DE60011087T2

DE60011087T2 - Konjugate zwischen erythropoietin und polyethylenglycol

Info

Publication number: DE60011087T2
Application number: DE60011087T
Authority: DE
Inventors: Josef Burg; Bernd Hilger; Hans-Peter Josel
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-28
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2020-06-29
Also published as: MA26806A1; ATE267840T1; WO2001002017A2; MY126776A; KR100510624B1; TWI266637B; CZ20014682A3; PT1196443E; JP4190184B2; AU6429900A; BRPI0012138B1; HRP20010966A2; HUP0201971A3; AU768452B2; IL146956A0; TR200103782T2; CO5180621A1; ES2220501T3; MXPA01012974A; GC0000196A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Erythropoese ist die Produktion von roten Blutkörperchen, welche auftritt, um Zellzerstörung auszugleichen. Erythropoese ist ein gesteuerter physiologischer Mechanismus, der ermöglicht, dass ausreichend rote Blutkörperchen für einwandfreie Gewebeoxygenierung verfügbar sind. Natürlich auftretendes humanes Erythropoietin (hEPO) ist ein Glycoprotein, das 165 Aminosäuren enthält, das produziert wird in der Niere und ist der humorale Plasmafaktor, der die Produktion roter Blutzellen stimuliert (Carnot, P und Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W und Plzak, LF (1957) Nature 179: 6331–4). Humanes EPO stimuliert die Teilung und Differenzierung von ausgesetzten Erythroid-Progenitoren im Knochenmark. Humanes EPO übt seine biologische Aktivität aus durch Binden an Rezeptoren auf Erythroidvorläufern (Krantz, BS (1991) Blood 77: 419). Natürlich auftretendes humanes Erythropoietin ist ein saures Glycoprotein, das in niederen Konzentrationen im Plasma vorliegt, um den Ersatz von roten Blutkörperchen, welche durch Alterung verlorengehen, zu stimulieren.
Erythropoietin ist biosynthetisch hergestellt worden unter Verwendung rekombinater DNA-Technologie (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al. (1986) Immunobiol. 72: 213–224) und das Produkt eines klonierten humanen EPO-Gens, das insertiert ist und exprimiert wird in den Ovargewebezellen des Meerschweinchens (CHO-Zellen). Natürlich auftretendes humanes EPO wird zuerst translatiert in eine 166 aa (Aminosäure), die eine Polypeptidkette mit Arginin 166 enthält. In einer posttranslatorischen Modifikation wird Arginin 166 durch eine Carboxypeptidase abgespalten. Die Primärstruktur von humanem EPO (165 aa) ist in 1 dargestellt. Die Primärstruktur von humanem EPO (166 aa) ist in 2 gezeigt. Es gibt zwei Disulfidbrücken zwischen Cys⁷-Cys¹⁶¹ Und Cys²⁹-Cys³³. Das Molekulargewicht der Polypeptidkette von humanem EPO ohne die Zuckergruppen ist 18236 Da. In dem intakten EPO-Molekül werden etwa 40 % des Molekulargewichts den Kohlenhydratgruppen zugerechnet (Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A und Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).
Da Erythropoietin wesentlich bei der Bildung roter Blutzellen bzw. roter Blutkörperchen ist, ist das Hormon geeignet bei der Behandlung von Blutstörungen, die gekennzeichnet sind durch niedere oder gestörte Produktion von roten Blutkörperchen. Klinisch wird EPO verwendet für die Behandlung von z.B. Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF) (Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316: 73–78; Eschbach, JW, Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, JG, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 252; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108–114) und bei AIDS- und Krebspatienten, die eine Chemotherapie durchlaufen (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI In: MB, Garnick, Hrsg. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: S. 301–324). Jedoch die Bioverfügbarkeit von derzeit verfügbaren Proteintherapeutika, wie etwa EPO, ist begrenzt durch ihre kurze Plasmahalbwertszeit und Suszeptibilität für Proteaseabbau. Diese Nachteile verhindern, dass sie maximale klinische Potenz erreichen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von PEG-Derivaten von EPO. Die physiologisch aktiven PEG-EPO-Konjugate dieser Erfindung umfassen ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe und die biologische in vivo-Aktivität besitzt, um Knochenmarkzellen dazu zu veranlassen, dass sie die Produktion von Reticulocyten und roten Blutzkörperchen erhöhen, und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus humanem Erythropoietin bzw. menschlichem Erythropoietin und Analoga davon, die die Primärstruktur von humanem Erythropoietin besitzen, das durch Addition von 1 bis 6 Glycosilierungsstellen modifiziert wurde; wobei das Glycoprotein kovalent an von eins bis drei niedere Alkoxypoly(ethylenglycol)-Gruppen gebunden ist, wobei jede Poly(ethylenglycol)-Gruppe kovalent gebunden ist an das Glycoprotein über einen Linker der Formel -C(O)-X-S-Y-, wobei das C(O) des Linkers eine Amidbindung bildet mit einer der Aminogruppen, X -(CH₂)_k- oder –CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- ist, k von 1 bis 10 ist, Y
ist, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht jeder Poly(ethylenglycol)-Einheit 20 Kilodalton bis 40 Kilodalton ist und das Molekulargewicht des Konjugats von 51 Kilodalton bis 175 Kilodalton ist. Diese Erfindung liefert weiterhin Zusammensetzungen, die Konjugate enthalten, die hier beschrieben sind, worin der Prozentanteil von Konjugaten in der Zusammensetzung, in welcher n 1 ist, mindestens neunzig Prozent ist.
Verglichen mit unmodifiziertem EPO (d.h. EPO ohne ein gebundenes PEG) und herkömmlichen PEG-EPO-Konjugaten, weisen die vorliegenden Konjugate eine erhöhte Zirkulationshalbwertszeit und Plasmaverweilzeit auf, erniedrigte Clearence und erhöhte klinische in vivo-Aktivität. Die Konjugate dieser Erfindung haben die gleichen Anwendungen wie EPO. Im Besonderen sind die Konjugate dieser Erfindung geeignet zum Behandeln von Patienten durch Stimulieren der Teilung und Differenzierung von ausgesetzten Erythroid-Progenitoren in dem Knochenmark, wobei EPO auf dieselbe Art verwendet wird, um Patienten zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Behandlung von Anämie in einem Menschen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Herstellen der Erythropoietinglycoproteinprodukte, umfassend das kovalente Umsetzen einer ε-Aminogruppe einer Lysinaminosäure eines Erythropoietinproteins mit einem bifunktionellen Reagenz, um ein Zwischenprodukt mit einer Amidbindung zu bilden. Das bifunktionelle Reagenz enthält eine reaktive Gruppe und eine geschützte Thiolgruppe. Das Amidgebundene Zwischenprodukt wird dann kovalent umgesetzt mit einem aktivierten Polyethylenglycolderivat, um das Erythropoietinglycoproteinprodukt der vorliegenden Erfindung zu bilden.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Primärstruktur von humanem EPO (165 Aminosäuren).
2: Primärstruktur von humanem EPO (166 Aminosäuren).
3: In vivo-Aktivität von pegyliertem EPO, bestimmt durch normocythämische Maus-Assay.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Die folgenden Ausdrücke werden die unten angegebenen Definitionen besitzen:
Der Ausdruck "Erythropoietinprotein", "Erythropoietin", "EPO" oder "Erythropoietinglycoprotein" betrifft ein Glycoprotein mit der in 1 gezeigten Sequenz (SEQ ID Nr.:1) oder 2 (SEQ ID Nr:2) oder ein Protein oder Polypeptid, das im Wesentlichen homolog hierzu ist, dessen biologischen Eigenschaften die Stimulierung der Produktion von roten Blutkörperchen und die Stimulierung der Teilung und Differenzierung ausgesetzter Erythroid-Progenitoren im Knochenmark betrifft. Wie hier verwendet, umfasst der Ausdruck EPO-Protein solche Proteine, die absichtlich modifiziert sind, wie z.B. durch stellengerichtete Mutagenese oder zufällige Mutationen. Diese Ausdrücke umfassen auch Analoge mit von 1 bis 6 zusätzlichen Glycosilierungsstellen, Analoge mit mindestens einer zusätzlichen Aminosäure am Carboxy-terminalen Ende des Proteins, worin die zusätzliche(n) Aminosäure(n) mindestens eine Glycosilierungsstelle aufweist (aufweisen) und Analoge mit einer Aminosäuresequenz, die eine Umordnung mindestens einer Glycosilierungsstelle umfasst, wie etwa z.B. die Analoga, die offenbart sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 640 619. Diese Ausdrücke umfassen sowohl natürliches als auch rekombinant produziertes humanes Erythropoietin.
