DE4244915C2

DE4244915C2 - DNA-Moleküle codierend Proteine, die an der O-Glykosylierung von Proteinen beteiligt sind

Info

Publication number: DE4244915C2
Application number: DE4244915A
Authority: DE
Inventors: Widmar Prof Dr Tanner; Sabine Dr Strahl-Bolsinger
Original assignee: STRAHL BOLSINGER SABINE DR
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 1992-08-14
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 1998-12-03
Anticipated expiration: 2012-08-15
Also published as: WO1994004687A1; JPH08500975A; DE4226971A1; AU4948293A; DE4226971C2; EP0658203B1; FI121075B; ATE245701T1; AU679935B2; NO950534L; JP3630424B2; CA2140894C; CA2140894A1; FI950628A; US5714377A; ES2203619T3; NO950534D0; DE69333112T2; ZA935915B; NZ255350A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die Pro teine codieren, die an der O-Glykosylierung von Proteinen in Pilzzellen beteiligt sind, sowie deren Verwendung zur Her stellung von Pilzzellen mit einer veränderten Fähigkeit der O-Glykosylierung homologer und/oder heterologer Proteine.

Die Entwicklung der DNA-Rekombinations-Technik hat die Her stellung fremder Proteine in solchen Wirtszellen möglich ge macht, in die für diese Produkte codierende exogene DNA-Se quenzen eingeführt worden sind. Die Vorteile dieser Techno logie bestehen darin, daß Produkte in hohen Ausbeuten, in hochgereinigter Form und ohne Risiko einer Verunreinigung, wie z. B. einer viralen Verunreinigung (AIDS, Hepatitis B usw.), erzeugt werden können. Diese Rekombinations-Techniken werden zur Herstellung rekombinanter Proteine in prokaryoti schen und auch in eukaryotischen Wirtszellen häufig einge setzt. Prokaryotische Wirtszellen umfassen E. coli [Nagata et al., Nature 284 (1980) 316; EP 1929], Bacillus subtilis [Saunders et al., J. Bacteriol. 169 (1987) 2917], Streptomyces, Corynebacterium (EP 433 117). Eukaryotische Wirtszellen umfassen pflanzliche Zellen, tierische Zellen und Pilzzellen.

Die Herstellung rekombinanter Produkte in großen Mengen durch diese Techniken ist jedoch immer noch begrenzt, dies ist auf Probleme bei der Expressionseffizienz dieser exoge nen DNA-Sequenzen zurückzuführen und beruht außerdem auf der Instabilität von Vektoren und auf dem intrazellulären Abbau der rekombinanten Produkte durch die Wirtszellen, in denen sie hergestellt werden. Hinsichtlich der Expressionseffi zienz sind Versuche unternommen worden, starke Promotoren zu isolieren, die zu einer gesteigerten Expression von exogenen DNA-Sequenzen führen und auf diese Weise die Herstellung von rekombinanten Produkten steigern. Außerdem sind verschiedene Systeme entwickelt worden, um die Stabilität der Vektoren in den Wirtszellen zu erhöhen, wobei am häufigsten die Inser tion eines Antibiotikaresistenz-Gens in den Vektor verwendet wird, wodurch die rekombinanten Wirtszellen in Selektivme dium überleben und wachsen können. Bezüglich des intrazellu lären Abbaus sind mehrere mutante Zellen beschrieben worden, die keine oder eine verminderte Proteaseaktivität aufweisen, wodurch die Fähigkeit dieser Zellen zum Abbau rekombinanter Produkte begrenzt wird.

Die Herstellung rekombinanter Produkte in großen Mengen und ihre pharmazeutische Anwendung wird jedoch noch durch wei tere Probleme eingeschränkt. Eines dieser Probleme kommt durch die Tatsache zustande, daß sich rekombinant herge stellte Produkte häufig von ihrem natürlichen Gegenstück un terscheiden. Beispielsweise besitzen bakterielle Wirtszellen nicht alle posttranslationalen Mechanismen, die für die Rei fung von Säugerpolypeptiden erforderlich sind. Demgemäß sind die in Bakterien hergestellten Säugerpolypeptide häufig un reif und nicht richtig gefaltet. Außerdem führen bakterielle Wirtszellen im allgemeinen ein weiteres N-terminales Methio nin in die Produkte ein.

Die in heterologen eukaryotischen Wirten hergestellten re kombinanten Produkte unterscheiden sich von ihren natürlich vorkommenden Gegenstücken üblicherweise in ihrem Glykosylie rungsgehalt. Dies kann die Gegenwart gegenüber der Abwesen heit einer beliebigen Kohlenhydratstruktur, die Stellung der Kohlenhydratstruktur auf dem Produkt und auch die Art des Kohlenhydrates betreffen. Insbesondere ist gezeigt worden, daß die aus Hefe stammenden rekombinanten Produkte im Ver gleich zu ihren natürlichen Gegenstücken häufig zusätzliche unnatürliche O-Glykane tragen. Beispielsweise ist gezeigt worden, daß der menschliche insulinähnliche Serum-Wachstums faktor I (IGF-I) nicht glykosyliert ist, seine in S. cerevisiae hergestellte rekombinante Form dagegen O-glykosy liert, genauer gesagt O-mannosyliert ist [Hard et al., FEBS Letters 248 (1989) 111]. Auf gleiche Art und Weise ist ge zeigt worden, daß menschlicher Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) und menschlicher GM-CSF unnatürliche O-Mannosylstrukturen aufweisen, wenn sie in S. cerevisiae hergestellt wurden [Biomedic. Environ. Mass Spectrometry 19 (1990) 665; BIO/TECHNOLOGY 5 (1987) 831]. Diese abnorme O- Glykosylierung wird durch wichtige Unterschiede zwischen den Glykosylierungsmechanismen von Säugerzellen (menschlichen Zellen) und denjenigen anderer eukaryotischer Zellen, wie z. B. Hefen, verursacht. In diesem Zusammenhang ist beobach tet worden, daß die O-Glykosylierung in Pilzzellen (ein schließlich Hefen und filamentösen Pilzen) in einer ähnli chen und unüblichen Art und Weise vor sich geht, die bisher in keinem anderen Organismus beobachtet worden ist.

Das Auftreten dieser unerwünschten O-Glykosylierung auf den aus Pilzen stammenden rekombinanten Produkten stellt bei der Arzneimittelherstellung einen wichtigen Nachteil dieser Technologie dar.

Der erste Grund besteht darin, daß pilzspezifische Glykane neue immunologische Determinanten auf ein Protein einführen können und ein Glykoprotein mit solchen unnatürlichen Koh lenhydraten daher bei der Verabreichung an Menschen antigen sein kann. In diesem Zusammenhang ist beispielsweise be kannt, daß die meisten Menschen Antikörper besitzen, die ge gen N-gebundene Hefe-Mannanketten gerichtet sind [Feizi und Childs, Biochem. J. 245 (1987) 1].

Ein weiterer Grund besteht darin, daß Proteine ohne passende Kohlenhydratstrukturen auch veränderte pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen können. Es ist gezeigt worden, daß Kohlenhydratstrukturen von Glykoproteinen die in vivo- Clearance-Rate, die für die Bestimmung der Wirksamkeit eines Arzneimittels wesentlich ist, beeinflussen und an deren De finition beteiligt sind. Genauer gesagt ist auf der Oberflä che von Leberendothelzellen und residenten Makrophagen ein Mannose-Rezeptor identifiziert worden, der offensichtlich ein Mittel zur Eliminierung von Glykoproteinen, die Oligo saccharide vom Mannosetyp aufweisen, darstellt [Stahl, Cell. Mol. Biol. 2 (1990) 317]. Daher kann das Vorliegen von unna türlichen zusätzlichen Mannosestrukturen auf einem Protein dessen Clearance-Rate erhöhen und auf diese Weise dessen Plasma-Halbwertszeit verringern.

Noch ein weiterer Grund besteht darin, daß sich die biologi sche Aktivität eines Glykoproteins mit seinem Kohlenhydrat gehalt, mit der Stellung und der Art der Kohlenhydrate wie gezeigt ändert. Beispielsweise ist gezeigt worden, daß die biologischen Eigenschaften von rekombinantem menschlichem EPO [Takeuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 7819] und rekombinantem menschlichem tPA [Parekh et al., Biochemistry 28 (1989) 7644] durch die Glykosylierung beein trächtigt werden.

