DE4420732A1 - Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Behandlung von Nuklein­ säuren aus einer Probe sowie ein System zur Handhabung dieser Vorrichtung.

Im Gegensatz zur klinischen Chemie und Immunologie spielt bei der Analyse von Nukleinsäuren die Probenvorbereitung eine entscheidende Rolle, vor allem wenn, Amplifikationsverfahren wie die Polymerase Chain Reaction (US-A-4,683,195) oder auf Transkriptionsreaktionen basierende Amplifikatio­ nen Teil des Analyseverfahrens sind. Dabei kann ein Nukleinsäureanalysever­ fahren theoretisch in drei Teilschritte zerlegt werden. Nämlich eine Proben­ vorbereitung, in der die Nukleinsäuren aus einer Probe zugänglich gemacht und von störenden Probenbestandteilen abgetrennt werden, eine Amplifika­ tion, bei der die Menge an Nukleinsäuren erhöht wird, und einen Detektions­ schritt, in dem die gebildeten Nukleinsäuren nachgewiesen werden.

In derzeit erhältlichen Nukleinsäureanalysetests, z. B. für den Nachweis von HIV aus Blut, sind eine ganze Reihe von chemischen und physikalischen Be­ handlungsschritten erforderlich. Dazu gehören Zentrifugations-, Dekantie­ rungs- und Extraktionsschritte. Diese Schritte finden in Reagenzröhrchen statt. Ergebnis der Probenvorbereitung sind gefällte Nukleinsäuren, die für den Ein­ satz in der Amplifikationsreaktion wieder aufgelöst werden.

Eine spezielle Variante, bei der die Nukleinsäuren nach der Probenvorberei­ tung in an ein Gel gebundender Form vorliegen, ist in der EP-A-O 389 063 be­ schrieben. Auch dieses Verfahren beinhaltet mehrere Zentrifugationsschritte zur Abtrennung der Gelpartikel von der Probenflüssigkeit.

Ein besonderes Problem bei der Analyse von Proben auf Nukleinsäuren ist die Gefahr einer Kontamination durch von außen, über die Luft oder Bearbei­ tungsvorrichtungen eingeschleppte Nukleinsäuren. Die oben geschilderten Verfahren sind zusätzlich noch besonders kontaminationsanfällig, da die Probengläschen mehrmals geöffnet und geschlossen werden müssen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und insbesondere eine Vorrichtung zur kontaminations­ armen und einfachen Behandlung von Nukleinsäuren bereitzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist daher eine Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen ersten Reaktionsraum zur Abtrennung der Nukleinsäuren von anderen Probenbe­ standteilen sowie einen damit über einen regelbaren Transportweg verbunde­ nen zweiten Reaktionsraum zur Vermehrung der Nukleinsäuren enthält. Eben­ falls Gegenstand der Erfindung ist ein System zur Behandlung von Nuklein­ säuren, welches auf die erfindungsgemäße Vorrichtung abgestimmt ist.

Grundgedanke der Erfindung ist, daß die Teilschritte Probenvorbereitung und Vermehrung von Nukleinsäuren besonders vorteilhaft aneinander gekoppelt in einer einzigen Vorrichtung durchgeführt werden. Eine solche Kopplung der Teilschritte wurde bisher noch nicht beschrieben.

Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind jegliche Art von Nukleinsäuren, sowohl DNA als auch RNA, einzelsträngig, doppelsträngig oder mehrfach­ strängig. Diese Nukleinsäuren können in jeder Art von Proben, insbesondere flüssigen Proben, enthalten sein. Unter Proben ist hierbei ein Gemisch von Stoffen zu verstehen. Sie können vor ihrem Einsatz in der erfindungsgemäßen Vorrichtung einer Behandlung unterzogen worden sein, können jedoch auch der Natur direkt entnommen sein, z. B. Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin.

Eine Behandlung von Nukleinsäuren ist für die Durchführung verschiedenster Verfahren erforderlich. Hierzu gehören Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe, wie sie bei der Erkennung von Infektionen durch nukleinsäurehaltige Organismen erforderlich sind. Mehrere Behand­ lungsschritte sind jedoch auch in Verfahren zur Feststellung des genetischen Status von Organismen sinnvoll. In all diesen Verfahren sind eine Reihe von Behandlungsschritten erforderlich. Da die Nukleinsäuren nur einen sehr gerin­ gen Anteil der Komponenten des Gemisches ausmachen, wird oft eine Ab­ trennung von Nukleinsäuren von anderen Probenbestandteilen vorgenommen. Der Grad der Abtrennung bzw. Aufreinigung richtet sich nach dem beabsich­ tigten Zweck der Gesamtbehandlung.

Die Vermehrung von Nukleinsäuren ist ebenfalls ein weit verbreiteter Schritt bei der Behandlung von Nukleinsäuren. Es stehen diverse Verfahren zur Ver­ mehrung von Nukleinsäuren bereit, z. B. die Polymerasekettenreaktion. Unter Vermehrung von Nukleinsäuren ist im wesentlichen die in-vitro-Vermehrung gemeint. Jedoch ist auch eine in-vivo-Vermehrung prinzipiell denkbar.

