DE60008099T2 - Codierung und decodierung von sensor-arrays mittels nanokristalle - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Codierung, Decodierung und Verwendung von Mikrokügelchen-Sensoranordnungen unter Verwendung von Nanokristallen (auf dem Gebiet der Erfindung auch als Quantenpunkte bezeichnet).
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es gibt mehrere Tests und Sensoren zum Nachweis der Gegenwart und/oder der Konzentration von bestimmten Substanzen in Fluiden und Gasen. Viele dieser basieren auf bestimmte Ligand/Antiligand-Reaktionen als Nachweismethode. Das heißt, dass Substanzpaare (d.h. die Bindungspaare oder Liganden/Antiliganden) miteinander Verbindungen eingehen, aber kaum oder gar nicht an andere Substanzen binden. Dies war Kernpunkt mehrerer Verfahren, welche diese Bindungspaare nutzen, um Komplexe nachzuweisen. Im Allgemeinen geschieht dies durch irgendeine Art der Markierung einer Komponente des Komplexes unter Verwendung beispielsweise von Radioisotopen, fluoreszierenden und anderen optisch aktiven Molekülen, Enzymen usw., sodass der gesamte Komplex nachweisbar wird.
  • Besonders nützlich bei Sensoren dieser Art sind Lumineszenz verwendende Nachweismethoden. In jüngster Zeit, insbesondere im letzten Jahrzehnt, erfuhr die Verwendung von optischen Fasern und optischen Fasersträngen in Kombination mit lichtabsorbierenden Farbstoffen für chemisch-analytische Bestimmungen eine sehr rasche Entwicklung. Die Verwendung von optischen Fasern für solche Zwecke und Verfahren wird von Milanovich et al., „Novel Optical Fiber Techniques For Medical Application", Proceedings of the SPIE 28th Annual International Symposium on Optics and Electro-Optics, Band 494 (1980); Seitz, W.R., „Chemical Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics" in C.R.C. Critical Reviews In Analytical Chemistry, Band 19, 135–173 (1988); Wolfbeis, O.S., „Fiber Optical Fluorosensors in Analytical Chemistry" in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Appli cations, S.G. Schulmau (Hrsg.), Wiley & Sons, New York (1988); Angel, S.M., Spectroscopy 2 (4), 38 (1987); Walt et al., „Chemical Sensors and Microinstrumentation", ACS Symposium Series, Band 403, 252 (1989); und Wolfbeis, O.S., Fiber Optic Chemical Sensors, Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, z. Band (1991), beschrieben.
  • Bei der Verwendung einer optischen Faser in einem In-vitro/in-vivo-Sensor werden ein oder mehrere lichtabsorbierende Farbstoffe nahe dem distalen Ende angeordnet. Typischerweise wird Licht aus einer geeigneten Quelle dazu verwendet, die Farbstoffe durch das proximale Ende der Faser zu befeuchten. Das Licht breitet sich entlang der optischen Faser der Länge nach aus, und ein Teil des sich so fortgepflanzten Lichts verlässt das distale Ende und wird von den Farbstoffen absorbiert. Die lichtabsorbierenden Farbstoffe können immobilisiert sein oder auch nicht, sie können direkt an die optische Faser selbst gebunden sein oder nicht, sie können in einer einen oder mehrere Analyten von Interesse enthaltenden Fluidprobe suspendiert sein oder auch nicht, und sie können für eine darauf folgende Verwendung für eine zweite optische Bestimmung herangezogen werden oder auch nicht.
  • Wurde das Licht vom Farbstoff absorbiert, kommt ein Teil des Lichts, dessen Wellenlänge und Intensität variiert, zurück und wird entweder durch die gleichen Faser oder die gleiche(n) Sammelfaser(n) zu einem Detektionssystem weitergeleitet, wo es beobachtet und gemessen wird. Die Wechselwirkungen zwischen dem von der optischen Faser transportierten Licht und den Eigenschaften des lichtabsorbierenden Farbstoffs stellen eine optische Basis für qualitative und quantitative Bestimmungen bereit.
  • Viele der in jüngerer Zeit gemachten Verbesserungen im Bereich der Verwendung von faseroptischen Sensoren für qualitative und quantitative analytische Bestimmungen betreffen das erwünschte Anbringen und/oder Immobilisieren der verschiedenen lichtabsorbierenden Farbstoffe am distalen Ende der optischen Faser. Auf diese Weise wurden zahlreiche verschiedene faseroptische chemische Sensoren und Verfahren für spezifische analytische Bestimmungen und Anwendungen, wie z.B. pH- Messungen, Sauerstoffnachweis und Kohlendioxidanalyse, entwickelt. Diese Entwicklungen sind in den folgenden Publikationen beispielhaft dargestellt: Freeman et al., Anal. Chem. 53, 98 (1983); Lippitsch et al., Anal. Chem. Acta. 205, 1 (1988), Wolfbeis et al., Anal. Chem. 60, 2028 (1988); Jordan et al., Anal. Chem. 59, 437 (1987); Lubbers et al., Sens. Actuators (1983); Munkholm et al., Talanta 35, 109 (1988); Munkholm et al., Anal. Chem. 58, 1427 (1986); Seitz, W.R., Anal. Chem. 56, 16A–34A (1984); Peterson et al., Anal. Chem. 52, 864 (1980); Saari et al., Anal. Chem. 54, 821 (1982); Saari et al., Anal. Chem. 55, 667(1983); Zhujun et al., Anal. Chem. Acta. 160, 47 (1984); Schwab et al., Anal. Chem. 56, 2199 (1984); Wolfbeis, O.S., „Fiber Optic Chemical Sensors", Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, z. Band (1991); und Pantano, P.; Walt, D.R., Anal. Chem, 481A–487A, Band 67 (1995).
  • In jüngster Zeit wurden faseroptische Sensoren hergestellt, welche die Verwendung von multiplen Farbstoffen mit einem einzelnen, diskreten optischen Faserbündel erlauben. Die U.S.-Patente Nr. 5.244.636 und Nr. 5.250.264 an Walt et al. offenbaren Systeme zum Anbringen von multiplen, unterschiedlichen Farbstoffen am distalen Ende des Bündels. Die offenbarten Konfigurationen ermöglichen den einzelnen optischen Fasern des Bündels den optischen Zugang zu einzelnen Farbstoffen. So wird das Problem der Dekonvolution der einzelnen Signale vom zurückkommenden Licht jedes Farbstoffes beseitigt, welches auftritt, wenn die Signale von zwei oder mehreren Farbstoffen, wobei ein jeder Farbstoff für einen anderen Analyten empfindlich ist, kombiniert sind, und es gibt beträchtliche Überlappungen bei den Emissionsspektren der Farbstoffe.
  • U.S.S. Nr. 08/818.199 (Patent Nr. 6.023.540) und Nr. 09/151.877 beschreiben Anordnungszusammensetzungen, welche Mikrokügelchen oder Perlen auf der Oberfläche eines Substrats, beispielsweise an einem Ende eines optischen Faserbündels, verwenden, wobei jede einzelne Faser eine Perle mit optischer Signatur umfasst. Da sich die Perlen zufällig absetzen, bedarf es einer einzigartigen optischen Signatur, um die Zusammensetzung zu „entschlüsseln", d.h. nachdem die Zusammensetzung erstellt worden ist, kann eine Korrelation zwischen einer bestimmten Stelle der An ordnung und der Perle oder dem bioaktiven Mittel an eben dieser Stelle aufgezeigt werden. Dies bedeutet, dass die Perlen zufällig auf der Anordnung verteilt sein können, ein im Vergleich zu der nach dem Stand der Technik bekannten In-situ-Synthese oder Tüpfelverfahren schnelles und kostengünstiges Verfahren. Ist die Anordnung erst mit Perlen beladen, kann die Anordnung decodiert oder mit der gesamten oder partiellen Decodierung, die nach der Untersuchung auftritt, verwendet werden, so wie unten noch detaillierter erklärt wird.
  • All diese oben genannten Systeme weisen unglücklicherweise den Nachteil des Arbeitens mit herkömmlichen Nachweismarkern, typischerweise mit organischen Farbstoffen wie z.B. Rhodamin, auf. Herkömmliche Farbstoffmoleküle verlangen den verwendeten optischen Systemen zwingende Voraussetzungen ab, um diese Messungen durchzuführen; ihr schmales Anregungsspektrum erschwert eine gleichzeitige Anregung in den meisten Fällen, während ihr breites Emissionsspektrum mit einem langen Abfall bei roten Wellenlängen zu einer spektralen Überlagerung zwischen den verschiedenen Detektionskanälen führt, was den mengenmäßigen Nachweis der relativen Mengen verschiedener Sanden schwer macht.
  • Deshalb ist es wünschenswert, Testkomponenten und Verfahren bereitzustellen, welche nachweisbare Marker verwenden, die spektral auflösbare Energien emittieren und über schmale, symmetrische Spektren verfügen und worin ganze Gruppen von nachweisbaren Markern bei einer einzigen Wellenlänge angeregt werden können.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Den oben genannten Zielen gemäß stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, welche ein Substrat mit einer diskrete Stellen umfassenden Oberfläche sowie eine Population von Mikrokügelchen, die auf den Stellen verteilt sind, umfassen. Zumindest eines dieser Mikrokügelchen umfasst einen Nanokristall. Der Nanokristall kann im Mikrokügelchen eingebettet, beispielsweise unter Einsatz des Sol-Gel-Polymerisationsverfahrens, oder an das Mikrokügelchen gebunden sein. Gege benenfalls umfassen die Mikrokügelchen bioaktive Mittel und/oder Identifikator-Bindungsliganden.
  • Einem weiteren Aspekt zufolge umfasst die Population der Mikrokügelchen mindestens eine erste und eine zweite Subpopulation, welche ein erstes bzw. ein zweites bioaktives Mittel umfassen, und eine erste und zweite optische Signatur, die fähig ist, jedes bioaktive Mittel zu identifizieren. Mindestens eine der optischen Signaturen umfasst einen Nanokristall.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen bereit, die das Bilden einer einzelne Stellen auf einem Substrat umfassenden Oberfläche sowie das Verteilen von Mikrokügelchen auf einer Oberfläche, sodass die einzelnen Stellen Mikrokügelchen enthalten, umfassen. Die Mikrokügelchen umfassen eine optische Signatur, und zumindest eine optische Signatur umfasst zumindest einen Nanokristall.
  • In einem zusätzlichen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Zielanalyten in einer Probe bereit, welches das Kontaktieren der Probe mit einer Zusammensetzung umfasst. Die Zusammensetzung umfasst ein Substrat mit einer Oberfläche, welche diskrete Stellen und eine Population von Mikrokügelchen umfasst, die zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation, umfassend ein bioaktives Mittel und eine optische Signatur, welche zur Identifikation des bioaktiven Mittels fähig ist, umfasst. Die Mikrokügelchen sind so auf der Oberfläche verteilt, dass die diskreten Stellen Mikrokügelchen enthalten, und worin zumindest eine der optischen Signaturen zumindest einen Nanokristall umfasst. Dann wird die Gegenwart oder Abwesenheit des Zielanalyten bestimmt.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, welches das Anhaften von Nanokristallen an porösem Siliciumdioxid sowie das dichte Verschließen der Poren des Siliciumdioxids unter Verwendung des Sol-Gel-Polymerisationsverfahrens umfasst.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung ist eine Verbesserung vorangegangener Arbeit, die ein auf Perlen basierendes analytisches Chemiesystem umfasst, in dem Perlen, auch als Mikrokügelchen bezeichnet, mit verschiedenen chemischen Funktionalitäten auf einem eine gemusterte Oberfläche von diskreten Stellen, die die einzelnen Mikrokügelchen binden können, umfassenden Substrat verteilt sind. Im Allgemeinen werden die Perlen zufällig auf dem Substrat verteilt, wodurch verschiedene Methodiken zur „Decodierung" der Anordnungen verwendet werden können. In einer Ausführungsform werden einzigartige optische Signaturen, im Allgemeinen Fluoreszenz-Farbstoffe, die zur Identifikation der chemischen Funktionalität einer jeden Perle herangezogen werden können, in die Perlen inkorporiert. Offenbarungen bezüglich Anordnungen, insbesondere zusammengesetzter Anordnungen und optischer Signaturen, sind unter anderem in U.S.S. Nr. 60/113.968, PCT US99/31022, U.S.S. Nr. 09/256.943, U.S.S. Nr. 09/473.904 und U.S.S. Nr. 09/553.993 beschrieben. Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal eine Verbesserung der vorangegangenen Arbeiten bereit, indem Nanokristalle (auch als „Quantenpunkte" oder „Halbleitercluster" bezeichnet) in zumindest einer Komponente der optischen Signaturen verwendet wird, was unten noch näher beschrieben wird.
  • Im Vergleich zu organischen Farbstoffen, wie z.B. Rhodamin, sind Nanokristalle zumindest 20-mal so hell, zumindest 100-mal so stabil gegenüber Photobleichung und sind, was die Spektrallinienbreite der Emission betrifft, etwa ein Drittel so breit. Siehe beispielsweise Bruchez et al., Science, 281, 2013–2016 (1998); Chan und Nie, Science, 281, 2016–2018 (1998); Bawnedi et al., Annu. Rev. Phys. Chem. 41, 477–496 (1990), sowie darin angegebene Literaturverweise. Die Helligkeit, Stabilität und Schmalheit der Emissionsbandbreite tragen zur Möglichkeit bei, eine relativ große Anzahl an unterschiedlichen Farben (d.h. Nanokristalle von unterschiedlicher Größe), wie unten näher beschrieben wird, zu verwenden, während gleichzeitig die Fähigkeit, sie untereinander aufzulösen sowie verschiedene Mengen eines jeden Nano kristalls aufzulösen, aufrechterhalten bleibt. Zusätzlich ermöglicht das breite Anregungsspektrum ein Anregen vieler verschiedener Nanokristalle durch eine gemeinsame Lichtquelle.
  • Die Verwendung von Anordnungen von Mikrokügelchen erlaubt die Synthese der Kandidat-Mittel (d.h. Verbindungen wie Nucleinsäuren und Antikörper) losgelöst von deren Lage auf der Anordnung, d.h. die Kandidat-Mittel können auf den Perlen synthetisiert werden, und dann werden die Perlen auf der gemusterten Oberfläche zufällig verteilt. Die zufällige Platzierung der Perlen auf der Oberfläche bedeutet, dass die Anordnung „decodiert" werden muss, d.h. nachdem die Anordnung erstellt worden ist, kann eine Korrelation zwischen der Lage einer bestimmten Stelle auf der Anordnung und der Perle oder dem Kandidat-Mittel auf dieser Stelle erstellt werden. Dies bedeutet, dass die Perlen zufällig auf der Anordnung verteilt werden, was ein im Vergleich zu der/den nach dem Stand der Technik bekannten In-situ-Synthese oder Tüpfeltechniken schnelles und kostengünstiges Verfahren ist. Diese Verfahren werden allgemein in PCT US98/05025 und in U.S.S. Nr. 08/818.199 und Nr. 09/151.877 dargelegt. Die Verwendung von Nanokristallen, so wie hierin beschrieben, verbessert die oben beschriebenen Verfahren.
  • Da die Lage der bioaktiven Mittel im Allgemeinen zufällig ist, bedarf es eines Codierungs-/Decodierungssystems, um das bioaktive Mittel an jedem einzelnen Ort der Anordnung zu identifizieren. Dies kann auf verschiedenste Weisen geschehen, wie weiter unten noch beschrieben wird, und umfasst im Allgemeinen: a) die Verwendung von optischen Signaturen, einschließlich Nanokristallen; b) die Verwendung eines Decoder-Bindungsliganden (DBL), der im Allgemeinen direkt markiert ist, der entweder an das bioaktive Mittel oder an die an die Perlen angehafteten Identifikator-Bindungsliganden (IBLs) anbindet; c) Positionsdecodierung, beispielsweise durch Abzielen auf die Lage der Perlen (z.B. mittels Verwendung von photoaktivierbaren oder lichtspaltbaren Gruppierungen, um das selektive Hinzufügen von Perlen an bestimmte Orten zu erlauben), oder durch Verwenden entweder von Subbündeln oder eines selektives Beladens der Stellen, was in Folge noch detaillierter beschrieben wird; d) selektive Decodierung, worin nur jene Perlen decodiert werden, die an einen Zielanalyten binden; oder e) Kombinationen dieser. Wie unten noch detaillierter beschrieben wird, kann es in einigen Fällen zu einer Decodierung für alle Perlen kommen oder nur für jene, die an ein bestimmtes Ziel binden. Gleichermaßen kann dies sowohl vor oder nach dem Zusetzen des Zielanalyten geschehen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet jeder bereitgestellte Test oder jede bereitgestellte Komponente zumindest eine Komponente, die mindestens einen Nanokristall umfasst. Die hierin beschriebenen Nanokristalle können auf zwei allgemeine Weisen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nanokristalle als gesamte oder als Teil der optischen Signatur der Perlen verwendet; das heißt, dass die Perlen mit den Nanokristallen „codiert" werden. Alternativ dazu können die Nanokristalle als Marker bei Tests eingesetzt werden; z.B. kann eine Zielnucleinsäure mit Nanokristallen markiert und zum Nachweis der Zielnucleinsäure verwendet werden. Beide Systeme werden in Folge noch ausführlicher erklärt.
  • Wurde die Identität (d.h. das tatsächliche Mittel) und die Lage eines jeden Mikrokügelchen auf der Anordnung ermittelt, wird die Anordnung gegenüber Proben, die den Zielanalyten enthalten, ausgesetzt, was jedoch, wie weiter unten beschrieben, sowohl vor als auch nach der Analyse durchgeführt werden kann. Die Zielanalyten binden sich an die an die bioaktiven Mittel, was zu einem veränderten optischen Signal einer bestimmten Perle führt. In einer weiteren, ebenfalls in Folge noch ausführlicher beschriebenen Ausführungsform umfasst der Zielanalyt zumindest einen Nanokristall.