Aus den vorstehend erwähnten Gründen geht hervor, daß die immunologischen, biologischen und pharmakokinetischen Eigen schaften der aus Pilzen stammenden rekombinanten Produkte durch die unnatürliche O-Glykosylierung ernsthaft beein trächtigt werden können, wodurch gegebenenfalls verhindert wird, daß diese Produkte für die therapeutische Anwendung beim Menschen weiterentwickelt werden können.

Strahl-Bolsinger und Tanner [Eur. J. Biochem. 196 (1991), 185-190] beschreiben zwar, daß ein Membranprotein aus Saccharomyces cerevisiae von 92 kDa verantwortlich ist für die Mannosylierung von Serin- und Threoninresten von Protei nen. Es werden jedoch weder Aminosäuresequenzen des Proteins oder entsprechende Nucleinsäuresequenzen beschrieben, noch Möglichkeiten zur genetischen Manipulation von Hefezellen, um eine Verringerung der O-Glykosylierung zu erreichen.

Die vorliegende Erfindung löst das vorstehend beschriebene Problem der abnormen O-Glykosylierung durch Bereitstellung von DNA-Molekülen, die ein Protein codieren, das an der O- Glykosylierung von Proteinen in Pilzzellen beteiligt ist. Derartige DNA-Moleküle eignen sich zur Herstellung von modi fizierten Pilzzellen, die in ihren DNA-Sequenzen (eine) ge netische Modifikation(en) aufweisen, die wenigstens zu einer verringerten Fähigkeit der Pilzzellen zur O-Glykosylierung von nativen oder fremden Proteinen führt (führen).

Der Anmelder hat jetzt gefunden, daß es möglich ist mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle genetisch modifi zierte Pilzzellen zu erhalten, die eine verringerte Fähig keit zur O-Glykosylierung aufweisen, die noch lebensfähig sind und unter industriellen Fermentationsbedingungen gute Wachstumseigenschaften zeigen. Unerwarteterweise hat der An melder außerdem gezeigt, daß die genetischen Modifikationen nicht die Stabilität der Pilzzellen beeinträchtigen, wenn diese mit exogener DNA transformiert werden. Die modifizier ten Pilzzellen der vorliegenden Erfindung können vorzugs weise als Wirtszellen zur Herstellung qualitativ hochwerti ger rekombinanter Produkte, die weniger oder keine uner wünschten O-Glykane aufweisen, verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle codieren Proteine, die aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität an der Anheftung eines Mannosylrestes an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten beteiligt sind, insbesondere an der Übertragung eines Mannosylrestes vom Dol-P-Man-Vorläufer auf die Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylaminosäure resten.

Ein solches Protein ist beispielsweise die Dol-P-Man: Pro tein (Ser/Thr)-Mannosyltransferase [DPM2], die die in Seq. ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere DNA- Moleküle, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyltransferase co dieren, wobei das Protein die in Seq. ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

Vorzugsweise umfaßt das DNA-Molekül die in Seq. ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz, insbesondere die codierende Region (Nucleotide 532-2983).

Die Erfindung betrifft ebenfalls DNA-Moleküle, die mit den obengenannten DNA-Molekülen hybridisieren und die enzymati sche Aktivität einer Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyl transferase aufweisen. Derartige DNA-Moleküle können aus DNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit (einer) Sonde(n), welche die Gesamtheit oder einen Teil der in Fig. 4 darge stellten Sequenz umfaßt (umfassen), isoliert werden. Die hy bridisierenden DNA-Moleküle umfassen auch Derivate der vor stehend beschriebenen DNA-Moleküle. Der Begriff Derivat be deutet ein beliebiges anderes DNA-Fragment, das durch (eine) beliebige genetische und/oder chemische Modifikation(en) der vorstehend erwähnten Gene hergestellt wird. Die geneti sche(n) und/oder chemische(n) Modifikation(en) kann (können) eine beliebige Suppression, Substitution, Deletion oder Ad dition von einer Base oder mehreren Basen oder von einer Re gion der Gene sein, wodurch bei Transformation in eine Pilz wirtszelle entweder eine erhöhte Enzymaktivität oder die gleiche Aktivität oder eine verminderte Enzymaktivität er halten wird. Somit können die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle auch Fragmente des beschriebenen Proteins codieren, die nach wie vor dieselbe, eine erhöhte oder eine verringerte Enzymaktivität aufweisen.

Homologe Gene, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen hybridisieren und ein Protein mit der oben angegebenen Enzymaktivität codiert, können prinzipiell aus jeder belie bigen Pilzzelle isoliert werden, vorzugsweise aus Zellen der Gattung Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae.

Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können verwendet werden, um Pilzzellen dahingehend genetisch zu modifizieren, daß sie eine verringerte Fähigkeit zur O-Glykosylierung von Pro teinen aufweisen. Die Pilzzelle kann dabei aus filamentösen Pilzen und Hefen ausgewählt werden. Arten filamentöser Pilze, die in der vorliegenden Erfindung beispielsweise ver wendet werden können, sind Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Neurospora, Fusarium und dgl. Beispiele für Hefearten umfas sen Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizosaccharomyces und dgl. Stärker bevorzugte Ar ten sind die Arten aus der Gruppe Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula und Candida und noch stär ker bevorzugt Kluyveromyces und Saccharomyces. Stämme von Kluyveromyces, die bevorzugt verwendet werden, umfassen bei spielseise K. lactis, K. fragilis, K. waltii, K. drosophilarum und dgl. Ein bevorzugter Stamm von Saccharomyces ist S. cerevisiae.

In der erfindungsgemäßen Bedeutung steht genetische Modifi kation vorzugsweise für eine beliebige Suppression, Substi tution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Basen oder eines Fragmentes der Pilzzell-DNA-Sequenzen. Solche ge netischen Modifikationen können in vitro (direkt auf iso lierter DNA) oder in situ, z. B. durch gentechnische Verfah ren oder indem die Pilzzellen mutagenen Agentien ausgesetzt werden, erhalten werden. Mutagene Agentien umfassen z. B. physikalische Agentien, wie z. B. energiereiche Strahlen (Röntgenstrahlen, c-Strahlen, UV usw.), oder chemische Agen tien, die befähigt sind, mit verschiedenen funktionellen DNA-Gruppen zu reagieren, wie z. B. alkylierende Mittel (EMS, NQO usw.), bisalkylierende Mittel, intercalierende Mittel usw. Genetische Modifikationen können auch durch genetische Disruption, z. B. gemäß dem von Rothstein et al. [Meth. Enzymol. 194 (1991), 281-301] beschriebenen Verfahren, er halten werden. Gemäß diesem Verfahren wird ein Teil oder die Gesamtheit eines Gens mittels homologer Rekombination durch eine in vitro-modifizierte Version ersetzt.

Genetische Modifikationen können auch durch eine beliebige mutative Insertion in DNA-Sequenzen, wie z. B. Transposons, Phagen usw., erhalten werden.

Außerdem ist bekannt, daß bestimmte Modifikationen, wie z. B. Punktmutationen, durch zelluläre Mechanismen revertiert oder abgeschwächt werden können. Solche Modifikationen stellen möglicherweise nicht die nützlichsten Formen modifizierter Pilzzellen dieser Erfindung bereit, da ihre phänotypischen Eigenschaften möglicherweise nicht sehr stabil sind. Ent sprechend der vorliegenden Erfindung können auch modifi zierte Pilzzellen hergestellt werden, in denen die Modifika tionen (und daher die phänotypischen Eigenschaften) während der Segregation stabil und/oder nicht-revertierend und/oder nicht durchlässig sind. Solche modifizierten Pilzzellen sind als Wirte für die Produktion rekombinanter Produkte beson ders geeignet.

Somit eignen sich die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle insbe sondere für die Herstellung von Pilzzellen, die (eine) gene tische Modifikation(en) aufweisen, die während der Segrega tion stabil und/oder nicht-revertierend und/oder nicht durchlässig ist (sind). Diese Modifikationen werden im all gemeinen durch Deletion(en) oder Disruption(en) erhalten. Die genetische(n) Modifikation(en) der Pilzzellen, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle in den Pilzzellen erreicht werden, kann (können) entweder in einer endogen vorliegenden codierenden Region einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz der Zelle liegen oder in einer Region, die für die Expression und/oder die transkriptionale Regulation dieser codierenden Region verantwortlich ist oder daran beteiligt ist.

Die verringerte Fähigkeit der Pilzzellen, die durch Verwen dung der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle genetisch modifi ziert werden, Proteine zu O-glykosylieren, kann daher durch die Herstellung von inaktiven Enzymen, bedingt durch Verän derungen in Struktur und/oder Konformation, die Herstellung von Enzymen mit veränderten biologischen Eigenschaften, die fehlende Herstellung der Enzyme oder die Herstellung der Enzyme in geringen Mengen verursacht werden.

