stearothermophilus gehörig eingeordnet und als Bacillus stearothermophilus H-165 benannt. Die Hinterlegung erfolgte unter der Nr. FERM BP-1673 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, the Government of Japan.

Ein Monoglyceridlipase bildender Mikroorganismus des Stamms H-165 (FERM BP-1673) wird unter Bedingungen gezüchtet, wie sie für Antibiotika, Enzyme und dergleichen allgemein bekannt sind und angewendet werden. Die Züchtung kann entweder in einem flüssigen oder in einem festen Nährmedium erfolgen. Für die industrielle Anwendung ist es vor teilhaft, zunächst ein Medium mit Zellen eines Monoglycerid lipase erzeugenden Mikroorganismus zu beimpfen und dann diese Zellen unter Bedingungen einer belüfteten Submerskultur und un ter Rühren weiter zu züchten.

Als Nährstoffquellen für das Nährmedium eignen sich alle Nähr stoffquellen, wie sie üblicherweise für die Züchtung von Mikro organismen eingesetzt werden. Als Quelle für Kohlenstoff kann jede kohlenstoffhaltige Verbindung verwendet werden, solange sie assimilierbar ist. Es ist daher beispielsweise möglich, Kohlehydrate, wie Glucose, Succhrose, Lactose, Galactose, Maltose, Mannit, Sorbit, Dextrin und Stärke zu verwenden. Außer dem eigenen sich die verschiedensten organischen Säuren, pflanzliche Öle, wie Sojabohnenöl und Olivenöl, tierische Öle und Fette, wie Speck und Hühneröl. Als Stickstoffquelle kann jede assimilierbare Stickstoffverbindung eingesetzt werden, beispielsweise eignen sich Pepton, gepulverter Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Kasein, entfettetes Baumwoll saatmehl, und dergleichen. Außerdem können auch ein oder mehrere der verschiedensten Salze mitverwendet werden, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Kalziumsalze, Kaliumsalze, Natrium salze, Zinksalze, Eisensalze, Mangansalze, Salze der Halogene, Maisweichwasser, die verschiedensten Vitamine und andere be kannte Zusatzstoffe.

Die Züchtungstemperatur kann an die Bedingungen angepaßt werden, welche der Mikroorganismus der Monoglyceridlipase erzeugt, zu seinem Wachstum und zur Bildung des gewünschten Enzyms benö tigt. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen jedoch im Be reich von 40 bis 65°C und insbesondere im Bereich von 45 bis 50°C. Auch die Züchtungsdauer variiert in Abhändigkeit von den Züchtungsbedingungen und es ist daher nur erforderlich, die Züchtung zu einem geeigneten Zeitpunkt abzubrechen, indem man den Zeitverlauf beobachtet, zu welchem das Enzym seine maximale Aktivität erreicht. Bevorzugte Züchtungszeiten liegen zwischen 10 und 22 Stunden.

Aus dem so erhaltenen Züchtungsmedium des Monoglyceridlipase erzeugenden Mikroorganismus wird dann die gewünschte Monogly ceridlipase erhalten. Da das Enzym in den Zellen des Mikro organismus erzeugt wird, werden diese Zellen durch eine ge geeignete Methode, wie Filtrieren oder Zentrifugieren, aus dem Züchtungsmedium abgetrennt. Diese Zellen werden kann aufgebro chen, indem man die verschiedenen bekannten Zellaufbrechmetho den anwendet oder auch kombiniert zur Einwirkung bringt, bei spielsweise mechanische Aufbrechmethoden, wie Ultrabeschallung, Bearbeitung in einer Mahlvorrichtung (French Press) und Behand lung mittels Glasperlen, wobei ferner enzymatische Aufbrechme thoden in Betracht kommen, wie eine Lysozymbehandlung, wodurch schließlich eine die Monoglyceridlipase enthaltende rohe Lö sung erhalten wird. Erforderlichenfalls kann dabei auch ein oberflächenaktives Mittel, wie "Triton X-100" (Handelsbezeich nung) mitverwendet werden.