Der Ausdruck "im Wesentlichen homolog" bedeutet, dass eine besondere Grundsequenz, z.B. eine Mutantensequenz, von einer Referenzsequenz abweicht durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen, wobei die Nettowirkung hiervon zu keiner nachteiligen funktionellen Abweichung zwischen den Referenz- und Grundsequenzen (subject sequences) führt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen mit mehr als 95 Prozent Homologie, äquivalenten biologischen Eigenschaften und äquivalenten Expressionscharakteristika als im Wesentlichen homolog erachtet. Zum Zweck der Homologiebestimmung sollte die Verkürzung der reifen Sequenz außer Acht gelassen werden. Sequenzen mit einem geringeren Homologiegrad, vergleichbarer Bioaktivität und äquivalenten Expressionscharakteristika werden als im Wesentlichen äquivalent erachtet.
Der Ausdruck "Fragment" des EPO-Proteins bedeutet jedes Protein oder Polypeptid mit der Aminosäuresequenz eines Teils oder Fragments eines EPO-Proteins, und welches die biologische Aktivität des EPO aufweist. Fragmente umfassen Proteine oder Polypeptide, die produziert werden durch proteolytischen Abbau des EPO-Proteins oder produziert werden durch chemische Synthese mittels Verfahren, die zur Routinetechnik zählen. Ein EPO-Protein oder Fragment davon ist biologisch aktiv wenn eine Verabreichung des Proteins oder Fragments an einen Menschen zur Stimulierung der Produktion von roten Blutkörperchen und zur Stimulierung der Teilung und Differenzierung von ausgesetzten Erythroidprogenitoren in Knochenmark führt. Die Bestimmung einer solchen biologischen Aktivität des EPO-Proteins kann durch herkömmliche, allgemein bekannte Tests durchgeführt werden, die verwendet werden für solche Zwecke bei einer oder mehreren Säugerspezies. Ein geeigneter Test, der verwendet werden kann, um eine solche biologische Aktivität zu zeigen, ist hier beschrieben.
Der Ausdruck "therapeutsch wirksame Menge" ist diejenige Menge Erythropoietinglycoproteinprodukt, die erforderlich ist für biologische in vivo-Aktivität, dass Knochenmarkszellen die Produktion von Reticulocyten und roten Blutkörperchen erhöhen. Die exakte Menge Erythropoietinglycoprotein ist eine Sache der Bevorzugung, die Faktoren unterliegt, wie etwa dem exakten Typ des zu behandelnden Zustands, dem Zustand des zu behandelnden Patienten als auch den anderen Bestandteilen in der Zusammensetzung. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Erythropoietinglycoproteinprodukte enthalten, können in einer Konzentration formuliert werden, die wirkungsvoll ist zur Verabreichung durch verschiedene Mittel an einen menschlichen Patienten, der Blutstörungen aufweist, die gekennzeichnet sind durch niedere oder defekte rote Blutkörperchenproduktion. Die mittleren therapeutisch wirksamen Mengen des Erythropoietinglycoproteinprodukts können variieren und im Besonderen sollten sie auf den Empfehlungen und Verordnungen eines qualifizierten Arztes beruhen.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Erythropoietinglycoproteinprodukte mit biologischer in vivo-Aktivität zum Veranlassen, dass Knochenmarkszellen die Produktion von Reticulocyten und roten Blutkörperchen erhöhen, dargestellt durch Formel 1: P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n 1,worin X und Y wie oben definiert sind, m von 450 bis 900 ist, n von 1 bis 3 ist, R niederes Alkyl ist und P ein Erythropoietinglycoprotein ohne die Aminogruppe oder Aminogruppen ist, welche eine Amidbindung mit X bilden. Wie unten im Einzelnen angegeben, ist die Herstellung und Reinigung von EPO in der Technik allgemein bekannt. Unter EPO versteht man das natürliche oder rekombinante Protein, vorzugsweise human, wie erhalten aus einer herkömmlichen Quelle, wie etwa Geweben, Proteinsynthese, Zellkultur mit natürlichen oder rekombinanten Zellen. Jedes Protein mit der Aktivität von EPO, wie etwa Muteine oder andere modifizierte Proteine ist umfasst. Rekombinantes EPO kann hergestellt werden durch Expression in CHO-, BHK- oder HeLa-Zelllinien, durch rekombinante DNA-Technologie oder durch endogene Genaktivierung, d.h. das Erythropoietinglycoprotein wird exprimiert durch endogene Genaktivierung. Die bevorzugten EPO-Spezies zur Herstellung von Erythropoietinglycoproteinprodukten sind humane EPO-Spezies. Bevorzugter ist die EPO-Spezies das humane EPO mit der Aminosäuresequenz, die in 1 angegeben ist (SEQ ID Nr:1) oder 2 (SEQ ID Nr:2), am bevorzugtesten das humane EPO mit der Aminosäuresequenz, die in 1 (SEQ ID Nr:1) angegeben ist.
Das humane Erythropoietinprotein kann auch an mindestens einer zusätzlichen Stelle zur Glycosilierung modifiziert sein, z.B. an 1 bis 6 zusätzlichen Glycosilierungsstellen, wie etwa die Aminosäuresequenzen, die unten angegeben sind. Die unten verwendete Schreibweise bedeutet, dass diese Sequenz, die in 1 angegeben ist, modifiziert worden ist durch Substituieren der nativen Aminosäure an der hochgestellten nummerierten Position, die für die Aminosäure gezeigt ist, welche links von der hochgestellten Zahl angegeben ist.
Das humane Erythropoietinprotein kann auch ein Analoges sein mit mindestens einer zusätzlichen Aminosäure am Carboxy-terminalen Ende des Glycoproteins, worin die zusätzliche Aminosäure mindestens eine Glycosilierungsstelle umfasst, d.h. das Glycoprotein besitzt eine Sequenz, umfassend die Sequenz von humanem Erythropoietin und eine zweite Sequenz am Carboxyterminus der humanen Erythropoietinsequenz, worin die zweite Sequenz mindestens eine Glycosilierungsstelle enthält.
Die zusätzliche Aminosäure kann ein Peptidfragment umfassen, das von dem Carboxy-terminalen Ende von humanem Chorion-Gonadotropin abgeleitet ist. Vorzugsweise ist das Glycoprotein ein Analoges, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) humanem Erythropoietin mit der Aminosäuresequenz Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID Nr:3), ausgehend vom Carboxyterminus; (b) dem Analogen aus (a) weiterhin umfassend Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; und (c) dem Analogen aus (a), weiterhin umfassend Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.
Das humane Erythropoietinprotein kann auch ein Analoges sein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Umlagerung von mindestens einer Glycosilierungsstelle aufweist. Die Umlagerung bzw. Änderung kann eine Deletion einer der N-gebundenen Kohlenhydratstellen in humanen Erythropoietin und eine Addition einer N-gebundenen Kohlenhydratstelle an Position 88 der Aminosäuresequenz von humanem Erythropoietin umfassen. Vorzugsweise ist das Glycoprotein ein Analoges, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; und Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.
Erythropoietin-Analoge mit zusätzlichen Glycosilierungsstellen sind in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 640 619 offenbart.
In Formel 1 kann R ein niederes Alkyl sein, worunter eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe zu verstehen ist mit von einem bis sechs Kohlenstoffatomen, wie etwa Methyl, Ethyl, Isopropyl usw. Ein bevorzugtes Alkyl ist Methyl.
In Formel 1 ist X -(CH₂)_k- oder -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, worin k von 1 bis 10 ist. Vorzugsweise ist k von 1 bis 4, bevorzugter ist k 1 oder 2. Am bevorzugten ist X -(CH₂).