Der O-Glykosylierungs-Stoffwechselweg der Pilzzellen umfaßt die Anheftung eines ersten Mannosylrestes an die Hydroxyl gruppe von Seryl- und/oder Threonylaminosäureresten von Pro teinen oder Peptiden und sodann die Erweiterung auf O-gebun dene Di- und Oligosaccharide durch weitere Hinzufügungen von Mannosylresten. Der erste Mannosylrest wird im endoplasmati schen Retikulum von Dolichol-Monophosphat-Mannose (Dol-P- Man) auf das Protein übertragen, die folgenden Mannosylreste werden von GPD-Man im Golgi-Apparat überführt. Im Gegensatz dazu verläuft die O-Glykosylierung bei höheren eukaryoti schen (nicht-Pilz-) Zellen nach einem anderen Mechanismus, wobei der erste Schritt in der kovalenten Anheftung von N- Acetylgalactosamin an Seryl- oder Threonylaminosäurereste besteht, an dieser ersten Umsetzung kein Lipid-gekuppelter Oligosaccharid-Donor beteiligt ist, der erste Schritt im Golgi-Apparat stattfindet, andere Kohlenhydratstrukturen vorliegen usw.

Zusätzlich zu (einer) Modifikation(en) in einem erfindungs gemäßen DNA-Molekül, das endogen in der modifizierten Pilz zelle vorliegt und das für ein Protein codiert, das bei der Anheftung des Mannosylrestes an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten beteiligt ist, können die genetisch modifizierten Pilzzellen auch (eine) Modifika tion(en) in den Genen aufweisen, die an den weiteren Hinzu fügungen von Mannosylresten, die zu Di- oder Oligosacchari den führen, oder an der Synthese des Mannosylreste-Donors (Dol-P-Man) beteiligt sind.

Spezifische Beispiele solcher Pilzzellen werden in den Bei spielen beschrieben.

Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können zur genetischen Modifikation von Pilzzellen als exogene DNA-Sequenzen einge führt werden.

In der erfindungsgemäßen Bedeutung ist die exogene DNA-Se quenz so gemeint, daß sie eine beliebige DNA-Sequenz ein schließt, die ein Gen oder mehrere Gene umfaßt, das (die) ein gewünschtes Protein codiert (codieren), das in der Zelle exprimiert und/oder sezerniert wird. Eine solche DNA-Sequenz kann eine komplementäre DNA-Sequenz (cDNA), eine künstliche DNA-Sequenz, eine genomische DNA-Sequenz, eine Hybrid-DNA- Sequenz oder eine synthetische oder halbsynthetische DNA-Se quenz sein, die sich in einer Expressionskassette befindet, welche eine Synthese der Proteine in den Pilzzellen ermög licht. Die Expressionskassette umfasst vorzugsweise eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, die zum 5'-Ende der Sequenz, die das (die) gewünscht(en) Protein(e) codiert, fusioniert ist, wodurch die Transkription und Translation der Sequenz gesteuert und gegebenenfalls regu liert wird. Die Auswahl dieser Regionen kann abhängig von der verwendeten Pilzzelle unterschiedlich sein. Im allgemei nen werden diese Sequenzen aus Promotoren und/oder Termina toren ausgewählt, die von Pilzzellgenen und, bei gelanter Expression in Hefewirten, von Hefegenen abgeleitet sind. Von speziellem Interesse sind bestimmte Promotor- und/oder Ter minatorregionen, die von glykolytischen Genen aus Pilzzellen abgeleitet sind, wobei die Gene z. B. für Hefen Phosphoglyce rat-Kinase (PGK), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GDP), Enolasen (ENO) oder Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) und für filamentöse Pilze Triosephosphat-Isomerase (tpi) codie ren. Die Promotor- und/oder Terminatorregionen können auch von anderen, stark exprimierten Genen abgeleitet sein, wie z. B. für Hefen dem Lactase-Gen (LAC4), dem Saure-Phospha tase-Gen (PHO5), dem Alkoholoxidase-Gen (AOX) oder dem Me thanoloxidase-Gen (MOX) und für filamentöse Pilze dem Cello biohydrolase-Gen (CBHI), dem Alkoholdehydrogenase-Gen (alcA, alcC), dem Glucoamylase-Gen (GAM) oder dem Acetamidase-Gen (amds) und dgl. Diese Transkriptions- und Translations initiationsregionen können weiter modifiziert werden, z. B. durch in vitro-Mutagenese, durch Einführung von zusätzlichen Kontrollelementen oder synthetischen Sequenzen oder durch Deletionen. Beispielsweise können transkriptionsregulierende Elemente, wie z. B. das sogenannte UAS, das von einem anderen Promotor stammt, verwendet werden, um Hybridpromotoren zu konstruieren, die eine Trennung der Wachstumsphase der Pilz zellkultur von der Phase der Expression der das (die) ge wünschte(n) Protein(e) codierenden Sequenz(en) ermöglichen. Außerdem kann eine in der geplanten Pilzzelle funktionelle Transkriptions- und Translationsterminationsregion an das 3'-Ende der codierenden Sequenz gestellt werden. Zusätzlich kann am N-Terminus der Proteinsequenz ein(e) Signalpeptid (Prä-Sequenz) eingeführt werden, wodurch das sich bildende Protein in den sekretorischen Stoffwechselweg der verwende ten Pilzzelle geleitet wird. Diese Prä-Sequenz kann der na türlichen Prä-Sequenz des Proteins entsprechen, sofern die ses Protein in der Natur sezerniert wird, oder sie kann einen anderen Ursprung haben, z. B. kann sie aus einem ande ren Gen erhalten werden oder auch künstlich sein.

Die exogene DNA-Sequenz ist vorzugsweise Teil eines Vektors, der sich entweder autonom in der verwendeten Pilzzelle re pliziert oder sich in deren eigene DNA-Sequenzen (Chromosom) integriert. Autonom replizierende Vektoren können autonom replizierende Sequenzen enthalten, die von der chromosomalen DNA der Pilzzelle (ARS) oder von natürlich vorkommenden Pilzzellplasmiden, wie z. B. pGKI-1 [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1982) 737], pKD1 (EP 241 435), 2 µm Plas mid [Broach., Cell 28 (1982) 203-204] und dgl., abgeleitet sind. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise Sequen zen, die zu Regionen des Pilzzellchromosoms homolog sind und die nach Einführung in die Zelle die Integration durch in vivo-Rekombination ermöglichen. In einer spezifischen Aus führungsform der Erfindung entsprechen die homologen Sequen zen der zu modifizierenden Region des Chromosoms in der Pilzzelle, wodurch ein einstufiger Modifikations-Integra tions-Mechanismus ermöglicht wird. Die Integration kann auch als nicht-homologe Rekombination stattfinden.

Die exogene DNA-Sequenz kann durch eine beliebige, auf dem Fachgebiet bekannte Technik, beispielsweise durch DNA-Rekom binations-Techniken, genetische Kreuzungen, Protoplastenfu sionen usw., in Pilzzellen eingeführt werden. Hinsichtlich DNA-Rekombinations-Techniken können Transformation, Elektro poration oder eine beliebige andere, in der Literatur be schriebene Technik verwendet werden. Insbesondere kann, so fern die Pilzzelle eine Hefezelle ist, die Transformation nach den Verfahren von Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 163], Durrens et al. [Curr. Genet. 18 (1990) 7] oder nach dem in EP 361 991 beschriebenen Verfahren durchgeführt wer den. Elektroporation kann gemäß Karube et al. [FEBS Letters 182 (1985) 90] durchgeführt werden.

Die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls oder Vek tors modifizierten Pilzzellen können vorzugsweise als Wirts zellen zur Herstellung von rekombinanten Produkten, wie z. B. heterologen Proteinen von pharmazeutischem und/oder land wirtschaftlichem Interesse, verwendet werden. Derartige Pilzzellen sind besonders vorteilhaft, da sie die Herstel lung und/oder Sekretion von qualitativ hochwertigen Produk ten ermöglichen und wegen ihrer genetischen Modifikationen die mitotische oder genetische Stabilität der Produktexpres sionsvektoren nicht beeinträchtigen. Sie sind besonders für die Herstellung von Proteinen geeignet, die beim Menschen therapeutisch angewendet werden und die einer O-Glykosylie rung durch die Wirtszelle zugänglich sind.