Aus dieser Rohlösung wird die Monoglyceridlipase in gereinigter Form erhalten, indem man eine bekannte und für Proteine, Enzyme und dergleichen angewendete Isolierungs- und Reinigungsmethode anwendet. Das Enzym kann beispielsweise durch fraktionierte Fällung oder durch eine Ausfällung mittels Salzen isoliert werden. Die zuerst genannte Methode wird durchgeführt, indem man ein organisches Lösungsmittel, beispielsweise Aceton, Metha nol, Äthanol oder Isopropanol, zu der die Monoglyceridlipase enthaltenden Enzymrohlösung zusetzt, während bei der zuletzt genannten Methode zu der rohen Enzymlösung ein Salz, wie Ammoniumsulfat, Natriumchlorid oder Natriumsulfat, zugesetzt wird. Der gebildete Niederschlag kann dann durch eine oder mehrere unterschiedliche chromatographische Methoden gereinigt werden, beispielsweise mittels Molekularsiebchromatographie und/oder Elektrophorese oder durch Ultrazentrifugierung, bis schließlich ein Produkt mit einem einzelnen Peak erhalten wird. Es ist zweckmäßig, für die erforderliche Reinigung solche Metho den zu verwenden, welche von den Eigenschaften der Monoglyce ridlipase Gebrauch machen. Beispielsweise löst man den Nieder schlag in Wasser oder einer Pufferlösung auf und dialysiert diese Lösung gegebenenfalls durch eine semipermeable Membran. Die Lösung oder das Dialysat wird dann einer Ionenaustausch chromatographie auf einem Anionen austauschenden Harz unterwor fen, beispielsweise DEAE-Cellulose, DEAE-"Sephacel" (Waren zeichen), DEAE-"Sepharose" (Warenzeichen), DEAE-"Sephadex A-50" (Handelsbezeichnung) oder DEAE-"Toyo Pearl" (Warenzeichen), oder an einem Gelfiltrationsmedium, wie "Sephadex G-100" (Han delsbezeichnung), "Sephadex G-75" (Handelsbezeichnung) oder "Sephacryl S-200" (Handelsbezeichnung). Im Anschluß an die An wendung von zwei oder mehreren dieser Methoden in Kombination wird die Monoglyceridlipase durch Elektrophorese, durch Ultra zentrifugieren oder dergleichen, weitergereinigt, bis schließ lich ein Material mit einem einzelnen Peak erhalten wird. Dann setzt man einen Stabilisator zu, beispielsweise einen Zucker, wie Mannit, Succhrose oder Sorbit, oder man setzt eine Aminosäure, wie Glutaminsäure oder Glycin, zu oder ein Peptid oder ein Protein, wie Rinderserumalbumin. Schließlich wird das Produkt lyophilisiert, wodurch man das Enzym in gereinig ter Form als Pulver erhält.

Eine Monoglyceridlipase mit den vorstehend angegebenen physi kalischen und chemischen Eigenschaften dient nur als Beispiel. Eine eingehende Beschreibung dieser Monoglyceridlipase be züglich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften, ihrer mykologischen Eigenschaften der Identifizierung und Bezeichnung des Mikroorganismus, aus welchem die Lipase er halten wird, ist der Beschreibung der japanischen Patentanmel dung Nr. 80 299/1987 zu entnehmen.

Die zusammen mit der vorstehend beschriebenen Monoglycerid lipase in den erfindungsgemäßen Reagenzien für die Analyse von Triglycerid einsetzbaren Lipasen werden nachstehend näher erläu tert.