In Formel 1 ist Y
Vorzugsweise ist Y
Am bevorzugtesten ist Y
In Formel 1 ist die Zahl m so ausgewählt, dass das resultierende Konjugat der Formel 1 eine physiologische Aktivität aufweist, die vergleichbar ist mit unmodifiziertem EPO, wobei die Aktivität die gleiche, höher oder ein Bruchteil der entsprechenden Aktivität von unmodifiziertem EPO darstellen kann. m bedeutet die Anzahl von Ethylenoxidresten in der PEG-Einheit. Eine einzelne PEG-Untereinheit von -(OCH₂CH₂)- hat ein Molekulargewicht von 44 Dalton. Daher hängt das Molekulargewicht des Konjugats (ausschließlich des Molekulargewichts des EPO) von der Anzahl m ab. m ist eine ganze Zahl im Bereich von 450 bis 900 (entsprechend einem Molekulargewicht von 20 bis 40 kDa), vorzugsweise ist m von 550 bis 800 (etwa 24 bis 35 kDa) und am bevorzugtesten ist m von 650 bis 700 (29 bis 31 kDa).
In Formel 1 ist die Zahl n die Zahl von ε-Aminogruppen einer Lysinaminosäure in einem Erythropoietinprotein, kovalent gebunden an eine PEG-Einheit über eine Amidbindung. Ein Konjugat dieser Erfindung kann eine, zwei oder drei PEG-Einheiten pro Molekül EPO aufweisen. n ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3, vorzugsweise ist n 1 oder 2, und bevorzugter ist n 1.
Bevorzugte Erythropoietinglycoproteinprodukte werden dargestellt durch die Formel:
worin P, R, X, m und n wie oben definiert sind.
Die bevorzugtesten Erythropoietinglycoproteinprodukte werden dargestellt durch die Formel
worin P, R, X, M und n wie oben definiert sind.
Andere bevorzugte Erythropoietinglycoproteinprodukte werden durch die Formel:
dargestellt, worin P und n wie oben definiert sind.
Bevorzugtere Erythropoietinglycoproteinprodukte werden durch die Formel:
dargestellt, worin P und n wie oben definiert sind.
Bevorzugte Verbindungen sind diejenigen, worin X -(CH₂)_k- ist, insbesondere diejenigen, worin k von 1 bis 4 ist, am bevorzugtesten diejenigen, worin X -CH₂-- ist.
Die Erfindung betrifft auch die obigen Konjugate, worin m eine ganze Zahl von 550 bis 800 ist, vorzugsweise ist m eine ganze Zahl von 650 bis 700.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, worin n 1 ist und/oder R Methyl ist.
Zusätzlich betrifft die Erfindung die obigen Verbindungen, worin das mittlere Molekulargewicht von jedem Poly(ethylenglycol)-Rest bzw. jeder Poly(ethylenglycol)-Gruppe von 24 Kilodalton bis 35 Kilodalton, bevorzugter bis 30 Kilodalton ist.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, worin das Glycoprotein kovalent gebunden ist an eine oder zwei niederes Alkoxy-gecappte Poly(ethylenglycol)-Gruppen, bevorzugter an ein mit niederem Alkoxy gecappte Poly(ethylenglycol)-Gruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Poly(ethylenglycol)-Gruppen gecappt durch Methoxy.
In der bevorzugtesten Ausführungsform betrifft die Erfindung die obigen Verbindungen, worin X -CH₂- ist, m eine ganze Zahl von 650 bis 700 ist, n 1 ist, R Methyl ist und worin das mittlere Molekulargewicht von jedem Poly(ethylenglycol)-Rest 30 Kilodalton ist.
In einer noch anderen Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung von Anämie in einem Menschen, umfassend das Verabreichen an einen Menschen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Erythropoietinglycoproteinprodukts, dargestellt durch Formel 1.
In einer noch anderen Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen eines Erythropoietinglycoproteinprodukts mit der biologischen in vivo-Aktivität zum Veranlassen von Knochenmarkszellen die Produktion von Reticulocyten und roten Blutkörperchen zu erhöhen, umfassend die Schritte:

(a) kovalentes Umsetzen einer ε-Aminogruppe einer Lysinaminosäure eines Erythropoietinproteins, dargestellt durch die Formel P-[NH₂]_n, mit einem bifunktionellen Reagenz, dargestellt durch die Formel Z-CO-X-S-Q, um ein Zwischenprodukt mit einer einer Amidbindung zu bilden, dargestellt durch die Formel: P-[NH-CO-X-S-Q]_n worin P ein Erythropoietinprotein ist ohne die Aminogruppe, die eine Amidbindung bildet; n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist; Z eine reaktive Gruppe ist, z.B. ein Carboxyl-NHS-Ester; X -(CH₂)_k- oder -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- ist, worin k von 1 bis 10 ist; und Q eine Schutzgruppe, wie etwa Alkanoyl, ist, z.B. Acetyl.
(b) Kovalentes Umsetzen des Zwischenprodukts mit einer Amidverbindung aus Schritt (a) mit einem aktivierten Polyethylenglycolderivat, dargestellt durch die Formel W-[OCH₂CH₂]_m-OR, um ein Erythropoietinglycoproteinprodukt zu bilden, dargestellt durch die Formel:
worin W eine Sulfhydryl-reaktive Form von Y ist; m eine ganze Zahl im Bereich von 450 bis 900 ist; R niederes Alkyl ist; und Y
ist.

In dieser Ausführungsform ist das bifunktionelle Reagenz vorzugsweise N-Succinimidyl-S-acetylthioproprionat oder N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat, Z ist vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid und das aktivierte Polyethylenglycolderivat W-[OCH₂CH₂]m-OR wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Jodacetylmethoxy-PEG, Methoxy-PEG-vinylsulfon und Methoxy-PEG-Malimid.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, umfassend Konjugate, worin jedes der Konjugate ein Erythropoietinglycoprotein umfasst mit mindestens einer freien Aminogruppe und die biologische in vivo-Aktivität aufweist zum Veranlassen von Knochenmarkszellen die Produktion von Reticulocyten und roten Blutzellen zu erhöhen und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus humanem Erythropoietin und Analoga davon, welche die Primärstruktur von humanem Erythropoietin aufweisen, das modifiziert ist durch die Addition von 1 bis 6 Glycosilierungsstellen oder durch die Umordnung von mindestens einer Glycosilierungsstelle; wobei das Glycoprotein kovalent gebunden ist an von einer bis drei niederes-Alkoxypoly(ethylenglycol)-Gruppen, wobei jede Poly(ethylenglycol)-Gruppe kovalent gebunden ist an das Glycoprotein über einen Linker der Formel -C(O)-X-S-Y-, wobei C(O) des Linkers eine Amidbindung bildet mit einer der Aminogruppen,
X -(CH₂)_k- oder -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- ist,
k von 1 bis 10 ist,
Y
ist,
wobei das mittlere Molekulargewicht von jedem Poly(ethylenglycol)-Rest von 20 Kilodalton bis 40 Kilodalton ist und das Molekulargewicht des Konjugats von 51 Kilodalton bis 175 Kilodalton ist; und worin der Prozentanteil von Konjugaten, worin n 1 ist, mindestens neunzig Prozent ist. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung oben definierte Konjugate, worin der Prozentanteil von Konjugaten, worin n 1 ist, mindestens neunzig Prozent ist, bevorzugter worin der Prozentanteil von Konjugaten, worin n 1 ist, mindestens zweiundneunzig Prozent ist, und sogar noch bevorzugter, worin der Prozentanteil von Konjugaten, worin n 1 ist, mindestens sechsundneunzig Prozent ist, und am bevorzugtesten, worin der Prozentanteil von Konjugaten, worin n 1 ist, von neunzig Prozent bis sechsundneunzig Prozent ist.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Konjugat oder eine Zusammensetzung, wie oben definiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträger bzw. Exzipienten und die Verwendung eines Konjugats oder einer Zusammensetzung, wie oben definiert, zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die in Beziehung stehen mit Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF), AIDS und für die Behandlung von Krebspatienten, die einer Chemotherapie unterzogen sind. Zusätzlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Störungen, umfassend Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF), AIDS- und Krebspatienten, die einer Chemotherapie unterzogen werden, umfassend den Schritt des Verabreichens an den Patienten einer oben definierten Zusammensetzung.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Konjugaten oder einer Zusammensetzung, wie oben definiert, wobei das Verfahren das kovalente Binden von Thiolgruppen an ein Erythropoietinglycoprotein und das Koppeln des resultierenden aktivierten Erythropoietinglycoproteins mit einem Poly(ethylenglycol)-(PEG)-Derivat umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung Konjugate und Zusammensetzungen, wie oben definiert, wann immer sie hergestellt werden durch ein oben beschriebenes Verfahren und Konjugate und Zusammensetzungen, wie oben definiert, zur Behandlung von Krankheiten, die verbunden sind mit Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF), AIDS- und Krebspatienten, die einer Chemotherapie unterzogen sind.