Die folgenden Proteine werden als Beispiele für heterologe Proteine angeführt, die mit genetisch modifizierten Pilzzel len hergestellt werden können: Enzyme (wie z. B. Superoxid- Dismutase, Katalase, Amylasen, Lipasen, Amidasen, Chymosin usw., oder ein beliebiges Fragment oder Derivat davon), Blutderivate (wie z. B. menschliches Serum-Albumin, Alpha- oder Beta-Globin, Faktor VIII, Faktor IX, van Willebrand- Faktor, Fibronectin, Alpha-1-Antitrypsin usw., oder ein be liebiges Fragment oder Derivat davon), Insulin und seine Va rianten, Lymphokine [wie z. B. Interleukine, Interferone, ko loniestimulierende Faktoren (G-CSF, GM-CSF, M-CSF usw.), TNF, TRF usw., oder ein beliebiges Fragment oder Derivat da von], Wachstumsfaktoren (wie z. B. Wachstumshormon, Erythro poietin, FGF, EGF, PDGF, TGF usw., oder ein beliebiges Frag ment oder Derivat davon), Apolipoproteine, antigene Polypep tide zur Herstellung von Impfstoffen (Hepatitis, Cytomegalo virus, Eppstein-Barr, Herpes usw.) oder ein beliebiges Fu sionspolypeptid, wie z. B. Fusionen, umfassend einen aktiven Anteil, der an einen stabilisierenden Anteil gebunden ist.

Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle oder beliebige Teile da von können ferner zur Isolierung homologer Gene verwendet werden.

In der erfindungsgemäßen Bedeutung steht homologes Gen für ein beliebiges anderes Gen einer beliebigen Pilzzelle, das für ein Enzym codiert, das die erforderliche Aktivität einer Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyltransferase aufweist. Die anderen Gene können beispielsweise folgendermaßen herge stellt werden: Komplementierung einer mutanten Pilzzelle, der diese Aktivität fehlt, mit DNA, die aus einer Pilzzelle hergestellt wurde, die zur Aktivität befähigt ist, Selektion der Transformanten, welche die Aktivität nun aufweisen, und Isolierung der eingefügten DNA-Sequenz. Ferner können die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle verwendet werden, um homologe Gene zu isolieren. Alternativ können homologe Gene auch aus DNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit (einer) Sonde(n), welche die Gesamtheit oder einen Teil der in Seq. ID No. 1 dargestellten Sequenz umfaßt (umfassen), isoliert werden.

LEGENDEN DER FIGUREN

Fig. 1: Restriktionskarte der Plasmide pDM3, pMT4 und pMT1.

Fig. 2: Subclonierung von Plasmid pDM3

Fig. 3: Strategie der Sequenzierung des DPM2-Gens

Fig. 4A: Nucleotidsequenz des DPM2-Gens (SEQ ID Nr. 1)

Fig. 4B: Aminosäuresequenz des DPM2-Gens (SEQ ID Nr. 2)

Fig. 5: Konstruktion und Restriktionskarte von pMT1.1/URA3

Fig. 6: O-Glykosylierungsaktivität von S. cerevisiae WT (Tabelle A) und MT (Tabelle B)

BEISPIELE Beispiel 1: Isolierung einer hochgereinigten Mannosyltrans ferase aus S. cerevisiae und Erzeugung von Peptiden

Die Mannosyltransferase-Aktivität wurde aus ganzen Hefemem branen solubilisiert und gemäß Strahl-Bolsinger und Tanner [Eur. J. Biochem. 196 (1991) 185] auf Hydroxylapatit gerei nigt. Sodann mußte das Protein durch (NH₄)₂SO₄-Fällung wei ter angereichert werden, worauf eine weitere Reinigung mit tels Affinitätschromatographie folgte. Anschließend wurde das eluierte Material auf SDS/PAGE aufgetrennt. Die resul tierende 92 kDa-Bande wurde aus dem Gel herausgeschnitten. Durch Trypsin-Spaltung (im Gel) wurden mehrere nichtüberlap pende Peptide erhalten, welche den Entwurf von Sonden ermög lichten.

E.1.1. (NH₄)₂SO₄-Fällung

100 ml von Fraktionen der Hydroxylapatit-Säule, die Manno syltransferase-Aktivität enthielten, wurden mit (NH₄)₂SO₄ bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gew./Vol.) gemischt und eine Stunde in einem Eis/Salz-Bad leicht gerührt. Das Gemisch wurde 30 Minuten zentrifugiert (8000 × g). Das re sultierende Pellet wurde in 8 ml AB-Puffer [10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 15% Glycerin (Vol.-%), 0,1% Lubrol (Vol.-%), 150 mM NaCl] resuspendiert und eine Stunde gegen den gleichen Puf fer dialysiert. Lagerung: -20°C.

E.1.2. Affinitätschromatographie E.1.2.1. Herstellung der Affinitätschromatographie-Säule

0,5 g gefriergetrocknetes Pulver von Protein A-Sepharose Cl 4B wurden in 10 ml 100 mM NaPi, pH 7,0, 15 Minuten gequollen und über ein gesintertes Glasfilter (G3) mit 200 ml des gleichen Puffers gewaschen. Protein A-Sepharose Cl 4B wurde in 100 mM NaPi, pH 7,0, äquilibriert. Etwa 3 bis 6 ml Anti- Mannosyltransferase-Serum wurden zwei Stunden gegen 1 l NaPi (100 mM), pH 7,0, dialysiert. Das dialysierte Serum wurde mit dem Säulenmaterial 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Se rum wurde unter Verwendung eines gesinterten Glasfilters (G3) entfernt. Das Säulenmaterial wurde zweimal mit 10 ml 100 mM NaPi, pH 8,5, gewaschen und in 50 ml des gleichen Puffers resuspendiert.

Für die kovalente Kupplung wurden 0,75 mg/ml Dimethylsube rimidat hinzugefügt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 5 bis 6 Tropfen 1 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Das Material wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Ein zweites Mal wurde Dimethylsuberimidat hinzugefügt und der pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Das Säulenmaterial wurde auf einem gesinterten Glasfilter (G3) nacheinander mit fol genden Lösungen gewaschen:

a) 50 ml 100 mM NaPi, pH 8,0,
b) 25 ml 100 mM NaPi, pH 8,0, 3 M Ammoniumrhodanid
c) 100 ml 100 mM NaPi, pH 8,0.

Das Material wurde gewaschen und in AB-Puffer äquilibriert.

E.1.2.2. Reinigung des 92 kDa-Proteins

8 ml des mit (NH₄)₂SO₄ gefällten und dialysierten Proteins (E.1.1.) wurden mit dem Material der Affinitätssäule (E.1.2.1.) 16 Stunden bei 4°C unter leichtem Schütteln inku biert. Eine Säule (2 cm × 0,5 cm) wurde gefüllt und mit 15 ml AB-Puffer gewaschen. Die Säule wurde mit 100 mM Gly cin/HCl, pH 3,0, 0,05% Lubrol (Vol.-%) und 15% Glycerin (Vol.-%) eluiert. Fraktionen zu 0,9 ml wurden gesammelt und sofort mit 1 M Tris (15 µl/0,9 ml Fraktion) neutralisiert.

Zum Nachweis des 92 kDa-Proteins wurden 40 µl von jeder elu ierten Fraktion durch SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen wie beschrieben (Strahl-Bolsinger und Tanner, 1991) untersucht. Die das 92 kDa-Protein enthaltenden Fraktionen (Fraktion 2 bis 6) wurden vereinigt und mittels Mikrokonzentratoren (Centricon/Amicon) durch Zentrifugation bei 5000 × g auf 100 µl eingeengt. 0,9 ml 98% Ethanol wurden hinzugefügt und das Protein 16 Stunden bei -20°C gefällt. Das ausgefällte Pro tein wurde 30 Minuten bei 10000 × g abzentrifugiert.

E.1.3. SDS-PAGE

Das ausgefällte Protein (E.1.2.2.) wurde in 150 µl SDS-Pro benpuffer (0,07 M Na₂CO₃, 0,07% β-EtSH, 2% SDS, 12% Saccha rose, 0,07% Bromphenolblau) resuspendiert. Die SDS-Gelelek trophorese gemäß Lämmli und Favre [J. Mol. Biol. 80 (1973) 575] wurde bei 50 bis 70 V unter Verwendung der BIORAD-Mini- Protean-Zelle durchgeführt. Proteinstandards: HMW- Standards/Gibco BRL.

Protein wurde durch Färbung mit 0,05% Coomassie R250 (Gew./Vol.), 25% Isopropanol (Vol.-%), 10% Essigsäure (Vol.- %) und Entfärbung in 7,5% Essigsäure (Vol.-%) nachgewiesen.