Im Rahmen der Erfindung kann jede Lipase verwendet werden, wie sie üblicherweise für die quantitative Analyse von Triglyceri den eingesetzt wird, sofern sie zumindest in der Lage ist, die Hydrolysereaktion von Triglyceriden unter Erzeugung von Di glyceriden und Fettsäuren und die Hydrolyse der Diglyceride zu Monoglyceriden und Fettsäuren zu katalysieren. Beispiele von Mikroorganismen, welche solche Lipasen erzeugen, sind Rhizopus delemar (ATCC 4858, ATCC 9374, ATCC 20134 und ATCC 24864), Rhizopus arrhizus (ATCC 10260, ATCC 24563 und ATCC 24865), Chromobacterium viscosum (ATCC 12472, ATCC 6918, NRRL B-3673 und FERM P-137), Aspergillus niger (ATCC 10864, ATCC 1004 und ATCC 1018), Aspergillus flavus oryzae (ATCC 9376, ATCC 11495 und ATCC 12891), Candida lipolytica (ATCC 8661, ATCC 20287 und ATCC 20363), Candida cylindracea (ATCC 14830), Mucor miehei (ATCC 16457 und ATCC 26282) sowie Mucor pusillus (ATCC 16458 und ATCC 16459). Für den gleichen Zweck können auch Lipasen verwendet werden, welche aus Tieren zugänglich sind, beispiels weise Rindviehpankreas. Außerdem können Lipasen Verwendung fin den, welche durch andere bekannte Lipase erzeugende Mikroorga nismen gebildet werden, beispielsweise solche der nachstehen den Mikroorganismen: Pseudomonas [Y. Kosugi, J. Ferment. Tech nol., Vol. 49, 968-980 (1971)], Corynebacterium [K. Weaber, Appl. Microb., Vol. 21, 639-642 (1971)], Staphilococcus [J.A. Troller, Appl. Microb., Vol. 20, 480-484 (1970)], Propioni bacterium [A. Oterholm, Appl. Microb., Vol.20, 16-22 (1970)], Alcaligenes [Y. Kokusho, Agric. Biol. Chem., Vol. 46, No.5, 1159-1164 (1982)]. Es gibt viele Veröffentlichungen bezüglich Lipasen, welche von Lipase erzeugenden Mikroorganismen des Genus Pseudomonas abstammen und diese werden beispielsweise in den nachstehenden japanischen Patentveröffentlichungen be schrieben:Nos. 7836/1966, 28516/1981, 28517/1981, 42312/1982, 42313/1982, 52835/1982 und 59753/1982. Darüber hinaus können Enzyme anstelle der vorstehend beschriebenen Lipasen eingesetzt werden, die unter der Bezeichnung Cbolesterinesterasen bekannt sind und die gleiche Wirkungsrichtung haben. Die im Rahmen der Erfindung einsetzbaren Lipasen sind nicht auf die vorstehend beschriebenen speziellen Vertreter beschränkt und sie umfassen andere bekannte Lipasen sowie solche, die durch ein geninge nieurmäßiges Verfahren zugänglich sind.

Nachstehend wird die Methode zur Bestimmung der Aktivität von Lipasen beschrieben.

Zusammensetzung der Reaktionsmischung

(ml)
0.2 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7.5)
0.2
27.5 mM Dilinoleoylglycerid (15%iges Triton X-100)	0.05
50 mM CaCl₂	0.01
200 mM ATP	0.005
100 mM CoASH	0.005
Acyl-CoA · Synthetase (50 U/ml)	0.01
Wasser	Restmenge bis zum Gesamtvolumen von 0.5 ml

0.5 ml der Lösung mit der vorstehend angegebenen Zusammen setzung werden in ein Reagenzglas eingefüllt und 2 bis 3 Minu ten lang bei 37°C vorinkubiert. Anschließend setzt man 50 µl einer Enzymlösung hinzu, welche 10 mM PIPES-NaOH-Puffer (pH 7,3) und 0.1% Rinderserumalbumin enthält. Diese Mischung läßt man 10 Minuten lang bei 37°C reagieren. Anschließend werden nacheinander 10 mM N-Äthylmaleinsäureimid (0.5 ml) und ein Reagenz (R-2) in einer Menge von 0.5 ml zugesetzt, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist. Diese Reaktions mischung läßt man weitere 5 Minuten bei 37°C reagieren. An schließend wird die Reaktion durch Zusatz von 1.5 ml einer 0. 5%igen Natriumdodecylsulfatlösung abgebrochen. Dann wird die Reaktionsmischung bei einer Wellenlänge von 550 nm kolo rimetrisch untersucht. Eine Aktivität, welche 0.1 µMol Linol säure je Minute freisetzt, wird als eine Einheit (1 U) defi niert.

Zusammensetzung des Reagenz R-2

(ml)
0.2 M PIPES-NaOH-Pufferlösung (pH 7.3)
0.05
0.3% 4-Aminoantipyrin	0.05
0.3% TOOS	0.05
Peroxidase (45 U/ml)	0.05
Acyl-CoA · Oxidase (500 U/ml)	0.02
0.2 M ATP	0.01
Wasser	0.27

Die Lipase und die Monoglyceridlipase, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Reagenz zur Analyse von Triglycerid ver wendet werden, werden in solchen Mengen eingesetzt, daß sie ausreichen, um die betreffende Reaktion gut ablaufen zu las sen. Es ist daher nur erforderlich, die benötigten Mengen zu bestimmen, welche von dem Gehalt an zu analysierendem Trigly cerid abhängen. Üblicherweise kann die Monoglyceridlipase in einer Menge von 0.05 U/ml oder mehr, vorzugsweise in einer Menge von 0.1 bis 0.5 U/ml je Analysetest verwendet werden. Die Lipasen werden in Mengen von 50 bis 1000 U/ml, vorzugsweise in Mengen entsprechend 100 bis 500 U/ml verwendet. Jedes der ein gesetzten Enzyme kann 50 wie es ist oder als Lösung in einer Pufferlösung oder aber in gefriergetrockneter Form verwendet werden.