  • In der vorliegenden Erfindung können zur „Decodierung" optische Signaturen, Decoder-Bindungsliganden, die während eines Decodierschritts zugesetzt werden, oder eine Kombination dieser Verfahren verwendet werden. Die Decoder-Bindungsliganden binden entweder an einen bestimmten, auf den Perlen befindlichen Identifikator-Bindungsliganden-Partner oder an das bioaktive Mittel selbst, beispielsweise wenn die Perlen einzelsträngige Nucleinsäuren als bioaktive Mittel umfassen. Die Decoder-Bindungsliganden sind entweder direkt oder indirekt markiert, und die Decodierung erfolgt durch den Nachweis der Gegenwart der Markierung. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Markierung zumindest einen Nanokristall. Durch die sequenzielle Verwendung von Decoder-Bindungsliganden-Pools ist es möglich, die Anzahl an erforderlichen Decodierungsschritten deutlich zu verringern.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Anordnungszusammensetzungen bereit, die zumindest ein erstes Substrat mit einer einzelne Stellen umfassenden Oberfläche umfasst. Mit „Anordnung" ist hierin eine Vielzahl an Kandidat-Mitteln im Format einer Anordnung gemeint; die Größe der Anordnung hängt von der Zusammensetzung und der letztendlichen Verwendung der Anordnung ab. Es können Anordnungen mit zwei bis zu vielen Millionen verschiedenen bioaktiven Mitteln (d.h. verschiedenen Perlen) erstellt werden, wobei sehr große faseroptische Anordnungen möglich sind. Im Allgemeinen umfasst die Anordnung zwei bis eine Milliarde oder mehr, wobei dies von der Größe der Perlen und dem Substrat sowie von der letztendlichen Verwendung der Anordnung abhängt, und somit können Anordnungen von sehr hoher Dichte, von hoher Dichte, von mäßiger Dichte, von geringer Dichte und von sehr geringer Dichte erstellt werden. Der bevorzugte Bereich für Anordnungen von sehr hoher Dichte reicht von ca. 10.000.000 bis ca. 2.000.000.000 (wobei alle Zahlen pro Quadratzentimeter zu verstehen sind), bevorzugt von ca. 100.000.000 bis ca. 1.000.000.000. Anordnungen von hoher Dichte reichen von ca. 100.000 bis ca. 10.000.000, wobei ca. 1.000.000 bis ca. 5.000.000 besonders bevorzugt wird. Anordnungen von mäßiger Dichte reichen vorzugsweise von ca. 10.000 bis ca. 100.000, insbesondere bevorzugt von ca. 20.000 bis ca. 50.000. Anordnungen von geringer Dichte liegen im Allgemeinen unter 10.000, wobei ein Bereich von ca. 1.000 bis ca. 5.000 bevorzugt wird. Anordnungen von sehr geringer Dichte liegen unter 1.000, vorzugsweise in einem Bereich von ca. 10 bis ca. 1.000, noch bevorzugter von ca. 100 bis ca. 500. In einigen Ausführungsformen ist das Format der Zusammensetzung gegebenenfalls keine Anordnung; das heißt, dass für einige Ausführungsformen auch Zusammensetzungen gebildet werden können, die ein einziges bioaktives Mittel umfassen. Weiters können bei einigen Anordnungen auch multiple Substrate, entweder von verschiedenen oder von identischen Zusammensetzungen, verwendet werden. So können beispielsweise große Anordnungen eine Vielzahl kleinerer Substrate umfassen.
  • Außerdem besteht ein Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, dass insbesondere durch die Verwendung von faseroptischer Technologie Anordnungen von äußerst hoher Dichte erstellt werden können. Beispielsweise ist es durch die Möglichkeit der Verwendung von Perlen von 200 um oder kleiner (wobei Perlen von 200 nm möglich sind) und durch das Wissen um sehr kleine Fasern möglich, über 250.000 oder mehr (in manchen Fällen 1 Million) verschiedene Fasern und Perlen in 1 mm2 großen Faserbündel zu verfügen, wodurch Dichten von mehr als 15.000.000 einzelnen Perlen und Fasern (in einigen Fällen wiederum sogar 25–50 Millionen) pro 0,5 cm2 erhalten werden kann.
  • Mit „Substrat" oder „Trägermaterial" oder anderen grammatikalisch gleichwertigen Benennungen wird hierin ein Material bezeichnet, das so modifiziert werden kann, dass es einzelne diskrete, für das Anlagern oder Anbinden von Perlen geeignete Stellen enthält, und das für zumindest ein Nachweisverfahren zugänglich ist. Von den Fachleuten im Bereich der Erfindung wird es wohl geschätzt sein, dass die Anzahl der möglichen Substrate sehr groß ist. Potentielle Substrate sind unter anderem Glas sowie modifiziertes oder funktionalisiertes Glas, Kunststoffe (unter anderem Acryle, Polystyrol und Copolymere von Styrol und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyurethane, TeflonTM usw.), Polysaccharide, Nylon oder Nitrocellulose, Harze, Silica oder auf Silica basierende Materialien, unter anderem Silicium und modifiziertes Silicium, Kohlenstoff, Metalle, anorganische Glase, Kunststoffe, optische Faserbündel sowie zahlreiche andere Polymere, was jedoch keine Einschränkung auf diese bedeutet. Im Allgemeinen erlauben die Substrate eine optische Detektion und sind selbst kaum fluoreszierend.
  • Im Allgemeinen ist das Substrat flach (planar), es können aber auch, was die Fachleute im Bereich der Erfindung schätzen werden, andere Substratkonfigurationen verwendet werden, beispielsweise können dreidimensionale Konfigurationen, z.B. durch Einbetten der Perlen in einen porösen Kunststoffblock, welcher einen Proben zugang zu den Perlen erlaubt, und Verwenden eines konfokalen Mikroskops zur Detektion, verwendet werden. Gleichermaßen können Perlen auf der Innenseite einer Röhre platziert werden, zur Durchführung einer Durchflussprobenanalyse, um das Probenvolumen zu minimieren. Bevorzugte Substrate umfassen optische Faserbündel, wie untenstehend erörtert, flache planare Substrate wie Glas, Polystyrol und andere Kunststoffe und Acryle.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat ein optisches Faserbündel oder eine Anordnung, so wie es allgemein in U.S.S. Nr. 08/944.850 und Nr. 08/519.062, PCT US98/05025 und PCT US98/09163 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungsformen wenden vorgefertigte einheitliche faseroptische Anordnungen an. Mit „vorgefertigten einheitlichen faseroptischen Anordnungen" ist hierin eine Anordnung diskreter einzelner faseroptischer Stränge gemeint, die koaxial angeordnet und ihrer Länge nach miteinander verbunden sind. Die Faserstränge sind im Allgemeinen jeweils einzeln beschichtet. Allerdings unterscheidet sich eine vorgefertigte einheitliche Anordnung von anderen faseroptischen Formaten dahingehend, dass die Fasern nicht einzeln physikalisch manipuliert werden können, das heißt, dass ein Strang üblicherweise an keinem Punkt seiner Länge physikalisch von einem anderen Faserstrang getrennt werden kann.
  • Zumindest eine Oberfläche des Substrats wurde so modifiziert, dass sie über diskrete, einzelne Stellen für das spätere Anbringen von Mikrokügelchen (oder, falls keine Mikrokügelchen verwendet werden, für das Anhaften von bioaktiven Mitteln) verfügen. Diese Stellen umfassen gegebenenfalls physikalisch veränderte Stellen, d.h. physikalische Konfigurationen, z.B. Mulden oder kleine Einbuchtungen im Substrat, welche die Perlen zurückhalten können, sodass ein Mikrokügelchen in der Mulde bleiben kann, oder die Verwendung anderer Kräfte (Druck- oder magnetische Kräfte) oder chemisch veränderte oder aktive Stellen, wie z.B. chemisch funktionalisierte Stellen, elektrostatisch veränderte Stellen, hydrophob/hydrophil funktionalisierte Stellen, Klebstoffpunkte usw.
  • Die Stellen können ein Muster, d.h. ein regelmäßiges Bild oder Konfiguration, bilden oder zufällig verteilt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein regelmäßiges Muster von Stellen verwendet, so dass die Stellen auf einer X-Y-Koordinatenebene adressiert werden können. In diesem Sinne beinhaltet „Muster" eine sich wiederholende Elementarzelle, vorzugsweise eine solche, die eine hohe Perlendichte auf dem Substrat erlaubt. Es sollte jedoch noch vermerkt werden, dass diese Stellen keine diskrete Stellen sein können. Das heißt, dass beispielsweise die Verwendung einer einheitlichen Oberfläche mit adhäsiven oder chemischen Funktionalitäten, die das Anbringen der Perlen an jedem Ort erlauben, möglich ist. Das heißt, dass die Substratoberfläche so modifiziert wird, dass die Mikrokügelchen an einzelnen Stellen anhaften können, unabhängig davon, ob diese Stellen an andere Stellen angrenzen oder nicht. Die Substratoberfläche wird daher so modifiziert, dass diskrete Stellen gebildet werden, die nur über eine angehaftete Perle verfügen können, oder alternativ dazu wird die Oberfläche modifiziert, und die Perlen senken sich an irgendeinem Ort ab, landen aber letztendlich auf diskreten Stellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche des Substrats so modifiziert, dass sie Mulden aufweist, d.h. Einbuchtungen in der Oberfläche des Substrats. Dies kann, wie gemeinhin nach dem Stand der Technik bekannt ist, unter Anwendung zahlreicher Techniken durchgeführt werden, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt darauf, durch Photolithographie, Stanz- und Formtechniken sowie Mikroätztechniken. Was Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung richtig einschätzen werden, ist, dass die verwendete Technik von der Zusammensetzung und der Form des Substrats abhängt. Umfasst das erste Substrat sowohl die Testorte als auch einzelnen Anordnungen, so wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Formungstechnik, bei der die Perlenmulden auf dem Grund der Testmulden in einer Mikrotiterplatte geformt werden, verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Bildung der Stellen auf der Oberfläche des Substrats physikalische Veränderungen vorgenommen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist, beispielsweise wenn das zweite Substrat ein optisches Faserbündel ist, die Oberfläche des Substrats ein Ende des Faserbündels, so wie dies allgemein in 08/818.199 und in 09/151.877 beschrieben ist, wobei beide hiermit ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind. In dieser Ausführungsform werden die Mulden an einem terminalen oder distalen Ende eines einzelne Fasern umfassenden Faserbündels gebildet. Bei dieser Ausführungsform sind die Kerne der einzelnen Fasern geätzt, und zwar in Bezug auf die Beschichtung, sodass die kleinen Mulden oder Einbuchtungen an einem Ende der Fasern gebildet werden. Die benötigte Tiefe der Mulden hängt von der Größe der den Mulden zugeführten Perlen ab.
  • Im Allgemeinen sind bei dieser Ausführungsform die Mikrokügelchen in den Mulden nicht kovalent gebunden, obwohl die Mulden, wie allgemein in Folge noch beschrieben wird, zusätzlich chemisch funktionalisiert sein können, und Vernetzer oder eine physikalische Barriere, z.B. eine Folie oder Membran über den Perlen, können verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Substratoberfläche so modifiziert, dass sie chemisch modifiziere Stellen enthält, die zur kovalenten oder nichtkovalenten Bindung der Mikrokügelchen der Erfindung an den diskreten Stellen oder Orten des Substrats verwendet werden können. „Chemisch modifizierte Stellen" bedeutet in diesem Zusammenhang unter anderem, allerdings nicht darauf eingeschränkt, den Zusatz eines Musters von chemischen funktionellen Gruppen, unter anderem Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, die zur kovalenten Bindung der Mikrokügelchen verwendet werden können, welche im Allgemeinen auch entsprechende reaktive funktionelle Gruppen beinhalten; den Zusatz eines Musters aus Haftmitteln, das zur Anbindung der Mikrokügelchen verwendet werden kann (entweder durch vorhergehende chemische Funktionalisierung für das Zusetzen des Haftmittels oder durch direktes Zusetzen des Haftmittels); den Zusatz eines Musters aus geladenen Gruppen (ähnlich der chemischen Funktionalitäten) für ein elektrostatisches Binden der Mikrokügelchen, d.h. falls die Mikrokügelchen entgegengesetzt geladene Gruppen zu den Stellen umfassen; den Zusatz eines Musters aus chemischen funktionellen Gruppen, welche die Stellen unterschiedlich hydrophob oder hydrophil machen, so dass das Zusetzen ähnlich hydrophober oder hydrophiler Mikrokügelchen unter geeigneten Versuchsbedingungen zur auf Hydroaffinität basierenden Anbindung der Mikrokügelchen an die Stellen führt. Beispielsweise lenkt die Verwendung hydrophober Stellen mit hydrophoben Perlen in einem wässrigen System die Perlen zur Anbindung bevorzugt auf die Stellen. Wie oben erwähnt beinhaltet „Muster" in diesem Sinne die Anwendung einer einheitlichen Oberflächenbehandlung, um ein Anbringen der Perlen an diskreten Stellen zu ermöglichen sowie die zur Bildung von diskreten Stellen führende Behandlung der Oberfläche. Wie die Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung richtig einzuschätzen wissen, kann dies auf verschiedenste Weisen durchgeführt werden.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen weiters eine Population von Mikrokügelchen. Unter „Population" ist hierin eine Vielzahl an wie oben beschriebenen Perlen für Anordnungen zu verstehen. Innerhalb der Population gibt es separate Subpopulationen, die aus einer einzigen oder aus multiplen, identischen Mikrokügelchen bestehen können. Das bedeutet, dass bei einigen Ausführungsformen, wie in Folge noch genauer beschrieben wird, die Anordnung nur eine einzige Perle für jedes bioaktive Mittel beinhalten kann; bevorzugte Ausführungsformen verwenden eine Vielzahl von Perlen einer jeden Art.
  • Mit „Mikrokügelchen" oder „Perlen" oder „Teilchen" oder äquivalenten Benennungen sind hierin kleine diskrete Teilchen gemeint. Die Zusammensetzung der Perlen variiert je nach Sorte des bioaktiven Mittels und des Syntheseverfahrens. Geeignete Perlenzusammensetzungen sind unter anderem solche, die bei der Synthese von Peptid, Nucleinsäure und organischen Gruppierungen verwendet werden, unter anderem, jedoch nicht ausschließlich, Kunststoffe, Keramik, Glas, Polystyrol, Methylstyrol, Acrylpolymere, paramagnetische Materialien, Thoriumoxid-Sol, Graphitkohle, Titandioxid, Latex oder vernetzte Dextrane wie z.B. Sepharose, Cellulose, Nylon, vernetzte Micellen und Teflon; all diese können verwendet werden. „Microsphere Detection Guide" von Bangs Laboratories, Fishers IN, ist ein hilfreicher Leitfaden.
  • Die Perlen müssen nicht kugelförmig sein; auch unregelmäßige Teilchen können verwendet werden. Zusätzlich können die Perlen porös sein, was die für die Bindung des bioaktiven Mittels oder des Markers zugängliche Oberfläche der Perle vergrößert. Die Perlengröße beträgt von Nanometer- bis Millimetergröße, d.h. von 100 nm bis 1 mm, wobei Perlen einer Größe von etwa 0,2 Mikrometer bis etwa 200 Mikrometer bevorzugt sind, noch bevorzugter sind Perlen von 0,5 bis ca. 5 Mikrometer, obwohl bei einigen Ausführungsformen kleinere Perlen verwendet werden können.
  • Es sollte festgehalten werden, dass eine Schlüsselkomponente der Erfindung in der Verwendung einer Substrat/Perlenpaarung besteht, welche das Anbinden oder Anbringen der Perlen an diskreten Stellen der Substratoberfläche erlaubt, sodass sich die Perlen im Verlauf des Tests nicht bewegen.
  • Jedes Mikrokügelchen umfasst ein bioaktives Mittel, obwohl, was die Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung richtig einschätzen werden, es gegebenenfalls einige Mikrokügelchen, die kein bioaktives Mittel enthalten, geben kann, was vom Syntheseverfahren abhängig ist. Unter „bioaktives Kandidat-Mittel" oder „bioaktives Mittel" oder „chemische Funktionalität" oder „Bindungsligand" ist, so wie hierin verwendet, ein beliebiges Molekül zu verstehen, das (entweder kovalent oder nichtkovalent) an die Mikrokügelchen der Erfindung gebunden werden kann, z.B. ein Protein, ein Oligopeptid, ein kleines organisches Molekül, ein Koordinationskomplex, ein Polysaccharid, ein Polynucleotid usw. Die Zusammensetzungen der Erfindung haben zwei Hauptverwendungsziele. In einer bevorzugten Ausführungsform, wie weiter unten noch näher beschrieben wird, werden die Zusammensetzungen zum Nachweis eines bestimmten Zielanalyten, z.B. der Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Nucleotidsequenz oder eines bestimmten Proteins, wie beispielsweise eines Enzyms, eines Antikörpers oder Antigens, verwendet. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen zum Screening bioaktiver Mittel, z.B. von Kandidat-Medikamenten, bezüglich ihrer Bindung an einen bestimmten Zielanalyten verwendet.
  • Bioaktive Mittel schließen zahlreiche chemische Klassen ein, obwohl es sich normalerweise um organische Moleküle, vorzugsweise um kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als 2.500 Dalton, handelt.
  • Bioaktive Mittel umfassen zur strukturellen Wechselwirkung mit Proteinen, insbesondere zur Wasserstoffbrückenbindung, benötigte funktionelle Gruppen und umfassen typischerweise zumindest eine Amino-, eine Carbonyl-, Hydroxy- oder Carboxygruppe, vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die bioaktiven Mittel umfassen häufig zyklischen Kohlenstoff oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, welche mit einer oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. Bioaktive Mittel können auch Biomoleküle, unter anderem Peptide, Nucleinsäuren, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine sowie Derivate, strukturanaloge Substanzen oder Kombinationen davon, sein. Besonders bevorzugt werden Nucleinsäuren und Proteine.