E.1.4. Trypsinspaltung und Entwurf von Oligonucleotiden

Nach der SDS-PAGE (E.1.3.) wurde die 92 kDa-Proteinbande ausgeschnitten (etwa 10 µg Protein). Das Gelfragment wurde in kleine Stücke geschnitten und dreimal 30 Minuten in 5 ml 50% Methanol/10% Essigsäure und einmal 30 Minuten in 5 ml 50% Methanol geschüttelt. Das Gel wurde 3 Stunden gefrierge trocknet. Eine Trypsinspaltung wurde in 0,3 ml 0,2 M Ammo niumhydrogencarbonat/2 µg Trypsin 16 Stunden bei 37°C durch geführt. Der Überstand wurde entfernt. Die Elution der Pep tide wurde dreimal eine Stunde bei 37°C in 0,2 ml 0,2 M Am moniumhydrogencarbonat und einmal eine Stunde bei 37°C in 0,2 ml 0,2 M Ammoniumhydrogencarbonat/30% Acetonitril durch geführt. Das eluierte Material wurde vereinigt, gefrierge trocknet und in 0,2 ml 1 M Guanidinium-Hydrochlorid/50 mM Tris/HCl, pH 7,5, gelöst. Die Peptide wurden unter Verwen dung einer in 0,13% Trifluoressigsäure äquilibrierten Um kehrphasen-RP18-Säule aufgetrennt. Die Peptide wurden mit Acetonitril (0 bis 70%) eluiert. Bis zu 40 verschiedene Pro teinpeaks konnten nachgewiesen werden. Fünf der Hauptpeaks wurden mittels automatischer Sequenzanalyse nach Edman se quenziert [G. Allen in: Sequencing of Proteins and Peptides. Laboratory Techniques in Biochem. and Mol. Biol. 9, Hrsg.: Burdon, R. H. & Knippenberg, P. H., Elsevier (1989)]. Von den hierbei erhaltenen Sequenzen eigneten sich drei zum Ent werfen von Oligonucleotiden, sie sind in der nachstehenden Tabelle I dargestellt.

Tabelle I

Auf der Grundlage dieser Sequenzen wurden die Oligonucleo tide A bis C chemisch synthetisiert, wobei die Codon-Anwen dung von S. cerevisiae verwendet wurde [Guthrie und Abelson, in: The molecular biology of the yeast Saccharomyces, Hrsg.: J. N. Strathern, E. W. Jones, J. R. Broach (1982)]. Die Oli gonucleotide A bis C weisen die nachstehenden Kennzeichen auf:
Oligonucleotid A:
Peak: 23
Aminosäuresequenz: G F D G D A
Oligodesoxynucleotid: 5'-G^T/_CGTCACCGTCGAANCC-3'
8-fach degeneriert, codierender Strang, 17 Nucleotide
Oligonucleotid B:
Peak: 34
Aminosäuresequenz: E P H V Y E
DNA-Sequenz: 5'-^C/_TTCGTAGAC^G/_ATG^A/_TGG^T/_CTC-3'
16-fach degeneriert, codierender Strang, 18 Nucleo tide
Oligonucleotid C:
Peak: 15
Aminosäuresequenz: I S Y K P A S F I S K
DNA-Sequenz: 5'-ATTTC^T/_ATA^T/_CAA^A/_GCC^A/_TGCT TC^T/_ATT^T/_AAAA-3'
128-fach degeneriert, codierender Strang, 33 Nucleo tide

Beispiel 2: Absuchen einer Plasmid-Bibliothek von genomi scher Hefe-DNA

Die chemisch synthetisierten Oligodesoxynucleotide A bis C (E.1.4.) wurden verwendet, um die Plasmidbibliothek von ge nomischer Hefe-DNA-pCS19 [Sengstag und Hinnen, Nucl. Acids Res. 15 (1987) 233] abzusuchen. Diese Bibliothek wurde her gestellt, indem genomische Hefe-DNA mit Sau3A partiell ge spalten und in die BclI-Restriktionsstelle des Vektors pCS19 cloniert wurde.

E.2.1. Markierung von Oligodesoxynucleotiden

Die Oligonucleotide A bis C wurden durch die Kinasereaktion markiert, die gemäß Maniatis et al., durchgeführt wurde [T. Maniatis, J. Sambrook, E. F. Fritsch (1989) Molecular cloning: A Laboratory manual, C. S. H. Press]. 40 pMol Oli godesoxynucleotid wurden unter Verwendung von 50 µCi [c³²P]- ATP markiert. Freie radioaktive Nucleotide wurden unter Ver wendung von "NUC Trap Push Columns" (Stratagene) gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers entfernt.

E.2.2. Absuchen der Bibliothek

Die DNA-Bibliothek (4992 verschiedene Einzelkolonien) wurde von Mikrotiterplatten auf Nitrocellulose übertragen. Die Ko loniehybridisierung wurde gemäß Grundstein und Hogness [PNAS 72 (1975) 3961] unter den folgenden Bedingungen durchge führt:

- Vorhybridisierung: Die Filter wurden bei 44°C in 200 ml 5 × Denhardt, 6 × NET, 0,1% SDS (Gew./Vol.) und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA mindestens 4 Stunden inkubiert (5 × Denhardt: 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA; 6 × NET: 0,9 M NaCl, 90 mM Tris-HCl, pH 8,3, 6 mM EDTA, pH 8,0).
- Hybridisierung: Die Filter wurden bei 44°C in 100 ml 5 × Denhardt, 6 × NET, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 0,1 mg/ml Lachs sperma-DNA und den markierten Oligodesoxynucleotiden A und B (jeweils 40 pMol) inkubiert. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden lang durchgeführt.
- Waschbedingungen: Die Filter wurden dreimal in 50 ml 6 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.) bei 0°C 15 Minuten gewaschen.

Zum Nachweis positiver Kolonien wurden die Filter 16 Stunden bei -70°C mit Röntgenfilmen in Kontakt gebracht. Unter die sen Bedingungen konnten 12 positiv reagierende Clone identi fiziert werden.

Beispiel 3: Southern-Analyse der 12 positiven Clone

Die 12 positiven Clone wurden im Southern-Blotting unter Verwendung von 3 verschiedenen Oligodesoxynucleotiden analy siert. Diese Analyse führte zur Identifizierung eines posi tiven Clons, der mit allen drei Oligonucleotiden reagierte. Dieser Clon wurde pDM3 genannt.

Die 12 positiven Clone wurden in 5 ml LB-Medium, das mit Am picillin angereichert war, gezüchtet und ihre DNA gemäß dem Verfahren von Birnbaum und Doly [Nucl. Acids. Res. 7 (1979) 1513] isoliert.

1/10 jeder isolierten Plasmid-DNA (Plasmide: pDM1 bis pDM12) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI-XhoI (jeweils 5 E), 1 × "one phor all"-Puffer (Pharmacia) in einem Gesamtvolumen von 20 µl eine Stunde bei 37°C gespalten. Die DNA-Fragmente wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und gemäß Mania tis et al. (1989) auf Nitrocellulose geblottet. Die Southern-Analyse wurde unter Verwendung von Oligo-A und -B und unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, die für das Absuchen der Bibliothek beschrieben werden. Die Hybridisie rungstemperatur für Oligo-A betrug 48°C und für Oligo-B 42°C. Die Clone 1, 2, 3, 5, 6, 7 und 11 reagierten mit bei den Oligodesoxynucleotiden positiv. Diese sieben Clone wur den durch Southern Blot-Analyse weiter analysiert. Hierzu wurden drei identische Blots hergestellt, in denen die DNA der Clone 1, 2, 3, 5, 6, 7 und 11 mit EcoRI-XhoI gespalten und wie beschrieben auf Nitrocellulose geblottet wurde. Die Blots 1, 2 und 3 wurden in 20 ml 5 × Denhardt, 6 × NET, 0,1% SDS (Gew./Vol.) und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA bei 50°C vier Stunden vorhybridisiert. Sodann wurde jeder Blot in 10 ml 5 × Denhardt, 6 × NET, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 0,1 mg/ml Lachs sperma-DNA und 40 pMol markierten Oligonucleotiden 16 Stun den hybridisiert. Die Hybridisierungstemperatur ist in der nachstehenden Tabelle II angegeben. Gewaschen wurde bei je der Temperatur 10 Minuten in 50 ml 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.).

Tabelle II

Clon 3 war der einzige Clon, der mit Oligo-A, -B und -C rea gierte. Der Clon wurde pDM3 genannt und weiter analysiert.