Nachstehend wird das Reagenz zur Bestimmung des gebildeten Gly cerins näher erläutert.

Ein solches Reagenz umfaßt Systeme, wie sie üblicherweise zur Bestimmung von Glycerin eingesetzt werden, wobei ein auf das erzeugte Glycerin einwirkendes Enzym verwendet wird. Bevorzugt handelt es sich dabei um ein System unter Verwendung einer Glycerokinase-Glycerophosphatoxidase, wobei das in Anwesenheit von ATP unter Verwendung von Glycerokinase aus dem Glycerin gebildete Glycero-3-phosphat durch die Einwirkung der Glycero phosphatoxidase oxidiert wird. Gemäß einer anderen Ausführungs form kann auch eine Bestimmung unter Verwendung einer Glycerin oxidase verwendet werden. In diesen Meßmethoden sind geeignete Parameter für die quantitative Bestimmung das Wasserstoffper oxid, welches ein Endprodukt der Umsetzung darstellt, oder der dabei verbrauchte Sauerstoff oder das dabei neu gebildete Di hydroxyacetonphosphat oder das dabei gebildete Dihydroxyaceton. Bei der Glycerokinase-Glycerophosphatoxidase-Methode werden beispielsweise 0.1 bis 2 U/ml Glycerokinase, 3 bis 30 U/ml Glycerophosphatoxidase, 1 bis 10 mM ATP und Magnesiumionen er zeugende Salze, wie Magnesiumchlorid in einer Menge von 1 bis 10 mM, welches die enzymatische Aktivität von Glycerokinase erhöht, zu dem Glycerin zugesetzt, welches aus dem zu analysie renden Triglycerid entstanden ist. Unter Verbrauch von Sauer stoff wird in einer solchen Reaktion Wasserstoffperoxid und Dihydroxyacetonphosphat erzeugt. Anschließend kann der ver brauchte Sauerstoff mittels Sauerstoffelektroden oder einer Meßvorrichtung für gelösten Sauerstoff quantitativ bestimmt werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das erzeugte Dihydroxyacetonphosphat mittels einer bekannten Methode quan titativ zu bestimmen (vgl. Method of Enzymatic Analysis, Vol. 3, Seiten 1314-1319). Die quantitative Bestimmung von Wasserstoff peroxid, welches in der Reaktion erzeugt wird, kann durchge führt werden mittels einer elektrochemischen Methode unter Verwendung von Wasserstoffperoxidelektroden. Eine andere Mög lichkeit besteht darin, das erzeugte Wasserstoffperoxid einer Umsetzung mit Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und einem färbenden Reagenz, wie einer Phenolverbindung der nachstehenden allge meinen Formel (I) oder einer Anilinverbindung der nachstehen den allgemeinen Formel (II) zu unterwerfen und dann das ge bildete färbende Material zu messen (vgl. japanische Patent veröffentlichung Nr. 3480/1985).

in welcher X ein Halogen, Y Wasserstoff, ein Halogen, eine niedere Alkyl- oder niedere Alkoxygruppe und Z Wasserstoff oder eine Sulfonyl- oder Carboxylgruppe bedeutet.

in welcher R₁ Wasserstoff oder eine niedere Alkyl- oder nie dere Alkoxygruppe ist, R₂ und R₃ jeweils eine niedere Alkyl-, niedere Alkoxy-, acetylamidhaltige niedere Alkyl- oder sulfohal tige niedere Alkylgruppe bedeutet.

Beispiele für geeignete Phenolverbindungen der allgemeinen Formel (I) sind die folgenden: p-Chlorphenol, p-Bromphenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,4-Dibromphenol und 2,4-Dichlorphenolsulfo nat. Beispiele für geeignete Anilinverbindungen der vorstehen den allgemeinen Formel (II) sind die folgenden: Diäthylanilin, N,N-Diäthyl-m-toluidin, m-Methoxy-N,N-dimethylanilin, N-Äthyl- N-(3-methylphenyl)-N-acetyläthylendiamin, Natrium-N-Äthyl-N- (3-sulfopropyl)-m-toluidin und Natrium-N-Äthyl-N-(2-hydroxy- 3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin.

Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid besteht in der Verwendung einer Indikatorzusammensetzung, die durch Umsetzung mit Wasserstoffperoxid ein Nachweisprodukt bil det. Bei der Indikatorzusammensetzung kann es sich um eine solche handeln, welche in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid einen Farbumschlag erleidet. Hierzu gehören färbende Reagen zien, Fluoreszenzreagenzien und Luminiszenzreagenzien. Als färbende Reagenzien, welche innerhalb des sichtbaren Bereichs eine Farbänderung bewirken, kann eine Mischung aus einer Sub stanz mit Peroxidasewirkung und einem Färbe-Präkursor verwen det werden. Als Peroxidase wird üblicherweise eine solche ver wendet, welche aus Rettich gewonnen wird. Eine Kombination aus 4-Amino-antipyrin und der Phenolverbindung der Formel (I) wird üblicherweise als Färbe-Präkursor eingesetzt. Eine Kombination aus 4-Aminoantipyrin und einer Anilinverbindung der allgemei nen Formel (II) kann aber gleichfalls als ein solcher Färbe- Präkursor verwendet werden. Beispielsweise gibt es eine Meß methode für Wasserstoffperoxid, in der die Menge an gefärbtem Material durch die Farbintensität bestimmt wird, wobei dieses Material aus der Umsetzung von 4-Aminoantipyrin, Peroxidase und N-Äthyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS) ent standen ist. Es gibt aber auch Nachweismethoden zur Bestimmung der Menge an gefärbtem Material mittels der Farbintensität, wobei dieses gefärbte Material durch eine Umsetzung zwischen Diäthylanilin oder Dimethylanilin und 3-Methyl-2-benzothiazoli nonhydrazon oder durch eine Reaktion zwischen Xylenol-Orange und einer vierwertigen Titanverbindung gebildet worden ist, die dazu fähig ist, ein stabiles rotgefärbtes Material mit Wasser stoffperoxid zu bilden. Es gibt außerdem Meßmethoden, in wel chen eine Kombination aus 2,6-Dichlorphenolindophenol und Peroxidase oder eine Kombination aus Guaiacum und Peroxidase und dergleichen eingesetzt werden. Diese Indikatoren können als eine gemischte Lösung verwendet werden, welche im voraus je nach dem gewünschten Zweck hergestellt worden ist.

In den vorstehend angegebenen Reaktionen unter Verwendung von Phenol- oder Anilinverbindungen, 4-Aminoantipyrin und Peroxi dase kann beispielsweise ein Phenol oder TOOS in einer Menge von etwa 0.01 bis etwa 0.1%, das 4-Aminoantipyrin in einer Menge von 0.01 bis 0.05%, vorzugsweise 0.0,3%, und die Pero xidase in einer Menge von 3 bis 30 U/ml, vorzugsweise von 4 bis 6 U/ml, jeweils bezogen auf die gesamte Reaktionsmischung, zur Anwendung kommen.

Anstelle der vorstehend beschriebenen färbenden Reagenzzusam mensetzungen können auch andere Reagenzien verwendet werden, bei denen die Veränderung spektrophotometrisch bestimmt wird, beispielsweise unter Einsatz von fluoreszierenden Reagen zien, wie Homo-Vanillinsäure, welche unter dem Einfluß einer Bestrahlung mit Ultraviolettlicht eine Fluoreszenz erzeugen, oder es können statt dessen luminiszierende Reagenzien verwen det werden.

In der Bestimmungsmethode, bei der Glycerinoxidase verwendet wird, läßt man 5 bis 50 U/ml Glycerinoxidase auf das Glyce rin einwirken, welches aus dem Triglycerid entstanden ist, wobei unter Verbrauch von Sauerstoff Dihydroxyaceton und Was serstoffperoxid erzeugt werden, und dann wird die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder die Menge an erzeugten Dihydro xyaceton oder die Menge anerzeugtem Wasserstoffperoxid quanti tativ bestimmt. Bevorzugt wird dabei die Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid bestimmt, wobei die gleiche Art von Reagen zien zur Anwendung kommt wie bei der Bestimmung des Wasser stoffperoxids mittels der Glycerokinase-Glycerophosphatoxidase- Methode. Im Fall der Bestimmung des verbrauchten Sauerstoffs können hierfür Sauerstoffelektroden oder Meßgeräte zur Bestim mung des gelösten Sauerstoffs verwendet werden, wie bereits vorstehend beschrieben. Zusätzlich kann auch gebildetes Dihy droxyaceton in an sich bekannter Weise quantitativ bestimmt werden (vgl. Method of Enzymatic Analysis, Vol. 3, Seiten 1442-1445).