  • Bioaktive Mittel können aus vielen verschiedenen Quellen, unter anderem aus Banken natürlicher und synthetischer Verbindungen, erhalten werden. Es stehen zahlreiche Methoden zur statistischen und gerichteten Synthese einer Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen, einschließlich der Expression von statistischen Oligonucleotiden, bereit. Alternativ dazu stehen Banken natürlicher Verbindungen in Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierextrakten zur Verfügung oder sind schnell erhalten. Hinzu kommt, dass natürlich oder synthetisch hergestellte Banken und Verbindungen leicht durch herkömmliche chemische, physikalische oder biochemische Mittel modifiziert werden können. Bekannte pharmakologische Mittel können gerichteten oder statistischen chemischen Modifikationen, z.B. Acylierung, Alkylierung, Veresterung und/oder Amidierung, zur Bildung strukturanaloger Substanzen unterzogen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Proteine. Mit „Protein" sind hierin zumindest zwei kovalent gebundene Aminosäuren, umfassend Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide, gemeint. Das Protein kann aus natürlich auftretenden Aminosäuren- und Peptidbindungen oder synthetischen peptidomimetischen Strukturen aufgebaut sein. „Aminosäure" oder „Peptidrest" bezeichnen somit hierin sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Aminosäuren. Beispielsweise werden Homophenylalanin, Citrullin und Norleucin als Aminosäuren für die Zwecke der Erfindung betrachtet. Die Seitenketten können sich sowohl in der (R)- als auch in der (S)-Konfiguration befinden. In der bevorzugten Ausführungsform befinden sich die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration. Werden nicht natürlich auftretende Seitenketten verwendet, können gegebenenfalls Nichtaminosäuren-Substituenten verwendet werden, um beispielsweise In-vivuo-Abbau zu verhindern oder zu verzögern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel natürlich vorkommende Proteine oder Fragmente natürlich vorkommender Proteine. So können beispielsweise Zellextrakte, die Proteine enthalten, oder statistische oder gerichtete Verdaue proteinhaltiger Zeltextrakte verwendet werden. Auf diese Weise können Banken prokaryotischer und eukaryotischer Proteine zum Screening in den hierin beschriebenen Systemen verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform besonders bevorzugt sind Banken von bakteriellen und viralen Proteinen sowie von Pilz- und Säugetierproteinen, wobei Letztere bevorzugt werden und menschliche Proteine noch bevorzugter sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Peptide aus ca. 5 bis ca. 30 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 20, noch bevorzugter ca. 7 bis ca. 15. Die Peiltide können Verdaue natürlich vorkommender Proteine, wie oben beschrieben, statistische Peiltide oder vorbestimmte („biased") statistische Peptide sein. Mit „statistisch" und äquivalenten Benennungen ist hierin gemeint, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid aus im Wesentlichen statistischen Nucleotiden bzw. Aminosäuren besteht. Da diese statistischen Peiltide (oder Nucleinsäuren, siehe unten) im Allgemeinen synthetisch hergestellt werden, können sie ein beliebiges Nucleotid bzw. eine beliebige Aminosäure an jeder beliebigen Stelle einbauen. Das Syntheseverfahren kann auf die Herstellung statistischer Proteine oder Nucleinsäuren ausgerichtet sein, um die Bildung aller oder der meisten möglichen Kombinationen über die Länge der Sequenz zu erlauben, wodurch eine Bank statistischer bioaktiver proteinartiger Mittel gebildet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bank bioaktiver Mittel verwendet. Die Bank sollte eine ausreichend strukturell diverse Population von bioaktiven Mitteln bereitstellen, um eine wahrscheinlichkeitstheoretisch ausreichende Bandbreite an Bindungen an die Zielanalyten zu gewährleisten, Demgemäß muss eine Wechselwirkungsbank so groß sein, dass mindestens eines seiner Bestandteile eine Struktur aufweist, die ihm eine Affinität für den Zielanalyten verleiht. Obwohl es schwierig ist, die benötigte absolute Größe einer Wechselwirkungsbank festzulegen, gibt die Natur durch die Immunantwort einen Hinweis: eine Vielfalt von 107–108 unterschiedlichen Antikörpern stellt zumindest eine Kombination mit ausreichender Affinität bereit, um mit den meisten potentiellen Antigenen, mit denen ein Organismus zu tun hat, wechselzuwirken. Veröffentlichte In-vitro-Selektionsverfahren haben ebenfalls gezeigt, dass eine Bankgröße von 107 bis 108 ausreicht, um darin Strukturen mit einer Affinität zum Ziel zu finden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zumindest 106, vorzugsweise mindestens 107, noch bevorzugter mindestens 108, insbesondere mindestens 109 verschiedene bioaktive Mittel gleichzeitig durch die vorliegenden Verfahren analysiert. Bevorzugte Verfahren maximieren Größe und Vielfalt der Bank.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bank zur Gänze statistisch, ohne Sequenzpräferenzen oder Konstanten an irgendeiner Position. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bank vorbestimmt („biased"). Das bedeutet, dass einige Positionen entweder konstant gehalten werden oder aus einer begrenzten Anzahl an Möglichkeiten ausgewählt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind beispielsweise die Nucleotid- oder Aminosäurereste willkürlich aus einer definierten Klasse, z.B. hydrophoben Aminosäuren, hydrophilen Resten, sterisch vorbestimmten (kleinen oder großen) Resten, hinsichtlich der Bildung von Cysteinen für Vernetzung, von Prolinen für SH-3-Domänen, von Serinen, Threoninen, Tyrosinen oder Histidinen für Phosphorylierungsstellen usw. oder für Purine etc. ausgewählt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Nucleinsäuren (im Allgemeinen hierin als „Nucleinsäuresonden" oder „Kandidat-Sonden" bezeichnet). Hierin stehen „Nucleinsäure" oder „0ligonucleotid" oder grammatikalisch gleichwertige Benennungen für zumindest zwei kovalent aneinander gebundene Nucleotide. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphordiesterbindungen, obwohl in einigen Fällen, wie unten noch beschrieben wird, Nuclein säureanaloga enthalten sind, die über alternierende Rückgrate verfügen, umfassend beispielsweise Phosphoramid (Beaucage et al. Tetrahedron 49 (10), 1925 (1993), und darin enthaltene Verweise; Letsinger et al., J. Org. Chem. 35, 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res., 14, 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984); Letsinger of al., J. Am. Chem. Soc., 110, 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26, 141 (1986)), Thiophosphate (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19, 1437 (1991); und U.S.-Patent Nr. 5.644.048), Dithiophosphate (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 2321 (1989)), O-Methylphosphoramiditbindungen (vgl. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptid-Nucleinsäurerückgrate und -bindungen (vgl. Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31, 1008 (1992); Nielsen, Nature 365, 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380, 207 (1996), wobei alle hierin durch Verweis aufgenommen sind). Andere analoge Nucleinsäuren umfassen solche mit positiven Rückgraten (Denpcy of al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6097 (1995)); nichtionischen Rückgraten (U.S.-Patente Nr. 5.386.023; 5.637.684; 5.602.240; 5.216.141; und 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30, 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleosides & Nucleotides 13, 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y.S. Sanghui und P. Dan Cook (Hrsg.); Mesmaeker et al., Bioorganic & Medical Chem. Lett. 4, 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34, 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37, 743 (1996)) und Nicht-Ribose-Rückgraten, einschließlich jener, die in den U.S.-Patenten Nr. 5.235.033 und Nr. 5.034.506 und in den Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y.S. Sanghui und P. Dan Cook (Hrsg.), beschrieben sind. Auch sind einen oder mehrere carbozyklische Zucker enthaltende Nucleinsäuren in der Definition von Nucleinsäuren eingeschlossen (vgl. Jenkins et al., Chem Soc. Rev., S. 169–176 (1995)). Einige Nucleinsäureanaloga sind in Rawls, C&E News, Seite 35, 2. Juni 1997, beschrieben. Diese Modifikationen des Ribose-Phosphat-Rückgrats können durchgeführt werden, um die Hinzufügung von zusätzlichen Gruppierungen, z.B. von Markern, zu erleichtern oder um die Stabilität und die Halbwertszeit derartiger Mole küle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen; beispielsweise ist PNA besonders bevorzugt. Zusätzlich können Gemische aus natürlich auftretenden Nucleinsäuren und -analoga hergestellt werden. Alternativ dazu können Gemische aus verschiedenen Nucleinsäureanaloga sowie Mischungen aus natürlich auftretenden Nucleinsäuren und -analoga hergestellt werden. Die Nucleinsäuren können, wie spezifiziert wurde, einzel- oder doppelsträngig sein oder Teile von doppelsträngigen und einzelsträngigen Sequenzen beinhalten. Die Nucleinsäure kann eine DNA sein, sowohl eine genomische oder eine cDNA, eine RNA oder ein Hybrid sein, wobei die Nucleinsäure irgendeine Kombination von Desoxyribo- und Ribonucleotiden sowie irgendeine Kombination von Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xanthin, Hypoxanthin, Isocytosin, Isoguanin, und Basenanaloga, wie beispielsweise Nitropyrrol und Nitroindol usw., enthält.
  • Wie oben bereits allgemein für Proteine beschrieben, können bioaktive Nucleinsäure-Mittel natürlich vorkommende Nucleinsäuren, statistische Nucleinsäuren oder vorbestimmte („biased") statistische Nucleinsäuren sein. Beispielsweise können Verdaue prokaryotischer oder eukaryotischer Genome, so wie oben für Proteine beschrieben, verwendet werden.
  • Im Allgemeinen sind die Sonden der vorliegenden Erfindung so konzipiert, dass sie komplementär zu einer Zielsequenz sind (entweder zur Zielanalytsequenz der Probe oder zu anderen Sondensequenzen, wie hierin beschrieben wird), sodass es zu einer Hybridisierung des Ziels und der Sonden der vorliegenden Erfindung kommt. Diese Komplementarität muss nicht vollständig sein; es kann eine beliebige Anzahl an Basenfehlpaarungen, die die Hybridisierung zwischen der Zielsequenz und den einzelsträngigen Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung beeinträchtigen. Ist die Anzahl der Mutationen jedoch so groß, dass es zu keiner Hybridisierung, auch nicht unter den am wenigsten stringenten Bedingungen einer Hybridisierung, kommt, so ist die Sequenz keine komplementäre Zielsequenz. Mit „im Wesentlichen komplementär" ist demnach hierin die ausreichende Komplementarität der Sonden zu den Zielsequenzen, um unter ausgewählten Reaktionsbedingungen eine Hybridisierung zu vollziehen, gemeint. Hoch stringente Bedingungen sind auf dem Gebiet der Erfin dung bekannt; vgl. beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), und Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), wobei diese hierin durch Verweis aufgenommen sind. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind, je nach Bedingung, unterschiedlich. Längere Sequenzen hybridisieren besonders bei höheren Temperaturen. Ein ausführlicher Leitfaden für die Hybridisierung von Nucleinsäuren findet sich in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Allgemein werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie bei 5–10°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) der betreffenden Sequenz bei definierter Ionenstärke und pH-Wert liegen. Tm ist jene Temperatur, bei der (unter definierter Ionenstärke, pH-Wert und Nucleinsäurekonzentration) 50% der zum Ziel komplementären Sonden mit der Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisieren (da Zielsequenzen im Überschuss vorhandenen sind, sind bei Tm im Gleichgewicht 50% der Sonden besetzt). Stringente Bedingungen sind jene, bei denen die Salzkonzentration bei unter ca. 1,0 M Natriumionen, typischerweise von ca. 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder anderer Salze), liegt, bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 und einer Temperatur von mindestens ca. 30°C für kurze Sonden (d.h. 10 bis 50 Nucleotide) und mindestens ca. 60°C für lange Sonden (d.h. mehr als 50 Nucleotide). Stringente Bedingungen können auch durch Zusatz eines Destabilisators, z.B. Formamid, geschaffen werden. In einer anderen Ausführungsform werden weniger stringente Hybridisierungsbedingungen verwendet; beispielsweise können nach dem Stand der Technik bekannte mäßig oder niedrig stringente Bedingungen angewendet werden; vgl. Maniatis und Aussubel (oben) und Tijssen (oben).
  • Die Bezeichnung „Zielsequenz" und grammatikalische gleichwertige Ausdrücke stehen hierin für eine Nucleinsäuresequenz auf einem Einzelstrang der Nucleinsäure. Die Zielsequenz kann ein Abschnitt eines Gens, eine Regulationssequenz, eine genomische DNA, eine cDNA, eine RNA, einschließlich mRNA und rRNA, oder eine andere sein. Sie kann jede beliebige Länge aufweisen, wobei es sich von selbst versteht, dass längere Sequenzen spezifischer sind. Wie für Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, kann die komplementäre Zielsequenz zahlreiche Formen aufweisen.
  • Beispielsweise kann sie in einer größeren Nucleinsäuresequenz beinhaltet sein, d.h. als Ganzes oder beispielsweise nur Abschnitte eines Gens oder einer mRNA, ein Restriktionsfragment einer Plasmid-DNA oder einer genomischen DNA, u.a. Wie unten noch genauer dargelegt wird, werden die Sonden so gebildet, dass sie mit Ziel-sequenzen hybridisieren, um die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenz in der Probe nachzuweisen. Im Allgemeinen ist diese Bezeichnung für die Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung verständlich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel organische chemische Gruppierungen, von denen in der Literatur eine breite Palette zur Verfügung steht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede Perle eine einzige Art eines bioaktiven Mittels, wobei jedoch vorzugsweise eine Vielzahl einzelner bioaktiver Mittel an jede Perle gebunden wird. Auf ähnliche Weise verwenden bevorzugte Ausführungsformen auch mehr als ein ein einzigartiges bioaktives Mittel enthaltende Mikrokügelchen: das heißt, dass es, durch die Verwendung von Subpopulationen der Mikrokügelchen, eine im System eingebaute Redundanz gibt, wobei jedes Mikrokügelchen der Subpopulation dasselbe bioaktive Mittel beinhaltet.
  • Wie für Fachleute des Gebiets ersichtlich ist, können die bioaktiven Mittel entweder direkt auf den Perlen synthetisiert oder zuerst hergestellt und nach der Synthese gebunden werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Linker verwendet, um die bioaktiven Mittel an die Perlen zu binden, um sowohl eine gute Anbindung als auch ausreichend Flexibilität für eine gute Wechselwirkung mit dem Zielmolekül zu erreichen und um unerwünschte Bindungsreaktionen zu vermeiden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Mittel direkt auf den Perlen synthetisiert. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, werden derzeit viele Klassen chemischer Verbindungen auf festen Trägern synthetisiert, z.B. Peptide, organische Gruppierungen und Nucleinsäuren. Es ist relativ einfach, diese derzeitigen Syntheseverfahren für die Verwendung von Perlen anzupassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Mittel zuerst synthetisiert und dann kovalent an die Perlen gebunden. Wie Fachleute auf dem Gebiet wissen, wird dies abhängig von der Zusammensetzung der bioaktiven Mittel und der Perlen durchgeführt. Die Funktionalisierung von festen Trägeroberflächen, z.B. von bestimmten Polymere mit chemisch reaktiven Gruppen, wie beispielsweise Thiole, Amine, Carboxyle usw., ist allgemein auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Demgemäß können „rohe" („blank") Mikrokügelchen mit einer bestimmten, die Anbringung der gewünschten Funktionalität durch den Benutzer erleichternden Oberflächenchemie verwendet werden. Einige Beispiele für diese Oberflächenchemie von rohen Mikrokügelchen umfassen Aminogruppen, einschließlich aliphatischer und aromatischer Amine, Carbonsäuren, Aldehyde, Amide, Chlormethylgruppen, Hydrazid- und Hydroxygruppen, Sulfonate und Sulfate, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
  • Diese funktionellen Gruppen können zur Hinzufügung einer beliebigen Anzahl an Kandidat-Mitteln zu den Perlen herangezogen werden, üblicherweise unter Verwendung bekannter Chemien. Beispielsweise können kohlenwasserstoffhaltige Kandidat-Mittel an einen aminofunktionalisierten Träger gebunden werden; der Aldehyd des Kohlenwasserstoffs wird unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt, woraufhin der Aldehyd mit einer Aminogruppe auf der Oberfläche umgesetzt wird. In einer alternativen Ausführungsform kann ein Sulfhydryllinker verwendet werden. Es gibt eine Reihe auf dem Gebiet der Erfindung bekannte reaktive Sulfhydryllinker, beispielsweise SPDP, Maleinimide, α-Haloacetyle und Pyridyldisulfide (vgl. z.B. den technischen Abschnitt über Vernetzer im Katalog der Pierce Chemical Company von 1994, S. 155–200), die zum Binden von cysteinhaltigen proteinartigen Mitteln an den Träger verwendet werden können. Alternativ dazu kann eine Aminogruppe auf dem Kandidat-Mittel zum Binden an eine Aminogruppe auf der Oberfläche verwendet werden. So sind beispielsweise auf dem Gebiet der Erfindung eine Vielzahl an stabilen bifunktionellen Gruppen, einschließlich homobifunktioneller und heterobifunktioneller Linker (vgl. Pierce-Katalog und Handbuch, S. 155–200), bekannt. In einer weiteren Ausführungsform können unter Verwendung wohl bekannter Linker (vgl.
  • Pierce-Katalog) Carboxygruppen (entweder von der Oberfläche oder vom Kandidat-Mittel) derivatisiert werden. Beispielsweise aktivieren Carbodiimide Carboxygruppen für den Angriff durch gute Nucleophile, wie z.B. Amine (vgl. Tourchilin et al., Critical Rev. Theapeutic Drug Carrier Systems 7(4), 275–308 (1991), ausdrücklich hierin aufgenommen). Proteinartige Kandidat-Mittel können ebenfalls mittels anderer auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren gebunden werden, beispielsweise für das Binden von Antikörpern an Polymere; vgl. Slinkin et al., Bioconi. Chem. 2, 342–348 (1991); Torchilin et al., oben; Trubetskoy et al., Bioconi. Chem. 3, 323–327 (1992); King et al., Cancer Res. 54, 6176–6185 (1994); und Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5, 220–235 (1994), wobei alle hiermit ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind. Es sollte sich von selbst verstehen, dass die Kandidat-Mittel auf zahlreiche verschiedene, einschließlich der oben aufgelisteten Weisen gebunden werden können. Wichtig ist, dass die Bindungsmethode die Funktionalität des Kandidat-Mittels nicht wesentlich verändert; das heißt das Kandidat-Mittel sollte auf so flexible Weise gebunden werden, dass seine Wechselwirkung mit dem Ziel gewährleistet ist.