Gegenstand der Erfindung ist nun die Verknüpfung beider Behandlungsschritte in einer einzigen Vorrichtung. Dabei findet die Abtrennung der Nukleinsäuren von anderen Probenbestandteilen in einem ersten Reaktionsraum statt und die Vermehrung der Nukleinsäuren in einem zweiten Reaktionsraum. Erfindungs­ gemäß sind die beiden Reaktionsräume über einen Transportweg miteinander verbunden, wobei dieser so gestaltet ist, daß er eine zeitliche Festlegung des Transports einer Flüssigkeit vom ersten in den zweiten Reaktionsraum erlaubt.

Der Behandlungsschritt zum Abtrennen der Nukleinsauren im ersten Reak­ tionsraum ist ein komplexer Vorgang, der je nach Probenart folgende Unterschritte beinhalten kann, die in mehr als einem erfindungsgemäß ver­ bundenen Reaktionsraum ablaufen können. Er kann beispielsweise beinhalten:

• a) Verflüssigung im Falle einer festen oder zähflüssigen Probe
• b) Vereinzelung von nukleinsäureenthaltenden Kompartimenten wie z. B. Zellen oder Zellkompartimente über geeignete, großteils bekannte Verfah­ ren.
• c) Anreicherung von nukleinsäureenthaltenden Kompartimenten wie z. B. Zellen oder Zellkompartimente über geeignete Verfahren (z. B. gemäß EP-A-0260280).
• d) Freisetzung von Nukleinsäuren aus den obenerwähnten Kompartimenten.
• e) Die Abtrennung von Nukleinsäuren von anderen Probenbestandteilen, vor allem solchen, die in den verschiedensten Vermehrungsprozessen inhibi­ torisch wirken, z. B. Polymeraseinhibitoren.

All diese Behandlungsschritte im ersten Reaktionsraum geschehen erfindungs­ gemäß nicht über Zentrifugationsschritte. Möglichkeiten dafür sind als Ver­ fahren in der Literatur beschrieben und beinhalten enzymatische Abbau­ reaktionen, diverse immunchemische Verfahren mit verschiedensten Fest­ phasen-Systemen wie Immunadsorption oder Einsatz von beschichteten Magnetpartikeln. Möglichkeiten zur Abtrennung von Nukleinsäuren sind ge­ geben durch Zurückhalten der Nukleinsäuren an einem Filtermaterial, (unspezifische) Immobilisierung von Nukleinsäuren an ein im Reaktionsraum enthaltenes Adsorbens wie beispielsweise Silikagel oder Glaspartikel, oder biospezifische Immobilisierung von Nukleinsäuren an biospezifischen Ad­ sorbentien, z. B. Affinitätsmaterialien. Hierbei kann die Fähigkeit von Nukleinsäuren, mit hierzu im wesentlichen komplementären Nukleinsäuren an einer festen Phase Hybride zu bilden, ausgenutzt werden.

Die Abtrennung der Nukleinsäuren kann auch über chromatographische Ver­ fahren im ersten Reaktionsraum vorgenommen werden. Neben der Abtrennung von Nukleinsäuren können im ersten Reaktionsraum zusätzlich weitere Be­ handlungsschritte für Nukleinsäuren durchgeführt werden, z. B. Filtration von nukleinsäurehaltigen Zellen, Lyse dieser Zellen oder Schritte zur Markierung von Nukleinsäuren. Beispielsweise kann im ersten Reaktionsraum gemäß der Erfindung in einem Schritt die Lyse und Immobilisierung von Nukleinsäuren gemäß EP-A-O 389 063 durchgeführt werden. Je nach den im ersten Reak­ tionsraum durchzuführenden Behandlungen, kann auch, angrenzend an den Reaktionsraum, ein Heizelement vorgesehen sein. Dieses ist insbesondere bei der Lyse von Zellen praktikabel.

Da einerseits bei allen hier gezeigten Verfahren vor einer Nukleinsäurever­ mehrung die Kontaminationsgefahr sehr groß ist und ein hohes Risiko birgt, falsch-positive Ergebnisse zu erzielen und andererseits wie beschrieben die Prozesse für die entsprechende Probenaufarbeitung sehr unterschiedlicher Natur sind, ist ein wichtiger Gegenstand der Erfindung die Verwendung von kostengünstigen modular anwendbaren Einmalplastikartikeln, die in einem weitgehend geschlossenem Verbund für Mehrstufenprozesse benutzt werden. Die Vorrichtung stellt daher ein im wesentlichen geschlossenes System dar, das an wenigen Stellen ohne Kontaminationsrisiko geöffnet werden kann, um mindestens einen Reagenzeintrag in mindestens einen Reaktionsraum zu ermöglichen. In einem ersten Aspekt der Erfindung stellt die Vorrichtung daher ein anwendungsbereites Mehrfachreaktionsgefäß dar.

Die Abtrennung der Nukleinsäure von anderen Probenbestandteilen wird be­ endet, indem die Flüssigkeit mit anderen Probenbestandteilen aus dem ersten Reaktionsraum entfernt wird, wohingegen die angereicherten Nukleinsäuren im Reaktionsraum verbleiben. Dazu weist der erste Reaktionsraum neben der für das Einfüllen der Probe in den ersten Reaktionsraum erforderlichen Öff­ nung eine weitere Öffnung bevorzugt am unteren Teil oder am Boden des Reaktionsraumes auf, die im weiteren als Ventilöffnung bezeichnet wird. Diese Ventilöffnung ist bevorzugt verschließbar. Sobald die Probe in dem ersten Reaktionsraum vorliegt, ist der Verschluß normalerweise geschlossen. Zur Abtrennung der anderen Probenbestandteile von den Nukleinsäuren wird der Verschluß, solange erforderlich, geöffnet und die anderen Probenbestand­ teile entnommen.