Beispiel 4: Analyse von pDM3 E.4.1. Methoden E.4.1.1. Spaltung mit Restriktionsendonucleasen

Die analytische Spaltung mit Endonucleasen wurde in 1 × "one phor all"-Puffer (Pharmacia), 0,2 bis 0,5 µg DNA, 1 bis 5 E Restriktionsenzym in einem Gesamtvolumen von 20 µl eine Stunde bei 37°C durchgeführt.

Die präparative Spaltung wurde in einem Gesamtvolumen von 40 bis 80 µl mit 1 bis 10 µg DNA, 5 bis 20 µl Restriktionsenzym und 1 × "one phor all"-Puffer zwei Stunden bei 37°C durchge führt.

E.4.1.2. DNA-Gelelektrophorese

Die Trennung von DNA-Fragmenten wurde gemäß Maniatis et al. (1989) durchgeführt.

E.4.1.3. Isolierung von DNA-Fragmenten

Nach der Trennung wurden die DNA-Fragmente mit dem "Gene clean Kit" (Stratagene) gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers isoliert.

E.4.1.4. Behandlung mit alkalischer Phosphatase

DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase gemäß Maniatis et al. (1989) dephosphoryliert.

E.4.1.5. Ligierung

DNA-Fragmente wurden in 1 × T4-Ligierungspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP) mit 1 E T4-DNA-Ligase (Gesamtvolumen 10 bis 15 µl) ligiert. Das mo lare DNA-Verhältnis von Vektor : Insertion betrug 1 : 4 oder 1 : 8. Die absolute Menge DNA war 20 bis 50 ng.
Inkubationszeit: 16 Stunden bei 14°C oder 5 Stunden bei 25°C.

E.4.1.6. Transformation von E. coli

Kompetente E.coli-DH5α-Zellen wurden gemäß Hanahan [J. Mol. Biol. 166 (1983) 557] hergestellt. Die Transformation wurde wie von Maniatis et al. (1989) beschrieben durchgeführt.

E.4.1.7. Herstellung von DNA

Plasmid-DNA wurde gemäß Birnbaum und Doly (a. a. O.) herge stellt.

E.4.1.8. Southern-Blot-Analyse

Die Southern-Blot-Analyse wurde unter Anwendung der gleichen Bedingungen wie in E.3. beschrieben durchgeführt.

E.4.1.9. DNA-Sequenzanalyse

Die DNA-Sequenzierung wurde nach dem Verfahren von Sanger et al. [PNAS 74 (1977) 5463] durchgeführt. Nur Plasmid-DNA wurde sequenziert. T7-DNA-Polymerase-Sequenzierungs-Kit (Pharmacia) wurde verwendet; das radioaktive Nucleotid war [α-³⁵S]-dATP (spez. Akt. 600 Ci/mMol).

E.4.2. Identifizierung des offenen Leserasters

Dieses Beispiel beschreibt eine Restriktionsanalyse von pDM3, die Identifizierung von verschiedenen, durch die Oli gonucleotide-A, -B oder -C erkannten DNA-Fragmenten und de ren Subclonierung. Die Sequenzierung dieser Subclone ermög lichte die Identifizierung eines offenen Leserasters (ORF).

E.4.2.1. Subclonierung von pDM3-DNA-Fragmenten, die mit Oligo-A, -B oder -C hybridisierten

pDM3-DNA wurde mit EcoRI, XhoI und EcoRI-XhoI gespalten. Die Southern-Blot-Analyse wurde unter Verwendung von Oligo-A, -B oder -C als Sonde durchgeführt.

Oligo-A erkennt ein 3,0 kB-EcoRI-Fragment, Oligo-B und -C erkennen ein 1,1 kB-EcoRI-XhoI-Fragment. Das 3,0 kB-EcoRI- Fragment wurde in pUC19 (linearisiert mit EcoRI und dephos phoryliert) subcloniert. Das 1,1 kB-EcoRI-XhoI-Fragment wurde in pUC18 (linearisiert mit EcoRI-SalI und dephosphory liert) subcloniert. Die richtigen Subclone wurden durch Re striktionsanalysen und Southern-Blot-Analysen unter Verwen dung von Oligo-A oder -B bzw. -C identifiziert.

Der 3,0 kB-EcoRI-Subclon wurde mit pMT4 und der 1,1 kB- EcoRI-XhoI-Subclon mit pMT1 bezeichnet. Die weitere Restrik tionsanalyse von pMT4 und pMT1 wurde unter Verwendung mehre rer verschiedener Restriktionsendonucleasen (z. B. PstI, HindIII und BglII) durchgeführt. Die Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von Oligo-A oder -B/-C wurde durchgeführt, um die genaue Region eines möglichen ORF zu bestimmen. Die Restriktionskarten von pDM3, pMT4 und pMT1 sind in Fig. 1 dargestellt.

E.4.2. Sequenzanalysen

Von beiden Enden wurden die DNA-Insertionen der Plasmide pMT4 und pMT1 sequenziert, wobei der universelle und reverse Primer verwendet wurde, der nahe dem Polylinker von pUC19/pUC18 bindet. Auch Oligo-A, -B und -C wurden als se quenzierende Primer verwendet. Die Sequenzierungsdaten führ ten zu einem ORF von etwa 400 Bp auf beiden Seiten der In sertion von pMT1. Auch pMT4 zeigte bei Sequenzierung mit dem reversen Primer ein ORF von etwa 200 Bp. Unter Verwendung dieser Sequenzierungsdaten konnte eine Aminosäuresequenz hergeleitet werden. Diese Aminosäuresequenz zeigte Peptidse quenzen, die aus der Peptidanalyse des 92 kDa-Proteins be kannt sind (Peptide wurden gefunden, die den Peaks 15, 23, 34 entsprachen). Anhand dieser Daten konnte die 5'/3'-Aus richtung des Gens vorausgesagt werden.

Mehrere andere Subclone wurden konstruiert und sequenziert, wobei die universellen und reversen Primer von pUC18/19 ver wendet wurden (Fig. 2).

Außerdem wurden zur Sequenzierung die nachstehenden Oli godesoxynucleotide verwendet:

Diese Oligonucleotide stellen Teile der neu sequenzierten DNA-Fragmente dar.

Zur Sequenzierung des 5-Bereichs des Gens wurden ExoIII/Mung-Bohnen-Deletionen des Vektors pMT4 erzeugt. pMT4 wurde unter Verwendung von SphI linearisiert (3' Überlap pung). Sodann wurde das Plasmid unter Verwendung von BamHI gespalten (5'-Überlappung). Die ExonucleaseIII-Deletion wurde gemäß Roberts und Lauer [Meth. Enzymol. 68 (1979) 473], Henikoff [Meth. Enzymol. 155 (1987) 156] durchgeführt. Überlappende Enden wurden durch Mung-Bohnen-Nuclease ent fernt. Die resultierenden Plasmide wurden durch Restrikti onsanalyse unter Verwendung von HindIII und EcoRI analy siert.

Sequenzanalysen der Clone wurden unter Verwendung des rever sen Primers von pUC19 durchgeführt. Die Sequenzstrategie ist in Fig. 3 dargestellt. Sequenzdaten sind in Fig. 4 darge stellt.

Beispiel 5: Northern-Blot-Analyse: Identifizierung von mRNA, die für Mannosyltransferase codiert E.5.1. Verfahren E.5.1.1. Isolierung von RNA

Die gesamte RNA wurde aus dem Hefestamm SEY2101 (Mat a, ade2-1, leu2-3, 112, ura3-52) [Emr et al., PNAS 80 (1983) 7080] gemäß Domdey et al. [Cell 39 (1984) 611] isoliert.

E.5.1.2. Northern-Blotting

Die gesamte RNA wurde unter Verwendung eines Formaldehyd- Agarosegels aufgetrennt und wie von Maniatis et al. (1989) beschrieben auf Nitrocellulose geblottet.

E.5.1.3. Die Ziel-DNA

Die 1,1 kB-Insertion von pMT1 wurde durch EcoRI-PstI-Spal tung isoliert. Das Fragment wurde mit dem "Gene clean Kit" (Stratagene) gereinigt.

200 ng des DNA-Fragmentes wurden mit [α-³²P]-dCTP (50 µCi) markiert, wobei das "Megaprime" Markierungskit (Amersham) gemäß Gebrauchsanweisung des Herstellers verwendet wurde.