  • Spezielle Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf Mikrokügelchen sind nach dem Stand der Technik bekannt. In einem Fall werden Mikrokügelchen mit einer NH2-Oberflächenchemie verwendet. Die Oberfläche wird mittels einer 2,5% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 6,9 (138 mM NaCl, 2,7 mM KCl) aktiviert. Das Ganze wird auf einem Rührbett ca. 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mikrokügelchen werden dann mit hochreinem Wasser plus 0,01%–0,02% Tween 20 (Tensid) und daraufhin nochmals mit PBS mit einem ph-Wert von 7,7 plus 0,01 Tween 20 gespült. Schließlich wird das Enzym zur Lösung, vorzugsweise nach Vorfiltrieren unter Verwendung eines 0,45-μm-Amicon-Micropure-Filters, zugesetzt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Mikrokügelchen zusätzlich zum bioaktiven Mittel eine optische Signatur, die zur Identifikation des gebundenen bioaktiven Mittels verwendet werden kann. Das bedeutet, dass jede Subpopulation von Mikrokügelchen eine einzigartige optische Signatur oder optische Markierung umfasst, die zur Identifikation des einzigartigen bioaktiven Mittels dieser Subpopulation von Mikrokügelchen verwendet werden kann; eine die einzigartige optische Signatur umfassende Perle kann von an anderen Orten befindlichen Perlen mit anderen optischen Signaturen unterschieden werden. Wie hierin beschrieben hat jedes bioaktive Mittel eine zugehörige einzigartige optische Signatur, sodass jede dieses bioaktive Mittel umfassende Perle auf Grundlage der Signatur identifizierbar ist. Wie in Folge noch genauer erklärt wird, ist es möglich, optische Signaturen innerhalb einer Anordnung wieder zu verwenden oder zu vervielfältigen, beispielsweise wenn eine andere Identifikationsebene verwendet wird, z.B. wenn Perlen von unterschiedlicher Größe verwendet werden oder wenn die Anordnung hintereinander mit unterschiedlichen Chargen von Perlen beladen wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die optische Signatur üblicherweise ein Gemisch aus Nanokristallen. Unter „Nanokristall", „Quantenpunkt" oder „Halbleitercluster" wird hierin ein Lumineszenz aufweisendes Teilchen kleiner als 30 nm verstanden. Es versteht sich jedoch, dass ein einziger Nanokristall als optische Signatur dienen kann. Durch Variationen des Materials, der Größe und der Konzentration des Nanokristalls können Matrizen einzigartiger Markierungen gebildet werden. Dies kann durch Binden der Nanokristalle an die Oberfläche der Perlen oder, alternativ dazu, durch Einbetten der Nanokristalle in der Perle geschehen, wie unten beschrieben wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können unterschiedliche Konzentrationen von Nanokristallen als unterschiedliche Codes verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Codieren in einem Verhältnis von zumindest zwei verschiedenen Nanokristallen vollzogen werden, wobei sich die Nanokristalle in Bezug auf Größe und/oder Material unterscheiden können, obwohl auch weitere Codierungsdimensionen, beispielsweise die Größe der Perlen, zusätzlich verwendet werden können. Außerdem sind die Markierungen voneinander unterscheidbar; demnach können zwei unterschiedliche Markierungen unterschiedliche Moleküle (d.h. zwei verschiedene Größen oder Materialien) oder, alternativ dazu, eine Markierung bei zwei oder mehr unterschiedlichen Konzentrationen oder Intensitäten umfassen.
  • Demnach können auch Verhältnisse unterschiedlicher Konzentrationen gebildet werden.
  • Die Fähigkeit eines bestimmten Nanokristallgemischs, für verschiedene chemische Funktionalitäten zu codieren, ist von der Auflösung der Verhältnis-Messung abhängig. Vorsichtig ausgedrückt sollte jedes Nanokristallpaar die Fähigkeit zur Unterscheidung von zumindest zwanzig unterschiedlichen Verhältnissen bereitstellen. Die Anzahl einzigartiger Kombinationen zweier Nanokristalle aus einem bestimmten Nanokristallsatz wird in Tabelle 1 aufgezeigt. Tabelle 1
    Anzahl der Nanokristalle des Satzes mögliche Kombinationen
    3 3
    4 6
    5 10
    6 15
  • Unter Verwendung von sechs Nanokristallen und zwanzig verschiedenen Verhältnissen für jedes Nanokristallpaar können also 300 separate chemische Funktionalitäten in einer gegebenen Population von Mikrokügelchen codiert werden. Durch Kombination von mehr als zwei Nanokristallen wird die Palette an Codierungskombinationen zusätzlich erweitert. Weiters trägt die Konzentration der Nanokristalle zu ihrer Intensität bei; somit ist Intensität eine weiterer Weg zur Steigerung der Anzahl einzigartiger optischer Signaturen. Zusätzlich können, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, zusätzliche „Stücke" des Kombinationssatzes zur Fehlerkorrektur verwendet werden.
  • In einem weiteren Beispiel ergeben 4 sich in der Teilchengröße unterscheidende Nanokristalle bei 10 unterscheidbaren Intensitätsebenen (d.h. unterschiedliche Mengen an Nanokristallen im Gemisch) 104 oder 10.000 Codes.
  • Werden Kombinationen von Nanokristallen verwendet, kombiniert eine bevorzugte Ausführungsform die Sätze, sodass der Emissionsbereich des Zielsignals leer ist; statt einen Anstieg der Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge des Zielsignals aufgrund der Gegenwart eines Codierungssignals zu detektieren, werden keine mit der Zielsignalwellenlänge emittierenden Nanokristalle verwendet. Dies erlaubt eine empfindlichere Detektion.
  • Bei Nanokristallen verschieben sich der Beginn der Extinktion und das Emissionsmaximum mit abnehmender Größe zu höherer Energie. Die Anregung folgt der Extinktion, was in einem abstimmbaren Fluorophor resultiert, welches bei jeder Wellenlänge kürzer als das Emissionsmaximum wirksam angeregt werden kann und doch, unabhängig von der Anregungswellenlänge, mit derselben Eigenschaft ein schmales, symmetrisches Spektrum emittiert. Variationen des für den Nanokristall verwendeten Materials und Variationen der Größe des Nanokristalls erfordern einen Spektralbereich beim Emissionsmaximum von mindestens 400 nm bis 2 μm, mit einer typischen Emissionsbreite von 20 bis 30 nm bei Raumtemperatur (Halbwertsbreite (FWHM)) im sichtbaren Bereich des Spektrums und großen Extinktionskoeffizienten im sichtbaren und ultravioletten Bereich (etwa 105 M–1 cm–1). Schmalere Emissionsbreiten können bei niedrigeren Temperaturen erhalten werden.
  • Metallische und magnetische Nanokristalle mit angemessener organischer Derivatisierung der Oberfläche wurden bereits zuvor beschrieben. Vgl. z.B. Bruchez, oben, Chan und Nie, oben, Miltenyi et al., Cytometry 11, 231 (1990); Lackle, Histochem. Cell. Biol. 106, 9 (1996); Hermann et al., Histochem. Cell. Biol. 106, 31 (1996); Elghanlan et al., Science 277, 1078 (1997), Alivisatos et al., Nature 382, 609 (1996); Mirkin et al., Nature 382, 607 (1996); und Beverloo et al., Cytometry 11, 784 (1990). Bevorzugte Materialien umfassen CdSe, InP, InAs, GaAs und CdS.
  • Von den Materialwissenschaften und der Elektronik übernommene Konzepte der Herstellung von Bandlücken haben zur Entwicklung von Kern-Schale-Nanokristallen geführt. Durch die Offenbarung eines Kern-Nanokristall aus einem Material mit einer Schale aus einem anderen Material mit einer größeren Bandlücke ist es möglich, die Anregung wirksam auf den Kern zu beschränken, wobei nichtstrahlende Relaxationswege beseitigt und photochemische Zersetzung verhindert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen demnach die Nanokristalle einen Kern und eine Schale. Beispielsweise umfassen bevorzugte Ausführungsformen einen CdSe-Kern und eine AnS- oder CdS-Schale. Weitere Beispiele verwenden CdS/HgS/CdS, InAs/GaAs, GaAs/AlGaAs und CdSe/ZnS.
  • Zusätzlich sind die Nanokristalle in der bevorzugtesten Ausführungsform zur verbesserten Löslichkeit der Kristalle beschichtet. Die Beschichtung ist vorzugsweise aus Siliciumdioxid. Darüber hinaus können die Nanokristalle Mercaptoessigsäure zur Solubilisierung und zur kovalenten Proteinbindung umfassen. Beim Umsetzen mit ZnS-verkappten CdSe-Nanokristallen in Chloroform bindet sich die Mercaptogruppe an ein Zn-Atom, und durch die polare Carbonsäuregruppe wird der Nanokristall wasserlöslich. Die freie Carboxygruppe steht auch zur Bindung an verschiedene Biomoleküle (z.B. Proteine, Peptide und Nucleinsäuren) durch Vernetzung mit reaktiven Aminogruppen zur Verfügung. Es können auch ähnliche Resultate liefernde Reagenzien verwendet werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen trägt die Größe der Nanokristalle zumindest teilweise zur optischen Signatur bei, da die Größe des Nanokristalls direkt proportional zur optischen Signatur eines einzelnen Nanokristalls ist. Wie oben beschrieben können auch eine Reihe weiterer Faktoren zur optischen Signatur beitragen, was die Anzahl einzigartiger optischer Signatur erhöht, sodass eine Vielzahl von Zielanalyten gleichzeitig ausfindig gemacht und identifiziert werden können. Die Nanokristalle können so hergestellt werden, dass sie bestimmte Größenspezifikationen aufweisen, oder sie können so hergestellt werden, dass sie über eine Größenverteilung verfügen und dann nach Größe sortiert werden. Zum Sortieren der Nanokristalle stehen eine Vielzahl an Standardtrennverfahren zur Verfügung, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Chromatographie, Größenfiltrierverfahren und elektrophoretische Verfahren, wie unter anderem die Kapillarelektrophorese und noch bevorzugter die Freiflusselektrophorese.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nanokristalle kovalent an die Oberfläche der Perlen gebunden. Dies kann, so wie allgemein für das Binden der bioaktiven Mittel beschrieben, unter Verwendung funktioneller Gruppen an der Oberfläche der Perlen durchgeführt werden. Wie für Fachleute des Gebiets klar ersichtlich ist, wird das Anbinden zur Minimierung der Wirkung auf den Nanokristall ausgeführt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nanokristalle nichtkovalent, üblicherweise durch Einbetten der Nanokristalle in die Perlenmatrix oder in die Poren der Perlen, an die Perlen gebunden. Dies kann während der Synthese der Perlen geschehen. Durch Inkorporieren von Markenmolekülen (einschließlich Nanokristallen, kolloidalen Metallen, Teilchen von Nanometergröße usw.) in stabile poröse Materialien und dem folgenden Einkapseln dieser werden äußerst stabile optisch aktive Per-len zur Verwendung in dieser Erfindung und in anderen Systemen hergestellt. Im Allgemeinen umfasst dieser Aspekt der Erfindung das Einweichen des porösen Materials, beispielsweise poröser Kieselsäure, in einer Lösung aus Farbstoff und Monomer und/oder Vernetzen und das anschließende Abspülen der Perlen zum Beseitigen etwaiger freier Farbstoffe oder Monomere auf der Oberfläche des porösen Materials. Das in den Poren verbleibende Restmaterial wird daraufhin polymerisiert, was eine nicht-diffusionsfähige Barriere schafft oder in einigen Fällen sogar zu einer kovalenten Immobilisierung des Farbstoffs in der Pore führt. Da die codierenden Moleküle, einschließlich der Nanokristalle, im Polymer verkapselt sind, kommen sie nicht in direkten Kontakt zu organischen Lösungen, und die Wahrscheinlichkeit, dass sie während der folgenden Synthese oder Untersuchung herausgelöst werden, ist geringer. Da die codierenden Moleküle physikalisch im Polymer gefangen und in den Poren des Festkörpers immobilisiert sind, sind die Farbstoffe räumlich von etwaigen anderen Farbstoffen an der Teilchenoberfläche (z.B. den Zielsignalfarbstoffen) getrennt, was den Austausch der Fluoreszenz-Energieübertragung oder der Resonanzelektronenübertragung verhindert. Weiters wird so die Möglichkeit physikalischer Wechselwirkungen, einschließlich einer Aggregation, verringert.
  • Die eingebetteten Perlen können nicht nur in der vorliegenden Erfindung, sondern auch bei Diagnosetests, dem Markieren von Organellen und anderen zellbiologischen Anwendungen, bei Analyseverfahren, einschließlich laserbasierender Durchflusszytometrie, Kapillarelektrophorese, Massenspektrometrie und Spektroskopie (UV/VIS, nahes IR, FTIR usw.), verwendet werden.
  • Da dieses Verfahren nicht auf der Verwendung reaktiver Gruppen auf dem Farbstoff zur Bindung basiert, können zusätzlich Farbstoffe, die nicht leicht durch solche Gruppen derivatisiert werden, verwendet werden.
  • In einem bevorzugten Einkapselungverfahren wird die Sol-Gel-Polymerisation angewendet; vgl. Corriu et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1420–1436 (1996), und zitierte Literaturstellen.
  • In einer Ausführungsform werden die Nanokristalle dem bioaktiven Mittel und nicht den Perlen zugeführt, obwohl dies im Allgemeinen nicht bevorzugt wird.
  • Bei einem Beispiel für die Bildung einer Perle wird eine Aliqoute von Ausgangsmikrokügelchen vakuumfiltriert, sodass ein trockener Filterkuchen erhalten wird. In einer Ausführung werden Mikrokügelchen-Copolymere von Methylstyrol (87%) und Divinylbenzol (13%) mit einem Durchmesser von 3,1 Mikrometern (μm) verwendet. Der trockene Kuchen wird dass auseinander gebrochen, und eine Nanokristalllösung wird zugesetzt, um optische Signaturen der Mikrokügelchen mit den gewünschten chemischen Oberflächenfunktionalitäten betreffenden Informationen zu codieren. Die Nanokristalle können kovalent an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebunden sein, oder die Mikrokügelchen werden in eine, vorzugsweise ein Verhältnis von mindestens zwei in einem organischen Lösungsmittel gelösten Nanokristallen umfassende Nanokristalllösung gelegt, welche ein Anschwellen der Mikrokügelchen bewirkt, z.B. Dimethylformamid (DMF). Die Dauer des Einweichens der Mikrokügelchen in der Nanokristalllösung bestimmt deren Intensität und die Breite des Verhältnisbereichs.
  • Es versteht sich, dass die Nanokristalle gemeinsam mit herkömmlichen Fluorophoren, beispielsweise organischen Farbstoffen, verwendet werden können. Eine optische Signatur kann demnach einen Nanokristall auf einer Perle (oder Ziel) und einen organischen Farbstoff auf einer anderen Perle (oder Ziel) umfassen, oder die optische Signatur kann sowohl einen Nanokristall als auch einen organischen Farbstoff auf ein und derselben Perle oder demselben Ziel umfassen.
  • Bei einigen Ausführungsformen können die Mikrokügelchen zusätzlich Identifikator-Bindungsliganden zur Verwendung in bestimmten Decodierungssystemen umfassen. Unter „Identifikator-Bindungsliganden" oder „IBLs" ist hierin eine Verbindung zu verstehen, die spezifisch einen entsprechenden Decoder-Bindungsliganden (DBL) zur Erleichterung der Feststellung der Identität des an die Perle gebundenen bioaktiven Mittels binden. Das bedeutet, dass der IBL und der entsprechende DBL ein Bindungspartnerpaar bilden. Mit „spezifisch binden" ist hierin gemeint, dass der IBL den DBL mit ausreichender Spezifität bindet, um zwischen dem entsprechenden DBL und anderen DBLs (d.h. DBLs für andere IBLs) sowie anderen Komponenten oder Verunreinigungen des Systems zu unterscheiden. Die Bindung sollte ausreichend sein, um unter den Bedingungen des Decodierungsschritts, einschließlich der Waschschritte zum Entfernen nichtspezifischer Bindungen, aufrechterhalten zu bleiben. In einigen Ausführungsformen, beispielsweise wenn die IBLs und die entsprechenden DBLs Proteine oder Nucleinsäuren sind, liegen die Dissoziationskonstanten des IBL zu seinem entsprechenden DBL unter ca. 10–4–10–6 M–1, wobei unter ca. 10–5 bis 10–9 M–1 bevorzugt wird und unter ca. 10–7 bis 10–9 M–1 noch bevorzugter ist.
  • IBL-DBL-Bindungspaare sind bekannt oder können mittels bekannter Verfahren einfach gefunden werden. Ist beispielsweise der IBL ein Protein, so schließen die DBLs Proteine (insbesondere Antikörper oder Fragmente dieser (Fabs usw.)) oder kleine Moleküle ein, oder umgekehrt (der IBL ist ein Antikörper und der DBL ein Protein). Metallion-Metallion-Liganden oder Chelatbildnerpaare sind ebenfalls nützlich. Antigen-Antikörper-Paare, Enzyme und Substrate oder Inhibitoren, andere Protein-Protein-wechselwirkende Paare, Rezeptorliganden, komplementäre Nucleinsäuren sowie Kohlenhydrate und deren Bindungspartner sind ebenfalls geeignete Bindungspartner. Nucleinsäure-Nucleinsäure-bindende Proteinpaare sind ebenfalls von Nutzen. Ähnlich können auch, wie in den U.S.-Patenten 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877, 5.637.459, 5.683.867, 5.705.337 und ähnlichen Patenten allgemein beschrieben ist, Nucleinsäure-„Aptomere" zur Bindung an praktisch jedes Ziel entwickelt werden; so ein Aptomer-Ziel-Paar kann als IBL-DBL-Paar verwendet werden. Umfassende Literatur bezüglich der Entwicklung von Bindungspaaren auf der Basis von kombinatorischen chemischen Verfahren ist verfügbar.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann der DBL an einer Perle, d.h. an eine „Decoder-Perle", die eine zumindest einen Nanokristall umfassende Markierung tragen kann, gebunden sein. Wie in Folge noch ausführlicher beschrieben, können die IBL-DBL-Systeme in Kombination mit anderen Codierungs- und Decodierungssystemen verwendet werden. In jedem Fall verwenden der Test oder die Komponenten zumindest einen Nanokristall. Deshalb müssen die IBL-DBL-Bindungspaare nicht notwendigerweise in jedem der Fälle einen Nanokristall umfassen.
  • In einer Ausführungsform ist der IBL ein Molekül, dessen Farb- oder Lumineszenzeigenschaften sich in Gegenwart eines selektiv bindenden DBL verändern. Beispielsweise kann der IBL ein Fluoreszenz-pH-Indikator sein, dessen Emissionsintensiät sich mit dem pH-Wert verändert. So kann auch der IBL ein Fluoreszenz-Ionenindikator sein, dessen Emissionseigenschaften sich mit der Ionenkonzentration verändern.
  • In einer Ausführungsform umfasst der IBL oder der DBL zumindest einen Nanokristall, dessen optische Signatur sich beim Binden an den DBL verändert. In einer Ausführungsform umfassen der IBL und der DBL mindestens je einen Nanokristall, wobei sich das Signal als Resultat der Wechselwirkung verändert.
  • Alternativ dazu ist der IBL ein Molekül, dessen Farb- oder Lumineszenzeigenschaften sich in Gegenwart diverser Lösungsmittel verändern. Beispielsweise kann der IBL ein fluoreszierendes Molekül, z.B. ein Ethidiumsalz, sein, dessen Fluoreszenzintensität in hydrophoben Umgebungen zunimmt. Gleichermaßen kann der IBL auch ein Fluoresceinderivat sein, dessen Farbe sich zwischen wässrigen und nichtpolaren Lösungsmitteln verändert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das IBL-DBL-Paar im Wesentlichen komplementäre einzelsträngige Nucleinsäuren. In dieser Ausführungsform können die Bindungsliganden als „Identifikator-Sonden" und „Decoder-Sonden" bezeichnet werden. Üblicherweise weisen die Identifikator- und Decoder-Sonden eine Länge von ca. 4 bis ca. 1.000, vorzugsweise von ca. 6 bis ca. 100, noch bevorzugter von ca. 8 bis ca. 40, Basenpaaren auf. Wichtig ist, dass die Sonden lang genug sind, um spezifisch zu sein, d.h. um unterschiedliche IBL-DBL-Paaren zu unterscheiden, und kurz genug, um a) eine Dissoziation, falls nötig, unter geeigneten Versuchsbedingungen und b) eine effiziente Hybridisierung zuzulassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform binden, wie in Folge noch näher beschrieben wird, die IBLs nicht an die DBLs. Die IBLs werden als Identifikator-Gruppierungen („IGs") verwendet, die direkt identifiziert werden, beispielsweise mittels Massenspektroskopie.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Mikrokügelchen keine optische Signatur. Wie in U.S.S. Nr. 08/818.199 und Nr. 09/151–877 dargelegt, umfasste bei früheren Arbeiten jede Subpopulation von Mikrokügelchen eine zur Identifikation des einzigartigen bioaktiven Mittels dieser Subpopulation von Mikrokügelchen dienende einzigartige optische Signatur oder optische Markierung; das bedeutete, dass zur Decodierung die optischen Eigenschaften der Perlen verwendet werden, sodass eine die einzigartige optische Signatur umfassende Perle von anderen, an anderen Orten befindlichen Perlen mit anderen optischen Signaturen unterschieden werden kann. Bei früheren Arbeiten wurde also jedem bioaktiven Mittel eine einzigartige optische Signatur zugeteilt, sodass jedes dieses bioaktive Mittel umfassende Mikrokügelchen auf Grundlage der Signatur identifizierbar war. Diese optischen Signaturen umfassten Farbstoffe, üblicherweise Chromophore und Fluorophore, die in den Perlen eingeschlossen oder an die Perlen selbst gebunden waren. Zur Vielfalt der optischen Signaturen wurden verschiedene Fluorochrome, verschiedene Mischungsver hältnisse von Fluorochromen und verschiedene Konzentrationen (Intensitäten) von Fluorochromen verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung basiert daher nicht einzig auf der Verwendung optischer Eigenschaften zur Decodierung der Anordnungen. Wie den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, ist es jedoch bei einigen Ausführungsformen möglich, optische Signaturen gemeinsam mit dem bisherigen System als zusätzliche Codierungsmethode zu verwenden. Wie unten noch genauer beschrieben wird, kann die Größe einer Anordnung auf wirksame Weise unter Verwendung eines einzigen Satzes an Decoder-Gruppierungen, der auf verschiedene Weisen, eine davon ist die Verwendung optischer Signaturen auf einigen Perlen, eingesetzt wird, gesteigert werden. So erlaubt beispielsweise die Verwendung eines „Satzes" an Decoder-Molekülen und die Verwendung zweier Perlenpopulationen, eine mit und eine ohne optische Signatur, die tatsächliche Verdoppelung der Anordnungsgröße. Ähnlich steigert auch die Verwendung multipler optischer Signaturen die mögliche Größe der Anordnung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede Subpopulation von Perlen eine Vielzahl an unterschiedlichen IBLs. Durch die Verwendung einer Vielzahl unterschiedlicher IBLs zur Codierung eines jeden bioaktiven Mittels wird die Anzahl der möglichen einzigartigen Codes deutlich gesteigert. Durch die Verwendung eines einzigartigen IBL pro bioaktivem Mittel entspricht die Größe der Anordnung der Anzahl an einzigartigen IBLs (unter der Voraussetzung, dass keine „Wiederverwendung" auftritt, wie unten beschrieben wird). Wird jedoch eine Vielzahl an unterschiedlichen IBLs pro Perle, n, verwendet, kann die Größe n der Anordnung auf 2" gesteigert werden, wenn die Gegenwart oder Abwesenheit eines jeden IBLs als Indikator herangezogen wird. Beispielsweise schafft die Zuteilung von 10 IBLs pro Perle einen 10-Bit binären Code, wobei jedes Bit mit „1" (IBL anwesend) oder „0" (IBL abwesend) bezeichnet werden kann. Ein 10-Bit binärer Code verfügt über 210 mögliche Varianten. Allerdings kann, wie in Folge noch näher dargelegt wird, die Größe der Anordnung durch Einbindung weiterer Parameter, beispielsweise Konzentration oder Intensität, weiter gesteigert werden; so steigert sich beispielsweise die Anordnungsgröße unter Verwendung zweier unterschiedlicher IBL-Konzentrationen auf 3". Demnach wird in dieser Ausführungsform jedem einzelnen bioaktiven Mittel in der Anordnung eine IBL-Kombination zugeteilt, die den Perlen vor Zusatz des bioaktiven Mittels, nach oder während der Synthese des bioaktiven Mittels zugeführt werden kann, d.h. das gleichzeitige Zusetzen der IBLs und der Komponenten des bioaktiven Mittels.
  • Alternativ dazu kann, wenn das bioaktive Mittel ein Polymer verschiedener Reste ist, d.h. wenn das bioaktive Mittel ein Protein oder eine Nucleinsäure ist, die Kombination unterschiedlicher IBLs zur Aufklärung der Sequenz des Proteins oder Nucleinsäure verwendet werden.
  • Beispielsweise kann durch die Verwendung zweier unterschiedlicher IBLs (IBL1 und IBL2) die erste Position einer Nucleinsäure aufgeklärt werden: Beispielsweise kann Adenosin durch die Gegenwart von IBL1 und IBL2 dargestellt werden; Thymidin kann durch die Gegenwart von IBL1 und die Abwesenheit von IBL2 dargestellt werden, Cytosin kann durch die Gegenwart von IBL2 und die Abwesenheit von IBL1 dargestellt werden, und Guanosin kann durch die Abwesenheit beider dargestellt werden. Die zweite Position der Nucleinsäure kann auf ähnliche Weise, unter Verwendung von IBL3 und IBL4, bestimmt werden; somit ergibt die Gegenwart von IBL1, IBL2, IBL3 und IBL4 eine Sequenz AA; IBL1, IBL2 und IBL3 zeigen die Sequenz AT; IBL1, IBL3 und IBL4 ergeben die Sequenz TA usw. Für die dritte Position werden IBL5 und IBL6 verwendet usw. Auf diese Weise kann die Verwendung von 20 verschiedenen Identifikatoren einen einzigartigen Code für jedes mögliche 10-mer erbringen.
  • Für Proteine ist das System sehr ähnlich, jedoch bedarf es einer größeren Anzahl an unterschiedlichen IBLs zur Identifikation jeder Position, abhängig von der erlaubten Diversität an jeder Position. Ist beispielsweise jede Aminosäure an jeder Position erlaubt, werden fünf verschiedene IBLs für jede Position benötigt. Werden jedoch, wie oben beschrieben, statistische Peptide als bioaktive Mittel verwendet, kann gegebenenfalls das System vorbestimmt werden; nicht alle Aminosäuren können an allen Positionen vorhanden sein, und einige Positionen können von vornherein festgelegt sein; demgemäß wäre es möglich, vier verschiedene IBLs für jede Aminosäure zu verwenden.
  • Auf diese Weise wird eine Art „Strichcode" für jede Sequenz erstellt; die Gegenwart oder Abwesenheit jedes bestimmten IBLs erlaubt die Identifikation eines jeden bioaktiven Mittels.
  • Zusätzlich erlaubt die Verwendung von unterschiedlichen Konzentrationen oder Dichten von IBLs eine „Wiederverwendung" der Arten. Weist beispielsweise die ein erstes Mittel umfassende Perle eine 1X-Konzentration von IBL und eine zweite ein zweites Mittel umfassende Perle eine 10X-Konzentration an IBL auf, erlaubt die Verwendung sättigender Konzentrationen des entsprechenden markierten DBLs dem Anwender, die Perlen zu unterscheiden.
  • Wurden die in einigen Fällen Kandidat-Mittel und einzigartige Markierungen umfassenden Mikrokügelchen hergestellt, werden sie einem Substrat zugeführt und bilden eine Anordnung. Im Allgemeinen werden die Verfahren zur Bildung der Anordnungen und zum Decodieren dieser ausgeführt, um die Anzahl unterschiedlicher Kandidat-Mittel, die einzigartig codierbar sind, zu maximieren. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auf zahlreiche Weisen erhalten werden. Üblicherweise werden die Anordnungen durch Zusetzen einer die Perlen umfassenden Lösung oder Aufschlämmung zu einer die Stellen zum Anbinden der Perlen umfassenden Oberfläche erhalten. Dies kann in verschiedenen Puffern, einschließlich wässriger und organischer Lösungsmittel, und Gemischen durchgeführt werden. Das Lösungsmittel kann verdampfen und der Perlenüberschuss entfernt werden.
  • Es sollte festgehalten werden, dass nicht alle Stellen einer Anordnung eine Perle umfassen müssen; das heißt, es kann einige leere Stellen auf der Substratoberfläche geben. Auch können einige Stellen mehr als eine Perle umfassen, obwohl dies im Allgemeinen nicht bevorzugt wird.
  • In einigen Ausführungsformen, beispielsweise bei Durchführung einer chemischen Bindung, ist es möglich, die Perlen auf nichtzufällige oder geordnete Weise anzubringen. Beispielsweise können bei der Verwendung von photoaktivierbaren Linkern oder photoaktivierbaren Klebern oder Masken ausgewählte Stellen auf der Anordnung nacheinander für die Anbindung vorbereitet werden, sodass die definierten Perlenpopulationen dort abgelagert werden.
  • Die Anordnungen der vorliegenden Erfindung sind so konzipiert, dass die Identität des Kandidat-Mittel in die Anordnung eingebaut ist, sodass die zufällige Ablagerung der Perlen in den Fasermulden „decodiert" werden kann, was die Identifizierung des Kandidat-Mittels an jedem Ort erlaubt. Dies kann auf zahlreiche Weisen entweder vor, während oder nach der Verwendung der Anordnung zum Detektieren von Zielmolekülen geschehen.
  • Nach Herstellung der Anordnung wird diese „decodiert", um die Lage eines oder mehrerer bioaktiver Mittel, d.h. jeder Subpopulation von Perlen, auf der Substratoberfläche zu ermitteln.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein selektives Decodierungssystem verwendet. In diesem Fall werden ausschließlich die eine Veränderung im Signal, resultierend aus der Bindung eines Zielanalyten, aufweisenden Mikrokügelchen decodiert. Dies wird vor allem dann durchgeführt, wenn die Anzahl der „Treffer", d.h. die Anzahl der zu decodierenden Stellen, im Allgemeinen gering ist. Das bedeutet, dass die Anordnung zuerst unter Versuchsbedingungen in Abwesenheit der Zielanalyten gescannt wird. Die die Zielanalyten enthaltende Probe wird zugesetzt, woraufhin nur jene Orte, die ein verändertes optisches Signal aufweisen, decodiert werden. Beispielsweise werden die Perlen an den positiven oder den negativen Signalpositionen entweder selektiv markiert oder von der Anordnung abgelöst (beispielsweise durch die Verwendung von lichtspaltbaren Linkern) und anschließend in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) sortiert oder angereichert. Das heißt, dass entweder alle negativen Perlen freigesetzt werden, woraufhin die positiven Perlen entweder freigesetzt oder in situ analysiert werden, oder aber es werden alle Positiven freigesetzt und analysiert. Alternativ dazu können die Markierungen halogenierte aromatische Verbindungen umfassen, und die Detektion der Markierung wird beispielsweise mittels Gaschromatographie, chemischen Markierungen, isotopischen Markierungen und/oder massenspektraler Markierung durchgeführt.
  • Wie Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, kann dies auch in Systemen geschehen, in denen die Anordnung nicht decodiert ist, d.h. eine Korrelation zwischen Perlenzusammensetzung und Ort muss nicht immer gegeben sein. In dieser Ausführungsform wird die Anordnung mit Perlen beladen und der Test durchgeführt. Die „positiven", d.h. die eine Veränderung im optischen Signal aufweisenden Perlen, wie in Folge noch genauer beschrieben wird, werden dann „markiert", um sie von den „negativen" Perlen zu unterscheiden oder zu trennen. Dies kann auf verschiedenste Weisen vollzogen werden, vorzugsweise unter Einsatz von faseroptischen Anordnungen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede Perle einen Nanokristall. Bei einer nichtselektiven Freisetzung aller Perlen mit darauf folgender Sortierung, beispielsweise mittels eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS), können demzufolge die nicht-fluoreszenzaktiven Perlen von den fluoreszierenden negativen Perlen getrennt werden. Alternativ dazu sind, wenn Licht auf die negativen Fasern geworfen wird, alle Negativen nicht-fluoreszierend und alle Positiven fluoreszierend, woraufhin das Sortieren fortgesetzt werden kann. Die Charakterisierung der gebundenen bioaktiven Mittel kann direkt, beispielsweise unter Einsatz der Massenspektroskopie, durchgeführt werden.
  • Alternativ dazu kann die Identifikation durch die Verwendung von Identifikator-Gruppierungen („IGs") vollzogen werden, die den IBLs zwar ähnlich sind, jedoch nicht notwendigerweise an DBLs binden. Anstatt die Struktur des bioaktiven Mittels direkt zu aufzuklären, kann hier die Zusammensetzung der IGs als Identifikator dienen. Beispielsweise kann eine bestimmte IG-Kombination zur Codierung der Perle herangezogen und zur Identifikation des Mittels auf der Perle bei der Freisetzung von der Perle und der darauf folgenden Analyse, z.B. mittels eines Gaschromatographen oder eines Massenspektroskops, verwendet werden.
  • In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform beinhalten die Bindungsstellen der Perlen (z.B. die Mulden) ein photopolymeruisierbares Reagens, oder das photopolymerisierbare Mittel wird der bestehenden Anordnung zugeführt. Nach der Testuntersuchung wird Licht entweder auf die „positiven" oder auf die „negativen" Fasern geworfen, um diese Populationen zu unterscheiden. Resultat der Bestrahlung ist die Polymerisation und Festhaltung oder Anbindung entweder aller positiver oder aller negativer Perlen an den Stellen, während die andere Perlenpopulation von der Anordnung freigesetzt werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Lage eines jeden bioaktiven Mittels unter Verwendung von Decoder-Bindungsliganden (DBLs) bestimmt. Wie oben beschrieben sind DBLs Bindungsliganden, die entweder an Identifikator-Bindungsliganden, falls vorhanden, oder an die bioaktiven Mittel selbst binden, vorzugsweise wenn das bioaktive Mittel eine Nucleinsäure oder ein Protein ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bindet sich, wie oben beschrieben, der DBL an den IBL.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel einzelsträngige Nucleinsäuren, und der DBL ist eine im Wesentlichen komplementäre einzelsträngige Nucleinsäure, hier als Decoder-Sonde bezeichnet, die an das bioaktive Mittel bindet (hybridisiert). Es wird eine Decoder-Sonde hergestellt, die im Wesentlichen komplementär zu jeder Kandidat-Sonde ist, und zur Decodierung der Anordnung verwendet. In dieser Ausführungsform sollten die Kandidat-Sonden und die Decoder-Sonden lang genug sein (und der Decodierungsschritt unter angemessenen Bedingungen durchgeführt werden), um Spezifität zu erlauben, d.h. jede Kandidat-Sonde bindet an die entsprechende Decoder-Sonde mit einer zur Unterscheidung einer jeden Kandidat-Sonde ausreichenden Spezifität.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die DBLs entweder direkt oder indirekt markiert. Mit „markiert" ist hierin eine Verbindung mit zumindest einem gebunde nen Element, Isotop oder chemischen Verbindung gemeint, um den Nachweis der Verbindung zu erlauben. Allgemein gibt es drei Klassen von Markierungen: a) isotopische Markierungen, die radioaktiv oder schwere Isotope sein können; b) magnetische, elektrische, thermische Markierungen; und c) farbige oder lumineszierende Markierungen; obwohl Markierungen auch Enzyme oder Teilchen, z.B. magnetische Teilchen, einschließen. Bevorzugte Markierungen sind unter anderem Lumineszenz-Markierungen. In den meisten bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Markierung zumindest einen Nanokristall. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der DBL direkt markiert, das heißt der DBL umfasst eine Markierung. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der DBL indirekt markiert, das heißt, ein an den DBL bindender Marken-Bindungsligand (MBL) wird verwendet. In dieser Ausführungsform kann das Marken-Bindungsligand-DBL-Paar wie oben für IBL-DBL-Paare beschrieben werden.
  • Demgemäß wird die Identifikation der Lage der einzelnen Perlen (oder Subpopulationen von Perlen) mittels eines oder mehreren Decodierungsschritten, umfassend die Bindung zwischen dem markierten DBL und entweder dem IBL oder dem bioaktiven Mittel (d.h. Hybridisierung zwischen Kandidat-Sonde und Decoder-Sonde, wenn das bioaktive Mittel eine Nucleinsäure ist), durchgeführt. Nach der Decodierung können die DBLs entfernt und die Anordnung verwendet werden; unter einigen Umständen, beispielsweise wenn der DBL an einen IBL und nicht an ein bioaktives Mittel bindet, ist die Entfernung des DBL nicht erforderlich (obwohl es unter bestimmten Umständen wünschenswert wäre). Zudem kann, wie hierin beschrieben, die Decodierung entweder vor der Verwendung der Anordnung in einer Untersuchung, während der Untersuchung oder nach der Untersuchung durchgeführt werden.