Als Verschluß im Sinne der Erfindung hat sich dafür insbesondere ein Ventil­ verschluß erwiesen, der durch Anlegen eines Vakuums von außen an den ersten Reaktionsraum geöffnet werden kann. Durch Anlegen eines Unter­ drucks gegenüber dem im ersten Reaktionsraum vorherrschenden Druck wer­ den die Probenbestandteile aus dem ersten Reaktionsraum entfernt. Wenn diese nicht mehr weiterbewertet werden sollen, werden sie verworfen, bevor­ zugt in ein Abfallgefäß transportiert.

Da die Öffnung zum Befüllen des Reaktionsraumes, die sich bevorzugt im oberen Teil des Reaktionsraumes befindet, wegen der hohen Kontaminations­ gefahr mit einem geeigneten automatisch zu öffnenden Deckel verschlossen sein muß, wie er in DE-A-44 12 286 beschrieben ist, muß für einen angemessenen Druckausgleich Sorge getragen werden. Erfindungsgemäße Lösungen werden später beschrieben.

Anschließend werden die abgetrennten Nukleinsäuren in einen zweiten Reak­ tionsraum überführt, in dem die Vermehrung der Nukleinsäuren stattfindet. Zwischen dem ersten und zweiten Reaktionsraum können jedoch noch weitere Reaktionsräume zur weiteren Aufreinigung oder andere Behandlungsschritte vorgesehen sein. Die Nukleinsäuren werden aus dem ersten Reaktionsraum durch Lösen in einer Flüssigkeit entfernt. Je nach Art der Immobilisierung der Nukleinsäuren kann dies durch Anlegen eines Reagenzgradienten, eines die Desorption bewirkenden Stoffes oder eine Verdrängung geschehen. Geeignete Verfahren sind insbesondere aus der EP-A-O 389 063 bekannt.

Die die Nukleinsäuren enthaltende Flüssigkeit wird über einen Transportweg zum zweiten Reaktionsraum transportiert. Erfindungsgemäß ist dieser Transportweg regelbar. Unter regelbar wird verstanden, daß der Transportweg Mittel enthält, mit denen sichergestellt wird, daß nur die nukleinsäurehaltige Lösung, und nicht die mit anderen Probenbestandteilen beladene Flüssigkeit, in den zweiten Reaktionsraum gelangt. Dies kann beispielsweise realisiert werden durch einen konventionellen 3-Wege-Hahn, von dem jeweils ein Weg zu dem ersten und zweiten Reaktionsraum führt und ein dritter Weg ein Ab­ falltransportweg ist. Wenn die Flüssigkeit mit den anderen Probenbestand­ teilen durch den Transportweg transportiert werden soll, verbindet das Ver­ teilerelement den vom ersten Reaktionsraum kommenden Weg mit dem Ab­ falltransportweg. Wenn die nukleinsäurehaltige Lösung in den zweiten Reak­ tionsraum überführt werden soll, wird das Verteilerelement so gestellt, daß der Weg vom ersten Reaktionsraum mit dem Weg zum zweiten Reaktionsraum verbunden wird. Weitere Möglichkeiten zur Teilung der Flüssigkeitsströme sind bekannt. Das Verteilerelement wird bevorzugt über eine zentrale Steuer­ einheit gesteuert, so daß die Zugabe von Reagenzien in den ersten Reaktions­ raum, die Initiation des Transports der Flüssigkeit mit den anderen Probenbe­ standteilen bzw. der nukleinsäurehaltigen Lösung und die Stellung des Ver­ teilerelements koordiniert werden kann.

Der zweite Reaktionsraum, welcher für die Durchführung der Vermehrungs­ reaktion benutzt wird, enthält die hierfür erforderlichen Reagenzien entweder bereits vor der Zugabe der nukleinsäurehaltigen Lösung oder diese Reagenzien werden über eine Öffnung zu der nukleinsäurehaltigen Flüssigkeit im zweiten Reaktionsraum zugegeben. Bevorzugt ist die hierfür vorgesehene Öffnung zur Verringerung der Kontaminationsgefahr von außen verschließbar und wird nach Herstellungen der Vermehrungsbedingungen verschlossen. Sofern die Zugabe weiterer Reagenzien zu einem späteren Zeitpunkt erforderlich wird, kann die Öffnung erneut geöffnet werden. Eine weit verbreitete Möglichkeit der Vermehrung von Nukleinsäuren ist die PCR, z. B. EP-A-0 200 362. Der zweite Reaktionsraum ist dazu bevorzugt so gestaltet, daß schnelle Tempera­ turänderungen darin vollzogen werden können.

Nach der Vermehrungsreaktion kann die Reaktionsmischung für die Durchfüh­ rung weiterer Reaktionen in dem zweiten Reaktionsraum verbleiben, oder aber daraus entfernt werden. Hierfür steht entweder die oben genannte verschließ­ bare Öffnung zur Verfügung oder es kann eine weitere Öffnung, wie für den ersten Reaktionsraum beschrieben, vorgesehen sein.