Verfahren zum Exprimieren von EPO-Proteinen
Erythropoietin (EPO) ist ein humanes Glycoprotein, das die Bildung von Erythrozyten stimuliert. Seine Herstellung und therapeutische Anwendung sind im Detail z.B. beschrieben in den U.S. Patenten Nr. 5,547,933 und 5,621,080, EP-B 0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708–2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 und EP-B 0 411 678, als auch Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116–3121, und Sasaki, H., et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059–12076. Erythropoietin zur therapeutischen Anwendung kann hergestellt werden durch rekombinante Mittel (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 und Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al (1986) Immunobiol. 72:213–224). Die Expression von Proteinen, einschließlich EPO, durch endogene Genaktivierung ist allgemein in der Technik bekannt und ist z.B. offenbart in den U.S. Patenten Nr. 5,733,761, 5,641,670 und 5,733,746 und in den internationalen Patentveröffentlichungen Nr. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 und WO 91/09955.
Verfahren zur Expression und Herstellung von Erythropoietin in serumfreiem Medium sind z.B. beschrieben in WO 96/35718 von Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, und in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 513 738 von Koch, veröffentlicht am 12. Juni 1992.
Verfahren zur Reinigung von humanem EPO-Protein
Zusätzlich zu den oben genannten Literaturstellen ist es bekannt, dass eine serumfreie Fermentation von rekombinanten CHO-Zellen, die EPO-Gen enthalten, durchgeführt werden kann. Solche Verfahren sind z.B. beschrieben in EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 und in einer allgemeinen Form von Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445–453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. und Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277–292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45–51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO 88/00967.
In EP-A 0 267 678 ist eine Ionenaustauschchromatographie auf S-Sepharose, eine präparative reverse Phase-HPLC auf einer C₈-Säule und eine Gelfiltrationschromatographie für die Reinigung von EPO beschrieben, hergestellt in serumfreier Kultur nach Dialyse. In diesem Zusammenhang kann der Gelfiltrationschromatographieschritt ersetzt werden durch Ionenaustauschchromatographie auf Schnelldurchfluss-S-Sepharose. Es ist ebenfalls vorgeschlagen, dass eine Farbstoffchromatographie auf einer Blue Trisacryl-Säule vor der Ionenaustauschchromatographie durchgeführt werden kann.
Ein Verfahren zur Reinigung von rekombinantem EPO ist beschrieben von Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352–359. In diesem Verfahren wird EPO jedoch mit einer Lösung von Tween^® 20, Phenylmethylsulfonylfluorid, Ethylmaleimid, Pepstatin A, Kupfersulfat und Oxaminsäure vor den Reinigungsschritten behandelt.
Mehrere Literaturstellen, wie WO 96/35718 von Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, offenbaren Verfahren zum Herstellen von Erythropoietin in einem serumfreien Fermentationsverfahren (EPOsf). Ein Verfahren zum Herstellen von EPO als Ausgangsmaterial für die Pegylierung ist beispielhaft im Folgenden beschrieben.
Biologischer Assay zum Bestimmen der spezifischen Aktivität von EPO und EPO-Konjugaten
Die spezifische Aktivität von EPO oder EPO-Konjugaten gemäß dieser Erfindung kann bestimmt werden durch verschiedene in der Technik bekannte Assays. Die biologische Aktivität des gereinigten EPO-Proteins dieser Erfindung ist so, dass Verabreichung des EPO-Proteins durch Injektion in menschliche Patienten dazu führt, dass Knochenmarkszellen die Produktion von Reticulocyten und roten Blutkörperchen erhöhen, verglichen mit nichtinjizierten oder Kontrollpatientengruppen. Die biologische Aktivität der EPO-Proteine oder Fragmente davon, die erhalten und gereinigt wurden gemäß dieser Erfindung, kann getestet werden durch Verfahren gemäß Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2).
Ein anderer biologischer Assay zum Bestimmen der Aktivität von EPO-Protein, der normocythämische Maus-Assay, ist in Beispiel 4 beschrieben.
Verfahren zur Herstellung von pegyliertem EPO
Verfahren zur Herstellung von Erythropoietinglycoproteinprodukten, die durch Formel 1 dargestellt werden, umfassen das kovalente Binden von Thiolgruppen an EPO ("Aktivierung") und das Koppeln des resultierenden aktivierten EPO mit einem Poly(ethylenglycol)-(PEG)-Derivat. Der erste Schritt zur Herstellung von pegyliertem EPO gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst kovalentes Binden von Thiolgruppen über NH₂-Gruppen von EPO. Diese Aktivierung von EPO wird durchgeführt mit bifunktionellen Reagenzien, welche eine geschützte Thiolgruppe und eine zusätzliche reaktive Gruppe tragen, wie etwa aktive Ester (z.B. ein Succinimidylester), Anhydride, Ester von Sulfonsäuren, Halogenide von Carbonsäuren bzw. Sulfonsäuren. Die Thiolgruppe wird geschützt durch Gruppen, die in der Technik bekannt sind, z.B. Acetylgruppen. Diese bifunktionellen Reagenzien können reagieren mit den ξ-Aminogruppen der Lysinaminosäuren durch Bilden einer Amidbindung. Der erste Schritt der Reaktion ist unten angegeben:
EPO, n und X sind wie oben definiert und Z ist eine reaktive Gruppe, die in der Technik bekannt ist, z.B. ein N-Hydroxy-succinimid (NHS)-Substituent der Formel
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aktivierung der ε-Aminolysingruppen durchgeführt durch Reaktion mit bifunktionellen Reagenzien mit einem Succinimidylrest. Die bifunktionellen Reagenzien können verschiedene Spacerspezies tragen, z.B. -(CH₂)_k- oder -CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_k-Reste, worin k von 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 4 und bevorzugter 1 oder 2 und am bevorzugtesten 1 ist. Beispiele dieser Reagenzien sind N-Succinimidyl-S-acetylthioproprionat (SATP) und N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA)
Acetylthioalkylcarbonsäure-NHS-Ester, wie

2-(Acetylthio)-(ethoxy)_k-Essigsäure-NHS-Ester,
wobei k wie oben definiert ist.
Die Herstellung der bifunktionellen Reagenzien ist in der Technik bekannt. Vorläufer von 2-(Acetylthio)-(ethoxy)_k-Essigsäure-NHS-Estern sind beschrieben in DE 39 24 705 , während die Derivatisierung der Acetylthioverbindung beschrieben ist von March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375–376. SATA ist kommerziell erhältlich (Molecular Probes, Eugene, OR, USA und Pierce, Rockford, IL).
Die Anzahl von an das EPO-Molekül zu addierenden Thiolgruppen kann ausgewählt werden durch Einstellen der Reaktionsparameter, d.h. der Protein-(EPO)-Konzentration und dem Protein/bifunktionelles Reagenz-Verhältnis. Vorzugsweise wird das EPO aktiviert durch kovalentes Binden von 1 bis 5 Thiolgruppen pro EPO-Molekül, bevorzugter von 1,5 bis 3 Thiolgruppen pro EPO-Molekül. Diese Bereiche betreffen die statistische Verteilung der Thiolgruppen über die EPO-Proteinpopulation.
