DE4428851A1

DE4428851A1 - Eisen enthaltende Nanopartikel, ihre Herstellung und Anwendung in der Diagnostik und Therapie

Info

Publication number: DE4428851A1
Application number: DE4428851A
Authority: DE
Inventors: Mayk Kresse; Detlev Dr Pfefferer; Ruediger Dr Lawaczek; Susanne Dr Wagner; Wolfgang Dr Ebert; Volker Elste; Wolfhard Dr Dr Semmler; Matthias Dr Taupitz; Josef Gaida; Anja Herrmann; Monika Jukl; Udo Swiderski
Original assignee: Institut fuer Diagnostikforschung GmbH
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1994-08-04
Filing date: 1994-08-04
Publication date: 1996-02-08
Anticipated expiration: 2014-08-05
Also published as: CA2195318C; CN1155844A; CN1103604C; JPH10503496A; NO970468D0; CA2195318A1; DE4428851C2; KR100278513B1; AU703042B2; ZA956005B; AU2921095A; NO970468L; EP0773796A1; KR970704476A; IL114713A; WO1996004017A1; HUT77993A; US6576221B1; US6048515A; IL114713A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft modular aufgebaute Eisen enthaltende Nanopartikel, ihre Herstellung und Anwendung in der Diagnostik und Therapie.

Substanzen, die schon bei niedriger Feldstärke maximal magnetisiert sind (hohe Sättigungsmagnetisierung) aber nach dem Abschalten des äußeren Magnetfeldes keine Rest magnetisierung (Remanenz) zeigen, da die thermische Energie einer permanenten Ausrichtung der spontan magne tisierten Weiß′schen Bezirke entgegenwirkt, werden als superparamagnetisch bezeichnet. Eisen enthaltende Kristalle, die als parenterale MR-Kontrastmittel entwickelt werden, fallen in diese Kategorie. Eine charakteri stische Eigenschaft dieser Substanzen als MR-Kontrastmit tel ist die starke Beeinflussung der Protonenrelaxations zeiten und damit die hohe Stärke als Kontrastmittel in diesem diagnostischen Verfahren. In der medizinischen Diagnostik wurden als superparamagnetische Kontrastmit tel bisher hauptsächlich Eisenoxide mit "magnetitartiger" Kristallstruktur untersucht, die z. B. im Magnetit oder Maghämit vorliegt (Spinell, inverses Spinell).

Die superparamagnetischen Eisenoxide, die als MR-Kon trastmittel verwendet werden sollen, zeigen vergleichbare Eigenschaften dahingehend, daß sie eine starke Beeinflussung der Protonen-Relaxation in ihrer Nahumgebung zeigen (hohe Relaxivität) und daß es sich um Partikel mit "magnetitartiger" Kristallstruktur handelt.

Es sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung Eisen enthaltender Kristalle (Eisenoxide) mit superparamagneti schen Eigenschaften beschrieben.

Die verschiedenen Verfahren lassen sich unter unter schiedlichen Gesichtspunkten einteilen. Die Herstellung der superparamagnetischen Eisen enthaltenden Kristalle unterscheidet dabei zwei prinzipielle Verfahren, nämlich das Sinterverfahren mit hoher Temperatur und anschlie ßender mechanischer Zerkleinerung und die naß-chemische Synthese in Lösung. Für die medizinische Anwendung wurden bisher nur Partikel untersucht, die auf naßchemischem Wege hergestellt worden sind, während das Sinterverfahren zur Herstellung von Eisenoxiden für technische (Tonträger, Farbpigmente und Toner) und biotechnische Anwendungen wie z. B. die Magnetseparationstechnik, beschrieben wurde [Schostek S, Beer A; DE 3,729,697 A1; Borelli NF, Luderer AA, Panzarino JN; US 4,323,056; Osamu I, Takeshi H, Toshihiro M et al.; JP 60,260,463 A2]. Die naßchemische Herstellung läßt sich weiter unter teilen. Bei der "Zweitopfsynthese" erfolgt erst die Herstellung des Eisen enthaltenden Kerns (Eisenoxid) und anschließend die Zugabe eines Stabilisators, um die physikalisch-galenische Qualität zu gewährleisten. Eine Variante der "Zweitopfsynthese" ist die Herstellung des Eisenkerns an Ionenaustauschern. Bei der "Eintopf synthese" erfolgt die Herstellung der Eisenoxide in Anwesenheit des Stabilisators, der die Kerne schon während der Präzipitation der Eisensalze umhüllt und so die Aggregation und Sedimentation der Partikel verhin dert.

Neben der Unterscheidung nach dem Herstellungsgang in "Eintopf-" und "Zweitopfsynthese" kann eine Unterteilung auch nach der Art des verwendeten Lösungsmittels in wäßrige [Hasegawa M, Hokukoku S; US 4,101,435; Fuji Rebio K.K.; JP 59,195,161] und nicht-wäßrige Verfahren [Porath J, Mats L; EP 179,039 A2; Shigeo A, Mikio K, Toshikatzu M; J. Mater. Chem. 2(3); 277-280; 1992; Norio H, Saturo O; JP 05,026,879 A2] erfolgen.

Partikel, die nach einem "Zweitopfverfahren" in nicht wäßrigen Lösungsmitteln hergestellt wurden, werden über wiegend in technischen Bereichen eingesetzt. Magnetische Eisenoxide, die als Kontrastmittel in der Humandiagnostik verwendet werden sollen, erfordern aus medizinisch-toxi kologischen Gründen ein wäßriges Dispersionsmedium. Eine Sonderstellung nehmen bei dieser Einteilung die Partikel ein, die zwar in einem nicht-wäßrigen Lösungsmittel hergestellt wurden, sich aber nach der Herstellung in einem wäßrigen Medium stabil dispergieren lassen. Solche Partikel werden derzeit im Allgemeinen in der ex vivo Diagnostik, z. B. in der magnetischen Separationstechnik [Chagnon MS, Groman EV, Josephson L, et al.; US 4,554,088], verwendet, wurden aber auch für die in vivo Diagnostik vorgeschlagen [Pilgrimm H; US 5,160,725].

Partikel, die nach dem "Zweitopfverfahren" hergestellt wurden, fanden hauptsächlich bei den frühen experimentel len Untersuchungen bis Mitte der 80er Jahre Verwendung, während z. Zt. nur noch Untersuchungen mit Eisenoxiden beschrieben werden, die nach einer "Eintopfsynthese" hergestellt sind. Das "Eintopfverfahren" zur Herstellung der superparamagnetischen Eisen-enthaltenden Oxide für Anwendungen in der Humandiagnostik hat sich durchgesetzt, da die Partikel dem "Zweitopfverfahren" hinsichtlich der physikalisch-chemischen Qualität und der pharmazeutisch galenischen Stabilität überlegen sind.

Auch die pharmazeutisch stabileren Suspensionen/Lösungen von Partikeln, die nach dem "Eintopfverfahren" in wäßri gen Medien hergestellt wurden, lassen sich weiter unter teilen in Eisenoxide unterschiedlicher Größe. Für die Partikel im Mikrometerbereich wurden biotechnische Anwen dungen vorgeschlagen [Schröder U, Mosbach K; WO 83/01738 oder Schröder U; WO 83/03426] oder auch schon die in vivo Verwendung in der Diagnostik oder Therapie beansprucht [Widder KJ, Senyei AE; US 4,247,406 oder Jacobsen T, Klaveness J; WO 85/04330]. Für medizinisch-diagnostische Ansätze werden jedoch heutzutage nur noch die Partikel im Nanometerbereich beschrieben. Auch der Nanometerbereich läßt sich je nach der bevorzugten Verwendung in "große" (ca. < 50 nm Gesamtdurchmesser) und "kleine" (ca. < 50 nm Gesamtdurchmesser) Partikel unterteilen. Hauptanwen dungsgebiet der großen Nanometerpartikel ist heute die Anwendung in der MR-Diagnostik von Leber und Milz, da Partikel dieser Größenordnung schnell und nahezu voll ständig von den Makrophagen dieser Organe aufgenommen werden [Kresse M, Pfefferer D, Lawaczeck R; EP 516,252 A2 oder Groman EV, Josephson L; US 4,770,183]. Darüberhinaus wurden Vorschläge für die Verwendung als Verstärkersub stanzen in der klinischen Hyperthermie gemacht [Hasegawa M, Hirose K, Hokukoku S, et al.; WO 92/22586 A1 und Gordon RT; US 4,731,239].

Bei nahezu allen derzeit für medizinische Anwendungen vorgeschlagenen Partikeln handelt es sich um Eisenoxide, die in Anwesenheit von Dextran als Stabilisatorsubstanz hergestellt wurden [Bacic G, Niesmann MR, Magin RL et al.; SMRM - Book of abstracts 328; 1987; Ohgushi M, Nagayama K, Wada A et al.; J. Magnetic Resonance 29; 599-601; 1978; Pouliquen D, Le Jeune JJ, Perdrisot R et al.; Magnetic Resonance Imaging 9; 275-283; 1991 oder Ferrucci JT und Stark DD; AJR 155; 311-325; 1990], beschrieben wurde aber auch die Verwendung anderer Polysaccharide wie Arabinogalactan [Josephson L, Groman EV, Menz E et al; Magnetic Resonance Imaging 8; 616-637; 1990], Stärke [Fahlvik AK, Holtz E, Schroder U et al; Invest. Radiol. 25; 793-797; 1990], Glycosaminoglycanen [Pfefferer D, Schimpfky C, Lawaczeck R; SMRM - Book of abstracts 773; 1993], oder auch von Proteinen [Widder DJ, Grief WL, Widder KJ et al.; AJR 148; 399-404; 1987].

Die genauen Synthesebedingungen wie Art der Eisensalze, Temperatur, Hüllpolymer (Stabilisator), Titrationsge schwindigkeit, Alkaliwahl, Reinigung usw. beeinflussen die chemisch-physikalischen Eigenschaften und damit die pharmazeutisch-galenische Qualität und letztendlich den medizinischen Nutzen.

Ein wichtiger Schritt in der weiteren Entwicklung zu einer zielgerichteteren Anwendung geht auf Weissleder und Papisov [Weissleder R; Papisov MI; Reviews of Magnetic Resonance in Medicine 4; 1-20; 1992] zurück, die zeigen konnten, daß die "targetability" der magnetischen Eisen oxide sich umgekehrt zur Partikelgröße verhält. Problema tisch ist in diesem Zusammenhang, daß zu kleinen Parti kelgrößen die Wirksamkeit (MR-Effekt) der Partikel ab nimmt. Die Herstellung besonders kleiner magnetischer Eisenoxide ohne Fraktionierungsschritte wurde kürzlich beschrieben [Hasegawa M, Ito Y, Yamada H, et al.; JP 4,227,792]. Für besonders kleine Partikel, MION′s, wurden auch schon Experimente zum "functional imaging" publi ziert, bei denen die Dextran-Hülle der Partikel (magnetische Label) mit Periodat oxidiert und anschlie ßend mit spezifischen Molekülen gekoppelt wurden (Antimyosin; polyklonaler Antikörper) [Weissleder R, Lee AS, Khaw BA et al.; Radiology 182; 381-385; 1992 oder Weissleder R, Lee AS, Fishman A et al.; Radiology 181; 245-249; 1991].

Einen spezifischen Weg gehen Menz et al. [Menz ET, Rothenberg JM, Groman EV, et al.; WO 90/01295], die ihre großen Nanometerpartikel durch Polymere (Arabinogalactan) mit physiologischen Effektorzellen umhüllen und, ebenso wie Gordon, der seine Dextran-stabilisierten Partikel mit Periodat oxidiert und dann Transferrin durch reduk tive Aminierung koppelt [Gordon RT; US 4,735,796], einen spezifischen Aufnahmemechanismus über Rezeptor-vermit telte Endozytose, beanspruchen.

Die Herstellung "großer" superparamagnetischer Eisenoxide für die Anwendung als Kontrastmittel in der MR-Diagnostik von Leber und Milz ist heute "Stand der Technik" und der diagnostische Nutzen für diese Indikationen ist nachge wiesen. Vertreter dieser Eisenoxide befinden sich in der klinischen Entwicklung (SHU 555A; Schering AG Berlin; Deutschland; Phase II und AMI-25; Advanced Magnetics Inc.; Cambridge; Mass.; USA; Phase III/IV).

Die Bedeutung der hydrodynamischen Durchmesser der Eisen oxide für spezifischere (extrahepatische) Ansätze wie die MR-Lymphographie oder die MR-Angiographie sind bekannt und werden bearbeitet. Bei sonst identischen Partikeln sollte die Bluthalbwertszeit mit kleinerem Durchmesser zunehmen. Aus der Literatur sind Synthesevarianten zur Herstellung kleiner Eisenoxide bekannt.

Ein wesentliches Problem für die Weiterentwicklung spezi fischer Kontrastmittel auf der Basis der superparamagne tischen Eisenoxide ist bisher, daß es nicht möglich ist, die Targeteigenschaften, also Anreicherung und Verteilung im Zielgewebe, zu verbessern ohne gleichzeitig Kompro misse bei den physikalisch-chemischen Parametern einzuge hen, da die Stabilisatoren, die besonders gut zur Her stellung der Eisen-enthaltenden Kerne geeignet sind, nur sehr eingeschränkt zum Targeting der Substanzen verwend bar sind. Darüberhinaus limitieren die Reaktionsbedingun gen bei der Synthese (pH-Extrema, Temperatur, Redoxreak tionen mit den Eisensalzen) die Auswahl der möglichen Stabilisatorsubstanzen, so daß ganze Gruppen wichtiger und hochspezifischer Moleküle (Proteine, Peptide, Oligo nukleotide aber auch die meisten Oligo- und Polysacchari de) nicht zur Stabilisierung bei der Herstellung verwen det werden können, zumindest dann nicht, wenn die Stabi lisatoren nach der Synthese noch über Targeteigenschaften (biologische Aktivität) verfügen sollen.

Auch bei den bisher verwendeten (chemisch) "unempfind lichen" Polymeren - in der Hauptsache Dextran - ist bekannt, daß es unter den Bedingungen der Synthese zu vielfältigen und nicht kontrollierbaren Reaktionen kommt, so z. B. zur Depolymerisation im sauren pH-Bereich (niedermolekulares Dextran wird technisch z. B. durch Säurehydrolyse gewonnen) und verschiedenen Reaktionen bis zur völligen Zerstörung des Polymers im alkalischen Bereich (Präzipitationsschritt). Unter Berücksichtigung der Zuckerchemie und der notwendigen Reaktionsbedingungen ist also davon auszugehen, daß die "Dextran-Magnetite" nach dem "Stand der Technik" gar keine Dextran-Magnetite sind, da zwar Dextran zur Stabilisierung eingesetzt wurde, es sich aber nach der Synthese nicht mehr um Dextran handelt.

Unter pharmazeutischen und zulassungsrelevanten Gesichts punkten heißt das, daß ein wesentlicher Bestandteil - der Stabilisator ist ja die Hülle und bestimmt damit überwie gend das biologische Verhalten - nicht bekannt oder deklariert ist.

Aus praktischen Gründen ergibt sich zusätzlich das Pro blem, daß eine Optimierung der Oberflächeneigenschaften für die weitere Entwicklung unmöglich erscheint, wenn die Oberfläche gar nicht bekannt ist.

Am Beispiel einer spezifischen Anwendung wie der am besten untersuchten MR-Lymphographie, läßt sich zeigen, daß mit den Partikeln nach dem "Stand der Technik" unter Verwendung von Dextran als Stabilisator - andere Polymere zur Herstellung der besonders kleinen Eisenoxide wurden bisher nicht publiziert -, die Optimierung der Größe zwar die Anwendbarkeit verbessert und eine sehr hohe Akkumula tion der Partikel im Lymphgewebe erzielt werden kann, aber für eine klinische Anwendung ist die Homogenität der inter-lymphonodalen Verteilung bisher unzureichend [Taupitz, M et al.; SMRM - Book of abstracts 500; New York; USA; 1993]. Die zwar insgesamt sehr hohe aber inhomogene Anreicherung läßt bei dieser Anwendung auch nicht erwarten, daß eine weitere Verbesserung durch nochmalige Optimierung der hydrodynamischen Durchmesser erreicht werden kann.

Ein wesentliches Problem bei der Entwicklung spezifischer Diagnostika ist die geringe Größe des Zielorgans. So repräsentieren z. B. die gesamten Lymphknoten weniger als ein Prozent des Körpergewichtes. Potentielle Diagnostika müssen also eine hohe Anreicherung im Zielgewebe (Spezifität) zeigen und schon in geringer Konzentration eine starke Kontrastbeeinflussung ermöglichen.

Da die superparamagnetischen Eisenoxide z. Zt. die Sub stanzklasse mit der stärksten MR-Kontrastbeeinflussung darstellen, erscheinen die Partikel für spezifische Anwendungen besonders geeignet. Ein Problem bei dieser Substanzklasse ist der Kristallkern der Eisenoxide, der den partikulären Charakter der Substanzen bedingt und die Partikelgröße wesentlichen Einfluß auf das biologische Verhalten hat. Kleinere Partikelgrößen verbessern die Steuerbarkeit, aber die Effektivität der Kontrastmittel nimmt wegen des Zusammenhangs zwischen der Kerngröße und dem magnetischen Moment zu den kleineren Größen ab, so daß hier ein Kompromiß zwischen kontrastbeeinflussender Wirkung (Physik) und Steuerbarkeit (Biologie) gewählt werden muß. Prinzipiell ist zu fordern, daß der Eisen enthaltende Kern so groß wie möglich sein sollte, um eine hohe Wirksamkeit zu erreichen, wobei allerdings der Gesamtdurchmesser klein bleiben muß.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eisenhaltige Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, welche die Forderungen der Physik und der Biologie an ein spezifisches Nanopartikel optimal erfüllen.