Für die Durchführung von Nukleinsäurenachweistests kann der Nachweis im zweiten Reaktionsraum geschehen, beispielsweise wie in der DE-A-43 44 742 beschrieben, oder nach Überführung in ein weiteres Gefäß, beispielsweise einen dritten Reaktionsraum.

Die einzelnen Elemente der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind prinzipiell bekannt bzw. sehr leicht herstellbar. Sie sind beispielsweise Tubes, die an ihrem Boden ein durch Unterdruck zu öffnendes Ventil enthalten, indem eine in der Mitte geschlitzte Gummidichtlippe sich in Richtung des Unterdruckes wölbt und die außenliegenden Auslaßöffnungen des Tubebodens freigibt. Wird der Unterdruck aufgehoben, so springt die Gummidichtlippe in die Ausgangs­ position zurück und dichtet die Auslaßöffnungen.

Der Tubekörper kann aus geeigneten Materialien, wie beispielsweise Kunst­ stoffen oder Glas, hergestellt sein. Die Gummidichtlippe kann aus elastischem Kautschukgummi oder vergleichbar elastischen Material hergestellt werden, wobei eine hohe Materialelastizität eine Öffnung durch geringen Unterdruck und umgekehrt ermöglicht.

Die Herstellung erfolgt in zwei Schritten: a.) Spritzgußtechnische Verarbeitung von Kunststoffen wie oben erwähnt zur Formgebung eines Grundkörpers, der am unteren Ende einen Rand überstehen hat. b.) Einlegen der Gummidichtlippe mit anschließender Umbördelung des Randes mittels Schmelzen, wodurch die Befestigung der Gummidichtlippe an den Grundkörper entsteht.

Der regelbare Transportweg kann aus einem Stück Schlauch bestehen, jedoch auch aus einer festen Röhre aus Kunststoff oder Plastik bestehen. Als Ver­ teilerelement können handelsübliche 3 -Wege-Verteilerelemente eingesetzt werden. Als zweiter Reaktionsraum kann praktisch jedes Tube, wie es aus Reagenzienautomaten bekannt sind, verwendet werden. Besonders vorteilhaft ist die erfindungsgemäße Vorrichtung jedoch aus einem Stück gebildet, mit Ausnahme der bewegten Teile, wie Ventil oder Verteiler. Zur Herstellung stehen Spritzgußverfahren zur Verfügung.

Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, daß sie als Einmal-Device gestaltet werden kann, d. h. nach Abtrennung der Nukleinsäuren und ihrer Vermehrung sowie Gewinnung der vermehren Nukleinsäuren kann die Vor­ richtung verworfen werden.

Eine weitere mögliche Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, daß die Vorrichtung aus einzelnen Modulen aufgebaut ist, die je nach der Art der durchzuführenden Behandlungsschritte, die von der Art der Probe und der gewünschten Behandlung abhängig ist, aus einzelnen Modulen beliebig zusammengesetzt werden kann. Unter einem Modul wird eine Vor­ richtung verstanden, die für einen Behandlungsschritt vorgesehen ist, und die mit anderen Vorrichtungen zur Abarbeitung einer ganzen Kaskade von Behandlungsschritten auf einfache Weise verbunden und kombiniert werden kann. In einem Aspekt der Erfindung besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung aus im wesentlichen baugleichen, zusammensteckbaren Modulen, so daß eine mehrstufige Reaktionsführung möglich ist. Im wesentlichen baugleich bedeutet hier, daß mindestens zwei Module eine ähnliche äußere Form und ein gleiches Prinzip für die Öffnung des Verschlusses, mit dem die Entnahmeöffnung verschlossen werden kann, aufweist. Im Hinblick auf die Inhalte des Reaktionsraumes des Moduls können je nach Einsatzzweck des Moduls beträchtliche Unterschiede bestehen, z. B. kann ein Modul ein Filtervlies, ein anderes Reagenz zur Lyse von Zellen, ein weiteres Materialien zur Immobilisierung von Zellen oder Nukleinsäuren enthalten. Der Begriff zusammensteckbar bedeutet, daß der Ausgang eines Moduls mit einer Eingangsöffnung eines anderen Moduls schnell flüssigkeitsdicht verbunden werden kann. Als Module können Module verwendet werden, die einen Reaktionsraum sowie einen flüssigkeitsdichten Verschluß, der durch Einwirkung von Vakuum von außen auf den Verschluß geöffnet werden kann, aufweisen. Für die Abtrennung der Nukleinsäuren enthält das Modul die für die Abtrennung erforderlichen Materialien und Reagenzien, während für die Durchführung der Vermehrungsreaktion die vermehrungsreaktionsspezifischen Reagenzien enthalten sind. Die Reaktionsmodule können über Verteilermodule miteinander verbunden werden. Die Verteilermodule enthalten Ansätze für die Verbindung mit den Reaktionsmodulen und einem Abfallgefäß, die Transportwege und das Verteilerelement.