Die Reaktion wird z.B. durchgeführt in einer wässrigen Pufferlösung, pH-Wert 6,5-8,0, z.B. in 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH-Wert 7,3. Das bifunktionelle Reagenz kann in DMSO zugegeben werden. Nach Abschluss der Reaktion, vorzugsweise nach 30 Minuten, wird die Reaktion durch Zugabe von Lysin gestoppt. Überschüssiges bifunktionelles Reagenz kann durch in der Technik bekannte Verfahren abgetrennt werden, z.B. durch Dialyse oder Säulenfiltration. Die mittlere Anzahl von an EPO addierten Thiolgruppen kann durch photometrische Verfahren bestimmt werden, die z.B. beschrieben sind in Grasetti, D.R. und Murray, J.F. in J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41–49 (1967).
Die obige Reaktion wird gefolgt von dem kovalenten Koppeln eines aktivierten Polyethylenglycol-(PEG)-Derivats. Geeignete PEG-Derivate sind aktivierte PEG-Moleküle mit einem mittleren Molekulargewicht von 20 bis 40 kDa, bevorzugter von 24 bis 35 kDa und am bevorzugtesten 30 kDa.
Aktivierte PEG-Derivate sind in der Technik bekannt und sind z.B. beschrieben in Morpurgo, M., et al., J. Bioconj. Chem. (1996) 7, Seite 363 ff für PEG-Vinylsulfon. Geradkettige und verzweigtkettige PEG-Spezies sind geeignet zur Herstellung der Verbindungen von Formel 1. Beispiele reaktiver PEG-Reagenzien sind Jodacetylmethoxy-PEG und Methoxy-PEG-Vinylsulfon:
Die Verwendung dieser Jod-aktivierten Substanzen ist in der Technik bekannt und z.B. beschrieben von Hermanson, G.T. in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) S. 147–148.
Am bevorzugtesten werden die PEG-Spezies aktiviert durch Maleimid unter Verwendung von (Alkoxy-PEG-maleimid), wie etwa Methoxy-PEG-Maleimid (MG 30.000; Shearwater Polymrs, Inc.). Die Struktur von Alkoxy-PEG-Maleimid ist wie folgt:
wobei R und m wie oben definiert sind.
Das bevorzugteste Derivat ist
worin R und m wie oben definiert sind.
Die Kopplungsreaktion mit Alkoxy-PEG-Maleimid findet nach in situ-Abspaltung der Thiolschutzgruppe in einer wässrigen Pufferlösung, z.B. 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH-Wert 6,2, statt. Die Abspaltung der Schutzgruppe kann z.B. durchgeführt werden mit Hydroxylaminen in DMSO bei 25 °C, pH-Wert 6,2, für 90 Minuten. Für die PEG-Modifizierung sollte das molare Verhältnis von aktiviertes EPO/Alkoxy-PEG-Maleimid von 1:3 bis 1:6 und vorzugsweise 1:4 sein. Die Reaktion kann gestoppt werden durch Zugabe von Cystein und Reaktion der verbleibenden Thiol-(-SH)-Gruppen mit N-Methylmaleimid oder anderen geeigneten Verbindungen, die in der Lage sind zum Bilden von Disulfidbindungen. Aufgrund der Reaktion von verbleibenden aktiven Thiolgruppen mit einer Schutzgruppe, wie etwa N-Methylmaleimid oder anderen geeigneten Schutzgruppen, können die EPO-Glycoproteine in den Konjugaten dieser Erfindung derartige Schutzgruppen enthalten. Im Allgemeinen wird das hier beschriebene Verfahren ein Gemisch von Molekülen erzeugen, die variierende Anzahlen von Thiolgruppen aufweisen, die geschützt sind durch verschiedene Anzahlen von Schutzgruppen, in Abhängigkeit von der Anzahl aktivierter Thiolgruppen auf dem Glycoprotein, die nicht an PEG-Maleimid konjugiert waren.
Während N-Methylmaleimid den gleichen Typ kovalente Bindung bildet wenn es verwendet wird, um die verbleibenden Thiolgruppen auf dem pegylierten Protein zu blockieren, werden Disulfidbindungen in einer intermolekularen Sulfid/Disulfid-Austauschreaktion zu einem Disulfidbrücken-Koppeln des Blockierungsmittels führen. Bevorzugte Blockierungsmittel für diesen Typ Blockierungsreaktion sind oxidiertes Glutathion (GSSG), Cystein und Cystamin. Während mit Cystein keine zusätzliche Nettoladung in das pegylierte Protein eingeführt wird, führt die Verwendung der Blockierungsreagenzien GSSG oder Cystamin zu einer zusätzlichen negativen oder positiven Ladung.
Die weitere Reinigung der Verbindungen der Formel 1, einschließlich die Auftrennung von mono-, di- und tri-pegylierten EPO-Spezies kann durch Verfahren durchgeführt werden, die in der Technik bekannt sind, z.B. Säulenchromatographie.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Erythropoietinglycoproteinprodukte, die gemäß dieser Erfindung hergestellt werden, können für pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die geeignet sind zur Injektion mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel, durch Verfahren, die in der Technik bekannt sind. Zum Beispiel sind geeignete Zusammensetzungen in WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 und WO 99/07401 beschrieben worden. Unter den bevorzugten pharmazeutisch verträglichen Trägern zum Formulieren der Produkte der Erfindung sind Humanserumalbumin, Humanplasmaproteine, usw. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in 10 mM Natrium/Kaliumphosphatpuffer bei pH- Wert 7, der ein tonisierendes Mittel enthält, z.B. 132 mM Natriumchlorid, formuliert werden. Optional kann die pharmazeutische Zusammensetzung ein Konservierungsmittel enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann verschiedene Mengen Erythropoietin, z.B. 10–1000 μg/ml, z.B. 50 μg oder 400 μg, enthalten.
Behandlung von Blutstörungen, die gekennzeichnet sind durch geringe oder defekte Produktion von roten Blutkörperchen
Die Verabreichung von Erythropoietinglycoproteinprodukten der vorliegenden Erfindung führt zur Bildung von roten Blutkörperchen in Menschen. Daher ergänzt die Verabreichung der Erythropoietinglycoproteinprodukte dieses EPO-Protein, welches wichtig zur Produktion von roten Blutkörperchen ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Erythropoietinglycoproteinprodukte enthalten, können in einer Konzentration formuliert werden, die wirkungsvoll ist zur Verabreichung durch verschiedene Mittel an einen menschlichen Patienten, der Blutstörungen erfährt, die gekennzeichnet sind durch geringe oder defekte Produktion von roten Blutkörperchen, entweder alleine oder als ein Teilzustand einer Krankheit. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können verabreicht werden durch Injektion, wie etwa durch subkutane oder intravenöse Injektion. Mittlere Mengen des Erythropoietinglycoproteinprodukts können variieren und sollten im Besonderen auf den Empfehlungen und Verordnungen eines qualifizierten Arztes beruhen. Die exakte Menge Konjugat unterliegt solchen Faktoren, wie etwa dem exakten Typ des zu behandelnden Zustands, dem Zustand des zu behandelnden Patienten als auch den anderen Bestandteilen in der Zusammensetzung. Zum Beispiel können 0,01 bis 10 μg pro kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,1 bis 1 μg pro kg Körpergewicht verabreicht werden, z.B. einmal wöchentlich.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche dargestellt werden, um die Herstellung der Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung zu zeigen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Fermentation und Reinigung von humanem EPO
a) Inokulumherstellung und Fermentation
Ein Gläschen der Working Cell Bank, die von einer EPO-produzierenden CHO-Zelllinie (ATCC CRL8695, veröffentlicht in EP 411 678 (Genetics Institute) kann verwendet werden} abgeleitet ist, wird aus der Gasphase des Flüssigstickstofflagertanks entnommen. Die Zellen werden in Glasdrehkolben übergeführt und in einem Hydrogencarbonat-gepufferten Medium in einem Feucht-CO₂-Inkubator kultiviert. Typische serumfreie Medien, die zur Inokulumherstellung und Fermentation verwendet werden, sind offenbart in der Europäischen Patentanmeldung 513 738 von Koch, herausgegeben am 12. Juni 1992 oder in WO 96/35718 von Burg, herausgegeben am 14. November 1996, und enthalten z.B. als Medium DMEM/F12 (z.B. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, Bestellnr. 57–736) und zusätzlich Natriumhydrogencarbonat, L+Glutamin, D+Glucose, rekombinantes Insulin, Natriumselenit, Diaminobutan, Hydrocortison, Eisen-(II)-Sulfat, Asparagin, Aspartamsäure, Serin und ein Stabilisierungsmittel für Säugerzellen, wie etwa z.B. Polyvinylalkohol, Methylcellulose, Polydextran, Polyethylenglycol, Pluronic F68, Plasmaexpansionsmittel-Polygelin (HEMACCEL^®) oder Polyvinylpyrrolidon (WO 96/35718).