E.5.2. Ergebnisse

Das Nitrocellulosefilter wurde 2 Stunden bei 42°C in 20 ml 5 ×Denhardt, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 50% Formamid (Vol./Vol.) und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 42°C 16 Stunden in 10 ml 1 × Denhardt, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 50% Formamid (Vol./ Vol.), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA und 200 µg [α-³²P]-dCTP markiertem 1,1 kB-EcoRI-PstI-Fragment von pMT1 durchgeführt. Gewaschen wurde zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 50°C in 50 ml 0,1 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.) Die Hybridi sierung der Sonde wurde durch Röntgenfilm-Exposition nachge wiesen (-70°C, 16 Stunden). Eine einzige mRNA in einer Größe von 3 kB wurde nachgewiesen.

Dieses Verfahren kann von Fachleuten mit anderen Sonden, die von der Sequenz von Fig. 4 abgeleitet werden, und mit RNA aus anderen Quellen (anderen Pilzzellen) einfach wiederholt werden.

Beispiel 6: Herstellung einer S. cerevisiae-Zelle, der die O-Glykosylierungsaktivität fehlt

Eine S. cerevisiae-Zelle, der die O-Glykosylierungsaktivität fehlt, wurde durch Gendisruption, durch Insertion des URA3- Gens in die HindIII-Restriktionsstelle des identifizierten ORF an Bp 1595 der codierenden Sequenz hergestellt.

E.6.1. Konstruktion des für die Gendisruption verwendeten Plasmides

Die 1,1 kB-Insertion von pMT1 wurde als EcoRI-PstI-Fragment isoliert und in einen pUC18-Vektor (EcoRI/PstI-linearisiert, dephosphoryliert, ohne HindIII-Restriktionsstelle im Poly linker) subcloniert. Der resultierende Vektor wurde mit pMT1.1 bezeichnet.

pMT1.1 wurde mit HindIII linearisiert und dephosphoryliert. Das 1,1 kB-HindIII-Fragment von YEp24 [Julius et al., Cell 37 (1984) 1075], enthaltend das URA3-Gen von S. cerevisiae, wurde isoliert und in den mit HindIII linearisierten, de phosphorylierten Vektor pMT1.1 subcloniert. Clone wurden durch Restriktionsanalysen identifiziert und mit pMT1.1/URA3 bezeichnet (Fig. 5).

pMT1.1/URA3 besitzt die DPM2-codierende Sequenz von 0,24 kB, die eine Seite des URA3-Gens flankiert, und DPM2-codierende Sequenz von 0,86 kB, die die andere Seite flankiert. CsCl- DNA von pMT1.1/URA3 wurde gemäß Maniatis et al. (1989) her gestellt.

E.6.2. Transformation von Hefe

40 µg CsCl-DNA von pMT1.1/URA3 wurden mit SphI/EcoRI gespal ten. Um festzustellen, ob die Spaltung vollständig verlaufen ist, wurde ein Teil der gespaltenen DNA auf einem DNA-Agaro segel analysiert. Sodann wurden die Spaltprodukte mit Phenol behandelt und die DNA mit 98% EtOH ausgefällt (Maniatis et al., 1989). Die DNA wurde in 10 µl TE, pH 8,0, gelöst.

S. cerevisiae-Stämme SEY2101/2102 (Mat a/α, ura3-52, leu2-3, 112) (Emr et al., a. a. O.) und SEY2101 (Mat a, ura3-52, leu2- 3, 112, ade2-1) wurden mit 5 µl des mit EcoRI/SphI ge spaltenen Vektors pMT1.1/URA3 gemäß dem Verfahren von Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 163] transformiert.

SEY2101/2102-Transformanten wurden auf Minimalmedien + Leu selektiert; Sey 2101-Transformanten wurden auf Minimalmedien + Leu + Ade selektiert.

Nach 3 bis 4 Tagen bei 30°C konnten die Transformanten her ausgegriffen und ein zweites Mal auf den gleichen Medien plattiert werden.

E.6.3. Southern-Blotting der genomischen DNA der Transfor manten

Genomische DNA von drei haploiden Transformanten und Wild typzellen wurde wie von Hoffmann und Winston [Gene 57 (1987) 267] beschrieben isoliert. 1 µg der genomischen DNA wurde mit XhoI/EcoRI gespalten, auf einem Agarosegel getrennt und wie von Maniatis et al. (1989) beschrieben auf Nitrocellu lose geblottet.

Der Blot wurde in 20 ml 5 × Denhardt, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA und 50% Formamid (Gew./ Vol.) 4 Stunden bei 42°C vorhybridisiert.

Die Hybridisierung wurde in 10 ml der gleichen Lösung unter Zusatz von 200 ng [α-³²P]dCTP-markiertem 1,1 kB-EcoRI/PstI- Fragment von pMT1.1 (vgl. E.5.1.3.) 16 Stunden bei 42°C durchgeführt. Gewaschen wurde zweimal bei Raumtemperatur in 50 ml 2 × SSC, 0, 1% SDS (Gew./Vol.) und zweimal bei 68°C in 50 ml 1 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.). Signale wurden durch Röntgenfilme nachgewiesen. Wildtypzellen zeigten ein einzi ges Signal bei 1,1 kB, welches für das EcoRI/XhoI-Fragment ohne UPA3-Insertion steht. In disruptierten Zellen fehlte dieses Signal. An dessen Stelle wurde durch die 1,1 kB-Sonde ein neues 2,2 kB-Fragment erkannt, welches das 1,1 kB- EcoRI/XhoI-Fragment, das die 1,1 kB-URA3-Insertion trug, darstellte.

Beispiel 7: Charakterisierung der Mutante E.7.1. Wachstum

SEY2101 Wildtypzellen wurden entweder auf YPD (Hefeextrakt 10 g/l, Pepton 10 g/l, Dextrose 20 g/l) oder auf Minimalme dium + Ade + Leu + Ura gezüchtet. Mutante SEY2101- DPM2::URA3-Zellen wurden entweder auf YPD oder auf Minimal medium + Ade + Leu gezüchtet. Die Zellen wurden bei 30°C in einem Wasserbadschüttler gezüchtet. OD578 wurde alle 30 Mi nuten nach Beschallung der Zellen gemessen. Die Wildtypzel len und die mutanten Zellen zeigen auf beiden Medien ein fast identisches Wachstum, die mutanten Zellen kleben jedoch in einigen Fällen aneinander. Trotzdem können solche Zellen durch Beschallung (30 Sekunden, Beschallung Wasserbad) ein fach getrennt werden. Die Wachstumseigenschaften dieser Zel len sind nachstehend zusammengestellt:

- Generationszeit:	WT: 99 Minuten/MT: 93 Minuten
- Zellzahl:	WT: 1 OD = 1,9 × 10⁷/MT: 1 OD = 1,9 × 10⁷
- Verdopplungsrate:	WT: 0,61/h/MT: 0,65/h

In einer logarithmisch wachsenden Kultur bilden 54,7% der Wildtypzellen und 56% der mutanten Zellen Sproßzellen. Nach 24-stündigem Wachstum auf YPD erreichten Wildtypzellen eine OD578 von 11,4 und mutante Zellen von 12,3.

E.7.2. In vitro-Mannosyltransferase-Aktivität und Western- Blotting E.7.2.1. Herstellung von Rohmembranen

SEY2101 wurde in 100 ml Minimalmedium + Ade + Leu + Ura bis zu einer OD578 von 0,5 gezüchtet. SEY2101 DPM2::URA3 wurde in 100 ml Minimalmedium + Ade + Leu bis zu einer OD578 von 0,5 gezüchtet.

Von jedem Stamm wurden zwei Präparate hergestellt. Die Ar beitsgänge wurden auf Eis durchgeführt, alle Puffer hatten 4°C. 40 OD Zellen wurden zentrifugiert und in 25 ml TMA (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 7,5 mM MgCl₂) gewaschen. Die Zellen wurden in 100 µl TMA resuspendiert und in ein Violax-Röhr chen überführt. 0,3 g Glasperlen wurden hinzugefügt und die Zellen auf einem Vortex viermal 30 Sekunden lang aufgebro chen (Kühlung auf Eis in den Intervallen zwischen dem Auf brechen). Das Extrakt wurde mit einer Pasteurpipette von den Glasperlen abgesaugt. Die Glasperlen wurden dreimal mit 250 µl TMA gewaschen. Alle Waschlösungen wurden in einem Eppen dorf-Becher gesammelt. Die Lösung wurde 15 Sekunden zentri fugiert (10000 × g). Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 40 µl TMA resuspendiert (1 OD = 1 µl).