Der Transport der Gase und insbesondere Flüssigkeiten innerhalb der Vorrich­ tung wird entweder über Kapillarität oder Unterdruck/Vakuum gewährleistet. Bevorzugt ist die Benutzung von Unterdruck. Hierzu wird an den Abfallbe­ hälter und/oder den zweiten Reaktionsraum ein leichter Unterdruck angelegt.

In Fig. 1 sind Module gezeigt, die für die Herstellung einer erfindungsge­ mäßen Vorrichtung verwendet werden können und zeigt ein Universal­ modul (1) für Reaktionsräume mit einer verschließbaren Bodenöffnung im ge­ öffneten und geschlossenen Zustand. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Universalmodul aus einem Boden (2) mit mehreren Auslaßöffnun­ gen (3) und einer geschlitzten Gummidichtlippe (4).

Fig. 1a zeigt die Aufsicht auf Boden (2) mit Auslaßöffnungen (3) sowie Gummidichtlippe (4) mit Schlitz (5). Durch Anlegen von Unterdruck wölbt sich die Gummidichtlippe (4), öffnet den Schlitz (5) und gibt die Bodenöff­ nungen (3) frei.

Fig. 1b zeigt den Schnitt durch den Deckel für die obere Öffnung mit Be­ lüftungsloch (6). Die Ausführungen Fig. 1c und 1d berücksichtigen den Kon­ taminationsschutz, wobei in Fig. 1c eine Papiervliesscheibe (7) und in Fig. 1d eine geschlitzte Gummidichtlippe (8) verwendet wird.

Fig. 1e zeigt ein Verteilerelement (9) mit einem Ansatz (10) für einen ersten Reaktionsraum (11), einem Ansatz (12) für einen Abfallbehälter und einen Ansatz (13) für ein zweites Modul mit einem zweiten Reaktionsraum (14) in einer Kaskadenanordnung. Die Öffnung (15) dient zur Aufnahme eines Deckels (19).

In Fig. 1f ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem ersten Reaktionsraum (11), einem zweiten Reaktionsraum (14), einem Abfallbehälter (16), Heizelementen (17) für den ersten und zweiten Reaktionsraum sowie Vakuumansatzstutzen (18) für den zweiten Reaktionsraum und den Abfallbe­ hälter gezeigt. Im gezeigten Zustand ist auf dem Verteilerelement in der Nähe des zweiten Reaktionsraums ein Deckel (19) vorgesehen, durch welchen die Reagenzien für die Vermehrung der Nukleinsäuren in den zweiten Reaktions­ raum gegeben werden können. Ferner ist ein Magnet (20) angedeutet, der zur Separierung magnetischer Phasen (z. B. Partikel von nicht magnetischen Phasen) während oder nach der Vermehrungsreaktion benutzt werden kann z. B. für eine vorgeschaltete Zellanreicherung mittels Immunadsorbtion.

Eine weitere Ausführungsform in einer planaren Anordnung zeigt Fig. 1g. Das Verteilerelement (21) ist hier in die Deckellösung integriert. Über eine Kapillare (22) kann die Reaktionslösung vom ersten Reaktionsraum (11) in den zweiten (14) durch Unterdruck im zweiten Reaktionsraum (14) bei ge­ schlossenem Ventil im ersten Reaktionsraum (11) überführt werden. Bei den diversen Reaktionen anfallender Abfall kann dabei direkt über die Bodenöff­ nungen (3) entfernt werden. Analog Fig. 1f können Heizelemente und Magnet­ separator eingesetzt werden.

In Fig. 2 ist ein anderes Beispiel für den variablen Aufbau eines kontami­ nationsfreien Reaktionsraumes aus Standardmodulen gezeigt, der zur immuno­ logischen Adsorption von Zellen genutzt werden kann. Im gezeigten Zustand ist das Modul durch einen Deckel (19) verschlossen. Bei Anlegen eines Vakuums an den Anschlüssen (12, 13) würde ein Transport der Flüssigkeit aus dem Modul schnell zum Erliegen kommen, wenn nicht eine weitere Öffnung (6) zum Druckausgleich vorgesehen wäre.

In Fig. 3 ist die Kombination eines Moduls mit Reagenzien zur Immunad­ sorption mit einem Modul für die Durchführung einer Vermehrungsreaktion von Nukleinsäuren schematisch gezeigt. Es wird klar, daß, sofern die Über­ gänge aufeinander abgestimmt sind, die erfindungsgemäßen Module für jeden Behandlungsschritt adaptiert und mit entsprechenden Heizelementen oder Magnetseparatoren versehen werden können und so analog Fig. 1a-g ein uni­ verselles System aus einfachen Grundmodulen ergeben.

In Fig. 4 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Probenvorbereitung und Amplifikation von Nukleinsäuren aus Vollblut dargestellt. In einem Reak­ tionsmodul (23) findet die Hämolyse statt. Die gewünschten Zellen werden über ein Grobfilter (24) von Geweberesten befreit. Durch Druckausgleich über den Ausgang (6) werden die Zellen auf einen Immunadsorber (25) aufgegeben. Durch Elution mit Puffern im pH-Bereich 2-3 werden die Zellen eluiert und die Suspension in einen Reaktionsraum (26) überführt, in dem die Lyse der Zellen stattfindet. Das gesamte Lysat wird in ein Modul (27) überführt, welches ein Glasvlies enthält. Daran werden die Nukleinsäuren adsobiert, während die anderen Probenbestandteile im Filtrat verbleiben und dem Abfall zugeführt werden. Nach Desorption mittels Puffer mit niedrigen Ionenstärken wird die nukleinsäurehaltige Flüssigkeit in eine Amplifikationskammer (14) überführt.

Der Transport von Flüssigkeiten wird in dem hier beschriebenen Device mittels eines einzigen Mehrwegeventils (28) und Anlegen von Unterdruck sowie der Belüftung (6) bewerkstelligt.

In Fig. 5 ist ein einteiliges Device für die Bearbeitung von EDTA-Blut ge­ zeigt. Der Flüssigkeitstransport findet über ein Abfallvlies (29) (Kapillarität zusammen mit Erdanziehungskraft) statt. In einem ersten Gefäß (23) findet eine Preinkubation, wie z. B. enzymatische Verflüssigung oder die oben er­ wähnte Hämolyse statt. Es schließt sich ein Immunadsorber (25) an. Die Nukleinsäuren werden über ein anschließendes Glasvlies (27) immobilisiert und von anderen Probenbestandteilen abgetrennt. Anschließend wird die nukleinsäurehaltige Lösung in die Amplifikationskammer (14) überführt. Im vorliegenden Fall sind die Verteilerelemente (28) 3-Wege-Hähne.

In Fig. 6 ist ein Schema für eine Aufbereitung von HIV-haltigem Vollblut für einen Nachweis der DNA oder RNA gezeigt. Es wird hierbei auf die Be­ schreibung von Fig. 1c verwiesen. Zusätzlich ist ein Magnet (20) auch im ersten Modul vorgesehen. Darüber hinaus ist angedeutet, daß die amplifizier­ ten Nukleinsäuren in ein konventionelles Tube (30) überführt und nachge­ wiesen werden können. Diese Figur ist in Beispiel 1 näher beschrieben.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein System zur Behandlung von Nukleinsäuren enthaltend eine Vorrichtung zum Pipettieren von Flüssigkeiten, eine Vorrichtung zur Aufnahme einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und eine Vorrichtung zum geregelten Transport von Gasen oder Flüssigkeiten in der Vorrichtung gemäß Anspruch 1. Als Vorrichtung zum Pipettieren von Flüssig­ keiten können übliche Pipettierautomaten z. B. der Firma Tecan verwendet werden. Mit diesen Automaten können sowohl die nukleinsäurehaltige Probe­ flüssigkeit als auch eventuell erforderliche Reagenzien aus Proben- bzw. Reagenzvorratsgefäßen in die erfindungsgemäße Vorrichtung überführt wer­ den. Der Transport in der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird bevorzugt über das Anlegen von Unterdruck gesteuert. Hierzu wird eine Anschlußöff­ nung der Vorrichtung mit einem Element verbunden, mit dem ein Unterdruck erzeugt werden kann. Daß die Flüssigkeiten aus den einzelnen Reaktions­ räumen wie gewünscht weiter transportiert werden, kann über eine Steuerung der Verteilerelemente oder/und der Unterdruckanlage gewährleistet werden.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung und Vermehrung von Nukleinsäuren aus einer Probe durch

• - Immobilisierung der Nukleinsäuren in einem ersten Reaktionsraum,
• - Entfernung anderer Probenteile von den immobilisierten Nukleinsäuren über einen regelbaren Transportweg,
• - die Immobilisierung der Nukleinsäuren und Überführung der nukleinsäure­ haltigen Flüssigkeit über einen regelbaren Transportweg in einen zweiten Reaktionsraum,
• - Amplifikation der Nukleinsäuren im zweiten Reaktionsraum.

Vorteil der Erfindung ist die hohe Flexibilität des Einsatzes der Module, die Möglichkeit, die Kontaminationen gering zu halten und die Automatisierbar­ keit von Probenvorbereitung und Amplifikation bei nukleinsäure­ diagnostischen Tests. Die Module sind bevorzugt so aufgebaut, daß sie nach einmalige Benutzung verworfen werden könne. Der jedoch wohl größte Vor­ teil der Erfindung ist die Möglichkeit, in den Schritten Probenvorbereitung und Amplifikation jegliche Zentrifugation vermeiden zu können.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

Beispiel 1a Bestimmung von HIV-DNA aus Vollblut (Fig 6)

Im Reaktionsmodul (1) werden mittels biotinyliertem Anti-T Helfer- Zellen/CD4, human-Antikörper (Hersteller: Boehringer Mannheim Biochemica Kat.Nr.: 881 171) und Streptavidin-Magnet-Partikeln (Hersteller: Dynal, Oslo, Norwegen) die HIV-DNA-haltigen Zellen aus Vollblut suspendiert, inkubiert und über einen ersten Magneten (20) zurückgehalten. Durch Anlegen von Vakuum an den Abfallbehälter (16) über den Stutzen (18) kann das nicht benötigte Vollblut ausgewaschen und entfernt werden.

Durch Zugabe von Proteinase K in einem geeigneten Puffersystem z. B. mit 1% Laureth 12 oder 0,5% Tween 20 nach Rolfs et al. (in PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992) S. 84 ff oder mit Natrium- Dodecylsulfatzusatz nach Anderson in Diagnostic Molecular Microbiology - Principals and Applications Edtrs.: D.H. Persing, T.F. Smith, F.C. Tenover und T.J. White; American Society of Microbiology; ISBN 1-55581-056-X (1993) S. 197-202 können die Zellen nach Resuspension durch Erhitzen über die erste Heizung (17) lysiert werden. Nach Zurückhalten der magnetischen Partikel durch Magnet (20) und durch Anlagen von Vakuum an (18) kann die Reaktionsmischung in Reaktionsmodul (14) überführt werden.

Durch den automatisch zu öffnenden Deckel (19) können anschließend PCR- Reagenzien zugegeben und durch Thermocycling über die Heizung (17) des Moduls (14) kann die DNA amplifiziert werden analog zu EPA-324474. Danach wird durch Zugabe von biotinylierter DNA-capture-Probe, die zu dem PCR-Amplifikat zwischen den Primerhybridisierungspositionen komplementär ist, und Erhitzen über die Heizung (17) des Moduls (14) eine Hybridisierung durchgeführt werden. Anschließend kann durch Vakuumanlegen an (31) die gesamte Reaktionsmischung in ein Streptavidin (SA)-beschichtetes (ES) Tube (30, Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 1602845) gefüllt in einem ES- Gerät (Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 1602845) detektiert und das Ergebnis ausgewertet werden.

Beispiel 1b

In einer Variante kann statt dessen in einem 2-Stufen-Prozeß statt PCR- Reagenz nach EP-A-O 389 063 Silicagel mit GuSCN-Puffer zugegeben wer­ den, der die DNA unspezifisch adsorbiert. Überschüssiges Material kann durch Anlegen von Vakuum an (32) abgetrennt werden, falls zuvor eine ent­ sprechende Filterschicht in (14) eingelegt wurde. Elution der Nukleinsäuren vom Silicagel erfolgt durch niedrig Salzpuffer (10 mM Tris-Hydrochlorid- 1 mM EDTA (pH 8.0) nach Boom et al. J. of. Clinical Microbiology, Vol. 28, Nr. 3; 1990; S. 496) mit anschließender PCR in einem weiteren, zwischengeschalteten Modul, Hybridisierung und Detektion (wie in 1a).

Beispiel 2 Bestimmung von HIV-RNA aus Vollblut (Fig 6)

In (1) wird Vollblut einer Hämolyse nach Rolfs et al. (in PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992) S. 69-70 unterworfen. An­ schließend werden durch Zugabe von biotinyliertem Anti-gp 120-Antikörper vom Schaf (Hersteller: Aalto Bio Reagents Ltd. Dublin, Irland) Viruspartikel über SA-beschichtete magnetische Beads (Hersteller: siehe Beispiel 1) abgetrennt und gemäß Beispiel 1a oder 1b aufgearbeitet, wobei statt PCR zur Amplifikation von RNA eine RT-PCR analog zu Wilber et al. in Diagnostic Molecular Microbiology - Principals and Applications Edtrs.: D.H. Persing, T.F. Smith, F.C. Tenover und T.J. White; American Society of Microbiology; ISBN 1-55581-056-X (1993) S. 327-331 angewendet werden muß.

Beispiel 3 Verarbeitung von Gewebe

Gewebe wird analog der von Lewin et al. in "Methods in Enzymology" Vol. 171 "Biomembranes"; Edtrs: S. Fleischer und B. Fleischer; Academic Press; S. 444 ff nach der Pronase EDTA-Methode oder der Collagenase-Pronase-EDTA Methode durch Erhitzen mittels Heizung (17) auf 37 Grad C in Reaktionsmodul (1) in Einzelzellen übergeführt. Mittels spezifischer biotinylierter Zelloberflächenmarker analog zu Garcia-Perez et al. in "Methods in Enzymology" Vol. 171 "Biomembranes"; Edtrs: S. Fleischer und B. Fleischer; Academic Press; S. 581 und Magnetpartikel (Hersteller sh. Beispiel 1) werden spezifische Zellen isoliert und gereinigt, die gemäß Bei­ spiel 1a oder 1b der PCR zugeführt werden.

Beispiel 4 Aufschluß von Sputum zur Diagnose von Mycobacterien

Sputum wird zur Verflüssigung nach der Methode, beschrieben bei Rolfs et al. (in PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992) S. 74 ff, in das Reaktionsmodul (1) und mit N-Acetyl-L-Cystein/NaOH-Lösung gegeben, wobei durch leichtes Erhitzen durch das Heizelement (17) die Reaktion beschleunigt werden kann. Die in der Originalliteratur angegebenen Zentrifugationsschritte werden ersetzt durch Einsatz spezifischer biotinylierter Antikörper gegen Oberflächenmarker von Mycobacterium hergestellt analog zu Garcia-Perez et al. in "Methods in Enzymology" Vol. 171 "Biomembranes"; Edtrs: S. Fleischer und B. Fleischer; Academic Press; S. 581 und Streptavidin beschichteten Magnetpartikel (Hersteller sh. Beispiel 1). Spezifische Zellen werden isoliert und wie in Beispiel 3 weiterbehandelt.