  • In einer Ausführungsform wird ein einziger Decodierungsschritt durchgeführt. In dieser Ausführungsform ist jeder DBL mit einer einzigartigen Markierung versehen, sodass die Anzahl einzigartiger Markierungen gleich oder größer als die Anzahl der bioaktiven Mittel ist (obwohl in einigen Fällen, wie hierin beschrieben, einzigartige Markierungen „wieder verwendet" werden können; auf ähnliche Weise können auch kleiner Varianten der Kandidat-Sonden denselben Decoder haben, sofern die Varianten noch in einer anderen Dimension, z.B. in der Perlengröße oder Markierung, codiert sind). Für jedes bioaktive Mittel oder für jeden IBL wird ein DBL hergestellt, welcher spezifisch an dieses oder diesen bindet und eine einzigartige Markierung, z.B. ein oder mehrere Fluorochrome, enthält. Somit ist die Identität eines jeden DBL, sowohl seine Zusammensetzung (d.h. im Falle von Nucleinsäuren die Sequenz) als auch seine Markierung, bekannt. Daraufhin kann durch Hinzufügen der DBLs zur bioaktive Mittel umfassenden Anordnung unter eine Komplexbildung (als Hybridisierungskomplexe bezeichnet, wenn die Komponenten Nucleinsäuren sind) zwischen den DBLs und den bioaktiven Mitteln bzw. den IBLs zulassenden Bedingungen die Lage eines jeden DBL aufgeklärt werden. Dies erlaubt die Identifikation der Lage eines jeden bioaktiven Mittels; die zufällige Anordnung wurde decodiert. Wenn nötig können die DBLs daraufhin entfernt werden und die Zielprobe angewendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anzahl der einzigartigen Markierungen geringer als die Anzahl der einzigartigen bioaktiven Mittel, wodurch eine Abfolge von Decodierungsschritten vollzogen wird. Um die Erörterung zu vereinfachen, wird diese Ausführungsform für Nucleinsäuren erklärt, obwohl auch andere Arten von bioaktiven Mitteln und DBLs nützlich sind. In dieser Ausführungsform werden die Decoder-Sonden in n Sätze zur Decodierung eingeteilt. Die Anzahl der Sätze entspricht der Anzahl der einzigartigen Markierungen. Jede Decoder-Sonde wird in n unterschiedlichen Reaktionen mit n bestimmten Markierungen markiert. Alle Decoder-Sonden teilen dieselben n Markierungen. Die Decoder-Sonden werden so gepoolt, dass jeder Pool nur eine der n Markierungsversionen eines jeden Decoders enthält, und in allen Pools haben zwei Decoder-Sonden niemals dieselbe Sequenz an Markierungen. Damit dies erfüllt wird, wird die hierfür benötigte Anzahl an Pools durch die Anzahl der Decoder-Sonden und n bestimmt. Die Hybridisierung eines jeden Pools an die Anordnung generiert an jeder Adresse ein Signal. Die aufeinander folgende Hybridisierung eines jeden Pools schafft einen einzigartigen, sequenzspezifischen Code für jede Kandidat-Sonde. Dieser identifiziert die Kandidat-Sonde an jeder Adresse der Anordnung. Werden beispielsweise vier Markierungen verwendet, so können 4 X n aufeinander folgende Hybridisierungen idealerweise 4n Sequenzen unterscheiden, ob wohl in manchen Fällen mehr Schritte erforderlich sein können. Nach der Hybridisierung eins jeden Pools werden die Hybride denaturiert und die Decoder-Sonden entfernt, sodass die Sonden für die nächste Hybridisierung einzelsträngig gemacht werden (obwohl es auch möglich ist, begrenzte Mengen des Ziels zu hybridisieren, sodass die zur Verfügung stehende Sonde nicht gesättigt ist. Die aufeinander folgenden Hybridisierungen können durchgeführt und durch Subtrahieren der bereits bestehenden Signale der vorigen Hybridisierung und analysiert werden).
  • Das Beispiel dient der Illustration. Angenommen werden eine Anordnung von 16 Nucleinsäuresonden (Nummer 1–16) und vier einzigartige Marker (z.B. vier verschiedene Nanokristalle; Macker A-D). Die Decoder-Sonden 1–16 sind so gemacht, dass sie den Sonden auf den Perlen entsprechen. Der erste Schritt besteht in der Markierung der Decoder-Sonden 1–4 mit Marken A, der Decoder-Sonden 5–8 mit Macker B, der Decoder-Sonden 9–12 mit Marken C und der Decoder-Sonden 13–16 mit Macker D. Die Sonden werden gemischt, und der Pool wird mit der die Perlen und die daran gebundenen Kandidat-Sonden umfassenden Anordnung kontaktiert. Die Lage einer jeden Markierung (und somit eines jeden Decoder- und Kandidat-Sonden-Paars) wird daraufhin ermittelt. Der erste Satz an Decoder-Sonden wird dann entfernt. Ein zweiter Satz wird hinzugefügt, wobei diesmal die Decoder-Sonden 1, 5, 9 und 13 mit Marker A, die Decoder-Sonden 2, 6, 10 und 14 mit Marker B, die Decoder-Sonden 3, 7, 11 und 15 mit Marken C und die Decoder-Sonden 4, 8, 12 und 16 mit Macker D markiert werden. Demzufolge enthalten jene Perlen, die die Markierung A bei beiden Decodierungsschritten aufwiesen, Kandidat-Sonde 1; Markierung A beim ersten Decodierungsschritt und Markierung B beim zweiten Decodierungsschritt bedeutet das Beinhalten von Kandidat-Sonde 2; Markierung A beim ersten Decodierungsschritt und Markierung C beim zweiten Decodierungsschritt bedeutet das Beinhalten von Kandidat-Sonde 3; usw. In einer Ausführungsform werden die Sonden in situ markiert; das bedeutet, sie müssen nicht vor der Decodierungsreaktion markiert werden. In dieser Ausführungsform ist die zugeführte Decoder-Sonde kürzer als die Kandidat-Sonde, was zu einem 5'-„Überhang" bei der decodierenden Sonde führt. Das Hinzufügen von markierten ddNTPs (ein jedes mit einzigartiger Markierung) und von Polymerase erlaubt das Hinzufügen der Marken auf sequenzspezifische Weise, was zur Schaffung sequenzspezifischer Muster von Signalen führt. Gleichermaßen dazu könrten auch weitere Modifikationen, unter anderem Ligation usw., vorgenommen werden.
  • Zusätzlich ist es möglich, da die Größe der Anordnung durch die Anzahl der einzigartigen Decoder-Bindungsliganden bestimmt wird, einen Satz einzigartiger DBLs „wieder zu verwenden", um eine größerer Anzahl an Teststellen zuzulassen. Dies kann auf verschiedene Weisen geschehen; beispielsweise durch die Verwendung einiger optische Signaturen umfassenden Subpopulationen. Ähnlich auch die Verwendung eines Positions-Codierungssystems in der Anordnung; verschiedene Subbündel können den DBL-Satz wieder verwenden. Auf ähnliche Weise verwendet eine Ausführungsform die Perlengröße als Codierungsmodalität, was die Wiederverwendung eines Satzes einzigartiger DBLs für jede Perlengröße ermöglicht. Alternativ dazu kann auch eine aufeinander folgende partielle Beladung der Anordnung mit Perlen die Wiederverwendung von DBLs erlauben. Auch kann ein „Code-Sharing" (das Verwenden eines gemeinsamen Codes) auftreten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die DBLs durch das Vorhandensein von einigen optische Signaturen umfassenden Perlen-Subpopulationen wieder verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die optische Signatur im Allgemeinen ein zumindest einen Nanokristall umfassendes Gemisch. Durch Variieren der Zusammensetzung des Gemischs (d.h. des Verhältnisses eines Nanokristalls zu einem anderen), der Teilchengröße und der Konzentration des Nanokristalls (was zu unterschiedlichen Signalintensitäten führt) können, wie oben beschrieben, Matrizen einzigartiger optischer Signaturen generiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein räumliches oder postionsbezogenes Codierungssystem ausgeführt. In dieser Ausführungsform werden Subbündel oder Subanordnungen (d.h. Teile der Gesamtanordnung) verwendet. Analog zum Telefonsystem entspricht jede Subanordnung einer „Ortsvorwahl", die über die selben Markierungen (d.h. Telefonnummern) wie andere Subanordnungen verfügen können, die aber durch die örtliche Lage der Subanordnung auseinander gehalten wer den können. So können also dieselben einzigartigen Markierungen von Bündel zu Bündel erneut verwendet werden. Die Verwendung von 50 einzigartigen Markierungen mit 100 verschiedenen Subanordnungen kann somit eine Anordnung von 5000 verschiedenen bioaktiven Mitteln bilden. In dieser Ausführungsform ist die Fähigkeit zur Unterscheidung eins Bündels von einem anderem von Bedeutung; allgemein wird dies entweder händisch oder mittels Markerperlen, d.h. für jede Subanordnung einzigartige Markierungen umfassende Perlen, getan.
  • In weiteren Ausführungsformen können zusätzliche Codierungsparameter verwendet werden, z.B. die Größe der Mikrokügelchen. Beispielsweise kann die Verwendung von Perlen unterschiedlicher Größe die Wiederverwendung von DBL-Sätzen erlauben; das bedeutet, dass die Möglichkeit besteht, Mikrokügelchen unterschiedlicher Größe zur Erweiterung der Codierungsdimensionen der Mikrokügelchen zu verwenden. Faseroptische Anordnungen können so gefertigt werden, dass sie Pixel mit unterschiedlichen Faserdurchmessern oder -querschnitten beinhalten; alternativ dazu können zwei oder mehrere faseroptische Bündel, wobei ein jedes unterschiedliche Querschnitte der einzelnen Fasern aufweist, zu einem größeren Bündel zusammengefügt werden; oder es können faseroptische Bündel mit dieselbe Querschnittsgröße aufweisenden Fasern verwendet werden, sofern sich die Größe der Perlen unterscheidet. Bei unterschiedlichen Durchmessern können die größten Mulden mit den größten Mikrokügelchen und dann schrittweise die kleiner werdenden Mulden mit kleineren Mikrokügelchen gefüllt werden, bis alle Mulden aller Größen gefüllt sind. Auf diese Weise könnte dasselbe Nanokristallverhältnis zur Codierung von Mikrokügelchen unterschiedlicher Größe verwendet werden, wodurch die Anzahl in der Anordnung vorhandener unterschiedlicher Oligonucleotidsequenzen oder chemischen Funktionalitäten erhöht wird. Obwohl hier für faseroptische Substrate dargelegt, können diese und andere hierin beschriebene Verfahren mit anderen Substraten und anderen Bindungsweisen angewendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Codierung und die Decodierung durch aufeinander folgendes Beladen der Anordnung mit Mikrokügelchen durchgeführt. Wie oben für die räumliche Codierung beschrieben wurde, können die opti schen Signaturen in dieser Ausführungsform „wieder verwendet" werden. In dieser Ausführungsform ist die Bank der Mikrokügelchen, von denen jedes ein unterschiedliches bioaktives Mittel umfasst (oder Subpopulationen, von denen jede ein unterschiedliches bioaktives Mittel umfasst), in eine Vielzahl von Subbanken aufgeteilt; beispielsweise werden, abhängig von der Größe der gewünschten Anordnung und der Anzahl an einzigartigen Markierungen, 10, je ca. 10% der Gesamtbank umfassende Subbanken gebildet, wobei jede Subbank in etwa dieselben einzigartigen Markierungen umfasst. Dann wird die erste Subbank zu dem die Mulden umfassenden faseroptischen Bündel hinzugefügt und die Lage eines jeden bioaktiven Mittels, üblicherweise unter Einsatz eines DBLs, bestimmt. Daraufhin wird die zweite Bank hinzugefügt, und die Lage eines jeden bioaktiven Mittels wird erneut ermittelt. In diesem Fall umfasst das Signal das Signal des „ersten" DBL und des „zweiten" DBL; durch Vergleichen der zwei Matrizen kann die Lage einer jeden Perle in jeder Subbank ermittelt werden. Das aufeinander folgende Hinzufügen der dritten, vierten usw. Subbank erlaubt gleichermaßen ein Füllen der Anordnung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Codes auf verschieden Weisen „gemeinsam verwendet" werden (Code-Sharing). In einer ersten Ausführungsform kann ein einziger Code (d.h. IBL-DBL-Paar) zwei oder mehr Mittel zugeteilt werden, sofern sich die Zielanalyten bezüglich ihrer Bindungsstärke ausreichend unterscheiden. Beispielsweise können bei einer Untersuchung zur mRNA-Quantifizierung verwendete Nucleinsäuresonden den selben Code benutzen, sofern sich die Bereiche ihrer Hybridisierungssignalintensitäten nicht überschneiden. Dies kann dann geschehen, wenn eine der Zielsequenzen immer mit einer höheren Konzentration als die andere gegenwärtig ist. Alternativ dazu können die Sequenzen ständig mit ähnlicher Konzentration präsent sein, sich jedoch bezüglich ihrer Hybridisierungseffizienz unterscheiden.
  • Alternativ dazu kann ein und derselbe Code mehreren Mitteln zugeteilt werden, sofern diese Mittel funktionell gleichwertig sind. Wird beispielsweise ein Satz an Oligonucleotidsonden zum Zweck des Detektierens der Gegenwart eines bestimmten Gens entwickelt, sind die Sonden, auch wenn sie sich in ihrer Sequenz unterschei den können, funktionell gleichwertig. Gleichermaßen, wenn Klassen von Analyten erwünscht sind, können alle Sonden für unterschiedliche Mitglieder einer Klasse, z.B. Kinasen oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, einen gemeinsamen Code verwenden. Auf ähnliche Weise kann eine derartige Anordnung zur Detektion von Homologen bekannter Gene verwendet werden. In dieser Ausführungsform ist jedes Gen durch einen heterologen Sondensatz, der an unterschiedliche Bereiche des Gens hybridisiert (und demzufolge sich bezüglich der Sequenz unterscheidet), repräsentiert. Der Sondensatz verwendet einen gemeinsamen Code. In Gegenwart eines Homologs kann es an einige, jedoch nicht an alle, Sonden hybridisieren. Das Ausmaß der Homologie kann, so wie auch die durchschnittliche Hybridisierungsintensität, durch den Anteil der hybridisierenden Sonden aufgezeigt werden. Gleichermaßen können mehrere Antikörper gegen ein und dasselbe Protein alle einen gemeinsamen Code teilen.
  • In jeder der zahlreichen oben beschriebenen Ausführungsformen kann das Mikrokügelchensystem am distalen Ende des optischen Faserbündels unter Einsatz zahlreicher kompatibler Verfahren angebracht werden. Die Mikrokügelchen befinden sich nahe dem Ende des Bündels. So wird gewährleistet, dass das zurückgeworfene Licht in jeder optischen Faser in erster Linie von einem einzigen Mikrokügelchen stammt. Dieses Charakteristikum ist nötig, um die Abfrage der optischen Signatur der einzelnen Mikrokügelchen zur Identifikation von die Funktionalität des Mikrokügelchen involvierenden Reaktionen zu ermöglichen sowie um die in diesen Mikrokügelchen enthaltenen Nanokristallverhältnisse zu decodieren. Die Anhaftungs- oder Anbringungsverfahren dürfen die Mikrokügelchen jedoch nicht vom Analyten isolieren.
  • Vorzugsweise übermittelt jede optische Faser eines Bündels Licht von einer einzigen in ihrer Mulde befindlichen Perle. Durch Abbilden des Bündelendes auf eine CCD-Anordnung werden folglich die optischen Signaturen der Mikrokügelchen individuell abfragbar.
  • Als Beispiel enthält, um Mikromulden auszubilden und Mikrokügelchen in die Mulden zu platzieren, eine 1 mm hexagonal gepackte Abbildungsfaser ca. 20.600 einzelne optische Fasern mit einem Kerndurchmesser von ca. 3,7 μm (Teile-Nr. ET26 von Galileo Fibers). Typischerweise sind die Kerne einer jeden Faser von hexagonaler Form, als Ergebnis der Ausgangsform; d.h. beim Ziehen verändert sich die Form der Faser üblicherweise nicht. In einigen Fällen kann die Form jedoch auch rund sein.
  • Weiters werden in diesem Beispiel sowohl das proximale als auch das distale Ende des Faserbündels sukzessive auf 12 μm, 9 μm, 3 μm, 1 μm und 0,3 μm Läppfilmen poliert. Daraufhin können die Enden mittels eines Rasterkraftmikroskops auf Kratzer untersucht werden. Eine Lösung aus 0,2 Gramm NH4F (Ammoniumfluorid) mit 600 μl destilliertem H2O und 100 μl NF (Fluorwasserstoffsäure), 50% Stammlösung, kann verwendet werden. Das distale Ende wird in dieser Lösung für eine bestimmte Zeit, vorzugsweise etwa von 30 bis 600 Sekunden, noch bevorzugter für 80 Sekunden, geätzt.
  • Nach dem Entfernen aus der Lösung wird das Bündelende zur Verhinderung weiterer Ätzungen sofort in entionisiertes Wasser getaucht. Danach wird die Faser mit laufendem Leitungswasser abgespült. Bei dieser Stufe wird vorzugsweise eine einige Minuten dauernde Beschallung zur Entfernung von etwaigen Salzprodukten der Reaktion durchgeführt. Danach wird die Faser luftgetrocknet.
  • Das vorangegangene Verfahren bildet durch anisotropisches Ätzen der Faserkerne, vorzugsweise in Bezug auf die Beschichtung für jede Faser des Bündels, Mulden. Die Mulden weisen in etwa den Durchschnitt der Kerne, 3,7 μm, auf. Dieser Durchmesser wird in diesem Beispiel etwas größer als der Durchmesser der Mikrokügelchen, 3,1 μm, gewählt. Es kommt zu einer gezielten Ätzung, weil das reine Siliciumdioxid der Kerne in Gegenwart von Fluorwasserstoffsäure schneller ätzt als die Beschichtungen.
  • Danach werden die Mikrokügelchen gemäß verschiedener Verfahren in den Mulden platziert. Das Platzieren der Mikrokügelchen kann durch Tropfen einer Lösung, die die gewünschten zufällig gemischten Subpopulationen der Mikrokügelchen enthält, auf das distale Ende, Beschallung des Bündels zur Ablagerung der Mikrokügelchen in den Mulden und Abdampfen des Lösungsmittels der Mikrokügelchen vollzogen werden. Alternativ dazu können die Subpopulationen hintereinander zum Bündelende zugeführt werden. Unter Verwendung einer verdünnten Lösung aus sulfoniertem Nafion, welche auf das Ende getropft wird, können die Mikrokügelchen in den Mulden fixiert werden. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels wurde ein dünner Nafion-Film über den Mikrokügelchen gebildet, welcher diese an Ort und Stelle hält. Dieser Ansatz ist zum Fixieren von FITC-Funktionalität tragenden Mikrokügelchen für die pH-Wert-Anzeige kompatibel. Die resultierende Anordnung von angebrachten Mikrokügelchen behält ihre pH-Empfindlichkeit aufgrund der Permeabilität des sulfonierten Nafions für Wasserstoffione bei. Dieser Ansatz kann jedoch nicht generell angewendet werden, da Nafion für die meisten wasserlöslichen Substanzen impermeabel ist. Eine ähnliche Herangehensweise kann mit verschiedenen Polymeren durchgeführt werden. Beispielsweise können Lösungen von Polyethylenglykol, Polyacrylamid oder Polyhydroxymethylmethacrylat (PolyHEMA) anstelle von Nafion verwendet werden, welche die erforderliche Permeabilität für wässrige Substanzen bereitstellt.
  • Ein anderes Verfahren zur Anbringung benutzt das Schwellen der Mikrokügelchen zum Festhalten eines jeden Mikrokügelchen in seiner entsprechenden Mikromulde. Bei diesem Ansatz werden die Mikrokügelchen zuerst durch Beschallung der in einem nichtschwellenden Lösungsmittel suspendierten Mikrokügelchen in Gegenwart der Mikromuldenanordnung am distalen Ende auf die Mikromulden verteilt. Nach Platzierung in den Mikromulden werden die Mikrokügelchen einem wässrigen Puffer ausgesetzt, in dem sie anschwellen und so physikalisch festgehalten werden, so wie Muffins, die in ihren Förmchen aufgehen.
  • Eine der herkömmlichen Mikrokügelchenformationen ist Tentagel, ein Styrol-Polyethylenglykol-Copolymer. Diese Mikrokügelchen schwellen in nichtpolaren Lösungen, z.B. in Hexan, nicht an, werden sie jedoch einem stärker polaren oder wässrigem Medium ausgesetzt, so schwellen sie um etwa 20–40% ihres Volumens an.
  • Diese Herangehensweise ist deshalb höchst wünschenswert, da sie die Diffusions- oder Permeabilitätseigenschaften der Mikrokügelchen selbst nicht signifikant beeinträchtigt.
  • In den meisten Umgebungen ist es gegebenenfalls unnötig, chemische oder mechanische Methoden zur Fixierung der Mikrokügelchen zu verwenden. In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere bei der Verwendung von Mulden, können die Perlen mittels eines Beschallungsschritts in den Mulden platziert werden.
  • Einmal hergestellt finden die Zusammensetzungen der Erfindung Verwendung in zahlreichen Anwendungen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen zum Sondieren einer Probenlösung zur Feststellung der Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielanalyten, einschließlich der mengenmäßigen Quantifizierung des vorhandenen Zielanalyten, verwendet. Unter „Zielanalyt" oder „Analyt" und grammatikalischen gleichwertigen Bezeichnungen ist hierin ein Atom, Molekül, Ion, Molekülion, eine Verbindung oder ein Teilchen zu verstehen, welches entweder detektiert oder auf Bindungspartner hin untersucht werden soll. Wie für Fachleute im Bereich der Erfindung klar ersichtlich ist, kann eine große Anzahl von Analyten in der vorliegenden Erfindung verwendet werden; praktisch kann jeder Analyt verwendet werden, der an ein bioaktives Mittel bindet oder für den ein Bindungspartner (d.h. Kandidat-Medikament) gesucht wird.
  • Geeignete Analyte sind unter anderem organische und anorganische Moleküle, einschließlich Biomolekülen. Wird die Detektion eines Zielanalyten durchgeführt, umfassen geeignete Zielanalyten unter anderem, jedoch nicht ausschließlich, einen Umweltschadstoff (einschließlich Pestiziden, Insektiziden, Toxinen usw.); eine Chemikalie (einschließlich Lösungsmitteln, Polymeren, organischen Materialien usw.); therapeutische Moleküle (einschließlich therapeutischen Medikamenten und Drogen, Antibiotika usw.); Biomoleküle (einschließlich Hormonen, Cytokinen, Proteinen, Nucleinsäuren, Lipiden, Kohlenhydraten, Zellmembranantigenen und Rezeptoren (neurale, hormonelle, Nährstoff- und Zelloberflächenrezeptoren) oder deren Liganden usw.); ganze Zellen (einschließlich prokaryotischen (z.B. pathogene Bakterien) und euka ryotischen Zellen, einschließlich Tumorzellen von Säugern); Viren (einschließlich Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Lentiviren usw.); und Sporen; usw. Besonders bevorzugte Analyten sind Nucleinsäuren und Proteine.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt ein Protein. Wie den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, gibt es eine Vielzahl möglicher proteinartiger Zielanalyten, die unter Einsatz der vorliegenden Erfindung detektiert oder auf Bindungspartner untersucht werden können. Geeignete Proteinzielanalyten sind unter anderem, aber nicht ausschließlich, (1) Immunoglobine; (2) Enzyme (und andere Proteine); (3) Hormone und Zytokine (von denen viele als Liganden für Zellrezeptoren) dienen; und (4) andere Proteine.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure. Diese Tests finden in einer Vielzahl von Anwendungen Verwendung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sonden für genetische Diagnose verwendet. Beispielsweise können Sonden unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren hergestellt werden, um Zielsequenzen, beispielsweise das Gen für nichtpolypösen Dickdarmkrebs, das BRCA1-Brustkrebsgen, P53, das ein mit zahlreichen Krebsarten in Verbindung gebrachtes Gen ist, das Apo-E4-Gen, das ein Indikator für eine höheres Alzheimerrisiko ist, was ein einfaches präsymptomatisches Screening von Patienten ermöglicht, Mutationen im Mukoviszidose-Gen, in den Cytochromen P450 oder einem der anderen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten zu detektieren.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform wir die virale oder bakterielle Detektion unter Verwendung von Komplexen der Erfindung durchgeführt. In dieser Ausführungsform sind die Sonden so konzipiert, dass sie Zielsequenzen einer Reihe von Bakterien und Viren detektieren. Beispielsweise basieren derzeitige Blutuntersuchungsverfahren auf der Detektion von Anti-HIV-Antikörpern. Die hierin offenbarten Verfahren erlauben ein direktes Screening klinischer Proben zur Detektion von HIV-Nucleinsäuresequenzen, insbesondere von hochkonservierten HIV-Sequenzen. Weiters erlaubt dies eine direkte Überwachung des zirkulierenden Virus in einem Patienten in einem verbesserten Verfahren zur Evaluierung der Wirksamkeit von antiviralen Therapien. Ähnlich können auch mit Leukämie in Zusammenhang gebrachte Viren, HTLV-I und HTLV-II, auf diese Weise nachgewiesen werden. Bakterielle Infektionen wie Tuberkulose, Chlamydien oder andere sexuell übertragbare Krankheiten können ebenso detektiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleinsäuren der Erfindung als Sonden für toxische Bakterien bei der Untersuchung von Wasser- und Nahrungsmittelproben herangezogen. Beispielsweise können Proben behandelt werden, um Bakterien zu lysieren, sodass diese ihre Nucleinsäuren freisetzen, und dann können Sonden so konzipiert werden, dass sie Bakterienstämme, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, pathogener Stämme wie z.B. Salmonella Campylobacter, Vibrio cholerae, Leishmania, enterotoxischer Stämme von E. coli und den Legionärskrankheitsbakterien, erkennen. Ähnlich können auch Strategien zur biologischen Sanierung unter Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung evaluiert werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden für forensische Untersuchungen „genetischer Fingerabdrücke" bezüglich Übereinstimmungen von vom Tatort stammender DNA mit Proben von Opfern und Verdächtigen verwendet.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden in einer Anordnung zum Sequenzieren durch Hybridisierung verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung findet auch als Verfahren zur Detektion von Mutationen oder Fehlpaarungen bei Zielnucleinsäuresequenzen Verwendung. Beispielsweise wurde in jüngster Zeit der Analyse der Beziehung zwischen genetischer Variabilität und Phänotypus unter Verwendung von polymorphen DNA-Markern große Aufmerksamkeit geschenkt. Bei vorangegangen Arbeiten wurden kurze Tandem-Wiederholungen (STRs) als polymorphe Positionsmarken eingesetzt; der jüngste Fokus liegt jedoch bei der Verwendung von Einzelnucleotid-Polymorphismen (SNPs), die mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von mehr als 1 pro Kilobase in der menschlichen genomischen DNA auftreten. Einige SNPs, insbesondere jene in und um Codierungssequenzen, sind wahrscheinlich direkte Ursache von therapeutisch relevanten phänotypischen Varianten. Es gibt zahlreiche wohl bekannte Polymorphismen, die klinisch bedeutsame Phänotypen bewirken; beispielsweise werden ApoE2/3/4-Varianten mit verschiedenen relativen Risiken für Alzheimer und andere Krankheiten in Verbindung gebracht (vgl. Condor et al., Science 261 (1993)). Multiplex-PCR-Amplifikation von SNP-Orten mit darauf folgender Hybridisierung an Oligonucleotidanordnungen stellte sich präzises und verlässliches Verfahren zur gleichzeitigen Genotypisierung von zumindest Hunderten von SNPs heraus; vgl. Wang et al., Science 280, 1077 (1998); vgl. auch Schäfer et al., Nature Biotechnology 16, 33–39 (1998). Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können einfach die Anordnungen nach dem Stand der Technik ersetzen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der Erfindung zum Screenen bioaktiver Mittel verwendet, um ein Mittel ausfindig zu machen, welches an ein Zielmolekül bindet und dessen Funktion vorzugsweise modifiziert. Wie oben beschrieben können zahlreiche unterschiedliche Untersuchungsmethoden herangezogen werden, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Im Allgemeinen wird der Zielanalyt, für den ein Bindungspartner gewünscht wird, markiert; das Binden des Zielanalyten mittels des bioaktiven Mittels mündet in der Übertragung der Markierung auf die Perle, woraufhin die Detektion erfolgt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung des bioaktiven Mittels und des Zielanalyten spezifisch; das heißt das bioaktive Mittel bindet spezifisch an den Zielanalyten. Unter „spezifisch binden" wird hierin verstanden, dass das Mittel mit einer Spezifität ausreichend für die Unterscheidung des Analyten von anderen Komponenten oder Verunreinigungen der Testprobe an den Analyten bindet. Wie für Fachleute auf dem Gebiet ersichtlich ist, besteht jedoch die Möglichkeit, Analyten unter Verwendung nicht sehr spezifischer Bindung zu detektieren; beispielsweise können die Systeme unterschiedliche Bindungsliganden verwenden, z.B. eine Anordnung unterschiedlicher Liganden, und die Detektion eines jeden bestimmten Analyten wird mittels seiner „Signatur" der Bindung an eine Gruppe von Bindungsliganden durchge führt, ähnlich dem Funktionieren von „künstlichen Nasen". Dies ist besonders beim Detektieren von chemischen Analyten von Nutzen. Die Bindung sollte stark genug sein, um unter den Untersuchungsbedingungen aufrecht zu bleiben, einschließlich der Waschschritte zum Entfernen nichtspezifischer Bindungen, obwohl in einigen Ausführungen Waschschritte nicht wünschenswert sind; d.h. beim Detektieren von Bindungspartnern mit niedriger Affinität. In einigen Ausführungsformen, beispielsweise bei der Detektion von bestimmten Biomolekülen, liegt die Dissoziationskonstante des Analyten zum Bindungsligand bei unter ca. 10– 4-10– 6 M–1, vorzugsweise bei unter ca. 10– 5 bis 10– 9 M–1, noch bevorzugter bei unter ca. 10–7 bis 10– 9 M–1.
  • Üblicherweise wird eine einen Zielanalyten umfassende Sonde (entweder zum Nachweis des Zielanalyten oder zur Suche nach Bindungspartnern für den Zielanalyten) einer Anordnung unter zur Bindung des Zielanalyten an zumindest eines der bioaktiven Mittel geeigneten Bedingungen zugeführt; d.h. unter im Allgemeinen physiologischen Bedingungen. Dann wird die Gegenwart bzw. Abwesenheit des Zielanalyten nachgewiesen. Wie den Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar ist, kann dies auf verschiedene Weisen durchgeführt werden, üblicherweise mittels einer Veränderung im optischen Signal. Diese Veränderung kann via verschiedener Mechanismen auftreten. Einige Beispiele schließen die Bindung des mit einem Nanokristall markierten Analyten an die Perle, die Herstellung einer Nanokristallart auf oder nahe der Perle, die Zerstörung einer bestehenden Nanokristallspezies, eine Veränderung der optischen Signatur nach der Wechselwirkung des Analyten mit dem Nanokristall auf der Perle und jeden anderen optisch abfragbaren Vorgang ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Veränderung des optischen Signals Resultat der Bindung eines direkt oder indirekt mit einer detektierbaren, vorzugsweise zumindest einen Nanokristall umfassenden, Markierung versehenen Zielanalyten.
  • Ein hierin bereitgestelltes Beispiel verwendet einen proteinartigen Zielanalyten, der entweder direkt mit zumindest einem Nanokristall oder indirekt, beispielsweise mittels eines markierten Antikörpers, markiert ist. Auf ähnliche Weise können Nucleinsäuren mit einem Nanokristall markiert sein, beispielsweise während der auf dem Gebiet der Erfindung bekannten PCR-Amplifikation. Alternativ dazu kann nach der Bindung der Zielsequenzen ein Hybridisierungsindikator als Markierung eingesetzt werden. Hybridisierungsindikatoren binden vorzugsweise an doppelsträngige Nucleinsäure, üblicherweise auf reversible Weise. Hybridisierungsindikatoren sind unter anderem Interkalationsverbindungen und an kleine und/oder große Furche bindende Gruppierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform können Interkalationsverbindungen verwendet werden; da es im Allgemeinen nur in Gegenwart einer doppelsträngigen Nucleinsäure zu einer Interkalation kommt, leuchtet die Markierung nur in der Gegenwart einer Zielhybridisierung auf. So wird nach Bindung des Zielanalyten an das bioaktive Mittel ein neues optisches Signal an dieser Stelle generiert, das daraufhin detektiert werden kann.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Perle zwar keine Lumineszenz-Markierung, sehr wohl aber das Ziel, wodurch die Veränderung in der Detektion der zumindest einen Nanokristall umfassenden optischen Signatur des Ziels besteht, wobei das Ziel an die Perle gebunden ist. Für weitere Beschreibungen für die Bindung von Nanokristallen an Biomoleküle vergleiche beispielsweise Bruchez, oben, und Chan und Nie, oben.
  • In einem Beispiel wird der Nanokristall an das Mikrokügelchen, das Ziel, den DBL oder das bioaktive Mittel über eine Avidin-Biotin-Wechselwirkung gebunden. Biotin wird kovalent an die Nanokristalloberfläche gebunden, und die biotinylierten Nanokristalle werden zur Markierung der Perle, des Ziels usw. verwendet, welches in Phalloidin-Biotin und Streptavidin inkubiert wurde. Andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte klassische Ligand-Rezeptor-Bindungsmodelle können zur gewünschten Bindung von Nanokristallen an Zusammensetzungen verwendet werden.
  • Alternativ dazu generiert in einigen Fällen, wie oben beschrieben, der Zielanalyt, z.B. ein Enzym, eine Spezies, welche entweder direkt oder indirekt optisch detektierbar ist.
  • Weiters kann in einigen Ausführungsformen eine Veränderung der optischen Signatur die Grundlage für das optische Signal sein. Beispielsweise kann die Wechselwirkung zwischen einigen chemischen Zielanalyten und einem Nanokristall auf der Perle die optische Signatur ändern und somit ein unterschiedliches optisches Signal schaffen.
  • Wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, kann in einigen Ausführungsformen die Gegenwart bzw. Abwesenheit von Zielanalyten mittels Veränderungen von anderen optischen oder nichtoptischen Signalen, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie, der Oberflächen-Plasmonresonanz, der Radioaktivität, bestimmt werden.
  • Die Untersuchungen können unter verschiedensten Versuchsbedingungen durchgeführt werden, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann in die Screening-Untersuchungen eingebunden werden. Diese schließen Reagenzien wie Salze, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergenzien usw. ein, die zur Erleichterung der optimalen Protein-Protein-Bindung und/oder zur Reduktion nichtspezifischer oder Hintergrund-Wechselwirkungen eingesetzt werden können. Auch die Effizienz der Untersuchung auf andere Weise steigernde Reagenzien, wie Protease-Inhibitoren, Nuclease-Inhibitoren, antimikrobielle Mittel usw., können verwendet werden. Das Gemisch der Komponenten kann in jeder für die erforderliche Bindung geeigneten Reihenfolge zugesetzt werden. Verschiedene Blockier- und Waschschritte können, wie nach dem Stand der Technik bekannt ist, durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden zweifarbige kompetitive Hybridisierungsuntersuchungen durchgeführt. Diese Untersuchungen können auf herkömmlichen Sandwichtests basieren. Die Perlen enthalten eine auf einer Seite (entweder stromauf- oder stromabwärts) des SNP befindliche Einfangsequenz zum Einfangen der Zielsequenz. Zwei SNP-Allel-spezifische Sonden, eine jede mit einem unterschiedlichen Nanokristall markiert, werden an die Zielsequenz hybridisiert. Der Genotypus kann von einem Verhältnis der zwei Signale erhalten werden, wobei im All gemeinen die korrekte Sequenz eine bessere Bindung aufweist. Dies hat den Vorteil, dass die Zielsequenz selbst nicht markiert werden muss. Außerdem, da die Sonden konkurrieren, kommt hinzu, dass die Bindungsbedingungen nicht optimiert werden müssen. Unter Bedingungen, bei denen eine fehlgepaarte Sonde stabil gebunden würde, kann eine richtig gepaarte Sonde sie immer noch verdrängen. Der kompetitive Test sorgt demnach unter diesen Bedingungen für eine bessere Unterscheidung. Da zahlreiche Untersuchungen parallel ausgeführt werden, können die Bedingungen nicht gleichzeitig für jede Sonde optimiert werden. Deshalb kann ein kompetitives Testsystem als Kompensationshilfe für die nicht-optimalen Bedingungen für die Fehlpaarungsunterscheidung herangezogen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Didesoxynucleotid-Kettenabbruchsequenzierung unter Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird eine DNA-Polymerase zur Ausweitung eines Primers unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten ddNTPs angewendet. Das 3'-Ende des Primers befindet sich direkt neben der SNP-Stelle. Auf diese Weise ist die Ausweitung der einzelnen Base komplementär zur Sequenz an der SNP-Stelle. Unter Verwendung von vier verschiedenen Nanokristallen, einen für jede Base, kann die SNP-Sequenz durch Vergleich der vier Basen-spezifischen Signale abgeleitet werden. Dies kann auf verschiedene Weisen getan werden. In einer ersten Ausführungsform kann die Einfangsonde verlängert werden; bei dieser Herangehensweise muss die Sonde entweder 5'–3' auf der Perle synthetisiert werden oder am 5'-Ende gebunden werden, um ein freies 3'-Ende zur Polymeraseverlängerung bereitzustellen. Alternativ dazu kann ein Sandwichtest durchgeführt werden; in dieser Ausführungsform wird das Ziel durch eine Sonde an der Perle eingefangen; woraufhin ein Primen anelliert wird verlängert wird. Wieder muss im letzten Fall die Zielsequenz nicht markiert werden. Da Sandwichuntersuchungen zwei spezifische Wechselwirkungen benötigen, sorgt dies zusätzlich für mehr Stringenz, was insbesondere für die Analyse komplexer Proben hilfreich ist.
  • Zusätzlich ist es möglich, wenn sowohl der Zielanalyt als auch der DBL an das Mittel binden, nichtmarkierte Zielanalyte mittels kompetitiven Decodierens nachzuweisen.
  • In einer Ausführungsform, bei der die Ziel direkt oder indirekt markiert sind, umfasst die Markierung zumindest einen Nanokristall.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Verfahren der Erfindung bei der Anordnungsqualitätskontrolle hilfreich. Vor dieser Erfindung wurden keine Verfahren zur Bereitstellung eines positiven Tests der Leistung einer jeden Sonde auf jeder Anordnung beschrieben. Das Decodieren der Anordnung stellt nicht nur diesen Test bereit, sondern tut dies unter Verwendung der während des Decodierungsverfahrens selbst erhaltenen Daten. Es ist demnach keine zusätzliche Versuchsarbeit erforderlich. Die Erfindung bedarf einzig eines Satzes von Datenanalysealgorithmen, die in einer Software kodiert werden können.
  • Das Verfahren zur Qualitätskontrolle kann eine Vielzahl systematischer und zufälliger Probleme in einer Anordnung identifizieren. Beispielsweise können zufällige Staubkörnchen oder andere Verunreinigungen dazu führen, dass einige Sensoren ein inkorrektes Signal abgeben – dies kann während des Decodierens detektiert werden. Auch kann die Auslassung eines oder mehrerer Mittel in multiplen Anordnungen detektiert werden. Ein Vorteil dieses Qualitätskontrollverfahrens ist, dass es unmittelbar vor der eigentlichen Untersuchung durchgeführt werden kann und einen echten Funktionstest für jeden einzelnen Sensor darstellt. Somit können jegliche Probleme, die möglicherweise zwischen Anordnungszusammenbau und tatsächlicher Verwendung auftreten könnten, detektiert werden. Bei Anwendungen, die einen hohes Vertrauensniveau voraussetzen und/oder bei denen die Möglichkeit eines Sensorfehlers während des Versuchsverfahrens beträchtlich ist, können Decodierung und Qualitätskontrolle sowohl vor als auch nach der eigentlichen Probenanalyse durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Anordnungen zur Reagensqualitätskontrolle verwendet werden. In vielen Fällen werden biologische Makromoleküle als Reagenzien verwendet und müssen einer Qualitätskontrolle unterzogen werden. Beispielsweise können große Sätze von Oligonucleotidsonden als Reagenzien be reitgestellt werden. Typischerweise ist es schwierig, eine Qualitätskontrolle für eine große Anzahl unterschiedlicher biologischer Makromoleküle durchzuführen. Die hierin beschriebene Vorgehensweise kann verwendet werden, um dies mittels Behandlung der Reagenzien (als DBLs formuliert) als Variable anstelle der Anordnungen durchzuführen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hierin beschriebenen Vorgehensweisen bei der Anordnungskalibration verwendet. Für zahlreiche Anwendungen, z.B. der quantitativen Bestimmung von mRNA, ist ein Signal wünschenswert, das eine lineare Reaktion auf die Konzentration des Zielanalyten ist, oder alternativ, falls nichtlinear, ist es wünschenswert, eine Beziehung zwischen Konzentration und Signal zu bestimmen, sodass die Konzentration des Zielanalyten geschätzt werden kann. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Schaffung von Kalibrationskurven parallel für mehrere Perlen in einer Anordnung bereit. Die Kalibrationskurven können unter die Komplexität der zu analysierenden Probe simulierenden Bedingungen geschaffen werden. Jede Kurve kann unabhängig von den anderen (z.B. für einen unterschiedlichen Konzentrationsbereich), jedoch gleichzeitig mit allen anderen Kurven für die Anordnung erstellt werden. So wird in dieser Ausführungsform also das sequentielle Decodierungsschema mit verschiedenen Konzentrationen, die als Code-„Markierungen" verwendet werden, und nicht mit verschiedenen Nanokristallen ausgeführt. So kann das Signal als Reaktion auf die Konzentration für jede Perle gemessen werden. Diese Kalibration kann kurz vor der Verwendung der Anordnung durchgeführt werden, sodass jede Sonde auf jeder Anordnung individuell nach Bedarf kalibriert werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verfahren der Erfindung bei der Untersuchungsentwicklung herangezogen werden. Beispielsweise erlauben die Verfahren die Identifizierung von guten und schlechten Sonden; wie den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, funktionieren einige Sonden aufgrund ihrer mangelhaften Hybridisierung oder der Kreuzhybridisierung mit mehr als einer Sequenz nicht sehr gut. Während der Decodierung können solche Probleme leicht detektiert werden. Die Fähigkeit zur schnellen Bewertung der Sondenleistung liefert das Potential zur deutlichen Verringerung von Zeit und Kosten der Entwicklung der Untersuchung.
  • Ähnlich sind, in einer bevorzugten Ausführungsform, die Verfahren der Erfindung zur quantitativen Bestimmung bei der Untersuchungsentwicklung von Nutzen. Eine große Herausforderung besteht für zahlreiche Untersuchungen in der Fähigkeit zum Detektieren von Unterschieden der Analytkonzentration zwischen Proben, zum Quantifizieren dieser Unterschiede und zum Messen der absoluten Konzentration der Analyte, immer in Gegenwart eines komplexen Gemischs von ähnlichen Analyten. Ein Beispiel für dieses Problem ist die Quantifizierung einer spezifischen mRNA in Gegenwart einer vollständig zellulären mRNA. Ein Ansatz, der auf Basis der mRNA-Quantifizierung entwickelt wurde, verwendet mehrere richtig- und mehrere fehlgepaarte Sondenpaare (Lockhart et al. (1996)), hiermit zur Gänze durch Verweis hierin aufgenommen. Während dieser Ansatz zwar einfach ist, bedarf er einer relativ großen Anzahl an Sonden. Bei diesem Ansatz wird eine quantitative Reaktion auf die Konzentration durch Mitteln der Signale eines Satzes von unterschiedlichen Sonden am Gen oder an der Sequenz von Interesse. Dies ist notwendig, weil nur einige der Sonden quantitativ reagieren, und es ist möglich, diese Sonden mit Gewissheit vorherzusagen. In Abwesenheit von anderen Wissen ist nur die mittlere Reaktion einer angemessen gewählten Sammlung von Sonden quantitativ. In der vorliegenden Erfindung jedoch kann dies allgemein auf nucleinsäurebasierende Untersuchungen und auf andere Untersuchungen angewendet werden. Kurz gesagt geht es bei diesem Ansatz um die Identifizierung von Sonden, die quantitativ auf in einer bestimmten Untersuchung reagieren, anstatt sie mit anderen Sonden zu mitteln. Dies wird unter Verwendung des oben angeführten Anordnungskalibrationsschemas vollzogen, bei dem konzentrationsbasierte Codes verwendet werden. Vorteile dieses Ansatzes sind unter anderem: geringerer Bedarf an Sonden; die Genauigkeit der Messung ist von der Anzahl der verwendeten Sonden weniger abhängig; und die Reaktion der Sensoren ist mit einem hohen Maß an Gewissheit bekannt, da jede einzelne der Sequenzen auf effiziente Weise getestet werden kann. Es ist wichtig festzuhalten, dass die eine gute Leistung bringenden Sonden empirisch ausgewählt werden, was, insbesondere bei komplexen Sequenzgemischen, Schwierigkeiten und Ungewissheiten bei der Vorhersage der Leistung der Sonden verhindert. Im Gegensatz dazu wurden bei bisher beschriebenen Versuchen mit geordneten Anordnungen eine relativ kleine Anzahl an Sequenzen mittels Durchführung von quantitativen Spiking-Versuchen geprüft, bei denen eine bekannte mRNA dem Gemisch zugeführt wurde.

Claims (38)

  1. Zusammensetzung, umfassend: a) ein Substrat mit einer Oberfläche, die diskrete Stellen umfasst; sowie b) eine Population von Mikrokügelchen, die auf den Stellen verteilt sind, worin zumindest eines der Mikrokügelchen einen Nanokristall umfasst; dadurch gekennzeichnet, dass die diskreten Stellen gemustert sind und dass zumindest eines der Mikrokügelchen zumindest einen eingebetteten Nanokristall umfasst.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Nanokristall unter Einsatz des Sol-Gel-Polymerisationsverfahrens dicht in poröse Kieselsäure-Mikrokügelchen eingeschlossen ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das den Nanokristall umfassende Mikrokügelchen weiters zumindest einen zusätzlichen Nanokristall umfasst.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zumindest mehrere Mikrokügelchen umfasst, worin jedes der mehreren Mikrokügelchen Nanokristalle umfasst.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin zumindest zwei Mikrokügelchen eine optische Signatur umfassen, die jeweils unterschiedlich ist.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die beiden Mikrokügelchen jeweils einen Nanokristall umfassen und worin sich die Nanokristalle in der Größe voneinander unterscheiden.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Mikrokügelchen bioaktive Mittel umfassen.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die bioaktiven Mittel Nucleinsäuren umfassen.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die bioaktiven Mittel Proteine umfassen.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin die Proteine aus der aus Enzymen und Antikörpern bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Population von Mikrokügelchen zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation umfasst, umfassend: i) ein erstes bzw. ein zweites bioaktives Mittel; sowie ii) eine erste bzw. eine zweite optische Signatur, die fähig sind, jedes bioaktive Mittel zu identifizieren, worin zumindest eine der optischen Signaturen den Nanokristall umfasst.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin zumindest eine der optischen Signaturen zumindest zwei Nanokristalle umfasst.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin die erste und die zweite optische Signatur jeweils einen Nanokristall umfassen und worin sich die Nanokristalle in der Größe voneinander unterscheiden.
  14. Anordnungszusammensetzung, umfassend: a) ein Substrat mit einer Oberfläche, die diskrete Stellen umfasst; sowie b) eine Population von Mikrokügelchen, die zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation umfasst; dadurch gekennzeichnet, dass die diskreten Stellen gemustert sind und dass jede Subpopulation ein bioaktives Mittel umfasst, das einen Zielanalyten gebunden ist, der einen eingebetteten Nanokristall umfasst, und worin die Mikrokügelchen auf der Oberfläche verteilt sind.
  15. Anordnungszusammensetzung nach Anspruch 14, worin jede Subpopulation umfasst: i) ein bioaktives Mittel; und ii) einen Identifikator-Bindungsliganden, der an einen Decoder-Bindungsliganden gebunden ist, der einen eingebetteten Nanokristall umfasst, so dass die Identifikation des bioaktiven Mittels aufgeklärt werden kann.
  16. Anordnungszusammensetzung nach Anspruch 14, worin jede Subpopulation ein bioaktives Mittel umfasst, das an einen Decoder-Bindungliganden gebunden ist, der einen eingebetteten Nanokristall umfasst.
  17. Anordnungszusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin sich zumindest ein Nanokristall der ersten Subpopulation in der Größe von einem Nanokristall der zweiten Subpopulation unterscheidet.
  18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, worin die bioaktiven Mittel Nucleinsäuren sind.
  19. Zusammensetzung nach Anspruch 17, worin die bioaktiven Mittel Proteine sind.
  20. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend: a) das Bilden einer Oberfläche, die einzelne Stellen auf einem Substrat umfasst; sowie b) das Verteilen von Mikrokügelchen auf der Oberfläche, so dass die einzelnen Stellen Mikrokügelchen umfassen, worin die Mikrokügelchen eine optische Signatur umfassen; dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Stellen gemustert sind und dass zumindest eine optische Signatur zumindest einen eingebetteten Nanokristall umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin zumindest zwei optische Signaturen einen Nanokristall umfassen und worin zumindest eine der optischen Signaturen einen Nanokristall umfasst, der sich in der Größe von einem Nanokristall einer anderen optischen Signatur unterscheidet.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Mikrokügelchen zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation umfassen, die jeweils umfasst: a) ein bioaktives Mittel; und b) eine optische Signatur, die fähig ist, das bioaktive Mittel zu identifizieren, worin zumindest eine optische Signatur zumindest einen eingebetteten Nanokristall umfasst.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, worin sich zumindest ein Nanokristall der ersten Subpopulation in der Größe von einem Nanokristall der zweiten Population unterscheidet.
  24. Verfahren nach Anspruch 20 oder 22, worin die Nanokristalle so hergestellt werden, dass sie eine spezifische Größe aufweisen.
  25. Verfahren nach Anspruch 20 oder 22, worin die Nanokristalle so hergestellt werden, dass sie eine Größenverteilung aufweisen, und dann nach Größe sortiert werden.
  26. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Zielanalyten in einer Probe, umfassend: a) das Kontaktieren der Probe mit einer Zusammensetzung, die umfasst: i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die diskrete Stellen umfasst; sowie ii) eine Population von Mikrokügelchen, die zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation umfasst, die jeweils umfassen: 1) ein bioaktives Mittel; und 2) eine optische Signatur, die fähig ist, das bioaktive Mittel zu identifizieren; sowie b) den Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens des Zielanalyten; dadurch gekennzeichnet, dass die diskreten Stellen gemustert sind und die Mikrokügelchen auf der Oberfläche verteilt sind, so dass die gemusterten diskreten Stellen Mikrokügelchen enthalten, und worin zumindest eine der optischen Signaturen zumindest einen eingebetteten Nanokristall umfasst.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, worin jeder der Nanokristalle eine Größe aufweist und sich zumindest ein Nanokristall der ersten Subpopulation in der Größe von einem Nanokristall der zweiten Population unterscheidet.
  28. Verfahren nach Anspruch 26, das weiters das Identifizieren der Position eines jeden bioaktiven Mittels auf dem Substrat umfasst.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, das weiters das Identifizieren der Position eines jeden bioaktiven Mittels auf dem Substrat durch Sortieren der optischen Signaturen auf Basis der Größe der Nanokristalle umfasst.
  30. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Zielanalyten, der eine optische Signatur umfasst, die zumindest einen Nanokristall in einer Probe umfasst, umfassend: a) das Kontaktieren der Probe mit einer Zusammensetzung, umfassend: i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die diskrete Stellen umfasst; sowie ii) eine Population von Mikrokügelchen, die zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation umfasst, die jeweils ein bioaktives Mittel umfassen; und b) den Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens des Zielanalyten durch Detektieren der optischen Signatur; dadurch gekennzeichnet, dass die diskreten Stellen gemustert sind und worin die Mikrokügelchen auf der Oberfläche so verteilt sind, dass die gemusterten diskreten Stellen Mikrokügelchen enthalten.
  31. Verfahren nach Anspruch 26, worin jede aus der ersten und der zweiten Subpopulation umfasst: a) ein bioaktives Mittel; und b) einen Identifikator-Bindungsliganden, der einen Decoder-Bindungsliganden bindet, der eine optische Signatur umfasst, die einen eingebetteten Nanokristall umfasst, so dass die Identifikation des bioaktiven Mittels aufgeklärt werden kann; und worin die Probe mit mehreren der Decoder-Bindungsliganden kontaktiert wird und die Gegenwart oder das Fehlen des Ziel-Analyten durch Detektion der optischen Signatur nachgewiesen wird.
  32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, worin die Größe der Nanokristalle zur optischen Signatur beiträgt.
  33. Verfahren zum Decodieren einer Anordnungszusammensetzung, umfassend: a) das Bereitstellen einer Anordnungzusammensetzung, die umfasst: i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die diskrete Stellen umfasst; sowie ii) eine Population von Mikrokügelchen, die zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation umfasst, worin jede Subpopulation ein bioaktives Mittel umfasst; worin die Mikrokügelchen auf der Oberfläche verteilt sind; b) das Zugeben mehrerer Decoder-Bindungsliganden, die optische Signaturen umfassen, zur Anordnungszusammensetzung, um die Position von zumindest mehreren der bioaktiven Mittel zu identifizieren; dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine der optischen Signaturen einen eingebetteten Nanokristall umfasst.
  34. Verfahren nach Anspruch 33, worin zumindest zwei der optischen Signaturen einen Nanokristall umfassen und worin zumindest eine der optischen Signaturen einen Nanokristall umfasst, der sich in der Größe von einem Nanokristall einer anderen optischen Signatur unterscheidet, und worin die Größe zur optischen Signatur beiträgt.
  35. Verfahren nach Anspruch 33, worin zumindest eine Subpopulation von Mikrokügelchen einen Identifikator-Bindungsliganden umfasst, an den sich ein Decoder-Bindungsligand binden kann.
  36. Verfahren nach Anspruch 33, worin sich der Decoder-Bindungsligand an die bioaktiven Mittel bindet.
  37. Verfahren nach Anspruch 33, worin die Position einer jeden Subpopulation durch die optische Signatur bestimmt wird.
  38. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend: a) das Anhaften von Nanokristallen an poröse Kieselsäureperlen; und b) das dichte Verschließen der Poren der Kieselsäureperlen unter Einsatz des Sol-Gel-Polymerisationsverfahrens.
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