E.7.2.2. Mannosyltransferase-Test (in vitro)

1 und 5 µl Rohmembranen (E.7.2.1.) wurden wie von Strahl- Bolsinger und Tanner (1991) beschrieben auf Enzymaktivität getestet. Zwei parallele Proben aus Wildtypzellen und mutan ten Zellen wurden gemessen. Die Mittelwerte dieser zwei un abhängigen Messungen sind dargestellt.

Im Gegensatz zu Wildtypzellen zeigen mutante Zellen keine in vitro-Mannosyltransferase-Aktivität.

E.7.2.3. Western-Blot-Analyse

Membranen (1 µl aus E.7.2.1.) wurden in 20 µl SDS-Probenpuf fer eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurden SDS-PAGE und Western-Blotting wie von Strahl-Bolsinger und Tanner (1991) beschrieben durchgeführt. Zum Antikörpernach weis wurde das Peroxidase-ECL-Kit (Amersham) gemäß der Ge brauchsanweisung des Herstellers verwendet. Antikörper gegen das 92 kDa-Protein reagieren spezifisch mit einem 92 kDa- Protein von Wildtypmembranen. In mutanten Membranen fehlt dieses 92 kDa-Signal.

E.7.3. In vivo-O-Glycosylierung

Um die in vivo-Glykosylierung zu untersuchen, wurden Wild typzellen und mutante Zellen in Gegenwart von [³H]-Mannose gezüchtet. Anschließend wurde eine aus Zellwand plus Rohmem branen bestehende Fraktion isoliert und O-glykosyliertes Ma terial durch β-Eliminierung freigesetzt.

E.7.3.1. Behandlung mit [³H]-Mannose

Wildtypzellen und mutante Zellen wurden über Nacht in Mini malmedium, das als einzige Kohlenstoffquelle Saccharose enthielt, gezüchtet. 7,5 OD der Kultur (ED578 = 1 bis 2) wurden zentrifugiert und mit 5 ml H₂O (vorgewärmt auf 30°C) gewaschen. Die Zellen wurden in 5 ml YP/0,5% Saccharose/250 µCi [H³]-Mannose in einem Wasserbadschüttler zwei Stunden bei 30°C gezüchtet.

E.7.3.2. Isolierung der aus Zellwand und Rohmembranen be stehenden Fraktion

5 OD der mit [H³]-Mannose behandelten Zellen wurden zentri fugiert und dreimal mit 1 ml TMA gewaschen. Die Zellen wur den in 200 µl TMA resuspendiert und wie in E.7.2.1. mit Glasperlen aufgebrochen (eine 10 µl-Probe wurde zum Zählen der Radioaktivität verwendet, die dem gesamten Einbau ent sprach).

Anschließend wurde der Extrakt 15 Minuten zentrifugiert (10000 × g) und der Überstand entfernt (eine 100 µl-Probe wurde zum Zählen der Radioaktivität verwendet, die dem lös lichen Material entsprach).

E.7.3.3. β-Eliminierung

Das Pellet wurde in 1 ml 0,1 N NaOH resuspendiert (eine 10 µl-Probe wurde zum Zählen der Radioaktivität verwendet, die dem Material vor der β-Eliminierung entsprach). Die Inkuba tion wurde 24 Stunden bei 30°C durchgeführt.

E.7.3.4. Analyse von β-eliminiertem Material

β-Eliminiertes Material wurde über eine Dowex 50WS8/H⁺-Säule (0,5 cm × 6 cm) entsalzt. Die Säule war mit 0,5 M Mannose gesättigt und in H₂O äquilibriert. Die Probe der β-Eliminie rung wurde auf die Säule aufgetragen und mit 1,5 ml H₂O durchgewaschen. Der Durchfluß wurde gesammelt (eine 100 µl- Probe wurde verwendet, um die Radioaktivität zu zählen, die dem β-eliminierten Material entprach) und in der Speed-Vac auf 10 µl eingeengt. Eine Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60 (Merck) in Aceton : Butanol : H₂O 70 : 15 : 15 wurde durchgeführt. Standards: Mannose, Saccharose, Stachyose, Raffinose. Der Chromatographie-Durchlauf wurde einmal wie derholt. Die Zucker wurden mit 0,5 g KMnO₄ in 100 ml 1 N NaOH nachgewiesen. Die Radioaktivität wurde mit einem Dünn schichtscanner (Berthold) nachgewiesen (vgl. Fig. 6).

Mutante Zellen zeigen im Vergleich zu Wildtypzellen eine verringerte Glykosylierung. Die O-Glykosylierung in mutanten Zellen ist etwa 40 bis 50% niedriger als in Wildtypzellen.

Claims

1. DNA-Moleküle, die ein Protein mit der enzymatischen Ak tivität einer Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr) Mannosyl transferase codieren, oder ein enzymatisch aktives Frag ment davon, das eine derartige enzymatische Aktivität aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) DNA-Molekülen, die ein Protein codieren, das die un ter Seq ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz auf weisen, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon, wobei die Seq. ID No. 2 Bestandteil des Anspruchs ist;
b) DNA-Moleküle, die die unter Seq ID No. 1 darge stellte Nucleotidsequenz umfassen, wobei die Seq ID No. 1 Bestandteil des Anspruchs ist;
c) DNA-Moleküle, die mit den unter (a) oder (b) genann ten DNA-Molekülen hybridisieren und die ein Protein codieren, das die enzymatische Aktivität einer Dol- P-Man: Protein (Ser/Thr) Mannosyltransferase auf weist.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das ein cDNA-Molekül ist.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das ein genomisches DNA-Mo lekül ist.

4. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das aus einem Pilz stammt.

5. DNA-Molekül nach Anspruch 4, das aus einem Pilz der Gat tung Saccharomyces stammt.

6. DNA-Molekül nach Anspruch 5, das aus Saccharomyces cerevisiae stammt.

7. Vektor enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprü che 1 bis 6.

8. Vektor nach Anspruch 7, wobei das DNA-Molekül verknüpft ist mit regulatorischen Elementen, die die Expression in Pilzzellen gewährleisten.

9. Vektor nach Anspruch 8, wobei die regulatorischen Ele mente eine Transkriptions- und Translationsinitiations region umfassen.

10. Vektor nach Anspruch 9, wobei die Transkriptions- und Translationsinitiationsregion von Hefegenen abgeleitet sind.

11. Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das DNA- Molekül verknüpft ist mit in Pilzzellen funktionellen Transkriptions- und Translationsterminationsregionen.

12. Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die co dierende Region des DNA-Moleküls ein Signalpeptid (Prä- Sequenz) am N-Terminus der Proteinsequenz codiert, die die Einleitung des codierten Proteins in den sekretori schen Stoffwechselweg einer Pilzzelle gewährleistet.

13. Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, der sich auto nom in einer Pilzzelle replizieren kann.

14. Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, der in das Ge nom (Chromosom) einer Pilzzelle integrieren kann.

15. Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 7 bis 14 zur Herstellung genetisch modifizierter Pilzzellen mit einer verringerten Fähigkeit zur O-Glykosylierung von Proteinen.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Pilzzelle von fi lamentösen Pilzen oder Hefen stammt.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der filamentöse Pilz aus der Gattung Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Neurospora oder Fusarium ist.

18. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Hefe aus der Gat tung Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida oder Schizosaccharomyces ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Hefe K. lactis, K. waltii oder K. drosophilarum ist.

20. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei die genetische Modifikation eine beliebige Suppression, Sub stitution, Deletion, Addition, Disruption und/oder muta tive Insertion umfaßt.

22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die genetische Modi fikation während der Segregation stabil und/oder nicht revertierend und/oder nicht durchlässig ist.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei die genetische Modifikation in einer codierenden Region liegt, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)-Mannosyltransferase codiert.

24. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei die genetische Modifikation in einer Region liegt, die für die Expression und/oder transkriptionalen Regulation eines Gens verantwortlich ist, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyltransferase codiert.

25. Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Isolierung homologer Gene, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyltransferase codieren, aus Pilzzellen.

26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Isolierung mit Hilfe von Hybridisierung mit DNA-Molekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Fragmenten davon erfolgt.

27. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Isolierung mit tels Komplementierung erfolgt, wobei

a) mit Hilfe eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprü che 1 bis 6 mutierte Pilzzellen hergestellt werden, die eine verringerte Fähigkeit zur O-Glykosylierung aufweisen;
b) in diese mutierten Pilzzellen DNA eingebracht wird, die aus Pilzzellen hergestellt wurde, die Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyltransferaseaktivität auf weisen;
c) Transformanten selektiert werden, die Dol-P-Man: Protein (Ser/Thr)-Mannosyltransferaseaktivität auf weisen; und
d) die eingeführte DNA-Sequenz isoliert wird.