Beispiel 5 Einsatz von Säulenchromatographie für die Zellisolierung bei HIV-DNA- Nachweis

Reaktionsmodul (1) wird-vor Zugabe der HIV-haltigen Probe befüllt mit Streptavidin-gekoppelter Bromcyan-aktivierter Sepharose (Hersteller Streptavidin: Boehringer Mannheim 1097679; Verfahren beschrieben in "Immunchemische Charakterisierung der ATP-Synthetase von E. coli K12", G. Bienhaus, Dissertation Universität Tübingen, S. 66, 1980). Dazu werden Reagenzien analog Beispiel 1a gegeben. Nach Reaktion wird überschüssiges Material durch Anlegen von Vakuum an (4) abgetrennt, falls eine ent­ sprechende Filterschicht in (1) zuvor eingelegt wurde.

Beispiel 6 Einsatz von NASBA statt PCR

Statt der PCR kann auch das NASBA-Verfahren (Cangene USP 5 130 239) angewendet werden, wobei über die Heizung (17) des Moduls (14) eine konstante Temperatur erzeugt werden kann.

Beispiel 7 Einsatz von Ionenaustauschchromatographie anstatt Glasvlies

Statt der Variante 1b kann auch gemäß DE 41 39 664 eine Ionenaus­ tauschchromatographie zur Isolierung von Nukleinsäuren benutzt werden.

Bezugszeichenliste

1 Reaktionsmodul
2 Boden von 1
3 Auslaßöffnungen in 2
4 Gummidichtlippe
5 Schlitz in 4
6 Belüftungsloch in 1
7 Papiervliesscheibe
8 geschlitzte Gummidichtlippe im Deckel
9 Verteilerelement
10 Ansatz
11 erster Reaktionsraum
12 Ansatz für Abfallbehälter
13 Ansatz für zweites Modul
14 Reaktionsraum des Amplifikationsmoduls
15 Öffnung des zweiten Moduls
16 Abfallbehälter
17 Heizelement der Module
18 Vakuumansatzstutzen
19 Deckel
20 Magnet
21 Verteilerelement einer planaren Anordnung
22 Kapillare
23 Reaktionsmodul für Hämolyse
24 Grobfilter
25 Immunadsorber
26 Reaktionsraum für Lyse
27 Modul für Adsorption von Nukleinsäuren
28 Mehrwegeventil
29 Abfallvlies
30 Tube
31 Vakuumansatzstutzen an Tubehalter
32 Vakuumansatzstutzen an Abfallbehälter

Claims (18)

1. Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen ersten Reaktionsraum zur Vorbereitung der Probe sowie einen damit über einen Transportweg verbundenen zweiten Reaktionsraum zur Vermehrung der Nukleinsäuren enthält.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein ge­ schlossenes System darstellt, das an einigen wenigen Stellen ohne Kon­ taminationsrisiko geöffnet werden kann, um mindestens einen Reagenz­ eintrag in mindestens einen Reaktionsraum zur Verfügung zu stellen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Proben­ vorbereitung Schritte aus den Schritten Verflüssigung, Anreicherung, Freisetzung und Abtrennung von Substanzen, die die anschließende Ver­ mehrung der Nukleinsäure stören, oder einer Kombination davon ausge­ wählt wird.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Reaktionsraum eine Öffnung zur Entfernung der Reaktionsmischung aus dem Reaktionsraum aufweist.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Reaktionsraum Mittel enthält, an welche Nukleinsäuren immobilisiert werden können.

6. Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Transportweg ein 3-Wege-Verteilerelement ent­ hält, von dem jeweils ein Weg zu dem ersten und zweiten Reaktionsraum führt und ein dritter Weg ein Abfalltransportweg ist.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Reaktionsraum beheizbar ist.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Reaktionsraum eine verschließbare Öffnung zur Zugabe von Reagenzien für eine Vermehrungsreaktion aufweist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das ge­ schlossene System aus Einwegmodulen besteht.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das ge­ schlossene System aus mehreren im wesentlichen baugleichen zu­ sammensteckbaren Modulen besteht, die mehrstufige Reaktionsabfolgen ermöglichen.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Reaktionsraum mittels Unterdruck entleert werden kann.

12. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Reaktionsraum mit einem Magnetseparator versehen ist zur Trennung magnetischen und nicht-magnetischen Phasen.

13. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das ge­ schlossene System als anwendungsbereites Mehrfachreaktionsgefäß ver­ wendet wird.

14. System zur Behandlung von Nukleinsäuren enthaltend

• - eine Vorrichtung zum Pipettieren von Flüssigkeiten
• - eine Vorrichtung zur Aufnahme einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und
• - eine Vorrichtung zum geregelten Transport von Gasen oder Flüssig­ keiten in der Vorrichtung gemäß Anspruch 1.

15. System gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Vor­ richtung zum Erhitzen eines oder mehrerer der Reaktionsräume der Vorrichtung des Anspruchs 1 enthält.

16. System gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehrere Magneten enthält, die in der Nähe des ersten und/oder zweiten Reaktionsraumes positioniert werden können.

17. Modul für die Behandlung von nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten, ent­ haltend

• - einen Behandlungsraum
• - einen flüssigkeitsdichten Verschluß, der durch Einwirkung von Vakuum von außen auf den Verschluß geöffnet werden kann.

18. Modul gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß ein am Boden des Behandlungsraums angebrachtes Ventil ist.