Die Kulturen werden mikroskopisch auf die Abwesenheit verunreinigender Mikroorganismen untersucht und die Zelldichten werden bestimmt. Diese Tests werden bei jedem Trennungsschritt durchgeführt.
Nach der anfänglichen Wachstumsperiode wird die Zellkultur mit frischem Medium auf die Ausgangszelldichte verdünnt und durchläuft einen weiteren Wachstumszyklus. Dieses Verfahren wird wiederholt bis ein Kulturvolumen von ungefähr 2 l pro Glasdrehkolben erhalten worden ist. Nach ungefähr 12 Verdopplungen sind 1 bis 5 Liter dieser Kultur verfügbar, welche dann verwendet wird als Inokulum für den 10 l-Inokulumfermenter.
Nach 3–5 Tagen kann die Kultur in dem 10 l-Fermenter als Inokulum für den 100 l-Inokulumfermenter verwendet werden.
Nach zusätzlichen 3–5 Tagen kultivieren kann die Kultur in dem 100 l-Fermenter als Inokulum für den 1000 l-Produktionsfermenter verwendet werden.
b) Ernten und Zellauftrennung
Ein Chargenrückführungsverfahren wird verwendet, d.h. wenn die gewünschte Zelldichte erreicht ist, werden ungefähr 80 % der Kultur geerntet. Die verbleibende Kultur wird mit frischem Kulturmedium ergänzt und kultiviert bis zur nächsten Ernte. Ein Produktionslauf besteht aus einem Maximum von 10 aufeinanderfolgenden Ernten: 9 Teilernten und 1 Gesamternte am Ende der Fermentation. Die Ernte findet alle 3–4 Tage statt.
Das bestimmte Erntevolumen wird in einen gekühlten Behälter übergeführt. Die Zellen werden durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und verworfen. Der EPO-enthaltende Überstand des Zentrifugationsschritts wird in der Leitung (in-line) filtriert, in einem zweiten gekühlten Behälter gesammelt. Jede Ernte wird separat während der Reinigung bearbeitet.
Ein typisches Verfahren zur Reinigung von EPO-Protein ist in WO 96/35718 von Burg, herausgegeben am 14. November 1996, offenbart. Das Reinigungsverfahren wird beispielhaft im Folgenden erklärt.
a) Blue-Sepharose-Chromatographie
Blue Sepharose (Pharmacia) besteht aus Sepharosekügelchen an deren Oberfläche der Cibacron Blau-Farbstoff kovalent gebunden ist. Da EPO stärker an Blue Sepharose bindet als die meisten nicht-Protein-haltigen Verunreinigen, einige Protein-haltige Verunreinigungen und PVA, kann EPO in diesem Schritt angereichert werden. Die Elution der Blue Sepharosesäule wird durchgeführt durch Erhöhen der Salzkonzentration als auch des pH-Werts.
Die Säule wird gefüllt mit 80–100 l Blue Sepharose, regeneriert mit NaOH und äquilibriert mit Äquilibrationspuffer (Natrium/Calcium-Chlorid und Natriumacetat). Der angesäuerte und filtrierte Fermenterüberstand wird aufgebracht. Nach Abschluss des Aufbringens wird die Säule zuerst gewaschen mit einem Puffer, ähnlich dem Äquilibrationspuffer, der eine höhere Natriumchloridkonzentration enthält, und nachfolgend mit einem Tris-Basepuffer. Das Produkt wird mit einem Tris-Basepuffer eluiert und in einer einzelnen Fraktion gemäß dem Grund-Elutionsprofil gesammelt.
b) Butyltoyopearl-Chromatographie
Das Butyltoyopearl 650 C (TosoHaas) ist eine Matrix auf Polystyrolbasis, an welche aliphatische Butylreste kovalent gekoppelt sind. Da EPO stärker an dieses Gel bindet als die meisten der Verunreinigungen und PVA, muss es mit einem Puffer-enthaltenden Isopropanol eluiert werden.
Die Säule wird gepackt mit 30–40 l Butyltoyopearl 650 C, regeneriert mit NaOH, gewaschen mit Tris-Basepuffer und äquilibriert mit einem Tris-Basepuffer enthaltenden Isopropanol.
Das Blue Sepharose-Eluat wird auf die Konzentration von Isopropanol in dem Säulenäquilibrationspuffer eingestellt und auf die Säule aufgebracht. Dann wird die Säule mit Äquilibrationspuffer mit erhöhter Isopropanolkonzentration gewaschen. Das Produkt wird mit Elutionspuffer (Tris-Basepuffer mit hohem Isopropanalgehalt) eluiert und in einer einzigen Fraktion entsprechend dem Grund-Elutionsprofil gesammelt.
c) Hydroxyapatit-Ultrogel-Chromatographie
Das Hydroxyapatit-Ultrogel (Biosepra) besteht aus Hydroxyapatit, welches in eine Agarosematrix eingebracht ist, um die mechanischen Eigenschaften zu verbessern. EPO hat eine niedere Affinität für Hydroxyapatit und kann daher bei niedereren Phosphatkonzentrationen als Proteinverunreinigen eluiert werden.
Die Säule wird gefüllt mit 30–40 l Hydroxyapatit-Ultrogel und regeneriert mit einem Kaliumphosphat/Calciumchlorid-Puffer und NaOH, gefolgt von einem Tris-Basepuffer. Dann wird sie äquilibriert mit einem Tris-Basepuffer, der eine geringe Menge Isopropanol und Natriumchlorid enthält.
Das EPO-enthaltende Eluat aus der Butyltoyopearl-Chromatographie wird auf die Säule aufgebracht. Nachfolgend wird die Säule mit Äquilibrationspuffer und einem Tris-Basepuffer ohne Isopropanol und Natriumchlorid gewaschen. Das Produkt wird mit einem Tris-Basepuffer eluiert, der eine geringe Konzentration Kaliumphosphat enthält, und in einer einzelnen Fraktion entsprechend dem Grund-Elutiogramm gesammelt.
d) Reverse Phase-HPLC auf Vydac C4
Das RP-HPLC-Material Vydac C4 (Vydac) besteht aus Silikagelteilchen, von welchen die Oberflächen C4-Alkylketten tragen. Die Abtrennung von EPO von den proteinhaltigen Verunreinigungen basiert auf Unterschieden in der Stärke der hydrophoben Wechselwirkungen. Elution wird durchgeführt mit einem Acetonitrilgradienten in verdünnter Trifluoressigsäure.
Präparative HPLC wird durchgeführt unter Verwendung einer Edelstahlsäule (gefüllt mit 2,8 bis 3,2 Liter Vydac C4-Silikagel). Das Hydroxyapatit Ultrogel Eluat wird angesäuert durch Zugeben von Trifluoressigsäure und auf die Vydac-C4-Säule aufgebracht. Zum Waschen und Eluieren wird ein Acetonitrilgradient in verdünnter Trifluoressigsäure verwendet. Fraktionen werden gesammelt und unmittelbar mit Phosphatpuffer neutralisiert. Die EPO-Fraktionen, die innerhalb der IPC-Grenzen liegen, werden gepoolt.
e) DEAE-Sepharosechromatographie
Das DEAE-Sepharose (Pharmacia)-Material besteht aus Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen, welche kovalent an die Oberfläche von Sepharosekügelchen gebunden sind. Das Binden von EPO an die DEAE-Gruppen wird vermittelt durch ionische Wechselwirkungen. Acetonitril und Trifluoressigsäure gelangen durch die Säule ohne dass sie zurückgehalten werden. Nachdem diese Substanzen abgewaschen worden sind, werden Spurenverunreinigungen durch Waschen der Säule mit Acetatpuffer bei niederem pH-Wert entfernt. Dann wird die Säule mit neutralem Phosphatpuffer gewaschen und EPO wird mit einem Puffer mit erhöhter Ionenstärke eluiert.