Gemäß weiteren Ausführungsformen kann die quantitative Bestim mung von Glycerin auch mittels der nachstehenden Arbeitswei sen erfolgen: Glycerophosphat-Dehydrogenase und NAD werden anstelle der vorstehend erwähnten Glycerophosphatoxidase ver wendet, wobei dann die reduzierte Menge an NAD mittels bekann ter Reagenzien bestimmt wird. Eine andere Bestimmungsmethode für Glycerin, welches erzeugt worden ist, besteht darin, die ses einer Umsetzung mit ATP und Glycerokinase zu unterwerfen, wobei dann das aus dem ATP gebildete ADP unter Verwendung eines Reagenz in an sich bekannter Weise gemessen wird (vgl. Method of Enzymatic Analysis, Vol. 4, Seiten 2127 bis 2129). Für diesen Zweck können die verschiedensten bekannten Reagen zien verwendet werden, wie sie dem Fachmann für die Glycerin bestimmung bekannt sind.

Um die Nachweismethode für Triglyceride zu erleichtern, kön nen nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, Zusatzstoffe zur Förderung der Reaktion der Bildung von Glycerin und Fettsäuren aus den Monoglyceriden und andere Zusatzstoffe zur Förderung der Enzymaktivitäten verwendet werden, so daß das gebildete Glycerin in wirkungsvoller Weise bestimmt werden kann. Bei spielsweise kann Triton X-100 (ein Handelsprodukt der Firma Rohm & Haas) als nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge von 0.05 bis 1% verwendet werden. Magnesiumchlo rid dient als Mittel zur Förderung der Glycerokinaseaktivität in einer Menge von 1 bis 10 mM und eine PIPES-NaOH-Pufferlö sung als Mittel, um den pH-Wert der Reaktionsmischung auf einem bestimmten Wert zu halten, beispielsweise im Bereich von 6 bis 8, vorzugsweise bei 7.3, wobei der Puffer in einer Kon zentration von 20 bis 500 mM verwendet wird.

Das erfindungsgemäße Reagenz zur Durchführung einer Analyse auf Triglyceride kann hergestellt werden, indem man die Lipa sen und die Monoglyceridlipase zusammen mit vorbestimmten Mengen an Zusatzstoffen, die aus den vorstehend genannten Zu satzstoffen in geeigneter Weise ausgewählt worden sind, sowie mit Enzymen zur Bestimmung des erzeugten Glycerins und ge wünschtenfalls Indikatoren für die Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids miteinander vermischt. Das erfindungsgemäße Reagenz kann in der Form verwendet werden, wie es für die be treffende Nachweismethode geeignet ist, beispielsweise in Form einer fertigen Packung, bei der ein fester Film mit dem Reagenz beschichtet worden ist.

Bei der Analyse der in einer Probelösung enthaltenen Triglyce ride können die zugleich mit dem Glycerin gebildeten Fettsäu ren quantitativ bestimmt werden anstelle der vorstehend genann ten Meßmethoden für Glycerin, welches nur eine Komponente der Monoglyceride darstellt. In diesem Fall kann dann ein Reagenz zur Bestimmung von Fettsäuren anstelle des Reagenz zur Bestim mung von Glycerin verwendet werden (vgl. japanische Offenle gungsschrift Nr. 8797/1982). Es kann jede beliebige Probenlö sung verwendet werden, solange diese Triglyceride als Substrat für Lipasen enthält. Beispiele hierfür sind Körperflüssigkeiten und Blutserum. Für eine Analyse werden diese Lösungen üblicher weise in einer Menge von 0.01 bis 5 ml eingesetzt. Die erfin dungsgemäße Analysenmethode läuft bei Einsatz eines Glycero kinase-Glycerophosphatoxidase-Systems in der nachstehend schematisch dargestellten Weise ab:

Eine Triglycerid enthaltende Probelösung und eine vorherbe stimmte Menge des Reagenz für die Triglyceridanalyse werden inkubiert und dann werden die gemäß der vorstehend angegebenen Reaktion verbrauchten oder erzeugten Komponenten quantitativ bestimmt. Wenn die zu bestimmende Komponente beispielsweise der Sauerstoff ist, dann wird diese meßtechnische Bestim mung unter Verwendung von Sauerstoffelektroden oder Meßvorrich tungen für gelösten Sauerstoff durchgeführt. In diesem Fall ist kein Indikator für das gebildete Wasserstoffperoxid erfor derlich. Das gleiche gilt für die Bestimmung des erzeugten Dihydroxyacetonphosphats. Unter den zu bestimmenden Komponen ten wird jedoch Wasserstoffperoxid bevorzugt. Die Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids erfolgt kolorimetrisch, fluo rimetrisch oder luminometrisch unter Verwendung eines Indika tors für Wasserstoffperoxid. Gemäß einer anderen Ausführungs form kann auch ein Elektrodenmeßgerät für Wasserstoffperoxid verwendet werden, beispielsweise ein Oxidase-Meter, welches durch YSI in den Handel gebracht wird.

Die Umsetzung zwischen dem erfindungsgemäßen Nachweisreagenz und der das Triglycerid enthaltenden Probelösung wird bei einer vorbestimmten Temperatur während einer vorbestimmten Zeitspanne durchgeführt, beispielsweise bei Temperaturen zwi schen 25 und 40°C,und dann wird eine der verbrauchten oder erzeugten Komponenten quantitativ bestimmt.

Nachdem der verbrauchte Sauerstoff oder das erzeugte Wasser stoffperoxid mittels irgendeiner der vorstehend beschriebenen Methoden quantitativ bestimmt worden ist, wird die Menge an Triglycerid unter Verwendung einer entsprechenden Eichkurve quantitativ bestimmt bzw. berechnet. Bei der quantitativen Be stimmung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung eines Indi kators wird die Extinktion bei einer geeigneten Wellenlänge für die Kolometrie des betreffenden Indikators bestimmt, bei spielsweise bei einer Wellenlänge von 600 nm oder bei einer Wellenlänge, wie sie für fluorimetrische Messungen geeignet ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält das Reagenz für die Analyse von Triglycerid Lipasen und eine Monoglyceridlipase und mittels dieses Reagenz können die verschiedensten Analy senmethoden wirksam durchgeführt werden. Beispielsweise eignen sich diese Analysenmethoden für das Gebiet der klinischen Dia gnostik, in welcher die Triglyceridanalyse unter Verwendung automatisch arbeitender Analysiervorrichtungen erfolgt. Es ist dabei möglich, die Analyse innerhalb einer sehr kurzen Zeit mit ausgezeichneter Genauigkeit durchzuführen, selbst wenn die betreffende Probe ein Triglycerid in hoher Konzentration ent hält.

Beispiel 1

Zusammensetzung eines Reagenz für die Analyse von Triglyceri den in Blutserum

Zu je 20 µl Blutserum als Probelösung werden 3,0 ml der be treffenden Triglyceridanalysereagenzien mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung hinzugesetzt (Lipasegehalt: 300 U/ml) und zwar mit oder ohne Zusatz von Monoglyceridlipase (0.2 U/ml) und man läßt die betreffende Mischung jeweils bei 37°C reagieren. Nach einem entsprechenden Zeitablauf wird die Extinktion bei 600 nm bestimmt.

Wie sich aus Fig. 1 ergibt, ist im Fall eines fehlenden Zu satzes von Monoglyceridlipase (Kurve -○-) der Endpunkt der Reaktion unklar, scheint aber bei etwa 3.5 Minuten zu liegen, während bei Zusatz von 0.2 U/ml Monoglyceridlipase (vgl. Kurve -⚫-) die Reaktion bereits nach 2 Minuten ihr Gleichge wicht erreicht hat und beendet ist.

Beispiel 2

Zu jeweils 20 µl Blutserum als Probelösung werden 3.0 ml des betreffenden Triglycerid-Analysereagenz der vorstehend angegebenen Zusammensetzung hinzugesetzt (Lipasegehalt: 233 U/ml), wobei der Gehalt an Monoglyceridlipase im Bereich von 0 bis 0.2 U/ml variiert wird. Jede Mischung läßt man bei 37°C reagieren. Es wird die Zeit bestimmt, welche für den vollständigen Ablauf der Farbreaktion erforderlich ist.