Überraschenderweise stellte sich heraus, daß die erfin dungsgemäßen Nanopartikel den bisherigen Eisenoxid-Parti keln nach dem Stand der Technik hinsichtlich der Tar getfähigkeit überlegen sind. Durch die Kombination der physikalischen Qualität mit der verbesserten Targetfähig keit der Nanopartikel lassen sich Kontrastmittel oder auch Therapeutika/therapeutische Trägersysteme mit bisher unerreichter "targetability" herstellen.

Die Herstellung der Nanopartikel erfolgt aus einzelnen Bausteinen (modulares Prinzip) und gewährleistet dadurch höchste Flexibilität bei der Kombination der Eisen ent haltenden Kerne (physikalische Wirksamkeit; Kontrast) mit der Targetkomponente (biologisches Verhalten). Ein modu larer Aufbau hat den Vorteil eine lagerfähige Komponente (Eisen-enthaltender Kern) mit möglicherweise empfindli chen Molekülen zur Steuerung erst "just in time" zum fertigen Nanopartikel zu kombinieren. Diese Anlehnung an die aus der klinischen Radiopharmazie bekannten "Cold- Kits" ermöglicht es z. B. auch individuelle Serumkompo nenten einzelner Patienten als Steuerungsmolekül zu nutzen (z. B. autologe Antikörper).

Aufgrund ihrer intensiven Färbung gelingt es, die Nanopartikel auch visuell zu detektieren, wie es z. B. bei der Verwendung als optische Markersubstanz in der chirurgischen Medizin wünschenswert ist.

Darüber hinaus sind die Nanopartikel auch für den Einsatz in der Therapie, z. B. durch ein magnetisches Targeting mit externen Magneten über einem Zielvolumen, verbunden mit einer magnetisch gekoppelten Freisetzung von Wirksub stanzen, geeignet. Die Nanopartikel können in z. B. Tumoren akkumuliert werden und ermöglichen daher die Verwendung als spezifische Verstärkersubstanzen in der lokalen Hyperthermie.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel bestehen aus einem Eisen enthaltenden Kern, einem Primärcoat (Synthese polymer) und einem Sekundärcoat (Targetpolymer) sowie gegebenenfalls pharmazeutischen Hilfsstoffen, Pharmaka und/oder Adsorptionsvermittler.

Der Eisen enthaltende Kern liegt als Partikel, Kolloid oder Kristall vor. Aus der Herstellung des Kerns enthal ten die Nanopartikel Synthesepolymer, das den Kern als Primärcoat umhüllt und während der Herstellung zur Steue rung der physikalischen oder pharmazeutisch-galenischen Qualität benötigt wird. Anschließend wird das Verhältnis von Synthesepolymer zu Eisen durch ein Desorptionsver fahren auf einen gewünschten Wert eingestellt. Für die Anwendung in der spezifischen Diagnostik wird ein Targetpolymer adsorbiert, das die Oberfläche der Nano partikel darstellt und den Grundbaustein aus Kern und Primärcoat umhüllt. Zur Verbesserung der Adsorption zwischen dem Primär- und dem Sekundärcoat können Adsorptionsvermittler enthalten sein. Als weitere Bestandteile können die Nanopartikel pharmazeutische Hilfsstoffe oder Pharmaka enthalten.

Eine schematische Darstellung des Aufbaus eines erfin dungsgemäßen Nanopartikels ist in Abb. 1 darge stellt.

Der hydrodynamische Durchmesser des Grundbausteins (Eisen enthaltender Kern und Primärcoat) in Lösung ist kleiner als 100 nm, bevorzugt kleiner als 50 nm, und höchstens fünfmal so groß wie der Durchmesser des Eisen enthal tenden Kerns.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel zeichnen sich weiter hin dadurch aus, daß sie als stabile kolloidale Sole in pharmazeutischer Qualität vorliegen, oder daß sie lyophi lisiert vorliegen und leicht mit medizinisch verwendeten Lösungsmitteln (Elektrolytlösung, Plasmaexpander, Gluco selösung, phys. Kochsalzlösung etc.) wieder in Lösung gebracht werden können oder daß Grundbaustein und Tar getkomponente und gegebenenfalls Zusätze getrennte Lösun gen sind, die auch als Lyophilisate vorliegen können, und erst zu einem beliebigen Zeitpunkt zur Applikationslösung zusammengemischt werden.

Der Eisen enthaltende Kern hat ein größeres magnetisches Moment als Eisen-II- oder Eisen-III-Ionen. Der Eisen enthaltende Kern ermöglicht durch seine magnetischen Eigenschaften die Kontrastierung bei der Verwendung als Kontrastmittel in der MR-Tomographie. Um eine optimale Kontraststärke zu erreichen, sollte der Kern superpara magnetisch sein oder zumindest superparamagnetische Anteile enthalten, d. h., daß der Kern als Kristall oder polyatomarer Komplex ("Partikel") vorliegen muß, da diese Art des Magnetismus nur in Festkörpern möglich ist.

Erfindungsgemäß kann der Eisen enthaltende Kern Magnetit oder Maghämit darstellen oder enthalten.

Bis zu 25 Gew.-% des im Kern enthaltenden Eisens können durch andere Metallionen ersetzt sein.

Die Nicht-Eisen-Metallionen sind paramagnetisch, diama gnetisch oder eine Mischung von beiden.

Ferner zeichnen sich die erfindungsgemäßen Nanopartikel dadurch aus, daß der Eisen enthaltende Kern einen durch Elektronenmikroskopie bestimmten Durchmesser kleiner als 30 nm, bevorzugt kleiner als 15 nm, aufweist und minde stens 50 Metallatome enthält sowie eine Partikelgrößen verteilung, wobei mindestens 90% der Eisen enthaltenden Kerne im Bereich 0,7·Mittelwert bis 1,3·Mittelwert liegen, aufweist.

Die Nanopartikel enthalten ein Synthesepolymer in einer Menge zwischen dem 0,01fachen und dem 1fachen der Summe der vorhandenen Metallionen. Bevorzugt ist eine Menge zwischen dem 0,25fachen und dem 0,75fachen.

Als Synthesepolymer wird eine monomere oder polymere Substanz oder ein Gemisch dieser Substanzen oder Deri vate, oder Derivate mit funktionellen Gruppen oder Derivate, die zusätzlich substituiert worden sind, mit einem Molekulargewicht kleiner 100.000 Da eingesetzt. Bevorzugt werden Substanzen mit Molekulargewichten, die kleiner 10000 oder 5000 Da sind, verwendet.

Besonders bevorzugt wird als Synthesepolymer ein Dextran derivat oder eine Mischung von Dextran und/oder Dextran derivaten eingesetzt.

Das Synthesepolymer kann eine oder mehrere Säuregruppen oder mehrere funktionelle Gruppen im Molekül enthalten, die bevorzugt N, S, P oder O-Atome enthalten.

Das Target- und das Synthesepolymer können unterschied liche oder gleiche Substanzen oder Substanzgemische sein, wobei das Targetpolymer aber nicht den Bedingungen der Synthese unterliegt und damit auch nicht den Nebenreak tionen des Synthesepolymers bei der Synthese unterlag, also noch in physiologischem Zustand ist.

Die Grundsubstanz aus Eisen enthaltendem Kern und Synthe sepolymer bestimmt die physikalische Qualität des Nano partikels, während das Targetpolymer das biologische Verhalten der Nanopartikel bestimmt.

Das Targetpolymer ist in dem Nanopartikel in einer Gewichtsmenge zwischen dem 0,5fachen bis 50fachen, bevorzugt zwischen dem 1fachen bis 25fachen des Gewichts der vorhandenen Metallionen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel enthalten Adsorptions vermittler, deren Menge kleiner oder gleich der Summe des Gewichts der enthaltenen Metallionen ist. Durch die Adsorptionsvermittler wird die Adsorption des Targetpoly mers an den Grundbaustein aus Eisen enthaltenden Kern/Synthesepolymer verstärkt oder erst ermöglicht.

Bevorzugt werden als Adsorptionsvermittler Peptide mit den Strukturen RRTVKHHVN, RRSRHH oder auch RSKRGR, oder Teilstrukturen davon, eingesetzt.

Der hydrodynamische Durchmesser inclusive aller Bestand teile der Nanopartikel ist höchstens zehnmal größer als der Durchmesser des Eisen enthaltenden Kerns und höchstens 20% größer als der Durchmesser des Grund bausteins.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel setzen sich aus einzelnen Modulen wie Grundbaustein, Targetpolymer, Pharmakon und Adsorptionsvermittler zusammen, die jederzeit kombinierbar sind.

Bei den Präparationen der Nanopartikel handelt es sich um niedrigviskose wäßrige kolloidale Lösungen oder Suspen sionen von Eisen enthaltenden stabilisierten Partikeln im Nanometerbereich. Die Lösungen der Nanopartikel enthalten keine größeren Aggregate und sind intravenös applizier bar, so daß Forderungen internationaler Arzneibücher an Parenteralia hinsichtlich der Partikelgrößen erfüllt sind.

Im allgemeinen kann der Grundbaustein durch Hitzeverfah ren sterilisiert werden. Das Verfahren zur "Sterilisation" der fertigen Nanopartikel richtet sich nach der Empfindlichkeit des Sekundärcoats, aber eine keimfreie aseptische Herstellung ist in jedem Fall gewährleistet. Eine "Sterilfiltration" kann wegen der geringen Größe der Partikel immer durchgeführt werden. Die Option, ein empfindliches Targetpolymer mit dem sterilisierbaren Grundbaustein erst kurz vor der Verwen dung herzustellen, ist eine weitere Möglichkeit eine praktisch sterile Applikationslösung zu gewährleisten.

Die Nanopartikel sind gut verträglich und weisen z. B. bei der Verwendung als MR-Kontrastmittel einen ausgespro chen günstigen Sicherheitsabstand zwischen diagnostischer Dosis und der letalen Dosis auf ("margin of safety"). Die diagnostische Dosis liegt, je nach spezieller Anwendung, etwa zwischen 5 und 200 µmol (Eisen) pro Kilogramm Kör pergewicht, während die letale Dosis etwa zwischen 20 und 50 mMol/kg Körpergewicht einzuordnen ist (gemessen an der Ratte).

Die Substanzen sind vollständig bioabbaubar. So wird der Eisen enthaltende Kern aufgelöst und das Eisen in den physiologischen Eisenstoffwechsel eingebracht. Im Allge meinen können auch die als Synthesepolymer oder Targetpo lymer benutzten Moleküle metabolisch in verwertbare Grundbausteine (Zucker, Aminosäuren) abgebaut werden.

Die Lösungen der Nanopartikel sind sehr stabil und es findet nach der Fertigstellung keine feststellbare Ände rung physikalischer Parameter statt (Partikelgröße, magnetische Eigenschaften). Bei keimfreier Herstellung weisen die Lösungen eine lange Lagerfähigkeit auf; es wurden z. B. innerhalb von 12 Monaten keine Instabilitä ten wie Aggregation oder Sedimentation festgestellt.

Die Lösungen oder Suspensionen sind rotbraun bis schwarz gefärbt, was auf die intensive Farbe der Eisen enthalten den Kristalle zurückzuführen ist. Die ausgeprägte Eigen farbe kann zur visuellen Detektion, z. B. als Markersub stanz in der chirurgischen Medizin, genutzt werden. Für die Detektion mit der MR-Technik sind die Nanopartikel superparamagnetisch oder enthalten superparamagnetische Anteile. Die Partikel zeigen physikalisch sehr hohe Sättigungsmagnetisierungen, die schon bei niedrigen ange legten Feldstärken erreicht werden und weisen nach dem Abschalten eines externen Magneten keine Restmagnetisie rung mehr auf, sie zeigen keine Remanenz.

Die Nanopartikel sind als Lösungen (Suspensionen) formu liert und können ohne weitere Vorbereitung appliziert werden. Da die Lösungen der Nanopartikel kompatibel mit üblichen medizinischen Lösungsmitteln wie physiologischer Natriumchloridlösung, Elektrolytlösungen oder Zuckerlö sungen sind, können die Partikel beliebig verdünnt und z. B. für spezielle Anwendungen auch infundiert werden.

Eine Alternative zur Formulierung der "Lagerform" Lösung stellt die Herstellung von Lyophilisaten dar. Möglich ist hier die Lyophilisation des Grundbausteins, der dann im gelösten Targetpolymer resuspendiert wird, oder Grundbau stein und Nanopartikel werden nach der Adsorption lyophi lisiert und dann vor der Anwendung in phys. NaCl oder Aqua ad injectabilia wieder gelöst. Die Vorratshaltung kann auch so erfolgen, daß Grundbaustein und Targetpoly mer in getrennten Lösungen aufbewahrt werden und erst vor der Applikation gemischt werden.

Die Herstellung der partikulären oder kolloidalen Eisen enthaltenden Kerne erfolgt aus monomolekular gelösten Eisenverbindungen durch Änderung des pH-Wertes und dadurch bewirkte Ausfällung in Anwesenheit einer Stabilisatorsubstanz (Synthesepolymer) nach einer "Eintopfsynthese". Das Synthesepolymer separiert die Kristallkerne während der Herstellung und dient so zur Steuerung der Partikelgröße. Das Synthesepolymer ist wesentlich für die physikalischen und pharmazeutisch galenischen Eigenschaften nicht nur des Kristallkerns sondern auch des gesamten Nanopartikels. Das Synthesepolymer ermöglicht es, eine stabile Lösung (Suspension) zu erhalten, da die Kerne soweit voneinander getrennt sind, daß keine Aggregation mehr stattfinden kann (sterische Stabilisierung).

Nachdem die Eisen enthaltenden Kernpartikel fertigge stellt sind, wird das Synthesepolymer durch ein Desorptionsverfahren auf ein vorgegebenes Synthesepolymer zu Eisen-Verhältnis eingestellt. Die Lösung (Suspension) aus Eisen-Kern und Rest-Synthesepolymer, das den Eisen enthaltenden Kern als Primärcoat umhüllt und stabilisiert, stellt den Grundbaustein des modularen Systems dar. Der Grundbaustein zeichnet sich hierbei durch hohe physikalisch-galenische Qualität aus.

Ein zweiter wesentlicher Baustein ist das Targetpolymer, daß postsynthetisch an den Grundbaustein adsorbiert wird und den Kern mit dem Primärcoat mit einer zweiten Hülle umgibt (Sekundärcoat). Der Sekundärcoat stellt die Ober fläche der Nanopartikel dar und bestimmt das In-vivo- Verhalten. Die Mischung zwischen dem Grundbaustein und dem Targetpolymer kann zu beliebiger Zeit erfolgen, so daß auch eine "just in time" Herstellung möglich ist.

Die Adsorption zwischen Rest-Synthesepolymer und Target polymer kann durch einen zwischengeschalteten Schritt mit Zugabe von Adsorptionsvermittlern verbessert oder auch erst ermöglicht werden. Die Zugabe des Adsorptionsver mittlers kann auch in einem Schritt in einer Mischung mit dem Targetpolymer erfolgen. In analoger Weise können zu einem beliebigen Zeitpunkt pharmazeutische Hilfsstoffe oder auch Pharmaka zugesetzt werden.

Die besonderen Vorteile der Erfindung sind offensicht lich, da es mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfah ren erstmals gelingt, Forderungen der Physik und der Biologie an ein spezifisches Nanopartikel optimal zu erfüllen.

Aufgrund des modularen Aufbaus, d. h. getrennte Herstel lung von Grundbaustein (Eisen enthaltender Kern + Pri märcoat) und Targetprinzip (Sekundärcoat), kann für die Synthese das für die physikalischen Eigenschaften opti malste Synthesepolymer gewählt werden ohne durch die erwünschte biologische Steuerbarkeit der Nanopartikel limitiert zu sein; - erstmals müssen also keine Kompro misse bzgl. der physikalisch-pharmazeutischen Qualität der Nanopartikel und der gewünschten biologischen Wirkung gemacht werden. Das Targetpolymer unterliegt nicht den zerstörenden Bedingungen der Synthese, so daß viele Substanzen zur Zielfindung eingesetzt werden können, die bisher von vornherein ausgeschlossen waren. Ebenso muß keine postsynthetische Chemie, die ihrerseits adäquate Reaktionsbedingungen erfordert und die Integrität des Liganden beeinträchtigt, angewandt werden; es finden z. B. keine Redoxreaktionen mit Disulfidbrücken-enthaltenden Proteinen wie bei der Periodat-Oxidation mit anschließen der reduktiver Aminierung, statt - die biologische Akti vität bleibt erhalten.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil ist, daß keine Reini gung von Grundbaustein-Targetpolymer erfolgen muß, da keine Reaktionslösungen, wie z. B. Periodat, abgetrennt werden müssen - die Methode ist also schnell und es können daher auch "just in time" Nanopartikel direkt vor der Applikation hergestellt werden, wie es z. B. bei "individuellen" Kontrastmitteln (z. B. autologe Antikör per) nötig ist oder vorteilhaft sein kann, wenn das Targetpolymer in Lösung nur kurzzeitig stabil ist.

Auch für eine weitere Optimierung zeigt die erfindungs gemäße Herstellung Vorteile, da hier die "Oberfläche" der Nanopartikel separat modifiziert/optimiert werden kann und sich eine Analyse auch mit modernen Analysemethoden wie der NMR-Spektroskopie oder der IR-Spektroskopie durchführen läßt; Methoden die in Anwesenheit des parti kulären Kerns nicht anwendbar sind.

Da die Oberfläche definiert hergestellt ist und auch adäquat analysiert werden kann, ist eine systematische Optimierung der Oberflächeneigenschaften möglich, während bei der Herstellung nach dem "Stand der Technik", welcher die Partikel als eine einheitliche Substanz ansieht, die Oberfläche gar nicht bekannt ist und eine Optimierung daher auch nur über "try and error" möglich ist.