Die Säule wird mit Schnelldurchfluss-DEAE-Sepharose gepackt. Das Säulenvolumen ist abgestimmt, um eine EPO-Beladung im Bereich von 3–10 mg EPO/ml Gel sicherzustellen. Die Säule wird mit Wasser und Äquilibrationspuffer (Natrium/Kaliumphosphat) gewaschen. Die gepoolten Fraktionen des NPLC-Eluats werden aufgebracht und die Säule wird mit Äquilibrationspuffer gewaschen. Dann wird die Säule mit Waschpuffer (Natriumacetatpuffer) gewaschen, gefolgt durch Waschen mit Äquilibrationspuffer. Nachfolgend wird EPO von der Säule mit Elutionspuffer eluiert (Natriumchlorid, Natrium-/Kaliumphosphat) und als eine einzelne Fraktion entsprechend dem Grund-Elutionsprofil gesammelt.
Das Eluat der DEAE-Sepharosesäule wird auf die angegebene Leitfähigkeit eingestellt. Die resultierende Arzneimittelsubstanz wird steril in Teflonflaschen filtriert und bei –70 °C aufbewahrt.
BEISPIEL 2: Kovalentes Binden von Thiolgruppen an EPO
Dieses Beispiel offenbart die Bestimmung von Reaktionsbedingungen für die kovalente Bindung von Thiolgruppen an EPO. Zum Bestimmen der Bedingungen werden verschiedene Mengen eines Reagenz, das eine blockierte Thiolgruppe enthält, hier SATA oder SATP (gelöst in DMSO mit 10 mg/ml) zu der EPO-Lösung gegeben, hier zu 1 ml von 5 mg/ml EPO in 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH-Wert 7,3. Die Reaktion wurde für etwa 30 Minuten gerührt (25 °C) und gestoppt durch Zugabe von 1 M Lysinlösung bei 10 mM. Überschüssige Mengen SATA und SATP wurden durch Dialyse gegen 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl und 2 mM EDTA, pH-Wert 6,2, entfernt. Nach Entfernung der Acetylschutzgruppe mit Hydroxylaminen wurde die Anzahl von Thiolgruppen, die kovalent an EPO gebunden sind, photometrisch mit Dithiodipyridin gemäß dem von Grasetti, D.R. und Murray, J.F. in J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, Seite 41–49 (1967) beschriebenen Verfahren bestimmt.
Die Anzahl von Thiolgruppen, die kovalent pro EPO-Molekül gebunden ist, ist unten gezeigt.
BEISPIEL 3: Modifikation von aktiviertem EPO mit Methoxy-PEG-Maleimid
A) Aktivierung von EPO:
100 mg EPO, hergestellt gemäß Beispiel 1 (190.000 IU/mg gemäß Bestimmung durch den normocythämische Maus-Assay) wurden mit SATA aktiviert (molares Verhältnis: EPO/SATA = 1/5) gemäß Beispiel 2. Das resultierende EPO ("aktiviertes EPO"), das kovalent gebundene blockierte Thiolgruppen trägt, wurde von den Nebenprodukten wie N-Hydroxysuccinimid oder nicht-umgesetztem SATA durch Dialyse wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt. Eine Lösung von 4,5 mg/ml aktiviertem EPO in 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH-Wert 6,2, wurde erhalten.
B) Pegylierung von aktiviertem EPO:
380 mg Methoxy-PEG-Maleimid mit der "bevorzugtesten" Struktur, die oben angegeben ist (MG 30.000; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)) wurde in der obigen Lösung gelöst, die 95 mg aktiviertes EPO (4,5 mg/ml in 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH-Wert 6,2) enthielt. Das resultierende molare Verhältnis zwischen aktiviertem EPO und Methoxy-PEG-Maleimid in der Lösung war 1:4. Durch Zugabe von 1 M wässriger Hydroxylaminlösung mit 30 mM, pH-Wert 6,2, zu der obigen Lösung wurden die kovalent verknüpften blockierten Thiolgruppen von aktiviertem EPO entblockiert. Das resultierende aktivierte EPO in dem Reaktionsgemisch der Lösung enthielt freie Thiol-(SH)-Gruppen. Entblocken der Thiolgruppen wurde unmittelbar gefolgt durch die Kopplungsreaktion zwischen dem aktivierten EPO, das nun freie Thiol-(SH)-Gruppen enthielt und Methoxy-PEG-Maleimid, für 90 Minuten (Rühren, 25 °C). Die Kopplungsreaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 0,2 M wässriger Cysteinlösung mit 2 mM zu dem Reaktionsgemisch. Nach 30 Minuten wurden überschüssige freie Thiolgruppen des aktivierten EPO, welche nicht mit Methoxy-PEG-Maleimid reagierten, durch Zugabe von 0,5 M N-Methylmaleimidlösung in DMSO blockiert, um eine Konzentration von 5 mM zu erreichen. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch, das nun pegylierte EPO-Spezies enthielt, gegen 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5, für ≥ 15 Stunden dialysiert.
C) Reinigung von pegylierten EPO-Spezies:
Zur Abtrennung der pegylierten EPO-Spezies von dem Reaktionsgemisch wurde das folgende Reinigungsverfahren durchgeführt: Eine 50 ml-Q-Sepharose ff-Säule (Schnelldurchflussfluss-Sepharose-Säule) wurde äquilibriert mit 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5. Das in Schritt B) erhaltene Reaktionsgemisch wurde auf die Säule aufgebracht (Flussrate: 3 Säulenvolumina (CV) pro Stunde). Zum Abtrennen von nicht umgesetztem Methoxy-PEG-Maleimidreagenz wurde die Säule mit 5 CV 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5, gewaschen. Pegylierte EPO-Spezies wurden abgetrennt durch Elution mit einem sich erhöhenden Salzgradienten, bestehend aus 5 CV Puffer A (10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5) und 5 CV Puffer B (10 mM Kaliumphosphat, 500 mM NaCl, pH-Wert 7,5) mit einer Flussrate von 3 CV pro Stunde. Basierend auf dem NaCl-Gradienten wurden die EPO-Spezies (tri-, bi- und mono-pegylierte EPO-Spezies) zuerst eluiert, gefolgt von den nicht-pegylierten EPO-Spezies. Die Fraktion des Eluats, das die pegylierten EPO-Spezies (tri-, di- und mono-pegylierte EPO-Spezies) enthielt, wurde gepoolt und filtriert (sterile Filtration mit einem 0,2 μm-Filter).
Gehalt und Reinheit von tri-, di- und mono-pegylierten EPO-Spezies wurden beurteilt auf Coomassie-gefärbten SDS-PAA-Gelen (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)), während Proteinkonzentrationen gemessen wurden bei 280 nm gemäß dem Lambert-Beer'schen Gesetz. Die scheinbaren Molekulargewichte der EPO-Spezies, bestimmt durch SDS-PAA-Elektrophorese, waren etwa 68 kDa (mono-pegylierte EPO-Spezies), etwa 98 kDa (di-pegylierte EPO-Spezies) und etwa 128 kDa (tri-pegylierte EPO-Spezies).
Eine weitere Auftrennung der tri-, di- und mono-pegylierten EPO-Spezies kann erreicht werden durch Chromatographie, z.B. durch Größenausschlusschromatographie (Superdex, pg 200; Pharmacia).
Die Bestimmung der biologischen in vivo-Aktivität des Eluats, das tri-, di- und mono-pegylierte Spezies enthält, wurde durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren durchgeführt.