Wie sich aus Fig. 8 ergibt (vgl. Kurve -○-), verändert sich der Effekt einer verkürzten Reaktionszeit nicht, solange die Monoglyceridlipase in Mengen von 0.05 U/ml oder mehr, vorzugs weise in Mengen von 0.1 U/ml mitverwendet wird.

Beispiel 3

Jeweils 20 µl einer verdünnten Lösung eines hochneutralen Fettserums werden zu dem entsprechenden Triglycerid-Analyse reagenz zugesetzt, welches die vorstehend angegebene Zusam mensetzung hat (Lipasegehalt: 300 U/ml) und entweder keine Monoglyceridlipase (Kurve -○- von Fig. 9) oder 0.2 U/ml Monoglyceridlipase (vgl. Kurve -⚫- in Fig. 9) enthält. Man läßt jede Mischung 3 Minuten lang bei 37°C reagieren. Anschlie ßend wird die Extinktion bei 600 nm gemessen.

Aus Fig. 9 ergibt sich, daß eine lineare Konzentrationsabhängig keit an Triglycerid bis zu einer Menge von 1500 mg/dl besteht, falls das Reagenz 0.2 U/ml Monoglyceridlipase enthält.

Claims

1. Reagenz für die Analyse von Triglyceriden, dadurch gekennzeichnet, daß es Lipase(n) in Kombination mit Monoglyceridlipase(n) enthält, wobei eine Monoglyceridlipase verwendet wird, die aus dem Mikroorganis mus Bacillus stearothermophilus, Stamm H-165 (FERM BP-1673) erhältlich ist.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Monoglyceridlipase enthält, welche die durch das nachstehende Reaktionsschema wiedergegebene enzymatische Reaktion zu katalysieren vermag und gleichzeitig mit Sub stratspezifität auf ein Monoglycerid einwirkt: Monoglycerid + H₂O → Glycerin + Fettsäure

3. Reagenz nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeich net, daß es außer Lipase(n) und Monoglyceridlipase(n) auch Reagenzien zur Bestimmung von Glycerin enthält.

4. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Reagenzien zur Glycerinbestimmung Glycerinoxidase oder eine Kombination aus Glycerokinase, Glycerophosphat oxidase und Adenosintriphosphat (ATP) enthält.

5. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Reagenzien zur Glycerinbestimmung mindestens einen Indikator enthält, welcher in Anwesenheit von Wasserstoff peroxid als Endprodukt der Glycerinbestimmung eine Farb änderung erfährt.

6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der/(die) Indikator/(en) farbbildende Reagenzien, fluoreszierende Reagenzien oder lumineszierende Reagenzien sind.

7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die farbbildenden Reagenzien 4-Aminoantipyrin, n-Äthyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin, Phenol und Peroixidase enthalten.

8. Analysenmethode für Triglycerid, bei der man eine Probelösung, welche Triglycerid(e) enthält, mit Lipase(n) kontaktiert und das freigesetzte Glycerin oder die freige setzte(n) Fettsäure(n) quantitativ bestimmt, dadurch ge kennzeichnet, daß man für das Kontaktieren mit der Probe lösung ein System verwendet, welches Monoglyceridlipase(n) enthält, wobei eine Monoglyceridlipase verwendet wird, die aus dem Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus, Stamm H-165 (FERM BP-1673) erhältlich ist, und daß man anschließend eine bei der Bestimmungsmethode für freigesetztes Glycerin bzw. freigesetzte Fettsäure verbrauchte oder gebildete Komponente mißt.

9. Analysenmethode nach Anspruch 8, dadurch gekenn zeichnet, daß man ein System mit einer Monoglyceridlipase verwendet, welche die durch das nachstehende Reaktionsschema wiedergegebene enzymatische Reaktion zu katalysieren vermag und gleichzeitig mit Substratspezifität auf ein Monoglycerid einwirkt Monoglycerid + H₂O → Glycerin + Fettsäure

10. Analysenmethode nach Anspruch 8 und 9, dadurch ge kennzeichnet, daß man ein System verwendet, welches außer der Monoglyceridlipase noch andere Lipase(n) enthält.

11. Analysenmethode nach Anspruch 10, dadurch gekenn zeichnet, daß man ein System verwendet, welches außer Mono glyceridlipase(n) und Lipase(n) zusätzlich Reagenzien für die Bestimmung von Glycerin enthält.