Die Nanopartikel werden in mehreren Stufen hergestellt. Der Eisen enthaltende Kern wird prinzipiell nach einer "Eintopfsynthese", also in Anwesenheit einer Stabilisa torsubstanz (Synthesepolymer), synthetisiert. Die Stabi lisatorsubstanz (Synthesepolymer) wird in Wasser gelöst und mit den monomolekularen Eisenverbindungen versetzt. Durch pH-Erhöhung werden die Eisensalze zu den vorzugs weise Oxiden umgesetzt und ausgefällt. Als Variante kann auch die Stabilisatorlösung alkalisch gestellt und dann mit den Eisensalzen versetzt werden. Das Gemisch wird unter Rückfluß erhitzt und dann neutralisiert, wobei Erhitzen und Neutralisieren auch in umgekehrter Reihen folge stattfinden kann. Die Rohsubstanz wird gereinigt und dann wird das überschüssige oder nicht fest adsor bierte/gebundene Synthesepolymer durch ein Desorptions verfahren auf ein exaktes Gewichtsverhältnis von Eisen zu Stabilisator eingestellt. Diese gereinigte und desorbier te Grundsubstanz aus Kern und (Rest-)Synthesepolymer stellt den Grundbaustein der modular aufgebauten Nano partikel dar. Optional kann hier eine Hitzesterilisation angeschlossen werden. Bei Bedarf oder "auf Vorrat" wird das gewählte Targetpolymer, gegebenenfalls unter Zwischen adsorption oder Ko-Adsorption eines Adsorptionsver mittlers, an den Grundbaustein adsorbiert. Optional können weitere Bestandteile wie pharmazeutische Hilfsstoffe oder Pharmaka zugegeben werden. Das allgemeine Herstellungsverfahren ist in der Abb. 2 schematisch zusammengefaßt.

Bei der folgenden Beschreibung des Eisen enthaltenden Kerns muß berücksichtigt werden, daß die Synthese immer in Anwesenheit des Stabilisators nach einer "Eintopf synthese" durchgeführt wird.

Zur Herstellung der Eisen enthaltenden Kerne werden stöchiometrische Mengen von Eisen-II und Eisen-III-Salzen miteinander gemischt. Die Qualität der entstehenden Kristalle wird dabei auch von den eingesetzten Salzen beeinflußt und im Allgemeinen werden in der Literatur die Salze der Salzsäure, also die Eisenchloride, eingesetzt. Prinzipiell sind hier aber alle Salze starker Säuren, also z. B. auch die Sulfate oder Nitrate verwendbar. Problematisch ist es, bei der Verwendung dieser Salze eine exakte Stöchiometrie zu gewährleisten, da die Eisen-II-Salze sehr oxidationsempfindlich sind. Vorteile ergeben sich hier durch die Verwendung komplexerer Salze wie z. B. dem Mohr′schen Salz, das nicht so oxidations empfindlich ist.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die Verwendung organischer Salze den anorganischen Salzen überlegen ist, da die organischen Anionen als Stabilisator oder Hilfs stabilisator wirken. Als besonders geeignet hat sich hier z. B. das Eisen-II-gluconat, oder das Eisen-III-citrat herausgestellt; verwendet werden können aber auch andere organische Anionen, wie z. B. die Fumarate, Tartrate, Lactate oder Salicylate.

Durch eine Synthesevariante, die nur von Eisen-III-Salz ausgeht, gelingt zum einen die Herstellung ohne die oxidationsempfindlichen Eisen-II-salze zu verwenden und zum anderen kann die Anzahl an "Fremdionen" reduziert werden. Diese Synthesevariante geht nur von Eisen-III-Salz aus, aus dem in situ durch eine berechnete Menge Reduktionsmittel Eisen-II erst durch die Reaktion gene riert wird. Obwohl prinzipiell alle Reduktionsmittel eingesetzt werden können, die Eisen-III stöchiometrisch exakt reduzieren, wird die Verwendung von Hydroxylamin bevorzugt, da das umgesetzte Hydroxylamin quantitativ zu Lachgas umsetzt und dadurch sehr einfach komplett aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden kann.

4 Fe³⁺ + 2 NH₂OH → 4 Fe²⁺ + N₂O↑ + 4 H+ + H₂O.

Ein Nachteil aller bisher beschriebenen Verfahren wird ersichtlich, wenn man sich die Chemie der Eisensalze näher betrachtet. Ziel des Präzipitationsschrittes ist es, Eisen-II und Eisen-III in stöchiometrischer Zusammensetzung zu einem Kristall mit definierter Kristallstruktur umzusetzen. Die Bildung der ent sprechenden Oxide wird durch die pH-Wert Erhöhung erreicht. Berücksichtigt man jedoch, daß schon bei einem pH-Wert von ca. 2 die Eisen-III-Ionen [pKL Fe(OH)₃ ca. 37] (Die pKL-Werte sind von der Konzentration abhängig und die Angaben beziehen sich auf eine 10^-2 Mol/l-Lösung.) schwerlösliche Hydroxide bilden, während die Eisen-II-Ionen erst bei pH 8 als Hydroxide [pKL Fe(OH)₂ ca. 13,5] ausfallen, so wird ersichtlich, daß eine direkte Bildung der gewünschten Kristalle kaum möglich erscheint und der Weg nur über eine Folgereaktion der Hydroxide stattfindet. Durch Verwendung geeigneter Komplexbildner ist es jedoch möglich die Fällungspunkte der Eisen verbindungen gegeneinander zu verschieben, so daß eine gleichzeitige Fällung und der Einbau auf die unter schiedlichen Gitterplätze im Eisenoxid-Kristall erfolgen kann. Durch die Wahl des Komplexbildners können die Fällungspunkte der eingesetzten Eisenverbindungen über weite Bereiche gesteuert werden.

Als Komplexbildner können neben den "klassischen" Sub stanzen nach Tabelle 1 auch die o. g. organischen Anio nen eingesetzt werden. Komplexe Salze, organische Anio nensalze und anorganische Salze der Eisen-II und Eisen-III-Ionen können auch beliebig miteinander kombiniert werden.

Tabelle 1

Auswahl an Komplexbildnern und Chelatoren für die Verschiebung der Fällungspunkte bei der pH- Erhöhung während der Magnetitsynthese

In einer Variante der Synthese erfolgt zunächst eine getrennte Herstellung von Eisen-II-hydroxid und Eisen- III-hydroxid. Die Herstellung der Eisenoxid-Kristalle gelingt überraschenderweise auch durch die Kombination der separat hergestellten Hydroxid-Lösungen, wobei ein Erhitzen der kombinierten Lösungen die Kristallisation beschleunigt.

Ein wichtiger Schritt bei der Herstellung der Eisen- enthaltenden Kerne ist der Präzipitationsschritt, bei dem durch pH-Wert Erhöhung aus den niedermolekularen Eisen verbindungen die partikulären Eisenverbindungen gebildet werden, wobei die Bildung der Partikel ggf. über die Bildung kolloidaler Eisenhydroxide erfolgen kann. Für die pH-Wert Erhöhung ist prinzipiell jede Substanz geeignet, die den pH-Wert der sauren Lösung der Eisensalze erhöhen kann. Neben der Verwendung von Natronlauge ist die pH-Wert Erhöhung durch Ammoniak, sowohl als Gas als auch als Salz, oder die Anwendung basischer Amine und flüchtiger Puffer, bevorzugt. Überraschenderweise hat sich heraus gestellt, daß die zur Präzipitation verwendete Base die Gesamteigenschaften so beeinflußt, daß auch "biologische" Auswirkungen sichtbar werden, so z. B. Unterschiede in der Organverteilung der Partikel.

Die Konzentration der basischen Substanz soll dabei im Bereich 0,1 bis 10 N liegen, bevorzugt sind hier konzen trierte Lösungen von etwa 1-4 N, da mit zunehmender Geschwindigkeit der pH-Wert-Erhöhung die Bildung von Partikeln mit kleinen Kerngrößen bevorzugt stattfindet. Die Zugabe der Basen erfolgt innerhalb von 30 Minuten, vorzugsweise aber innerhalb von 30 Sekunden.

Die Präzipitation der Eisenverbindungen zu den Partikeln erfolgt im Temperaturbereich von 0-120°C, wobei der Bereich 50-80°C bevorzugt ist. Prinzipiell gilt, daß die Temperatur niedrig sein kann, wenn direkt das Eisenoxid gebildet wird, und hoch sein muß, wenn die Bildung über die Hydroxide als Zwischenschritt erfolgt. Nach der Präzipitation erfolgt die Neutralisation und dann, insbesondere wenn zunächst die Hydroxide vorliegen, ein Erhitzen der Rohsubstanz unter Rückflußbedingungen, wobei die Dauer des Erhitzens zwischen 0 Minuten und 24 Stunden, vorzugsweise zwischen 30 Minuten und einer Stunde liegt. Neutralisation und Erhitzen unter Rückfluß bedingungen können dabei auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden.

Für die Anwendung als Kontrastmittel (optische Markersub stanz) bei visueller Detektion ist eine hohe Eigenfärbung wünschenswert. Die Anwendung als Kontrastmittel in der Magnetresonanz-Tomographie (MRT) erfordert eine hohe Wirksamkeit, die bei diesem Tomographieverfahren durch die magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel bestimmt wird. Aufgrund der hohen Sättigungsmagnetisierung schon bei niedrigen angelegten Feldstärken, wie sie in der klinischen MRT verwendet werden, erscheinen die Eisenoxide Maghämit und Magnetit bei der Verwendung der Nanopartikel als MR-Kontrastmittel besonders geeignet. Die besonderen magnetischen Eigenschaften werden hier durch die Kristallstruktur der partikulären Eisenkerne festgelegt. Überraschenderweise ist es jedoch möglich, Fremdionen in den Kristallkern einzubauen und trotzdem zu der magnetitartigen Kristallstruktur zu gelangen. Diese Dotierung mit Nicht-Eisenhaltigen Metallionen kann prinzipiell über zwei Wege erfolgen. Zum einen können Eisen-II und/oder Eisen-III-Ionen auf ihren Gitterplätzen durch andere paramagnetische Metallionen ersetzt werden und zum anderen kann die Substitution auch mit diamagnetischen Ionen erfolgen. Zum Verständnis sei daran erinnert, daß die Magnetisierung im Magnetitkristall nur von den Eisen-II-Ionen herrührt, da die Eisen-III-Ionen parallele/antiparallele Gitterplätze besetzen und sich in ihrer magnetischen Wirkung genau aufheben. Eine Erhöhung der Netto-Magnetisierbarkeit des Kristalls kann erfolgen, wenn Ionen mit stärkeren magnetischen Eigenschaften als Eisen verwendet werden, oder wenn durch para- oder diamagnetische Ionen das genau gleiche Besetzungsverhältnis auf den parallelen /antiparallelen Gitterplätzen für die Eisen-III-Ionen verändert wird. Für die Substitution mit paramagnetischen Metallen durch stärkere magnetische Ionen, wie z. B. Gadolinium kann dabei eine Erhöhung um die Differenz des magnetischen Momentes im Vergleich zum ersetzten Eisen erfolgen. Bei der Substitution von Eisen-III mit diamagnetischen Metallen kann das jetzt nicht mehr kompensierte Moment eines Eisen-III-Ions zum Gesamtmoment beitragen. In einer Variante können auch dia- und paramagnetische Ionen zusammen in das magnetitartige Kristallgitter eingebaut werden. Die Dotierung mit den Nicht-Eisen-Ionen erfolgt durch teilweise Substitution der niedermolekularen Eisen-haltigen Ausgangsverbindungen in der Synthese.

Die allgemeine Herstellung der Eisen enthaltenden Kerne hat zum Ziel, ein magnetitartiges Kristallgitter zu synthetisieren. Für diesen Zweck werden Eisen-II- und Eisen-III-Ionen in einem Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 20 eingesetzt. Am einfachsten gelingt die Synthese, wenn ein genau stöchiometrisches Verhältnis von 1 : 2 verwendet wird. Die Verhältnisse von Eisen-II zu Eisen-III können auch durch die Reduktion von Eisen-III während der Synthese durch ein Reduktionsmittel erhalten werden. Eisen-II- und/oder Eisen-III-Ionen können bis zu 25% des Gesamteisens (Gewicht) durch andere Metallionen ersetzt sein. Neben paramagnetischen Ionen wie Gadolinium oder Mangan können auch diamagnetische Ionen wie Lithium, Magnesium oder Calcium, oder eine Mischung para- und diamagnetischer Ionen, verwendet werden. Als Kristall struktur wird die Bildung von Magnetit bevorzugt. Der Magnetitkristall kann dabei zum einen sekundär entstehen, z. B. wenn bei der Herstellung zunächst die Hydroxide entstehen, oder der Magnetitkristall kann auch zu anderen Kristallen weiterreagieren, so z. B. bei der Oxidation von Magnetit zum Maghämit. Die besondere Qualität der Nanopartikel als Kontrastmittel für die MRT, erfordert superparamagnetische magnetische Eigenschaften. Superparamagnetismus kann nur in Festkörpern vorkommen, so daß als weitere Eigenschaft gefordert wird, daß die Kristalle Festkörpereigenschaften haben, also partikuläre Kristalle sind. Als Minimal-Eisenanteil müssen mindestens 50 Eisenatome (bzw. Metallatome) pro Kristall enthalten sein. Die Größe der Eisen enthaltenden Kerne kann durch Variation bei der Synthese über weite Bereiche gesteuert werden (1- ca. 30 nm), bevorzugt ist aber die Synthese kleiner Kerne mit Durchmessern kleiner 15 nm, wobei die Partikelgrößenverteilung so liegt, daß mindestens 90% der Partikel im Bereich 0,7 · MW bis 1,3 · MW (MW gleich mittlerer Durchmesser, bestimmt durch Elektronen mikroskopie) sind.

Einer der besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens ist die große Flexibilität bei der Wahl des Synthesepolymers, wobei der Begriff des "Polymers" hier nicht wörtlich zu nehmen ist, da sowohl niedermolekulare Substanzen als auch Mischungen nieder- mit höhermolekularen Substanzen zur Herstellung der Eisen enthaltenden Kerne verwendet werden können. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von nieder- oder höhermolekularen Substanzen, die negative Ladungsträger im Molekül enthalten. Bevorzugt sind hier Carboxylate oder Analoga, Phosphate (oder andere P enthaltende Gruppen) und Sulfate (oder andere S enthaltende Gruppen). Diese Derivate können dabei lediglich eine einzige funktionelle Gruppe tragen oder auch mehrere der funktionellen Gruppen enthalten. Die zugrundeliegende Theorie geht davon aus, daß die Affinität zur Oberfläche des Eisen enthaltenden Kerns durch Wechselwirkung zwischen positiver Eisenoxidoberfläche und negativer Ladung im Synthesepolymer erfolgt. Enthält das Synthese polymer mehrere der Gruppen, so ist die Wechselwirkung besonders ausgeprägt ("Multi-Side-Attachement"). Einige besonders geeignete Klassen für die Stabilisierung während der Synthese sind:

Niedermolekulare Substanzen, wie z. B. Carboxypolyalkoho le, Polycarboxypolyalkohole, Polycarboxyalkohole, Carboxyalkohole, Alkohole, Monozucker, Oligomere Zucker und synthetische Polymere, wie z. B. Polyethylenglycol, Polypropylenglycol und Mischungen (Block und Copolymere), Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol, Polymilchsäure (Polylactide und Polylactid-Glycid), sowie natürliche oder insbesondere partialsynthetische oder chemisch und/oder enzymatisch modifizierte natürliche Polymere wie z. B. Dextrane und Derivate, Arabinsäure, Glycosamino glycane und synthetische Analoga, Stärke und Derivate sowie Gelatinederivate.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung niedermolekularer Dextranderivate, die negative Ladungsträger enthalten. Ein Beispiel ist hier (Mono-)Carboxydextran; die Herstellung ist z. B. bei Bremner et al. [Bremner, I.; Cox, JSG; Moss, GF; Carbohydrate Research 11; 77-84; 1969] beschrieben und ein anderes bevorzugtes Beispiel ist die Verwendung von Polycarboxydextran, daß durch Ether bindung zwischen 6-Bromhexansäure und den Hydroxylgruppen des Dextrans hergestellt werden kann. [Noguchi, A.; Takahashi, T; Yamaguchi, T.; Kitamura, Y.; Takakura, T.; Hashida, M.; Sezaki, H.; Bioconjugate chemistry 3; 132-137; 1992]. Das Polycarboxydextran kann durch die vielen negativen Ladungen über ein "Multi-Side-Attachement" mit der Eisenoxidoberfläche wechselwirken.

Die Menge an Synthesepolymer zur Stabilisierung während der Herstellung beträgt das 0,5-20fache des Gewichtes der Summe der im Ansatz enthaltenden Metallionen, wobei der Gesamtanteil im Reaktionsgemisch so gewählt wird, daß die Viskosität bei Verwendung polymerer Synthesepolymere noch eine gute Durchmischung des Ansatzes erlaubt (< 50% g/V). Bevorzugt ist die Verwendung eines etwa 3-15fachen Überschusses (Gewicht) an Synthesepolymer gegenüber der Summe der enthaltenen Metallionen.

Nach der Herstellung der Rohsubstanz erfolgt die Reduk tion des Anteils an Synthesepolymer im Ansatz durch ein Desorptionsverfahren. Zur Desorption können chromatogra phische Verfahren, ein Verfahren aus dem Bereich der Magnetseparationstechnik, eine Dialyse, eine Zentrifuga tion oder Ultrazentrifugation, eine Ultrafiltration oder andere geeignete Verfahren verwendet werden. Die Desorption kann durch die Anwendung erhöhter Temperatur in Kombination mit einem der Desorptionsverfahren angewandt werden. Eine weitere Möglichkeit Einfluß auf das Ausmaß der Desorption zu nehmen ist die Verwendung desorbierender Substanzen, wie z. B. von Pufferlösungen oder Tensiden.

Nach der Desorption der Rohsubstanz erhält man eine stabile, physikalisch optimale Lösung/Suspension, die den Grundbaustein für die Herstellung der spezifischen Nanopartikel darstellt. Die Grundbausteine bestehen aus dem Eisen enthaltenden Kern und dem (Rest-)Synthesepoly mer. Die Menge an verbliebenem Synthesepolymer beträgt, je nach dem durch das Desorptionsverfahren eingestellte Verhältnis, 0,01 bis 1. Bevorzugt ist der Bereich von 0,25 bis 0,75, da in diesem Bereich der beste Kompromiß aus Stabilität und Adsorptionsfähigkeit des Grundbau steins resultiert. Die Gesamtgröße (hydrodynamischer Durchmesser) des Grundbausteins variiert in Abhängigkeit von der Größe des Eisen-enthaltenden Kerns und dem verwendeten Synthesepolymer und liegt in der Größenord nung kleiner 100 nm, vorzugsweise kleiner 50 nm. Beson ders bevorzugt ist die Herstellung von Grundbausteinen, bei denen der Gesamtdurchmesser höchstens fünfmal so groß ist wie der Kerndurchmesser.

Der Grundbaustein wird mit einem Targetpolymer zum ferti gen Nanopartikel kombiniert. Das adsorbierte Targetpoly mer bildet um das Synthesepolymer/Eisen-enthaltender Kern eine Sekundärhülle und bildet die Oberfläche des Gesamt systems und bestimmt, neben dem partikulären Charakter der Partikel, das In-vivo-Verhalten. Der besondere Vorteil des Herstellungsverfahrens liegt darin, daß praktisch jede Substanz, die an den Grundbaustein adsorbiert werden kann, zur biologischen Steuerung der Nanopartikel verwendbar ist. Die Targetpolymere unterlie gen keinem Synthesestreß, so daß auch empfindliche und bisher nicht verwendbare Substanzen als Leitmoleküle zur Steuerung des biologischen Verhaltens verwendet werden können.

Beispiele für geeignete Targetpolymere sind u. a.:
Natürliche Oligo- und Polysaccharide wie Dextran mit Molekulargewichten kleiner als 100.000, Mischungen verschiedener Dextrane, Dextrane unterschiedlicher Herkunft, besonders gereinigtes Dextran (FP = free pyrogen Qualität), Fucoidan, Arabinogalactan, Chondroitin und -sulfate, Dermatan, Heparin, Heparitin, Hyaluron säure, Keratan, Polygalacturonsäure, Polyglucuronsäure, Polymannuronsäure, Inulin, Polylactose, Polylactosamin, Polyinosinsäure, Polysucrose, Amylose, Amylopektin, Glycogen, Glucan, Nigeran, Pullulan, Irisin, Asparagosin, Sinistrin, Tricitin, Kritesin, Graminin, Sitosin, Lichenin, Isolichenan, Galactan, Galactocaolose, Luteose, Mannane, Mannocarolose, Pustulan, Laminarin, Xanthan, Xylan und Copolymere, Araboxylan, Arabogalaktan, Araban, Lävane (Fructosane), Teichinsäure, Blutgruppenpoly saccharide, Guaran, Carubin, Alfalfa, Glucomannane, Galactoglucomannane, Phosphomannane, Fucane, Pektine, Cyclo-Dextrine, Alginsäure, Traganth und andere Gummi sorten, Chitin, Chitosan, Agar, Furcellaran, Carrageen, Cellulose, Celluronsäure, Arabinsäure und die chemisch und/oder enzymatisch hergestellten Derivate, die ggf. noch beliebig substituiert sein können und die niedermo lekularen Abbauprodukte der hochmolekularen Verbindungen. Ebenso geeignet sind die Polyamino- und Pseudopolyami nosäuren.

Synthetische Oligomere und Polymere wie Polyethylen glycol, Polypropylenglycol, Polyoxyethylenether, Polyanetholsulfonsäure, Polyethylenimin, Polymaleimid, Polyvinylalkohol, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylsulfat, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polylactid, Polylactid-glycid.

Monomere bis oligomere Zucker und verwandte Substanzen wie Aldo- und Ketotriosen bis Aldo- und Ketoheptosen, Ketooktosen und Ketononosen, Anhydrozucker, Monocarbon säuren und Derivate mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen in der Hauptkette, Cyclite, Amino- und Diaminozucker, Desoxy zucker, Aminodesoxyzucker und Aminozucker-carbonsäuren, Aminocyclite, Phosphor enthaltende Derivate der Mono- bis Oligomere.

Oligomere/Polymere mit antitumoralen Eigenschaften (höhere Pflanzen, Pilze, Flechten und Bakterien) wie Lipopolysaccharide, β-2, 6-Fructan, β-1,3-Glucan, Manno glucan, Mannan, Glucomannan, β-1,3/1,6-Glucane, β-1,6-Glucan, β-1,3/1,4-Glucan, Arabinoxylan, Hemicellulose, β-1,4-Xylan, Arabinoglucan, Arabinogalactan, Arabinofuco glucan, α-1,6/1,3-Glucan, α-1,5-Arabinan, α-1,6-Glucan, β-2,1/2,6-Fructan, β-2,1-Fructan.

Eine wesentliche Voraussetzung für die Wirkung der Antitumorpolysaccharide ist die Wasserlöslichkeit, die bei den β-1,3/1,6-Glucanen durch Verzweigungen in Position 6 gewährleistet ist. Bei wasserunlöslichen Polysacchariden läßt sich durch die Einführung hydrophi ler und gut hydratisierter Gruppen die Löslichkeit verbessern. Als Substituenten können u. a. Methyl-, Ethyl-, Acetyl-, Carboxymethyl- oder Sulfatgruppen verwendet werden.

Tenside und oberflächenaktive Substanzen wie Niotenside, Alkylglucoside, Glucamide, Alkylmaltoside, mono- und polydisperses Polyoxyethylen, Quartäre Ammoniumsalze, Gallensäuren, Alkylsulfate, Betaine, CHAP-Derivate.

Beispielhaft und um die Vielzahl der verwendbaren Steuerungsmöglichkeiten aufzuzeigen und damit auch die Vorzüge des modularen Systems zu demonstrieren, können die Moleküle zur Steuerung des In-vivo-Verhaltens (Spezifität) auch Zellfragmente, Zellen, Bakterienfrag mente, Substanzen aus der großen Gruppe der Lectine, der Hormone und Mediatorsubstanzen, der Proteine und Neopro teine, der Peptide und Polypeptide, der Antikörper, Antikörperfragmenten oder den "molecular recognition units", der Integrine (ELAM, LECAM, VCAM usw.) oder Rezeptor-spezifischen Substanzen (z. B. Lewis-X, Sialyl- Lewis-X usw.) sein. Ferner gehören dazu die Vielzahl der Blut-/ Plasma-/Serumbestandteile und der Opsonine, der Gruppe der Oligonukleotide und synthetischen Oligo nukleotide, DNA und RNA oder deren Derivate oder Fragmente oder Analoga und Homologe, aus der Gruppe der Lipopolysaccharide, Lipoproteine, Glycerinester, Cholesterine- und Ester, stammen, oder auch Metabolite und Antimetabolite, Arzneistoffe, Arzneistoffkonjugate, Chemotherapeutika und Zytostatika.

Als Targetpolymere können zusätzlich oder statt der o. g. Beispiele für Targetpolymere auch die chemischen und/oder enzymatisch hergestellten Derivate oder Abbauprodukte verwendet werden.

Die Derivate oder die "nativen" Targetpolymere können zusätzlich funktionelle Gruppen tragen. Diese funktionel len Gruppen können an einem Ende oder an beiden Enden oder an beliebiger Stelle im zugrundeliegenden Targetmo lekül sein. Dabei können die funktionellen Gruppen alle gleich oder aber auch unterschiedliche Gruppen miteinan der kombiniert sein. Sowohl bei den Derivaten selber als auch bei den funktionellen Gruppen sind diejenigen, die N-, S-, O- oder P-Atome, Säure- oder Analoga, Hydroxy-, Ether- oder Estergruppen enthalten, bevorzugt.

Die genaue Zusammensetzung der Nanopartikel richtet sich nach der jeweiligen, durch die Indikation festgelegten, Anforderung. Als Targetpolymere können sowohl einzelne Substanzen als auch beliebige Kombinationen der Targetpo lymere, z. B. synthetisch und nichtsynthetisch, nieder- und höhermolekular, derivatisiert und nicht-derivati siert, verwendet werden.

Eine besondere Variante der Herstellung besteht darin, daß das Targetpolymer und das Synthesepolymer gleich sein können. In diesem Zusammenhang heißt das, daß das Target polymer mit dem zur Synthese eingesetzten Polymer gleich ist, da wie schon o. g. beschrieben, daß Synthesepolymer nach der Synthese ja nicht mehr mit dem zur Synthese eingesetzten Polymer identisch ist. Das Targetpolymer ist hier also das deklarierte Synthesepolymer, unterlag aber nicht wie dieses den drastischen Bedingungen während der Herstellung und befindet sich daher noch in "physiolo gischem" Zustand.

Die Mengen an Targetpolymer in der fertigen Lösung der Nanopartikel können über weite Bereiche variiert werden. Prinzipiell ist der Bereich vom 0,5- bis zum 50fachen Gewicht der Summe des Gewichtes der enthaltenen Metallio nen, verwendbar, aber bevorzugt ist die Verwendung von Mengen entsprechend dem 1 bis ca. 25fachen.

Als Adsorptionsvermittler sind alle Stoffe aufzufassen, die die Adsorption zwischen dem Targetpolymer oder dem Gemisch der Targetpolymere an die Oberfläche des Eisen enthaltenden Kerns oder Kern plus Primärcoat, verbessern oder erst ermöglichen. Prinzipiell müssen die Adsorpti onsvermittler also bifunktionelle Eigenschaften aufwei sen, wobei ein Molekülteil die Affinität zum Grundbau stein beinhaltet, während ein anderer Molekülteil, der allerdings mit dem ersten funktionellen Teil identisch sein kann, die Affinität zum Targetmolekül bedingt. Geeignet sind z. B. Stoffe mit 2 funktionellen Gruppen oder einem hydrophoben und einem hydrophilen Molekülteil. Bevorzugte Adsorptionsvermittler sind Peptide, die eine Affinität zum Eisenkern oder zum Eisenkern plus Pri märcoat aufweisen. Solche Peptide lassen sich mit moder nen Methoden der Biochemie in Peptid-Librarys selektie ren. Bevorzugt sind Peptide, die die RRTVKHHVN oder die RRSRHH oder auch RSKRGR Sequenz oder Teile davon im Molekül enthalten [Ein-Buchstaben-Code der Aminosäuren s. z. B. Stryer, Biochemistry; Freeman and Comp.; New York; 1988].

Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung der Peptide als Adsorptionsvermittler ist, daß der nicht zur Affinität benötigte Molekülteil auch mit üblichen Methoden der Biochemie kovalent an das oder die Targetpolymere gekop pelt werden kann, so daß hier die Affinität zum Targetpo lymer nur optional vorhanden sein muß. Die Menge an Adsorptionsvermittler hängt von der oder den Eigenschaf ten der verwendeten Substanzen (Stärke der Adsorptions vermittlung) und von den Eigenschaften des oder der Targetpolymere ab; der maximale Zusatz ist allerdings kleiner oder höchstens gleich dem Gewicht der Summe der im Kern enthaltenen Metallionen.

Pharmazeutische Hilfsstoffe, die in den Lösungen der Nanopartikel enthalten sein können, lassen sich nach ihrer Aufgabe den Klassen Konservierungsmittel, pH-Stabi lisatoren, Antioxidantien, Isotonisierungszusätze, Pep tisatoren und Lösungsvermittler zuordnen. Als weitere Hilfsstoffe können medizinisch tolerable Lösungsmittel wie Zuckerlösungen, Plasmaexpander, Elektrolytlösungen, physiologische Kochsalzlösung oder auch Wasser ad injek tionem, sowie parenteral applizierbare ölige "Lösungsmittel" verwendet werden.

Exemplarische Beispiele für Pharmaka, die in den Lösungen der Nanopartikel enthalten sein können, lassen sich den Gruppen Antiallergika, Antianaphylaktika oder Prophylak tika, den Vasodilatatoren oder Vasokonstriktoren, den Stoffen mit Einfluß auf die Durchblutung, den Stoffen, die den Metabolismus der Nanopartikel beeinflussen, den Stoffen, die die Pharmakokinetik der Nanopartikel beein flussen, den Stoffen, die die Eisenbilanz verändern, den Stoffen aus dem Bereich der Enzyminduktoren und Inhibito ren, oder allgemein den Mediatoren und Antimediatoren, zuordnen. Für die Verwendung in der Therapie sind haupt sächlich Arzneistoffe aus den Gruppen Zytostatika, Che moptherapeutika, der Hormone und Antidiabetika von besonderem Interesse.

Die Pharmaka können den Lösungen der Nanopartikel dabei als optionale Komponente zusätzlich zugesetzt sein oder aber auch an die Targetpolymere gebunden und dann das Polymer-Arzneistoff-Konjugat als Targetpolymer verwendet werden.

Das "physiologische" Verteilungsverhalten der Nanoparti kel läßt sich nicht nur über die Beeinflussung "physiologischer" Faktoren, wie Durchblutung, Lymphfluß und Lymphproduktion o. ä. durch Pharmaka verändern, sondern die in vivo Verteilung kann auch durch einfache physiotherapeutische Maßnahmen verändert werden. Beson ders hervorzuheben sind hier die Bewegung, die z. B. durch einen Spaziergang oder Übungen auf dem Ergometer gezielt "appliziert" werden kann und entgegengesetzt dazu die Bewegungslosigkeit, wie z. B. bei bettlägerigen Patienten und oder die Anwendung in Narkose o. ä. die zu einem völlig anderen Verteilungsverhalten und -muster führt. Zum anderen ist insbesondere die Zufuhr von Wärme, die sich durch einfache Anwendung von Rotlicht oder Ganz- bzw. Teilkörperbädern, ermöglichen läßt, zu erwähnen. Besonders bevorzugt ist hier die Wärmezufuhr durch eine Hyperthermie-Vorrichtung, wie sie in vielen Kliniken zur gezielten Wärmezufuhr in der adjuvanten Tumortherapie verwendet wird. Durch gezielte lokale Erwärmung läßt sich die "Selektivität" durch physiotherapeutische Begleitung verbessern.

Die hohe Flexibilität der modularen Herstellung erlaubt die freie Kombination von Targetpolymer(en), Adsorptions vermittler(n), pharmazeutischen Hilfsstoffen und Pharma ka sowie die Anwendung beliebiger Zusammensetzungen der Nanopartikel in Kombination mit physiotherapeutischen Maßnahmen.

Die Nanopartikel bzw. die Lösungen können aus vielen unterschiedlichen Bestandteilen zusammengesetzt sein, so daß nur allgemeine Aussagen zur exakten Zusammensetzung, die sich nach der jeweiligen Anwendung richtet, gegeben werden können:

Tabelle 2

Prozentuale bzw. Mengenzusammensetzung der erfindungsgemäßen Nanopartikel

Der Gesamtdurchmesser der Nanopartikel inklusive aller Zusatzstoffe ist höchstens zehnmal höher (gemessen durch ein Laserlichtstreuverfahren, PCS) als der Durchmesser des Eisen enthaltenden Kerns (gemessen durch Elektronen mikroskopie in Transmissionsanordnung; TEM). Bevorzugt sind die Kombinationen, bei denen der Durchmesser des Grundbausteins (Kern + Primärhülle) durch das Target polymer oder die Kombination Targetpolymer und optionale Zusätze nur unwesentlich erhöht wird, der mit PCS gemessene Durchmesser soll maximal 20% über dem Durchmesser des Grundbausteins liegen.

Durch die Kombination optimaler physikalischer Eigen schaften der Grundbausteine mit einer Vielzahl möglicher Targetpolymere lassen sich Nanopartikel mit bisher uner reichter Flexibilität und Qualität für Anwendungen, die hohe biologische Spezifität und hohe physikalische Quali tät (z. B. Partikelgröße, magnetische Eigenschaften) erfordern, herstellen. Durch die modulare Bauweise und die damit verbundenen vielen Kombinationsmöglichkeiten ergibt sich ein breites Spektrum möglicher Anwendungen:

Aufgrund ihrer hohen physikalischen Qualität und der besonders guten Steuerungsfähigkeit ("targetability") der Nanopartikel durch flexible Anpassung (modularer Aufbau) des Targetpolymers (Sekundärcoat) an die jeweilige Frage stellung, ergeben sich viele Einsatzbereiche für spezi elle Indikationen wie die MR-Lymphographie nach intravenöser oder lokaler interstitieller Gabe, die Tumordarstellung, die Darstellung von Funktionen oder gestörten Funktionen, die Plaque-Darstellung (Atherosklerose-Imaging), die Darstellung von Thromben und Gefäßverschlüssen, die MR-Angiographie, Perfusions untersuchungen, die Darstellung von Infarkten, die Darstellung von Endothelschädigungen, das Rezeptor- Imaging, die Darstellung der Integrität der Blut-Hirn- Schranke usw. und für die Differentialdiagnose, insbesondere zur Unterscheidung von Tumoren/Metastasen und hyperplastischem Gewebe.

Die Partikel eignen sich durch die außerordentliche Flexibilität bei der Herstellung auch für die unter schiedlichsten Einsatzgebiete in der In-vitro-Diagnostik, so z. B. als spezifische Träger bei der Magnetseparation stechnik in EIA′s (Enzym-Immuno-Assays).

Eine Kombination von In-vitro-Verfahren mit einem thera peutischen Ansatz ist die selektive Depletierung spezifi scher Faktoren aus dem Blut ("Ex-vivo-Blutwäsche").

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel weisen eine hohe Eigenfärbung auf und durch die Kombination mit einem Targetpolymer, das zu besonders hoher Akkumulation in den Lymphknoten führt, eignen sich die Partikel hervorragend als intraoperative Markersubstanzen zum Lymphknotenstai ning. Bei vielen chirurgischen Tumorentfernungen werden die Lymphknoten mit entfernt und die Vorabapplikation der Nanopartikel erleichtert es dem Operateur erheblich, die z. T. äußerst kleinen Lymphknoten im umgebenden Gewebe zu identifizieren. Die Nanopartikel weisen für diese Indikation ein besonders breites nutzbares Zeitfenster auf und können von ca. 60 min bis mehr als 24 Stunden vor Operationsbeginn appliziert werden.

Neben der visuellen Darstellung von Lymphknoten ergibt sich bei intratumoraler Applikation oder Applikation in die Tumorperipherie die Möglichkeit, zum einen die Tumor peripherie anzufärben und damit die Abgrenzbarkeit des Tumors zum umgebenden Gewebe zu erhöhen und zum anderen werden die Partikel aus dem Tumorarreal über die gleichen entsorgenden Lymphgefäße abtransportiert, über die auch der Tumor metastasieren würde. Die Nanopartikel zeigen also die für eine Metastasierung besonders prädesti nierten Lymphwege bzw. Lymphknoten auf.

Neben der Verwendung als intravenöses Kontrastmittel können die Partikel auch lokal appliziert werden. Die lokale Anwendung kann z. B. bei einem Mammakarzinom vorteilhaft sein, da nur ein begrenztes Gebiet darge stellt werden soll und durch die zielgerichtete Anwendung werden einerseits hohe Konzentrationen des Kontrastmit tels im Zielgebiet deponiert und zum anderen wird der restliche Organismus nicht belastet. Die indirekte gezielte Applikation ins Interstitium der Umgebung bestimmter Lymphknoten kann auch erforderlich sein, um eine Diagnose zu erhärten, falls sich nach intravenöser Gabe ein verdächtiger aber unsicherer Befund ergeben hat.

Ein weiteres Anwendungsgebiet der Nanopartikel ist die Verwendung als Verstärkersubstanz in der In-vivo-Diagnostik auf der Basis hochempfindlicher Meßmethoden (SQUID) zur Messung der Magnetisierung oder magnetischer Felder/Flußdichten. Die Entwicklung hoch empfindlicher Meßmethoden auf diesem Gebiet hat die Verfolgung magneti scher Partikel in vivo möglich gemacht, so daß, ähnlich wie in der Szintigraphie mit radioaktiven Substanzen, magnetische Partikel zur Diagnostik von Funktionsstörun gen und Läsionen herangezogen werden können.

In der Therapie lassen sich die Partikel als Arzneistoff träger verwenden. Die Spezifität der Nanopartikel wird zum Transport von Arzneistoffen an den Wirkort ausge nutzt. Die Arzneistoffe können dabei in den Eisen- enthaltenden Kern inkorporiert sein, auf der Oberfläche adsorbiert werden oder aber auch chemisch an das Synthe sepolymer und /oder das Targetpolymer gebunden sein. Eine Alternative ist die Adsorption von Arzneistoff-Polymer- Konjugaten oder Arzneistoffe an Adsorptionsvermittler zu binden, so sind z. B. bestimmte Peptidsequenzen mit hoher Adsorption an Eisenoxidoberflächen herstellbar.

Eine mögliche Indikation ist hier auch die Anreicherung hoher Konzentrationen von niedermolekularen Chemothera peutika in phagozytierenden Zellen, wie es z. B. bei vielen Krankheiten mit in RES Zellen persistierenden Mikroorganismen therapeutisch erforderlich ist. Bei allen therapeutischen Ansätzen können die Nanopartikel-Arznei stoff-Systeme auch durch externe Magnetfelder selektiv im Zielgebiet akkumuliert werden. Bei speziellen Fragestel lungen besteht auch die Möglichkeit, kleine Magnete zur Steuerung im Zielgebiet, z. B. in einem Tumorarreal, zu implantieren.

Neben einer Verwendung der Nanopartikel als Träger für den gezielten Transport von Arzneistoffen in bestimmte Gewebe, lassen sich Arzneiformen mit modifizierter Wirk stoff-Freisetzung herstellen. Die Freisetzung des Wirk stoffs kann dabei durch biologisch spaltbare Arzneistoff- Konjugate gesteuert werden oder durch die Einlagerung des Arzneistoffs in verschiedene Komponenten des Nanoparti kels mit unterschiedlichem Bioabbau erfolgen. Eine mögli che Indikation ist z. B. die Verwendung der Nanopartikel als Depotarzneiform für die Verabreichung von Hormonen.

Auch der Einsatz in neuen therapeutischen Systemen, bei denen die Freisetzung des Arzneistoffs über die magneti schen Eigenschaften der Nanopartikel über einen "magnetischen Schalter" der z. B. auch extern geregelt werden kann, induziert und gesteuert wird, ist denkbar. Eine wichtige Indikation ist hier die Entwicklung thera peutischer Systeme mit der regulierbaren Freisetzung von Antidiabetika für die Behandlung des Diabetes mellitus.

Als Arzneistoffe, die sich mit den Nanopartikeln gezielt zum Wirkort transportieren lassen, kommen insbesondere Chemotherapeutika und Zytostatika in Betracht. Auch die antimikrobielle Therapie erfordert oft den gezielten Transport des Arzneistoffs zum Wirkort (z. B. Tuberku lose, in Makrophagen persistierende Mikroorganismen) . Als Arzneistoffe für therapeutische Systeme, bei denen die Freisetzung über die magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel erfolgt, kommen neben anderen insbesondere Antimikrobiotika, Hormone, Antidiabetika, Zytostatika und Chemotherapeutika in Betracht.

Über die indirekte therapeutische Verwendung hinaus lassen sich die Nanopartikel aber auch selber als "Arzneistoff" nutzen, so z. B. als Absorber in der Hyperthermie oder in der Mößbauer-Kernabsorptionsthera pie, oder bei entsprechender Dotierung mit Bor oder Gadolinium in der Neutroneneinfang-Therapie. Auch in der Dotierung der Nanopartikel mit radioaktiven Elementen, die im Kern oder auch durch Adsorption geeigneter Moleküle mit Isotopen oder Molekülen an den Grundbaustein erfolgen, besteht eine Möglichkeit zur Verwendung der Nanopartikel in der medizinischen Strahlentherapie.

Eine bevorzugte Anwendung der Nanopartikel in der Strahlentherapie ist beispielsweise gegeben, indem die Nanopartikel entweder über das radioaktive Isotop ⁵⁵Fe einen "Selbststrahler" enthalten oder indem die Nano partikel ein Isotop enthalten, das durch eine externe "Aktivierung" in ein stahlendes Isotop angeregt werden kann. Beispielsweise kann der Kern ¹⁵⁷Gd enthalten und die externe Anregung auf Neutronen zurückgehen.

Eine weitere Anwendung der Nanopartikel in der Strahlen therapie ergibt sich durch die Möglichkeit, die Nanopartikel im Kern, im Synthese- oder im Targetpolymer oder auch im Adsorptionsvermittler so zu verändern, daß Selbststrahler wie z. B. ¹²³I oder ¹²⁵I enthalten sind. Alternativ können die Nanopartikel auch ein Isotop enthalten, das erst durch externe Anregung in ein strahlendes Isotop überführt wird. Ein Beispiel ist hier z. B. die Markierung des Targetpolymers mit Iod und die externe Anregung der Iod-K-Kante mit monoenergetischer Röntgenstrahlung.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch zur Entfernung von Bakterien, Viren, Endo- und Exotoxinen aus dem Vasalraum eingesetzt werden, wobei zum einen die Wechselwirkung mit den Nanopartikeln an sich zur Inaktivierung führen kann und zum anderen die Wechselwir kung zur Erkennung der Konjugate/Adsorbate durch das RES mit nachfolgender intrazellulärer Inaktivierung, erfolgen kann.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele unter Verwendung der Abb. 1 bis 35 näher erläu tert.

Im einzelnen zeigen:

Abb. 1: Schematischer Aufbau der Nanopartikel mit Eisen-enthaltendem Kern, Primärcoat (Synthesepolymer) und Sekundärcoat (Targetpolymer);

Abb. 2: Allgemeines Syntheseschema zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nanopartikel;

Abb. 3: FTIR-Spektrum von Mono-Carboxydextran und der Ausgangsverbindung Dextran 4;

Abb. 4: FTIR-Spektrum von Poly-Carboxydextran und der Ausgangsverbindungen Dextran T10 und 6-Bromhexansäure;

Abb. 5: MR-Aufnahmen von in Agarose-eingebetteten Rattenlymphknoten;

Abb. 6: Quantitative Auswertung (aus Abb. 5) der relativen Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte;

Abb. 7: Quantitative Auswertung (aus Abb. 5) der relativen Signalintensitäten GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte;

Abb. 8: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der Pro tonen-Dichte gewichteten Spin-Echo-Sequenz (SE 2000/15);

Abb. 9: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der Pro tonen-Dichte gewichteten Spin-Echo-Sequenz (SE 2000/15);

Abb. 10: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschieden Lymphknoten des Kaninchens 24 h p.i.;

Abb. 11: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der T2*- gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz (GE 135/15/150);

Abb. 12: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der T2*- gewichteten Gradienten-Echo-Sequenz (GE 135/15/150);

Abb. 13: Modifizierte Charge vs Originalsubstanz: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten des Kaninchens 24 h p.i.;

Abb. 14: Ex vivo MR-Aufnahmen (GE-Sequenz) von Agarose- eingebetteten Lymphknoten des Kaninchens;

Abb. 15: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten des Kaninchens 24 h p.i.;

Abb. 16: Relative Signalintensitäten in Abhängigkeit der applizierten Dosis für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Applikation der Nanopartikel;

Abb. 17: Relative Signalintensitäten in Abhängigkeit der applizierten Dosis für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Applikation der Nanopartikel;

Abb. 18: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation (Vergleichssubstanz);

Abb. 19: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation der spezifischen Nanopartikel;

Abb. 20: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation (Vergleichssubstanz);

Abb. 21: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation der spezifischen Nanopartikel;

Abb. 22: Beeinflussung der Lymphknotenanreicherung durch gezielte Applikation von Wärme;

Abb. 23 : Transversale Dynamik-Studie des Rattenabdomens mit einer T1-gewichteten SE Sequenz (TR: 200 ms, TE: 10 ms) nach Bolus-Injektion der spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 (Dosis 20 µmol Fe/kg);

Abb. 24: Vergleich der relativen Signalintensitäten für SE TR/TE 200 ms/10 ms im venösen Gefäß und dem Leberparenchym für die spezifischen Nanopar tikel nach Beispiel D2 und die unspezifische Vergleichssubstanz nach Beispiel C2;

Abb. 25: Koronare MIPS (maximum-intensity projections) von 3D-Flash-Aufnahmen (TR: 40 ms, TE: 6 ms, FA 60°) für die spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 und die Vergleichssubstanz C2;

Abb. 26: Erfindungsgemäße Nanopartikel als "intraoperative" Markersubstanzen für die visuelle Detektion von Lymphknoten (Übersichtsaufnahme);

Abb. 27: Erfindungsgemäße Nanopartikel als "intraoperative" Markersubstanzen für die visuelle Detektion von Lymphknoten (Detailansicht);

Abb. 28: Demonstration von Metastasen in Lymphknoten durch visuelle Detektion in metastatischen Lymphknoten am Kaninchen;

Abb. 29: Zellaufnahme von spezifischen Nanopartikeln (mit Transferrin) im Vergleich zur unspezi fischen Kontrolle (Nanopartikel ohne Trans ferrin);

Abb. 30: Ex vivo MR-tomographische Darstellung atherosklerotischer Plaques der Aorta eines Kaninchens mit der Modifikation zu den Nanopartikeln nach Beispiel D7 (Dosis 200 µmol Fe/kg; Resektion der Aorta 5 h p.i.);

Abb. 31: Histologischer Eisen-Nachweis in der atherosklerotischen Membran der Kaninchen- Aorta mit Berliner-Blau-Färbung.

Abb. 32: Histochemische Detektion (Berliner Blau Färbung) der akkumulierten Nanopartikel nach Beispiel D7 in der Aorta eines Watanabe Kaninchens;

Abb. 33: Transversale T1-gewichtete Spin-Echo Dynamik- Studie (TR: 300 ms, TE: 15 ms) des tumoralen Signalverhaltens nach Bolusinjektion von Nanopartikeln nach Beispiel D2 (200 Mmol Fe/kg);

Abb. 34: Verlauf der relativen Signalintensität (Anreicherung) im Tumor;

Abb. 35: Zeitabhängige transversale Protonen-Dichte gewichtete (SE 2000/15) Aufnahmen nach Appli kation der Nanopartikel nach Beispiel D2 (200 µmol Fe/kg).

Beispiele zur Herstellung und zur Anwendung A: Herstellung von Synthesepolymeren A1 Synthese von (Mono-)Carboxydextran (CDx)

100 g Dextran 4 werden in 500 ml Wasser gelöst und auf 60°C erhitzt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe von ungefähr 55 ml ca. 10 N Natronlauge. Nach 5 Stunden Reaktionszeit erfolgt die (teilweise) Neutralisation der Lösung auf pH 8. Die braune Lösung wird anschließend über einen Misch bett-Ionenaustauscher gereinigt. Die Fraktionen mit sauren Eigenschaften werden gepoolt und am Rotationsver dampfer bei 40°C im Vakuum aufkonzentriert. Anschließend erfolgt die Gefriertrocknung.

Tabelle 3

Analytische Daten

A2 Synthese von Polycarboxydextran (P-CDx)

10 g Dextran T10 werden in einen 250 ml 2-Hals-Kolben eingewogen und mit 100 ml 4 N NaOH versetzt. Der eine Hals des Kolbens wird mit einem Rückflußkühler ausge stattet und die Lösung dann auf ca. 80°C erhitzt. Unter Rühren (Magnetrührer) erfolgt durch den zweiten Zugang die portionsweise Zugabe von 30 g 6-Bromhexansäure. Nach der Zugabe wird der Zugang durch einen Stopfen verschlos sen und das Reaktionsgemisch für 3 Stunden weitergerührt. Nach der Reaktion erfolgt unter einem Abzug die Neutrali sation mit 6 N HCl und dann eine Vorkonzentration am Rotationsverdampfer (60°C, Vakuum). Die Abtrennung des nicht umgesetzten Reagenzes bzw. die Reinigung des modi fizierten Carboxydextrans erfolgt durch Fällung mit Ethanol. Der weiße Niederschlag wird gewaschen, in Aqua bidest. wieder aufgelöst und abschließend durch 0,22 µm Filter filtriert und lyophilisiert.

Tabelle 4

Analytische Daten

B: Herstellung der Rohsubstanzen B1 Herstellung aus CDx mit Ammoniak-Gas

5,0 g Mono-Carboxydextran (CDx, Beispiel A1) mit einem Molekulargewicht von ca. 2000 Da werden in 17,5 ml Aqua bidest. gelöst. Die Lösung wird durch Einblasen von Stickstoff entgast. In einem Reagenzglas werden 6,7 ml 1 molare Eisen-III-chlorid-hexahydrat-Lösung vorgelegt und mit Stickstoff entgast. Zur Eisen-III-Lösung werden 648 mg Eisen-II-chlorid-tetrahydrat gegeben und im Stick stoffstrom gelöst. Die Polymer-Lösung wird auf ca. 75°C erwärmt und die Eisenlösung zugegeben (unter Stickstoff begasung). Das Reaktionsgemisch wird in der Wärme unter guter Durchmischung durch schnelles Einleiten von Ammoniak aus einer Gasflasche alkalisch gestellt. Anschließend wird die Reaktionslösung etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Anschließend wird noch für ca. 10 Minuten am offenen Kolben erhitzt, um den nicht umgesetzten Ammoniak auszutreiben. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 7 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und ggf. neutralisiert und nach der Konzentrationsbestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 µm filtriert. Die Lösung kann in einem Autoklaven mit gespanntem Wasserdampf (Verfahren A121) sterilisiert werden.

Tabelle 5

Analytische Daten

Anmerkung 1-3: Bestimmung der Bluthalbwertszeit Bluteliminationshalbwertszeit

In Ethernarkose wird in die arteria carotis communis der Versuchstiere (Ratte, ca. 200 g) ein 50,5 cm langer mit heparinisierter Kochsalzlösung (0,2 ml) gefüllter Katheter implantiert und etwa 1,5 cm zum Herzen vorgeschoben. Das frei bewegliche Ende des Katheters wurde nach außen geführt und mit Histoacryl fixiert. Etwa eine Stunde nach Operationsende wird die Prüfsub stanz i.v. über die Schwanzvene (ca. 1 ml/min) appliziert. Die Blutentnahmen erfolgten zu verschiedenen Zeitpunkten entsprechend den erwarteten Eliminations geschwindigkeiten der Probesubstanzen am wachen Tier.

Nach Ende des Versuchs wurden die Tiere unter Ether narkose durch Entbluten aus der vena cava getötet.

Halbwertszeit des T₁- und T₂-Effektes

Die Blutproben werden für 15 min bei 2900 rpm (1000 g) zentrifugiert und dann werden aus dem Überstand 0,250 ml abgenommen und mit bidest. Wasser auf 2,0 ml aufgefüllt und das Gemisch dann auf 40°C temperiert.

Die "Konzentrationsbestimmung" erfolgt über die Messung der T_1,2-Relaxationszeiten mit dem Relaxometer pc120 (Bruker, Deutschland). Die Messung wurde mit einer 180°- 90°-IR-(Inversion Recovery)-Sequenz (T₁) bzw. mit einer CPMG-Sequenz (T2) durchgeführt.

Die Auswertung wurde mit einem pharmakokinetischen Zwei- Kompartiment-Modell vorgenommen und die Berechnung der Daten erfolgte mit Hilfe des Pharmakokinetik Computer programms TOPFIT, indem die Konzentrationen, ausgedrückt als reziproke T_1,2-Zeiten (Relaxationsraten) abzüglich Leerwert, über der Zeit aufgetragen wurden. TOPFIT errechnet durch lineare Regression aus der halblogarith mischen "Konzentrations"-Zeit-Darstellung die Steigung der Geraden und daraus die Effekt-Halbwertszeiten.

Halbwertszeit über den Eisengehalt

Von den Lösungen zur Relaxationszeitbestimmung wurden 800 µl abpipettiert, mit konzentrierter Salpetersäure aufgelöst, ad 10,0 ml mit bidest. Wasser aufgefüllt und anschließend der Eisengehalt mit Atomemissionsspektro skopie (AES) quantifiziert. Unter Berücksichtigung der Verdünnungsfaktoren erfolgt dann die Umrechnung in Blutkonzentrationen und die Auswertung über ein Konzentrations-Zeit-Diagramm mit TOPFIT.

B2 Herstellung aus P-CDx mit NaOH und Fe-III-citrat und Fe-II-gluconat

5,0 g Poly-Carboxydextran (Beispiel A2) mit einem Molekulargewicht von ca. 12000 Da werden in 17,5 ml Aqua bidest. gelöst. Die Lösung wird durch Einblasen von Stickstoff entgast. In einem Reagenzglas werden 6,7 ml 1 molare Eisen-III-citrat-monohydrat-Lösung vorgelegt und mit Stickstoff entgast. Zur Eisen-III-Lösung werden 1,635 g Eisen-II-gluconat-trihydrat gegeben und im Stick stoffstrom gelöst. Die Polymer-Lösung wird auf ca. 75°C erwärmt und die Eisenlösung zugegeben (unter Stickstoff begasung) . Das Reaktionsgemisch wird in der Wärme unter guter Durchmischung innerhalb von 30 Sekunden mit ca. 12 ml 3 N Natronlauge versetzt. Anschließend wird die Reaktionslösung mit ca. 6 N Salzsäure neutralisiert und etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 7 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und nach der Konzentrations bestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 µm filtriert. Die Lösung kann in einem Autoklaven (Verfahren A121) sterilisiert werden.

Tabelle 6

Analytische Daten

B3 Herstellung aus CDx mit Fe-III-NTA und Ammoniumhydroxid

5,0 g (Mono-)Carboxydextran (CDx, Beispiel AI) mit einem Molekulargewicht von ca. 2000 Da werden in 35 ml Aqua bidest. gelöst. Die Lösung wird durch Einblasen von Stickstoff entgast. Das Reaktionsgemisch wird erwärmt und unter guter Durchmischung mit konzentrierter Ammonium hydroxid-Lösung (32%) versetzt, bis ein pH-Wert von 10 erreicht ist. In einem Reagenzglas werden 6,85 ml 1 molare Eisen-III-Lösung vorgelegt, mit der äquimolaren Menge NTA versetzt und mit Stickstoff entgast. Zur Eisen-III-Lösung werden 667 mg Eisen-II-chlorid-tetrahydrat gegeben und im Stickstoffstrom gelöst. Die Eisenlösung wird innerhalb von 20 Sekunden zur alkalischen Polymer- Lösung gegeben. Anschließend wird die Reaktionslösung mit ca. 6 N Salzsäure neutralisiert und etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 6 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und nach der Konzentrationsbestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 µm filtriert. Die Lösung kann im Autoklaven sterilisiert werden

Tabelle 7

Analytische Daten

B4 Herstellung aus P-CDx mit Eisen-III und Reduktionsmittel, Natronlauge

5,0 g Poly-Carboxydextran (Beispiel A2) mit einem Molekulargewicht von ca. 12000 Da werden in 17,5 ml Aqua bidest. gelöst. Die Lösung wird durch Einblasen von Stickstoff entgast. Zur Polymer-Lösung werden 10 ml 1 molare Eisen-III-chlorid-hexahydrat-Lösung gegeben und weiter mit Stickstoff entgast. Die Polymer-Lösung wird auf ca. 75°C erwärmt und dann werden 113,6 mg Hydroxylamin-HCl zugegeben (unter Stickstoffbegasung). Das Reaktionsgemisch wird in der Wärme unter guter Durchmischung innerhalb von 30 Sekunden mit ca. 12 ml 3 N Natronlauge versetzt. Anschließend wird die Reaktions lösung mit ca. 6 N Salzsäure neutralisiert und etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 7 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und nach der Konzentrations bestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 µm filtriert. Die Lösung kann im Autoklaven sterilisiert werden (Verfahren A121).

Tabelle 8

Analytische Daten

B5 Herstellung mit einer Mischung aus Dextran 4 und Dextran 15

5,0 g einer 1 : 1 Mischung von Dextran 4 und Dextran 15 mit einem Molekulargewicht von ca. 4000-6000 Da bzw. 15000-20000 werden in 20 ml Aqua bidest. gelöst. Die farblose Polymerlösung wird mit 3 N Natronlauge auf einen pH-Wert von ca. 12 eingestellt und für 1 Stunde am Rückfluß gekocht und dann mit ca. 6 N HCl neutralisiert. Die dunkelrot-braune Lösung wird durch Einblasen von Stick stoff entgast. In einem Reagenzglas werden 6,7 ml 1 molare Eisen-III-chlorid-hexahydrat-Lösung vorgelegt und mit Stickstoff entgast. Zur Eisen-III-Lösung werden 648 mg Eisen-II-chlorid-tetrahydrat gegeben und im Stick stoffstrom gelöst. Die Polymer-Lösung wird auf ca. 75°C erwärmt und die Eisenlösung zugegeben (unter Stickstoff begasung) . Das Reaktionsgemisch wird in der Wärme unter guter Durchmischung innerhalb von 30 Sekunden mit ca. 11,5 ml 3 N Natronlauge versetzt. Anschließend wird die Reaktionslösung mit ca. 6 N Salzsäure neutralisiert und etwa 1 Stunde unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach dem Abkühlen wird für 30 min bei 2500 g zentrifugiert und das Filtrat am Rotationsverdampfer auf etwa 8 ml eingeengt, der pH-Wert kontrolliert und nach der Konzentrations bestimmung mit Aqua bidest. auf eine etwa 1 molare Eisenkonzentration eingestellt sowie anschließend 0,22 µm filtriert. Die Lösung kann im Autoklaven nach dem Verfahren A121 sterilisiert werden.

Tabelle 9

Analytische Daten

C: Herstellung der Grundsubstanzen C1 Dialyse gegen Wasser

5 ml der Lösung nach Beispiel B1 werden in einen Visking Dialyseschlauch gefüllt und unter Rühren 5mal für jeweils 6 h gegen 1 l frisches Aqua bidest dialysiert. Das Retentat wird durch Verdünnen mit Aqua bidest auf eine Eisenkonzentration von 200 mMol/l eingestellt und anschließend durch sterile 0,22 µm Filter (Cellulose acetat) in Portionen à 5 ml in sterile 10 ml Vials abgefüllt. Die desorbierte Lösung kann im Autoklaven sterilisiert werden.

C2 Dialyse gegen 20 mMol Natriumlactat

5 ml der Lösung nach Beispiel B1 werden in einen Visking Dialyseschlauch gefüllt und unter Rühren 5 mal für jeweils 6 h gegen 1 l frische Natriumlactat-Lösung (20 mMol/l, pH 7) dialysiert. Anschließend wird noch 2 mal für 5 h gegen jeweils 1 l frisches Aqua bidest. dialy siert. Das Retentat wird durch Verdünnen mit Aqua bidest auf eine Eisenkonzentration von 200 mMol/l eingestellt und anschließend durch sterile 0,22 µm Filter (Cellulose acetat) in Portionen à 5 ml in sterile 10 ml Vials abgefüllt.

C3 Ultrafiltration mit Amicon

Jeweils 5 ml der Lösung nach Beispiel B1 werden in präparative Ultrafiltrationseinheiten pipettiert und mit Aqua bidest auf 15 ml aufgefüllt (Centriprep 100, Cut off 100 kDa) und für 1 h bei 1000 g ultrafiltriert. Anschließend wird das Filtrat verworfen und der Retentatbehälter wieder bis zur 15 ml Marke mit frischem Aqua bidest. aufgefüllt und erneut ultrafiltriert. Das Retentat wird durch Verdünnen mit Aqua bidest auf eine Eisenkonzentration von 200 mMol/l eingestellt und anschließend durch sterile 0,22 µm Filter (Cellulose acetat) in Portionen à 5 ml in sterile 10 ml Vials abgefüllt.

C4 Chromatographische Trennung

5 ml der Lösung nach Beispiel B1 werden mit einem 10 ml Superloop auf eine S400HR Sephacryl-Säule (100 × 5 cm) gegeben und mit 50 mM Zitronensäure/250 mM Mannit mit einem Flow von 300 ml/Stunde eluiert. Die Fraktion von 450 ml bis 840 ml wird gesammelt und im Rotations verdampfer bei 60°C im Vakuum auf ca. 50 ml aufkon zentriert. Das Konzentrat wird 3 mal für 6 Stunden gegen bidest. Wasser dialysiert, erneut am Rotationsverdampfer aufkonzentriert und nach der Eisenbestimmung auf eine Konzentration von 200 mMol Eisen/l eingestellt. Die Lösung wird durch 0,22 µm Celluloseacetat Filter filtriert und in Portionen à 5 ml in sterilisierte 10 ml Vials abgefüllt. Die Lösungen können im Autoklaven sterilisiert werden.

Tabelle 10

Analytische Daten zu den Grundbausteinen nach Beispiel C1-C4

Die physiko-chemischen Daten zu den magnetischen Eigenschaften und zu den Größenparametern entsprechen den Werten der Ausgangsverbindung (Beispiel B1).

D: Applikationslösungen D1 Dextran T10

5,0 ml Lösung nach Beispiel C1 mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/l (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml 35585 00070 552 001000280000000200012000285913547400040 0002004428851 00004 35466 Vial vorgelegt. 33,6 mg Dextran T10 als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 µm) unter aseptischen Bedingungen 5,0 ml zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 1 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 28 mg). Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die direkt zur Anwendung für die intravenöse MR- Lymphographie geeignet ist.

D2 Dextran FP1 Herstellung aus 2 Lösungen

5,0 ml Lösung nach Beispiel C1 mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/l (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 302,4 mg Dextran FP1 als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 µm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 5 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 252 mg). Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die direkt zur Anwendung für die intravenöse MR- Lymphographie geeignet ist.

D3 Dextran FP1 als Lyophilisat

5,0 ml Lösung nach Beispiel C1 mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/l (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 302,4 mg Dextran FP1 als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 µm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 5 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 252 mg). Die Lösung wird in der Injektionsflasche lyophilisiert und dann verschlossen.

Die Zubereitung der Applikationslösung erfolgt durch Zugabe von 10 ml physiologischer Kochsalzlösung; die Flasche enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die zur Anwendung für die intravenöse MR-Lymphographie geeignet ist.

D4 Dextran FP1

252 mg Dextran FP1 als Targetpolymer werden in eine 5 ml Injektionsflasche eingewogen und mit 5,0 ml Lösung nach Beispiel 01 mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/l (entsprechend 56 mg Gesamteisen) aufgefüllt und die Flasche dann verschlossen. Durch Drehen der Injektions flasche wird das Dextran FP1 gelöst. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 5 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 252 mg).

Die Zubereitung enthält jetzt 5 ml 200 mmolare (Eisen) Lösung, die direkt zur Anwendung für die intravenöse MR- Lymphographie geeignet ist.

D5 Laminarin

5,0 ml Lösung nach Beispiel C1 mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/l (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 33,6 mg Laminarin als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 µm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 1 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 28 mg). Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die direkt zur Anwendung für die intravenöse MR- Lymphographie geeignet ist.

D6 mit Transferrin

5,0 ml Lösung nach Beispiel Cl mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/l (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 33,6 mg humanes Fe₂- Transferrin als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 µm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid-Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 1 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 28 mg).
Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die zur Anwendung als spezifisches Kontrastmittel für die Darstellung proliferierender Zellen (Tumore) geeignet ist.

D7 Mit Endothelin-Agonist

5,0 ml Lösung nach Beispiel C1 mit einer Konzentration von 200 mMol Fe/l (entsprechend 56 mg Gesamteisen) werden in ein 10 ml Vial vorgelegt. 33,6 mg eines Endothelin- Rezeptor spezifischen Heptapeptids [Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp] als Targetpolymer werden in 6,0 ml Aqua bidest gelöst und 5,0 ml über eine Spritze mit Filtervorsatz (0,22 µm) unter aseptischen Bedingungen zu der Eisenoxid- Lösung gegeben. Der Gewichtsquotient Polymer zu Eisen ist 1 (Rest Synthesepolymer = 28 mg + Targetpolymer = 28 mg).
Die Zubereitung enthält jetzt 10 ml 100 mmolare (Eisen) Lösung, die zur Anwendung für das intravenöse MR-Plaque- Imaging (Atherosklerose-Imaging) geeignet ist.

E: Anwendungen Anwendungsbeispiel E1 MR-Lymphographie an der Ratte

Ziel: Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen zwischen der Ausgangsverbindung (Synthesepolymer = Targetpolymer) und einer nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren hergestellten Modifikation (Synthesepolymer ≠ Target polymer) am Tiermodell Ratte.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D5); Vergleich = Grundbaustein nach Beispiel C1
(= D5 ohne Targetpolymer)
Tiere: Ratte, SPF -Man Wistar; ca. 150 g
Dosierung: 100 µMol Fe/kg Körpergewicht (KGW)
Zeiten: 24 h p. i. (post injectionem)
MR-Methode:
Gerät: Siemens Magnetom 1,5 T MR Ganzkörpertomograph mit Extremitätenspule
MR-Parameter: Field of View (FOV) = 150 mm, Matrix = 256×256; Slice = 3 mm
Schichtorientierung = frontal
Sequenz 1: Protonendichte-betonte Spin-Echo Sequenz
(SE) mit TR = 2000 ms und TE = 15 ms
Sequenz 2: T2-gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz
(GE) mit TR = 135 ms und TE = 15 ms; FA = 150

Ex-vivo-Modell Lymphknotenanreicherung an Ratten und Kaninchen

Zur Untersuchung der Anreicherung und Verteilung der Substanzen in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen wurde ein Ex-vivo-Agar- Phantom verwendet. Dieses Ex-vivo-Modell hat den Vorteil auch bei kleinen Versuchstieren (Maus, Ratte, Kaninchen) die Akkumulation in verschiedenen zentralen und peripheren Lymphknoten(gruppen) bewerten zu können und ermöglicht damit auch Aussagen zur Homogenität der Verteilung; eine Quantifizierung der Signalbeeinflussung ist möglich.

Den Versuchstieren (Maus, Ratte oder Kaninchen) wird die Lösung der Nanopartikel über die Schwanzvene injiziert (Bolus). Nach 24 Stunden werden die Tiere getötet und verschiedene Lymphknoten bzw. Lymphknotengruppen präpariert (Lnn. popliteales, Lnn. mandibulares, Lnn. iliacales, Lnn. axillares, Lnn. mandibulares, Lnn. inguinales). Die Lymphknoten werden anschließend in ein Agar-Phantom eingegossen und bis zur MR-Messung im Kühlschrank verwahrt (max. 24 Stunden).

Herstellung des Ex-vivo Agarose-Phantoms

Zur Herstellung des Phantoms werden 10 g Agar-Agar für die Mikrobiologie in 500 ml bidestilliertem Wasser, dem 0,5 ml Magnevist (0,5 Mol/l Gadolinium-DTPA-dimeglumin) für einen Signal-homogenen Hintergrund in der MR-Aufnahme zugesetzt sind, suspendiert. Die Suspension wird aufgekocht und dann auf ca. 80°C abgekühlt und bei dieser Temperatur gehalten. Etwa die Hälfte der Agar- Lösung wird zu einer 0,5-1 cm dicken Schicht in eine Plastikschale gegossen. Nach dem Erkalten werden die Organproben auf der Agarschicht angeordnet (entsprechend linker-rechter Körperhälfte bzw. in "physiologischer Reihenfolge" von oben nach unten) und mit wenig Agar- Lösung fixiert (Pasteurpipette). Abschließend wird eine zweite Schicht Agar-Lösung über die Gewebeproben gegossen. Das Phantom wird innerhalb von 24 Stunden gemessen und bis zur Untersuchung im Kühlschrank gelagert.

Zur Kontrolle (Organleerwerte) werden Tiere ohne Injektion von Nanopartikeln mitgeführt und die Gewebe identisch präpariert bzw. ein entsprechendes Phantom angefertigt.

Neben der visuellen Auswertung erfolgt zum einen eine Quantifizierung der relativen Signalreduktion in den einzelnen Geweben über

und zum anderen werden die Gewebeproben nach der MR- Messung wieder vorsichtig aus dem Agar-Phantom herausgelöst, in konzentrierter Salpetersäure zersetzt und dann mit ICP-AES (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy) der Eisengehalt quantifiziert. An adäquat behandelten Kontrolltieren ohne Applikation von Nanopartikeln wurden die Leerwerte ermittelt und bei der Eisen-Bestimmung der Proben berücksichtigt.

Ergebnis

Abb. 5: MR-Aufnahmen von in Agarose eingebetteten Ratten lymphknoten; Resektion 24 h nach Applikation von der Vergleichssubstanz (Beispiel C2, links) bzw. der modifizierten Substanz nach Beispiel D2 (rechts); Dosis jeweils 100 µmol Fe/kg.

Abb. 6: Modifizierte Charge vs Originalsubstanz: Quantitative Auswertung (aus Abb. 5) der relativen Signalinten sitäten für SE 2000/15 in verschieden Lymphknoten der Ratte 24 h nach Magnetit-Applikation (100 µmol Fe/kg).

Abb. 7: Modifizierte charge vs Originalsubstanz: Quantitative Auswertung (aus Abb. 5) der relativen Signalinten sitäten GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Magnetit-Applikation (100 µmol Fe/kg).

Die Auswertung über die Beeinflussung der relativen lymphonodalen Signalintensität (Abb. 6 = SE; Abb. 7 = GE) der spezifischen Nanopartikel bzw. der Ausgangssubstanz demonstriert eindrucksvoll die homogenere Anreicherung der modifizierten Substanz in den Lymphknoten. Die lymphonodale Signalreduktion von mandibularen, axillären, iliakalen, poplitealen Lymphknoten sowie der mittleren Anreicherung über alle Lymphknoten-Gruppen durch die mit Dextran FP1 als Sekundärcoat modifizierte Charge unter scheidet sich signifikant (t-Test, p < 0,05) von der unmodifizierten Ausgangsverbindung (Abb. 6 und 7). Die Überlegenheit der spezifischen Nanopartikel wird schon durch die optische Beurteilung der "Schwärzung" der einzelnen Lymphknoten in der Abb. 5 eindrucksvoll gezeigt. Besonders bemerkenswert ist die Homogenität der Verteilung über alle untersuchten Lymphknoten.

Anwendungsbeispiel E2 MR-Lymphographie am Kaninchen

Ziel: Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen zwischen der Ausgangsverbindung (Synthesepolymer = Targetpolymer) und einer nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren hergestellten Modifikation (Synthesepolymer ≠ Target polymer) am Tiermodell Kaninchen.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2); Vergleich = Grundbaustein nach Beispiel C2
(= D2 ohne Targetpolymer)
Tiere: Neuseeländer, ca. 3 kg
Dosierung: 150 µMol Fe/kg Körpergewicht (KGW)
Zeiten: 24 h p. i. (post injectionem)
MR-Methode: MR-Tomographie in SE und GE-Technik
(s. Anwendungsbeispiel E1)
In-vivo-Modell: Kaninchen mit stimulierten Lymphknoten

Lymphknotenstimulation mit Eigelb

Die Kaninchen wurden etwa eine Woche vor der Applikation der Prüfsubstanzen vorbehandelt. Zur Induktion einer reaktiven Hyperplasie (Lymphknotenvergrößerung) wurde den Versuchstieren 3 × im Abstand von 2 Tagen je 0,5 ml einer sterilen Eigelbsuspension (Oxoid) i.m. in den Oberschenkel und s.c. in die Flanke injiziert.

Ex-vivo-Modell: Agarose-Phantom
(s. Anwendungsbeispiel E1)

Ergebnis

Abb. 8: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der Protonen-Dichte gewichteten Spin-Echo-Sequenz (SE 2000/15). (links: prae-Kontrast; rechts: spezifische Substanz D2 (150 µmol Fe/kg)).

Abb. 9: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der Protonen-Dichte gewichteten Spin-Echo-Sequenz (SE 2000/15). (links: prae-Kontrast; rechts: Ausgangsverbindung C2 (150 µmol Fe/kg)).

Abb. 10: Spezifische Nanopartikel vs unspezifische Ausgangspartikel: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschieden Lymphknoten des Kaninchens 24 h p.i. (150 mmol Fe/kg, n=3). (Quantitative Auswertung nach Abb. 8 und 9).

Abb. 11: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der T2*-gewichteten Gradienten-Echo-Sequenz (GE 135/15/15°) (links: prae-Kontrast; rechts: spezifische Substanz D2 (150 µmol Fe/kg)).

Abb. 12: Frontale prae- und post-Kontrast MR-Aufnahmen der Beckenregion des Kaninchens in der T2*-gewichteten Gradienten-Echo-Sequenz (GE 135/15/15°) (links: prae-Kontrast; rechts: Ausgangsverbindung C2 (150 µmol Fe/kg)).

Abb. 13: Spezifische Nanopartikel vs unspezifische Ausgangs partikel: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschieden Lymphknoten des Kaninchens 24 h p.i. (150 µmol Fe/kg, n=3) (Quantitative Auswertung der Abb. 11 und 12).

Abb. 14: Ex vivo MR-Aufnahmen (GE-Sequenz) von Agarose-eingebetteten Lymphknoten des Kaninchens; Dosis - 150 µmol Fe/kg; links: unspezifische Vergleichspartikel; rechts: spezifische Nanopartikel.

Abb. 15: Spezifische Nanopartikel vs unspezifische Ausgangspartikel: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschieden Lymphknoten des Kaninchens 24 h p.i. (150 µmol Fe/kg, n=3).

Die Auswertung der Beeinflussung der relativen lymphonodalen Signalintensität (Abb. 8, 9 = SE; Abb. 11, 12 = GE) durch die spezifischen Nanopartikel bzw. die Ausgangspartikel demonstriert die homogenere Signalreduktion der Lymphknoten durch die modifizierte Substanz. Die lymphonodale Signalreduktion (GE-Sequenz) in den von subiliacalen, iliakalen und poplitealen Lymphknoten sowie die mittlere Anreicherung über alle Lymphknoten-Gruppen durch die FP1-modifizierten Nanopartikel unterscheidet sich signifikant (gepaarter t-Test, p < 0,05) von den unmodifizierten Vergleichspartikeln (Abb. 13). Die homogenere interlymphonodale Signalbeeinflussung (Abb. 15) der spezifischen Partikel ist auch deutlich in den MR-tomographischen Aufnahmen der Agarose-eingebetteten Lymphknoten zu erkennen (Abb. 14); hier zeigt die Vergleichssubstanz, wie auch bei der Ratte beobachtet, eine starke, aber auf die mesenterialen Lymphknoten beschränkte Signalreduktion.

Anwendungsbeispiel E3 Dosisabhängigkeit der Lymphknotenanreicherung an der Ratte

Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen zwischen der Ausgangsverbindung (Synthesepolymer = Targetpolymer) und einer nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren hergestellten Modifikation (Synthesepolymer ≠ Targetpolymer) in Abhängigkeit der applizierten Dosis.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2); Vergleich = Grundbaustein nach Beispiel C2 (= D2 ohne Targetpolymer)
Tiere: s. Anwendungsbeispiel E1
Dosierung: 50-200 µMol Fe/kg Körpergewicht (KGW) (n=3 /Dosis)
Zeiten: 24 h p. i. (post injectionem)
Methode: MR-Tomographie in SE und GE-Technik (s. Anwendungsbeispiel E1)
Ex-vivo-Modell: Agarose-Phantom (s. Anwendungsbeispiel E1)

Ergebnis

Abb. 16: Spezifische Nanopartikel nach Beispiel D2 vs unspezifische Partikel nach Beispiel C2: Relative Signalintensitäten in Abhängigkeit der applizierten Dosis für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Applikation der Partikel.

Abb. 17: Spezifische Nanopartikel nach Beispiel D2 vs unspezifische Partikel nach Beispiel C2: Relative Signalintensitäten in Abhängigkeit der applizierten Dosis für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte 24 h nach Applikation der Partikel.

In allen Lymphknotengruppen mit Ausnahme der mesenterialen und inguinalen Lymphknoten zeigt sich eine signifikant (p < 0,05) bessere Signalreduktion durch die nach Beispiel D2 modifizierte Ausgangsverbindung schon bei halb so hoher Dosierung (200 µmol Fe/kg (C2) vs 100 µmol Fe/kg (D2)). Diese deutlichen Unterschiede zeigen sich auch, wenn man die mittlere Signalbeeinflussung über alle Lymphknotenstationen betrachtet (s. Tab 11).

Tabelle 11

Mittlere relative Signalintensitäten und Standardabweichung über alle Lymphknotenstationen in Abhängigkeit der applizierten Substanz und Dosis

Anwendungsbeispiel E4 Zeitabhängigkeit der Lymphknotenanreicherung

Ziel: Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen zwischen der Ausgangsverbindung (Synthesepolymer = Targetpolymer) und einer nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren hergestellten Modifikation (Synthesepolymer ≠ Targetpolymer) in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2); Vergleich = Grundbaustein nach Beispiel C2 (= D2 ohne Targetpolymer)
Tiere: Ratte; (s. Anwendungsbeispiel E1)
Dosierung: 200 µMol Fe/kg Körpergewicht (KGW) (n=3/Zeitpunkt)
Zeiten: 4-168 h p. i. (post injectionem)
Methode: MR-Tomographie in SE und GE-Technik (s. Anwendungsbeispiel E1)
Ex-vivo-Modell: Agarose-Phantom (s. Anwendungsbeispiel E1)

Ergebnis

Abb. 18: Vergleichssubstanz nach Beispiel C2: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation.

Abb. 19: Spezifische Nanopartikel nach Beispiel D2: Relative Signalintensitäten für SE 2000/15 in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation.

Abb. 20: Vergleichssubstanz nach Beispiel C2: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation.

Abb. 21: Spezifische Nanopartikel nach Beispiel D2: Relative Signalintensitäten für GE 135/15/15° in verschiedenen Lymphknoten der Ratte in Abhängigkeit der Zeit nach Applikation.

Die zeitabhängigen MR-tomographischen Untersuchungen zur lymphonodalen Signalreduktion nach intravenöser Applikation der Substanzen zeigen deutlich, daß auch zeitabhängig die nicht-spezifische Ausgangssubstanz eine schlechtere Signalreduktion in den Lymphknoten verursacht als die spezifische Modifikation nach Beispiel D2.

Anwendungsbeispiel ES Kombination mit physiotherapeutischen Maßnahmen am Beispiel Temperatur

Ziel: Vergleich der relativen Signalintensität in verschiedenen Lymphknoten/Lymphknotengruppen in Abhängigkeit von der durch ein Wärmebad regulierten peripheren Körpertemperatur.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2);
Dosierung: 100 µMol Fe/kg Körpergewicht (KGW) (n=7
/Gruppe)
Zeiten: 24 h p. i. (post injectionem)
Methode: MR-Tomographie in GE-Technik (s. Anwendungsbeispiel E1)
Hyperthermie-Modell:

Applikation von Wärme

Um den Einfluß von Wärme auf die Anreicherung des Kontrastmittels in verschiedenen Lymphknotengruppen zu untersuchen, wurden Ratten für 3-4 h in Narkose gelegt, um sie dann für 2 h in ein Wasserbad zu legen. In diesem Wasserbad lagen die Ratten mit der linken Körperseite auf einer Wärmeplatte und mit der rechten Körperseite auf einer gleich hohen isolierenden Kunststoffplatte, die nicht erwärmt wurde. Dadurch entstand eine Temperaturdifferenz zwischen der Wassertemperatur auf der linken Körperseite und der Wassertemperatur auf der rechten Körperseite. Die Wassertemperatur unter der linken Schulter der Ratten betrug anfangs 41,0-41,5°C und nach 30 min pendelte sich die Temperatur auf den konstanten Wert von 41,5-42,0°C ein. Unter der rechten Schulter betrug die Wassertemperatur anfangs 37,0-37,5°C und nach 30 min. wurde die dann konstant bleibende Temperatur von 37,5-38,0°C erreicht. Nachdem die Ratten 30 min. im Wasserbad lagen, bekamen sie die Nanopartikel in einer Dosis von 100 µmol Fe/kg KGW intravenös als Bolus injiziert. Nach weiteren 1,5 h im Wasserbad bei konstanten Temperaturen wurden die Ratten wieder in den Käfig zurückgelegt und 24 h post injektionem die Lymphknoten präpariert und MR-tomographisch untersucht.

Ergebnis

Abb. 22: Beeinflussung der Lymphknotenanreicherung durch gezielte Applikation von Wärme. In der linken prä- Kontrast Aufnahme sind die poplitealen Lymphknoten nur als helle Flecken zu erahnen. In der rechten Abbildung ist der Einfluß der Wärmebehandlung eindrucksvoll demonstriert. Die linke Seite der narkotiserten Ratte lag auf einer isolierenden Kunststoffplatte und hatte die normale Körpertemperatur während die rechte Seite in einem Wasserbad auf 41,5-42,0°C erwärmt wurde. Die "kalte" Seite zeigt praktisch keine Anreicherung während die erwärmte Seite eine hohe und homogene intralymphonodale Akkumulation der Nanopartikel aufweist (Nanopartikel nach Beispiel D 2; 100 µMol/kg KGW; 24 h p. i.; GE 135/15/15).

Die In-vivo-Aufnahme (Abb. 22) demonstriert eindrucksvoll die Effekte der Wärmebehandlung. Während die kalte, nicht erwärmte, linke Seite der Ratte keine erkennbare Anreicherung in den poplitealen Lymphknoten zeigt, hat die erwärmte rechte Seite eine hohe und homogene Signalauslöschung (Anreicherung) in den beobachteten Lnn. popliteales.

Um die Effekte der Erwärmung besonders deutlich zeigen zu können, wurden die Ratten narkotisiert in das Wärmebad gelegt. Die Narkose führt zu einem Stillstand der peripheren Muskelaktivität, einem verminderten Lymphfluß und herabgesetzter Gefäßpermeabilität mit der Folge, daß sich ohne Erwärmung praktisch keine Anreicherung der Nanopartikel nachweisen läßt.

Anwendungsbeispiel E6 MR-Angiographie

Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2)
Tiere: Ratte (s. Anwendungsbeispiel E1)
Dosis: 20 µmol Fe / kg i. v.
Zeitpunkt 0-2 h p. i . .
MR-Technik:
Gerät: Siemens Magnetom 1,5 T MR Ganzkörpertomograph mit Extremitätenspule
MR-Parameter: Siemens Magnetom 1.5 T, Extremitätenspule, Dynamik (transversal) mit T1- gewichteter SE Sequenz (TR: 200 ms, TE: 10 ms), FOV 170 mm, Matrix 256×256, SD: 3 mm;
- koronare MIPS von 3D-Flash (TR: 40 (60) ms, TE: 6 ms, FA 60 (40)°) und 3D-FISP-Sequenz (TR: 40 ms, TE: 7 ms, FA 35°) , FOV 240 mm, Matrix 256×256, SD: 17 mm.
MR-Auswertung: Signalintensitäten in benutzerdefinierten Regions of Interest von Gefäßen (V. cava), Leber, Fett und Muskel. Die Signalintensitäten werden standardisiert auf den Hintergrund kalkuliert.

Ergebnisse

Abb. 23: Transversale Dynamik-Studie des Rattenabdomens mit einer TI-gewichteten SE Sequenz (TR: 200 ms, TE: 10 ms) nach Bolus-Injektion der spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 (Dosis 20 µmol Fe/kg); deutliches Signal-Enhancement (1 min p.i.) in den intrahepatischen Gefäßen und der V. cava).

Abb. 24: Vergleich der relativen Signalintensitäten für SE TR/TE 200 ms/10 ms im venösen Gefäß und dem Leberparenchym für die spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 und die unspezifische Vergleichssubstanz nach Beispiel c2; Dosis 20 µmol Fe/kg;.

Abb. 25: Koronare MIPS (maximum-intensity projections) von 3D- Flash-Aufnahmen (TR: 40 ms, TE: 6 ms, FA 60 0);
Vergleich der spezifischen Nanopartikel nach Beispiel D2 (links) mit der Vergleichssubstanz C2 (rechts) - Dosis jeweils 20 µmol Fe/kg.

Die Abb. 23 und 25 zeigen deutlich die Vorteile der spezifischeren Nanopartikel (nach Beispiel D2) gegenüber der Ausgangssubstanz nach Beispiel C2. Die graphische Zusammenfassung des zeitlichen Signalverlaufs (Abb. 24) in der Vena cava bzw. im Leberparenchym demonstriert die überragenden Eigenschaften der spezifischen Nanopartikel für die Anwendung als Kontrastmittel in der MR-Angiographie. Das Enhancement ist dreifach höher als bei der Kontrollsubstanz und der hellmachende Effekt hält lange an und ist sehr konstant (diagnostisches Fenster < 60 min).

Anwendungsbeispiel E7 Visuelle Darstellung von Lymphknoten an der gesunden Ratte und am tumortragenden Kaninchen

Ziel: Nachweis der Eignung der erfindungsgemäßen Nanopartikel für die Verwendung als visuelle Markersubstanz in der chirurgischen Medizin.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2)
Tiere: Ratte, SPF Han-Wistar; ca. 150 g Russenkaninchen (Chbb: HM, Thomae GmbH) mit implantiertem VX2-Tumor (Tumorbank des Deutschen Krebsforschungszentrums, Heidelberg); ca. 2,6 kg. Der Tumor wurde durch Injektion von 3 · 10⁶ lebenden Tumorzellen in die kaudolaterale Oberschenkelmuskulatur implantiert. Die Aufnahme erfolgt 20 Tage nach der Implantation.
Dosierung: Ratte: intravenöse Injektion von 500 µMol
Fe/kg Körpergewicht
Kaninchen: Interstitielle Applikation von 20 µMol pro Pfote
Zeiten: Ratte: 1, 4 und 24 h p. i. Kaninchen: 12 h p. i.

Ergebnisse

Abb. 26: Erfindungsgemäße Nanopartikel als "intraoperative" Markersubstanzen für die visuelle Detektion von Lymphknoten (Übersichtsaufnahme)

Abb. 27: Erfindungsgemäße Nanopartikel als "intraoperative" Markersubstanzen für die visuelle Detektion von Lymphknoten (Detailansicht).

Abb. 28: Demonstration von Metastasen in Lymphknoten durch visuelle Detektion in metastatischen Lymphknoten am Kaninchen. Die Metastasen sind als helle Aussparungen im ansonsten homogen dunkel gefärbten Lymphknoten erkennbar.

Die Aufnahmen der Ratten (Abb. 26 und 27) zeigen, daß eine Vielzahl unterschiedlichster Lymphknoten-/Lymphknotengruppen durch die einmalige intravenöse Applikation der Lösung der Nanopartikel angefärbt werden kann. Die Lymphknoten heben sich deutlich vom umgebenden Gewebe ab und können so einfach detektiert werden um dann ggf. vom Operateur entfernt zu werden.

Die Untersuchungen am VX2-tumortragenden Kaninchen demonstrieren, daß durch die Anwendung der spezifischen Nanopartikel auch nach interstitieller Applikation die Lymphknoten im Einzugsgebiet homogen angefärbt sind und daß auch kleine Metastasen schon rein visuell als helle Aussparungen im dunkel angefärbten gesunden Lymphknotengewebe abgrenzbar sind (Abb. 28).

Anwendungsbeispiel E8 Zellexperiment zum Nachweis der Spezifität der Nanopartikel

Ziel: Nachweis der spezifischen zellulären Aufnahme (Rezeptor-vermittelte Endozytose) bei Nanopartikeln mit Transferrin als Sekundärcoat (Targetpolymer)
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D6)
Vergleich: Grundsubstanz nach Beispiel C1 (D6 ohne Transferrin)
Konzentration: 0,5 mMol Fe/l Medium
Zeiten: 18 h Inkubation bei 37°C; 5% CO₂-95% Luft
Zellkultur:

Zellaufnahme in humane Myeloma-Zellen

Humane Myeloma-Zellen (ATCC CRL 9068; Zellinie NCI H929) werden in einer Konzentration von mindestens 1 · 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 mit 10% FCS und 0,05 mMol/l 2-Mercaptoethanol in Kultur genommen (37°C, 5% Kohlendioxid; Kulturflaschen 225 cm².

Wenn die Zellen eine Konzentration von ca. 1,5 · 10⁶ Zellen/ml erreicht haben, werden die Zellen zentrifugiert und in frischem Medium resuspendiert.

Die Zellen werden mit den Nanopartikeln in einer Konzentration von 0,5 mMol/l (berechnet als Eisen) für 18 Stunden inkubiert.

Die Zellen werden pelletiert, 2 mal mit PBS gewaschen und dann in einem Aliquot die Zellzahl bestimmt (Neubauer- Zählkammer). Das Zellpellet wird in 500 µl konz. Salpetersäure/ 100 µl Wasserstoffperoxid durch Erhitzen aufgelöst und auf ein Volumen von 5,0 ml aufgefüllt. Anschließend wird mit Atomemissionsspektroskopie (AES, Nachweisgrenze 0,1 ppm) die Eisenkonzentration bestimmt.

Ergebnisse

Abb. 29: Zellaufnahme von spezifischen Nanopartikeln (mit Transferrin) im Vergleich zur unspezifischen Kontrolle (Nanopartikel ohne Transferrin). Die NCI- Zellen (humane Myeloma Zellinie) akkumulieren die spezifischen Partikel mehr als doppelt so stark wie die Kontroll-Partikel.

Die spezifischen Nanopartikel zeigen eine deutlich höhere Aufnahme durch die Myeloma NCI 929 Zellen. Die um über 50% geringere Aufnahme der Nanopartikel ohne Targetpolymer demonstriert die Vorteile der erfindungsgemäßen Ausgestaltung der spezifischen Nanopartikel.

Anwendungsbeispiel E9 Atherosklerose-Imaging am Watanabe-Kaninchen (Plaque- Darstellung)

Ziel: Darstellung von atherosklerotischen Plaques am Kaninchen mit Nanopartikeln, auf die nach dem Desorptions-Adsorptions-Verfahren ein Plaque-affines Peptid (Sekundärcoat, Targetpolymer) aufgebracht wurde.
Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D7)
Tiere: Watanabe-Kaninchen
Dosierung: 200 µMol Fe/kg Körpergewicht (KGW)
Zeiten: 5 h p. i. (post injectionem)
MR-Technik:
Gerät: Siemens Magnetom 1,5 T MR Ganzkörpertomograph mit Extremitätenspule
MR-Parameter: Field of View (FOV) = 150 mm, Matrix = 256×256; Slice = 3 mm Schichtorientierung = frontal
Sequenz 1: Protonendichte-betonte Spin-Echo Sequenz
(SE) mit TR = 2000 ms und TE = 15 ms
Sequenz 2: T2-gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz
(GE) mit TR = 135 ms und TE = 15 ms; FA = 15°
Ex-vivo-Modell: Agarose-Phantom (s. Anwendungsbeispiel E1)

Die Aorta wurde herauspräpariert, vorsichtig aufgeschnitten und dann mit kalter PBS-Lösung gespült, um nicht-gebundene oder aufgenommene Nanopartikel zu entfernen. Anschließend wurde die Aorta in zwei Teile geteilt und im Agarose-Phantom eingegossen und dann MR- tomographisch untersucht.
Histologie: Berliner-Blau Färbung.

Ergebnisse

Abb. 30: Ex vivo MR-tomographische Darstellung atherosklerotischer Plaques der Aorta eines Kaninchens mit der Modifikation D7 (Dosis 200 µmol Fe/kg; Resektion der Aorta 5 h p.i.); links Protonendichte-gewichtete Spin-Echo-Sequenz; rechts T2*-gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz.

Abb. 31: Histologischer Eisen-Nachweis in der atherosklerotischen Membran der Kaninchen-Aorta mit Berliner- Blau-Färbung. Die Gegenüberstellung mit der MR- tomographischen Aufnahme (GE 135/15/15°) zeigt, daß sich das histologisch nachgewiesene Eisen an den Stellen befindet, an denen im Image das Signal infolge der Anreicherung der spezifischen Nanopartikel deutlich reduziert ist. Resektion der Aorta 5 h nach intravenöser Applikation von 200 µmol Fe/kg der spezifischen Partikel nach Beispiel D7.

Abb. 32: Histochemische Detektion (Berliner Blau Färbung) der akkumulierten Nanopartikel nach Beispiel D7 in der Aorta eines Watanabe Kaninchens. Die obere Abbildung zeigt eine Übersicht der präparierten Aorta auf dem Agar und der untere Teil demonstriert die gute Korrelation der Eisenfärbung (blaue Granula) mit den schon visuell erkennbaren Plaques im besonders stark veränderten Aortenbogen.

Die MR-tomographische Aufnahme ("Ex-vivo-Aufnahme") der präparierten Aorta zeigt die Plaques als dunkle Flecken (Signalreduktion). Der histologische Nachweis über die Berliner Blau Färbung (Eisen) zeigt in der Gegenüberstellung mit der MR-tomographischen Aufnahme (GE 135/15/15°), daß sich das histologisch nachgewiesene Eisen an den Stellen befindet, an denen im Image das Signal infolge der Nanopartikel-Anreicherung deutlich reduziert ist. Die Befundung aus der MR-Aufnahme korreliert mit den schon visuell deutlich erkennbaren Plaques. Die größten Plaques befinden sich im Bereich des Aortenbogens und bestätigt sich in der MR-tomographischen Aufnahme und der histologischen Ansicht; auch kleinere Plaques sind sowohl im MR-Bild als auch mit der histologischen Eisenfärbung gut detektierbar.

Anwendungsbeispiel E10 Tumoranreicherung an der tumortragenden Maus

Ziel: Es sollte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Nanopartikel sich in Tumoren anreichern können. Die Untersuchungen sollen zum einen zeigen, daß die Partikel geeignete Arzneistoffträger für Chemotherapeutika darstellen und zum anderen dokumentieren, daß mit Hilfe der Nanopartikel kontrolliert werden kann, ob die Therapeutika ihren gewünschten Wirkort, also den Tumor, überhaupt erreichen können, so daß hier ein Beispiel für die Kombination von Diagnose und Therapie vorliegt.

Substanz: Spezifische Nanopartikel (Beispiel D2);
Tiere: Nacktmaus (Swiss nude) mit implantiertem Tumor (n = 5/Dosis)
(LS 174T, s. c. - Applikation 10 Tage vor Versuchsbeginn)
Narkose: Rompun/Ketavet (1 : 1), ca. 0.5 ml pro kg Körpergewicht i.m.
Dosierung: 200 µMol Fe/kg Körpergewicht (KGW)
Zeiten: 0-120 Minuten und 12 bzw. 24 Stunden nach Applikation.
MR-Methode:
Gerät: Siemens Magnetom 1,5 T MR Ganzkörpertomograph mit Extremitätenspule
MR-Parameter: Field of View (FOV) = 150 mm, Matrix = 256×256; Slice = 3 mm
Schichtorientierung = frontal
Sequenz 1: Protonendichte-betonte Spin-Echo-Sequenz
(SE) mit TR = 2000 ms und TE = 15 ms
Sequenz 2: Dynamische Aufnahmen: SE-Sequenz mit TR/TE = 300 ms/15 ms
MR-Auswertung: Signalintensitäten in benutzerdefinierten Regions of Interest von Tumor, Muskel, Fett und Background. Die relativen Signalintensitäten in den verschiedenen Geweben werden standardisiert auf die Signalintensität im Fett kalkuliert.

Ergebnisse

Abb. 33: Transversale T1-gewichtete Spin-Echo Dynamik-Studie (TR: 300 ms, TE: 15 ms) des tumoralen Signalverhaltens nach Bolusinjektion von Nanopartikeln nach Beispiel D2 (200 µmol Fe/kg). Die Aufnahmen zeigen ein zeitabhängig langsam ansteigendes Signal- Enhancement (Anreicherung) im Tumor mit deutlich zunehmender Abgrenzung der Raumforderung.

Abb. 34: Verlauf der relativen Signalintensität (Anreicherung) im Tumor. Der zeitliche Signalverlauf (Enhancement) für eine Dosis von 200 µMol/kg Kgw verdeutlicht das starke und mit der Zeit zunehmende Enhancement (zunehmende Anreicherung) im Tumor (SE 2000/15).

Abb. 35: Zeitabhängige transversale Protonen-Dichte-gewichtete (SE 2000/15) Aufnahmen nach Applikation der Nanopartikel nach Beispiel D2 (200 µmol Fe/kg).

In der T1-gewichteten und in der Protonen-Dichte-gewichteten Spin-Echo-Sequenz ist eine zunehmende Akkumulation der Nanopartikel im Tumor mit zeitabhängig linear ansteigendem Signalenhancement festzustellen (Abb. 33; 35). Bis 135 min nach Injektion wird ein 35-40%iges Enhancement beobachtet, was eine deutliche Abgrenzung des Tumors vom gesunden Gewebe erlaubt und die Anreicherung der Nanopartikel bestätigt. Im Gegensatz zu den hier gemachten Beobachtungen wurde bei angiographischen Untersuchungen festgestellt, daß ein durch die Perfusion verursachtes Enhancement im Tumor schon nach spätestens 30 min (p.i.) wieder vollständig abgeklungen ist.

Claims

1. Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Eisen enthaltenden Kern, einem Primärcoat (Synthesepolymer) und einem Sekundärcoat (Targetpolymer) sowie gegebenenfalls pharmazeutischen Hilfsstoffen, Pharmaka und/oder Adsorptionsvermittlern bestehen.

2. Nanopartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der hydrodynamische Durchmesser des Grundbausteins aus Eisen enthaltendem Kern und Primärcoat in Lösung kleiner als 100 nm und höchstens fünfmal so groß wie der Durchmesser des Eisen enthaltenden Kerns ist.

3. Nanopartikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Eisen enthaltende Kern Magnetit oder Maghämit ist oder mindestens eine dieser Verbindungen enthält.

4. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu 25 Gew.-% des im Kern enthaltenen Eisens durch andere Metallionen ersetzt sind.

5. Nanopartikel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht-Eisen-Metallionen paramagnetisch, diamagnetisch oder eine Mischung para- und diamagnetischer Metallionen sind.

6. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Eisen enthaltende Kern einen durch Elektronenmikroskopie bestimmten Durchmesser von kleiner als 30 nm aufweist und mindestens 50 Metallatome enthält sowie eine Partikelgrößenverteilung, wobei mindestens 90% der Eisen enthaltenden Kerne im Bereich 0,7·Mittelwert bis 1,3·Mittelwert liegen, aufweist.

7. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Synthesepolymer in einer Menge zwischen dem 0,01fachen und dem 1fachen der Summe der vorhandenen Metallionen enthalten.

8. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Synthesepolymer eine monomere oder polymere Substanz oder ein Gemisch dieser Substanzen oder Derivate, oder Derivate mit funktionellen Gruppen, oder Derivate, die zusätzlich substituiert worden sind, mit einem Molekulargewicht kleiner 100 000 Da, darstellt.

9. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Synthesepolymer ein Dextranderivat oder eine Mischung von Dextran und/oder Dextranderivaten darstellt.

10. Nanopartikel nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Synthesepolymer eine oder mehrere Säuregruppen im Molekül, oder mehrere funktionelle Gruppen, die N, S, P oder O-Atome enthalten, im Molekül aufweist.

11. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Targetpolymer und das Synthesepolymer gleiche oder unterschiedliche Substanzen oder Substanzgemische darstellen.

12. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Targetpolymer in einer Gewichtsmenge zwischen dem 0,5fachen bis 50fachen des Gewichts der vorhandenen Metallionen enthalten.

13. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie Adsorptionsvermittler enthalten, deren Menge kleiner oder gleich der Summe des Gewichtes der enthaltenen Metallionen ist.

14. Nanopartikel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Adsorptionsvermittler Peptide enthalten.

15. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der hydrodynamische Durchmesser aller Bestandteile höchstens zehnmal größer als der Durchmesser des Eisen enthaltenden Kerns und höchstens 20% größer als der Durchmesser des Grundbausteins ist.

16. Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einzelnen Modulen wie Grundbaustein, Targetpolymer, Pharmakon und Adsorptionsvermittler bestehen, die jederzeit kombinierbar sind.

17. Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt ein Eisen enthaltender Kern in Anwesenheit eines Synthesepolymers durch Basenbehandlung hergestellt wird, in einem zweiten Schritt das Verhältnis von Eisen zu Synthesepolymer durch ein Desorptionsverfahren verändert wird und in einem dritten Schritt ein Targetpolymer adsorbiert wird und gegebenenfalls Adsorptionsvermittler, pharmazeutische Hilfsstoffe und/oder Pharmaka zugesetzt werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des Eisen enthaltenden Kerns ein Eisen-II-, Eisen-III-Salz-Gemisch verwendet wird, wobei das Verhältnis von divalentem zu trivalentem Eisen 1 : 1 bis 1 : 20 beträgt.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des Eisen enthaltenden Kerns ein Eisen-III-Salz-Gemisch in Kombination mit einem Reduktionsmittel verwendet wird, wobei die Menge an Reduktionsmittel so gewählt ist, daß das generierte Eisen-II- zu Eisen-III- Verhältnis 1 : 1 bis 1 : 20 beträgt.

20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Eisenverbindungen beliebige Mischungen aus anorganischen und organischen Salzen sowie Komplexen davon darstellen.

21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Eisen enthaltenden Kristalle durch Mischung der zuvor getrennt hergestellten Eisen-II-hydroxid- und Eisen-III-hydroxid-Lösungen hergestellt werden.

22. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu 25 Gew.-% der eingesetzten Metallionen Nicht-Eisen-Ionen sind.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht-Eisen-Metallionen paramagnetisch, diamagnetisch oder eine Mischung para- und diamagnetischer Metallionen sind.

24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß als Synthesepolymer Substanzen oder Kombinationen verschiedener Substanzen verwendet werden, welche die während der Ausfällung entstehenden Kristalle voneinander separieren, wobei die Menge an Synthesepolymer im Reaktionsgemisch, relativ zum Gewicht der enthaltenen Metallionen, 0,5 bis 20fach höher liegt, aber insgesamt weniger als 50% (g/v) im Reaktionsgemisch beträgt.

25. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausfällung der Eisenverbindungen eine 0,1 bis 10 N Base eingesetzt wird, deren Zugabe schnell erfolgt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausfällung der Eisenverbindungen Ammoniak als Gas oder Salz, ein Amin oder ein Aminderivat eingesetzt wird.

27. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese des Grundbausteins in einem Temperaturbereich zwischen 0°-120°C erfolgt.

28. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Eisen zu Synthesepolymer auf ein Gewichtsverhältnis von 1 : 0,01 bis 1 : 1 eingestellt wird.

29. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an zugesetztem Targetpolymer so gewählt ist, daß das Verhältnis der enthaltenen Metallionen zu dem Targetpolymer 1 : 0,5 bis 1 : 50 beträgt.

30. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Nanopartikel als stabile kolloidale Sole oder lyophilisiert vorliegen und mit medizinisch verwendeten Lösungsmitteln wieder in Lösung gebracht werden können oder daß der Grundbaustein, Targetkomponente und gegebenenfalls Zusätze getrennte Lösungen oder Lyophilisate sind, die erst zu einem bestimmten Zeitpunkt zur Applikationslösung zusammengemischt werden.

31. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Module der Nanopartikel jederzeit kombinierbar sind.

32. Verwendung der Nanopartikel als Kontrastmittel in der Diagnostik als visuelle Markersubstanz in der chirurgischen Medizin und/oder als Arzneistoffträger oder Wirkstoff in der Therapie.