BEISPIEL 4: In vivo-Aktivität von pegyliertem EPO, bestimmt durch den normocythämische Maus-Assay
Der normocythämische Maus-Bioassay ist in der Technik bekannt (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) und ein Verfahren in der Monographie von Erythropoietin von Ph. Eur. BRP. Die Proben werden mit BSA-PBS verdünnt. Normalen gesunden Mäusen, 7–15 Wochen alt, wird s.c. eine 0,2 ml-EPO-Fraktion verabreicht, die tri-, di- und mono-pegyliertes EPO, wie in Beispiel 2 beschrieben, enthält. Über eine Dauer von 4 Tagen, beginnend 72 Stunden nach der Verabreichung, wird Blut durch Punktion der Schwanzvene entnommen und so verdünnt, dass 1 μl Blut in 1 ml einer 0,15 μmol Acridin-Orange-Färbelösung vorliegt. Die Färbungszeit ist 3 bis 10 Minuten. Die Reticulocytenzählungen werden mikrofluorometrisch in einem Flusscytometer durchgeführt durch Analyse des roten Fluoreszenzhistogramms. Die Reticulocytenzählungen sind bezüglich der absoluten Figuren (pro 30.000 analysierter Blutzellen) angegeben. Für die angegebenen Daten bestand jede Gruppe aus 5 Mäusen pro Tag und die Mäuse wurden nur einmal bluten gelassen.
Methoxy-PEG-Maleimid, gekoppelt an EPO gemäß Beispiel 3, unmodifiziertes EPO und Pufferlösung, wurden Mäusen verabreicht. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen die überragende Aktivität und die ausgedehnte Halbwertszeit der pegylierten EPO-Spezies, die durch deutlich erhöhte Mengen Reticulocyten und die Verschiebung des Reticulocytenzählungsmaximums unter Verwendung der gleichen Dosis pro Maus gezeigt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Konjugat, wobei das Konjugat ein Erythropoietin-Glycoprotein umfasst, das mindestens eine freie Aminogruppe und die biologische in-vivo-Aktivität besitzt, Knochenmarkszellen dazu zu veranlassen, die Produktion von Reticulocyten und roten Blutkörperchen zu erhöhen, und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus menschlichem Erythropoietin und Analoga davon, die die Primärstruktur von menschlichem Erythropoietin besitzen, das durch Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder durch die Umordnung von mindestens einer Glycosylierungsstelle modifiziert wurde; wobei das Glycoprotein kovalent an ein bis drei C₁-C₆ Alkoxypoly(ethylenglycol)reste gebunden ist, wobei jeder Poly(ethylenglycol)rest über einen Linker der Formel -C(O)-X-S-Y- kovalent an das Glycoprotein gebunden ist, wobei das C(O) des Linkers eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen eingeht, wobei X -(CH₂)_k- oder -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k, k eine Zahl von 1 bis 10, Y
ist, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht jeder Poly(ethylenglycol)einheit 20 kD bis 40 kD beträgt und das Molekulargewicht des Konjugats 51 kD bis 175 kD beträgt.
Konjugat nach Anspruch 1 mit der Formel: P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)_m-OR)_n wobei X und Y wie in Anspruch 1 definiert sind, m eine Zahl von 450 bis 900 ist, n eine Zahl von 1 bis 3 ist, R ein C₁-C₆ Alkylrest ist und P ein Erythropoietin-Glycoprotein ohne die Aminogruppe oder Aminogruppen ist, die eine Amidbindung mit X eingehen.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche mit der Formel
wobei P, R, X, m und n wie in Anspruch 2 definiert sind.
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2 mit der Formel
wobei P, R, X, m und n wie in Anspruch 2 definiert sind.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei X -(CH₂)_k- ist.
Konjugat nach Anspruch 5, wobei k eine Zahl von 1 bis 4 ist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei X -CH₂- ist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei m eine ganze Zahl von 550 bis 800 ist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei m eine ganze Zahl von 650 bis 700 ist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei n 1 ist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei R eine Methylgruppe ist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht jeder Poly(ethylenglycol)einheit 24 kD bis 35 kD beträgt.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht jeder Poly(ethylenglycol)einheit 30 kD beträgt.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Glycoprotein kovalent mit einer oder zwei Poly(ethylenglycol)einheiten verbunden ist, die mit C₁-C₆-Alkoxy-Gruppen als Kappe versehen sind.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Poly(ethylenglycol)einheiten mit einer Methoxy-Gruppe als Kappe versehen sind.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei X -CH₂- ist, m eine ganze Zahl von 650 bis 700 ist, n 1 ist, R eine Methylgruppe ist, und wobei das durchschnittliche Molekulargewicht jeder Poly(ethylenglycol)einheit 30 kD beträgt.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Erythropoietin-Glycoprotein ein menschliches Erythropoietin ist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Erythropoietin-Glycoprotein durch endogene Genaktivierung exprimiert wird.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Erythropoietin-Glycoprotein die Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder Seq ID Nr. 2 besitzt.
Konjugat nach Anspruch 19, wobei das Erythropoietin-Glycoprotein die Sequenz SEQ ID Nr. 1 besitzt.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Glycoprotein die Sequenz von menschlichem Erythropoietin besitzt, das durch Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen modifiziert wurde.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 8 und 10, wobei das Glycoprotein die Sequenz von menschlichem Erythropoietin besitzt, das durch eine Modifikation modifiziert wurde, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Glycoprotein eine Sequenz, die die Sequenz von menschlichem Erythropoietin umfasst, und eine zweite Sequenz am Carboxyterminus der menschlichen Erythropoietinsequenz besitzt, wobei die zweite Sequenz mindestens eine Glycosylierungsstelle enthält.
Konjugat nach Anspruch 23, wobei die zweite Sequenz eine Sequenz umfasst, die von der carboxyterminalen Sequenz von menschlichem Choriogonadotropin abgeleitet ist.
Konjugat nach Anspruch 24, wobei das Glycoprotein eine Sequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) menschlichem Erythropoietin mit der Aminosäuresequenz Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID Nr. 3), die sich vom Carboxyterminus erstreckt; b) der Sequenz von (a), modifiziert durch Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰; und c) der Sequenz von (a), modifiziert durch Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Glycoprotein die Sequenz von menschlichem Erythropoietin besitzt, das durch eine Umordnung von mindestens einer Glycosylierungsstelle modifiziert wurde.
Konjugat nach Anspruch 25, wobei die Umordnung die Deletion einer beliebigen N-verknüpften Kohlenhydratstelle in menschlichem Erythropoietin und die Addition einer N-verknüpften Kohlenhydratstelle an Position 88 der Sequenz von menschlichem Erythropoietin umfasst.
Konjugat nach Anspruch 14, wobei das Glycoprotein die Sequenz von menschlichem Erythropoietin besitzt, das durch eine Modifikation modifiziert wurde, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Zusammensetzung, umfassend Konjugate wie in einem der Ansprüche 1 bis 28 definiert.
Zusammensetzung, umfassend Konjugate wie in einem der Ansprüche 2 bis 27 definiert, wobei der Prozentsatz von Konjugaten, bei denen n 1 ist, mindestens 90% beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 oder 30, wobei der Prozentsatz von Konjugaten, bei denen n 1 ist, mindestens 92% beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei der Prozentsatz von Konjugaten, bei denen n 1 ist, mindestens 96% beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 oder 32, wobei der Prozentsatz von Konjugaten, bei denen n 1 ist, 90% bis 96% beträgt.
Arzneimittel, umfassend ein Konjugat oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 33 und einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.
Verwendung eines Konjugats oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 33 für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, die mit Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF) in Beziehung stehen, von AIDS und zur Behandlung von Krebspatienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung oder Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wobei das Verfahren das kovalente Verknüpfen von Thiolgruppen mit einem Erythropoietin-Glycoprotein und das Verknüpfen des resultierenden aktivierten Erythropoietin-Glycoproteins mit einem Poly(ethylenglycol) (PEG)-Derivat umfasst.
Konjugate und Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wenn sie durch das Verfahren nach Anspruch 36 hergestellt werden.
Konjugate und Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 33 zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF) in Zusammenhang stehen, von AIDS und von Krebspatienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen.