DE60014365T2

DE60014365T2 - Fluoreszenzpolarizationsbestimmungen unter verwendung von polyionen

Info

Publication number: DE60014365T2
Application number: DE60014365T
Authority: DE
Inventors: T. Theo NIKIFOROV
Original assignee: Caliper Life Sciences Inc
Current assignee: Caliper Life Sciences Inc
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-11
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-05-12
Also published as: AU5134300A; EP1183536A1; DE60029363T2; EP1183536B1; ATE278190T1; DE60014365D1; IL146375A0; MXPA01011831A; JP4472879B2; ATE332978T1; NZ515384A; JP2003502620A; DE60029363D1; CA2373747A1; CN1355884A; AU762155B2; CN1130564C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Praktisch die gesamte chemische, biologische und biochemische Forschung hängt von der Fähigkeit der Wissenschafter ab, die Richtung ihrer Forschungsarbeiten insofern festzulegen, als sie Reaktionsgemische auf Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten chemischen Spezies im Reaktionsgemisch untersuchen. In einem einfachen Fall wird die Rate oder Wirksamkeit der Reaktion getestet, indem die Bildungsrate des Reaktionsprodukts oder der Verbrauch eines Reaktionssubstrats gemessen wird. Ebenso werden interaktive Reaktionen, z.B. Bindungs- oder Trennungsreaktionen im Allgemeinen durch Messen der Menge an gebundenem oder freiem Material im resultierenden Reaktionsgemisch untersucht.
Für bestimmte Reaktionen ist die Spezies von Interesse oder ein geeigneter Ersatz leicht nachweisbar bzw. detektierbar und vom übrigen Teil der Reagenzien problemlos unterscheidbar. Um eine solche Spezies nachzuweisen, muss man lediglich nach ihr suchen. Dies bedeutet oft, dass man das Reaktionsprodukt optisch detektierbar und von den Reagenzien unterscheidbar macht – mittels eines Signalisierungselements bzw. einer Signalisierungsgruppe, das bzw. die nur auf dem Produkt oder Substrat vorhanden oder aktiv ist. Durch Messen des Werts des optischen Signals kann man direkt die Menge an Produkt oder verbleibendem Substrat ermitteln.
Leider besitzen zahlreiche Reaktionen von besonderem Interesse nicht den Vorteil, dass man leicht verfügbares Ersatzreagens hat, das Signal nur dann erzeugt, wenn es der Reaktion von Interesse unterzogen wird. Beispielsweise unterziehen zahlreiche Reaktionen, die für die biologische Forschung von großem Interesse sind, ihre Reagenzien nicht jenen Modifikationen, die zu beträchtlichen Änderungen der optischen Eigenschaften führen können. Forscher versuchten, Substrate zu entwickeln, die zu solchen Veränderungen der optischen Eigenschaften führen. Beispielsweise bewirken typische Bindungsreaktionen zwischen zwei Molekülen einen gebundenen Komplex dieser Moleküle. Selbst wenn aber ein Mitglied des Bindungspaars markiert ist, verursacht die Bildung des Komplexes nicht notwendigerweise eine optisch de tektierbare Differenz zwischen dem Komplex und dem markierten Molekül. In der Folge hängen die meisten Bindungstests von der Immobilisierung eines Mitglieds oder Moleküls des Bindungspaars ab. Das markierte Molekül wird dann mit dem immobilisierten Molekül in Kontakt gebracht und der Immobilisierungsträger gewaschen. Nach dem Waschen wird der Träger auf Gegenwart des markierten Moleküls untersucht, was ein Indikator für die Bindung der markierten Komponente an die unmarkierte immobiliiserte Komponente ist. Es werden sehr viele unterschiedliche Bindungspaarelemente erzeugt, um den Durchsatz des Testformats zu steigern. Siehe z.B. US-Patent 5.143.854 (Pirrung et al.).
Alternativ dazu entwickelten Forscher – in Zusammenhang mit Nucleinsäure-Hybridisierungstests – Komplementaritäts-Markierungssysteme, die sich die Nähe der gebundenen Elemente zunutze machen, um fluoreszierende Signale zu erzeugen (entweder im gebundenen oder ungebundenen Zustand). Siehe z.B. die US-Patente 5.668.648, 5.707.804, 5.728.528, 5.853.992 und 5.869.255 (Mathies et al.) für eine Beschreibung von FRET-Farbstoffen und Tyagi et al., Nature Biotech 14, 303–308 (1996) sowie Tyagi et al., Nature Biotech 16, 49–53 (1998) für eine Beschreibung molekularer Signale.
WO 98/18956 offenbart ein Verfahren, das die Messung der Fluoreszenzpolarisation eines Reporter-Moleküls dazu verwendet, die Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines Peptids oder Proteinsubstrats in Lösung zu quantifizieren.
WO 94/13665 offenbart ein Verfahren, in dem ein Fluoreszenz-markiertes Oligonucleotid zum Detektieren eines Makromoleküls, wie z.B. Nucleinsäure, dient.
Wie oben erwähnt, sind Bindungsreaktionen nur ein Kategorie von Tests, die im Allgemeinen keine optisch detektierbaren Signale liefern. Ebenso gibt es eine Reihe anderer Tests, deren Reagenzien und/oder Produkte nicht problemlos voneinander unterschieden werden können – und dies sogar trotz der Inkorporation optisch detektierbarer Elemente. Beispielsweise enthalten Kinase-Tests, die Phosphatgruppen auf phosphorylierbaren Substraten umfassen, im Allgemeinen keine Ersatzsubstrate, die nach Abschluss der Phosphorylierungsreaktion ein detektierbares Signal erzeugen. Stattdessen beruhen solche Reaktionen typicherweise auf einer Änderung in der Struktur des Produkts, welche strukturelle Änderung dazu dient, die Reaktanten vom Produkt zu trennen. Dann wird das abgetrennte Produkt detektiert. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig sein sollte, können Tests, die zusätzliche Trennungsschritte erfordern, aufgrund der Verluste während der verschiedenen Testschritte extrem zeitaufwändig und wenig wirkungsvoll sein.
Es wäre allgemein wünschenswert, die oben beschriebenen Tests ohne die Notwendigkeit fester Träger, zusätzlicher Trennschritte o.dgl. durchzuführen. Die vorliegende Erfindung erreicht dieses und eine Vielzahl anderer wichtiger Ziele.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bietet Verfahren, Systeme, Sets u.dgl. zur Durchführung einer großen Anzahl unterschiedlicher Tests. Diese Tests umfassen typischerweise die Bereitstellung eines ersten Reagensgemischs, das ein erstes Reagens mit einer fluoreszierenden Markierung enthält. Ein zweites Reagens wird in das erste Reagensgemisch eingeleitet, um ein zweites Reagensgemisch zu erzeugen, wobei das zweite Reagens mit dem ersten Reagens reagiert, um ein fluoreszierend markiertes Produkt mit einer anderen Ladung als das erste Reagens zu bilden. Ein Polyion wird in zumindest eines von erstem und zweitem Reagensgemisch eingeführt und die Fluoreszenzpolarisation im zweiten Reagensgemisch relativ zum ersten Reagensgemisch bestimmt, wobei diese Fluoreszenzpolarisation ein Indikator für die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der Reaktion ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen einer Reaktion. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung eines ersten Reagensgemischs, das ein erstes Reagens mit einer fluoreszierenden Markierung enthält. Ein zweites Reagens wird in das erste Reagensgemisch eingebracht, um ein zweites Reagensgemisch zu bilden. Dieses zweite Reagens reagiert mit dem ersten Rea gens, um ein fluoreszierend markiertes Produkt mit anderer Ladung als das erste Reagens zu bilden. Ein Polyion wird in zumindest eines des ersten und zweiten Reagensgemischs eingeführt und die Fluoreszenzpolarisation im zweiten Reagensgemisch relativ zum ersten Reagensgemisch verglichen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart einer Teilsequenz von Nucleotiden in einer Zielnucleinsäure. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren der Zielnucleinsäuresequenz mit einem positiv geladenen oder im Wesentlichen ungeladenen, fluoreszierend markierten Nucleinsäureanalog in einem ersten Reaktionsgemisch. Das Nucleinsäureanalog ist komplementär zur Teilsequenz, wodurch das Nucleinsäureanalog zur spezifischen Hybridisierung an die Teilsequenz fähig ist, um ein erstes Hybrid zu bilden. Das erste Reaktionsgemisch wird mit einem Polyion kontaktiert und der Fluoreszenz-Polarisationsgrad des ersten Reaktionsgemischs in Gegenwart des Polyions mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad des Nucleinsäureanalogs in Abwesenheit der Zielnucleinsäuresequenz verglichen. Eine Zunahme des Fluoreszenz-Polarisationsgrads zeigt die Gegenwart des ersten Hybrids an.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Detektieren der Phosphorylierung einer phosphorylierbaren Verbindung. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung der phosphorylierbaren Verbindung mit einer fluoreszierenden Markierung. Die phosphorylierbare Verbindung wird mit einem Kinase-Enzym in Gegenwart einer Phosphatgruppe in einem ersten Gemisch und dann das erste Gemisch mit einem Polyion in Kontakt gebracht. Der Fluoreszenz-Polarisationsgrad aus dem ersten Gemisch in Gegenwart des Polyions wird mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad aus der phosphorylierbaren Verbindung mit der fluoreszierenden Markierung in Abwesenheit des Kinase-Enzyms verglichen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren der Phosphorylierung einer phosphorylierbaren Verbindung. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung der phosphorylierbaren Verbindung mit einer fluoreszierenden Markierung. Die phosphorylierbare Verbindung wird mit einem Kinase-Enzym in Gegenwart einer Phosphatgruppe in einem ersten Gemisch in Kontakt gebracht. Das erste Gemisch wird mit einem zweiten Reagensgemisch, das ein Protein mit einer damit verbundenen Chelatgruppe enthält, und einem Metallion, ausgewählt aus Fe³⁺, Ca²⁺, Ni²⁺ und Zn²⁺, kontaktiert. Der Fluoreszenz-Polarisationsgrad aus dem ersten Gemisch in Gegenwart des zweiten Gemischs wird mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad aus der phosphorylierbaren Verbindung mit der fluoreszierenden Markierung in Abwesenheit des Kinase-Enzyms verglichen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein einen Fluidbehälter umfassendes Testsystem. Das System enthält eine erste Reaktionszone mit einem ersten Reagensgemisch, das ein erstes Reagens mit einer fluoreszierenden Markierung, ein zweites Reagens, das mit dem ersten Reagens reagiert, um ein fluoreszierend markiertes Produkt mit anderer Ladung als das erste Reagens zu bilden, und ein Polyion umfasst. Das System enthält ferner eine Detektionszone und einen Detektor, der in Sensorkommunikation mit der Detektionszone steht. Der Detektor ist solcherart konfiguriert, dass er den Fluoreszenz-Polarisationsgrad von Reagenzien in der Detektionszone detektiert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Testsystem, das einen ersten in einer Körperstruktur angeordneten Kanal umfasst. Der erste Kanal steht in Fluidkommunikation mit einer Quelle eines ersten Reagensgemischs, umfassend ein erstes Reagens mit einer fluoreszierenden Markierung, eine Quelle eines zweiten Reagens, das mit dem ersten Reagens reagiert, um ein fluoreszierend markiertes Produkt zu bilden, das eine andere Ladung als das erste Reagens aufweist, und eine Quelle eines Polyions. Das System enthält ferner ein Materialtransportsystm zur Einleitung des ersten Reagens, des zweiten Reagens und des Polyions in den ersten Kanal und einen Detektor, der in Sensorkommunikation mit dem ersten Kanal steht. Der Detektor ist ausgebildet, den Fluoreszenz-Polarisationsgrad von Reagenzien in der Detektionszone zu detektieren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Set. Dieses enthält ein Volumen eines ersten Reagens, das eine fluoreszierende Markierung umfasst; ein Volumen eines zweiten Reagens, das mit dem ersten Reagens reagiert, um ein fluoreszierenes Produkt zu bilden, dessen Ladung sich vom ersten Reagens unterscheidet; und ein Volumen eines Polyions. Das Set enthält auch Anweisungen zur Bestimmung des Fluoreszenz-Polarisationsgrad des ersten Reagens, zur Mischung des ersten Reagens, des zweiten Reagens und des Polyions in einem ersten Gemisch, zur Bestimmung des Fluoreszenz-Polarisationsgrad des ersten Gemischs und zum Vergleichen des Fluoreszenz-Polarisationsgrads des ersten Reagens mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad des ersten Gemischs.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines allgemeinen gemäß der Erfindung durchgeführten Testverfahrens.
2 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäß durchgeführten Bindungstests, z.B. eines Nucleinsäure-Hybridisierungstests.
3 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäß durchgeführten Enzymtests, z.B. eines Kinase-Tests.
4 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäß durchgeführten Phosphatase-Tests.
5 ist eine allgemeine schematische Darstellung eines Gesamtsystems zur Durchführung der Testverfahren der Erfindung.
6 ist eine schematische Darstellung einer mehrschichtigen Mikrofluidikvorrichtung, die gegebenenfalls als Reaktions/Testbehältnis der Erfindung verwendet wird.
7 ist eine schematische Darstellung einer Mikrofluidikvorrichtung, die eine externe Probenzieh-Pipettiereinrichtung als Reaktions/Test-Behältnis der Erfindung umfasst.
8 ist eine schematische Darstellung eines Beispiels für ein hierin zu verwendendes optisches Detektionssystem.
9 ist ein Flussdiagramm eines Softwareprogramms oder computerisierten Verfahrens, das als Teil eines Testsystems zur Durchführung der Tests der Erfindung abläuft.
10 veranschaulicht ein Beispiel für ein Computersystem und eine Computerarchitektur zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung.
11 zeigt die Schnitstellen einer Mikrofluidikvorrichtung mit anderen Elementen eines Systems zum Steuern von Stoffbewegungen, Detektieren von Testergebnissen aus der Mikrofluidikvorrichtung und Analysieren dieser Ergebnisse.
Die 12A bis 12E sind Graphen, aus denen die Fluoreszenzpolarisation unterschiedlicher fluoreszierender phosphorylierbarer Verbindungen in Gegenwart steigender Mengen eines Polykations ersichtlich ist.
13 ist ein Graph der Fluoreszenzpolarisation eines Gemischs aus fluoreszierendem phosphorylierbarem Substrat und phosphoryliertem Produkt, wobei die relativen Konzentrationen von Substrat und Produkt in Gegenwart eines Polykations variiert werden.
14 ist ein ähnlicher Graph wie jener von 13, außer dass ein anderes phosphorylierbares Substrat und phosphoryliertes Produkt verwendet wird.
15 ist ein Graph, aus dem die Korrelation zwischen Aktivität von Protein-Kinase B (PKB) beim Detektieren mittels kapillarer elektrophoretischer Trennung/Detektion (vertikale Achse) und fluoreszierender Polarisationsdetektion (horizontale Achse) ersichtlich ist.
16 ist ein Graph der Fluoreszenzpolarisation über der Reaktionszeit für PKA-Tests, die in Gegenwart unterschiedlicher ATP-Konzentrationen im Reaktionsgemisch erfolgen.
17 ist ein Graph der Anfangsreaktionsrate über der ATP-Konzentration (anhand der in 16 gezeigten Daten).
18 ist ein Lineweaver-Burke-Graph auf der Basis der Testdaten aus den 16 und 17.
19 ist der Graph von Phosphatase-Aktivität für die Vergleichs- und Enzymtestgemische über der Zeit.
20 ist ein Graph des Fluoreszenz-Polarisationsgrads über der Zeit für jeden von drei unterschiedlichen Protease-Testläufen (negativer Vergleich und zwei unterschiedliche Enzymkonzentrationen).
21 ist ein Balkendiagramm des Fluoreszenz-Polarisationsgrads einer fluoreszierenden PNA-Sonde, die zur Abfrage einer nichtkomplementären und komplementären Ziel-DNA-Sequenz in Abwesenheit und Gegenwart variierender Mengen an Polykation dient.
22 ist ein Graph der Fluoreszenzpolarisation eines Gemischs einer Zielnucleinsäuresequenz und einer perfekt komplementären fluoreszierenden PNA-Sonde (obere Linie, Rauten) sowie eines Gemischs einer Zielsequenz, die mit Ausnahme einer einzelnen Basenfehlübereinstimmung mit einer fluoreszierenden PNA-Sonde komplementär ist (untere Linie, Quadrate).
Die 23A, B und C sind Graphen von Schmelzkurven von DNA/PNA-Hybriden, wobei die Zielsequenzen und Sonden drei unterschiedliche Konfigurationen aufweisen. Es sind die Zielsequenzen zu sehen, die eine perfekte Übereinstimmung und zwei unterschiedliche Fehlübereinstimmungen für das Ziel (23A, B bzw. C) sowie drei unterschiedliche Sondenlängen (9-mer, 11-mer und 13-mer) darstellen, wie dies durch die drei Linien in jedem Graphen zu sehen ist.
24 ist ein Graph der SNP-Detektion unter Anwendung der erfindungsgemäßen Fluoreszenzpolarisations-Detektion und Vergleichen dieses Detektionsverfahrens mit einfachen Fluoreszenzintensitäts-Messungen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Einleitung
Die vorliegende Erfindung bietet allgemein Testverfahren und -systeme, die sich für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen eignen, für die andere typische Testformate nicht in Frage kommen. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Systeme können ein Reaktionsprodukt in Gegenwart des Reaktionssubstrats nachweisen, obwohl das Produkt aufgrund einer Eigenschaft nachgewiesen wird, die es mit dem Reaktionssubstrat gemeinsam hat, z.B. einer fluoreszierenden Markierungsgruppe.
Im Allgemeinen unterscheiden die Verfahren und Systeme der Erfindung Reaktionsprodukt von einem Reaktionssubstrat aufgrund einer durch die Reaktion bedingten Differenz der Ladung zwischen ihnen. Die Ladung auf einer dieser Reaktionskomponenten – ob sie sich nun auf dem Substrat oder dem Produkt befindet – dient dazu, diese Komponente mit einer relativ großen polyionischen Verbindung zu assoziieren. Der bevorzugte Zusammenschluss der großen polyionischen Verbindung mit dem Substrat oder dem Produkt führt zu einer substanziellen Differenz im Grad der Fluoreszenzpolarisations-Emissionen aus dieser Komponente, wenn sie mit polarisiertem Licht angeregt wird. Da sich die große Verbindung vorzugsweise nur mit einem von Substrat und Produkt zusammenschließt (infolge der Verfügbarkeit oder des Fehlens von Ladung aufgrund der Reaktion von Interesse), werden diese Assoziation und ihre nachfolgende Änderung der Fluoreszenzpolarisation zu Indikatoren des Fortschritts der Reaktion von Interesse.
II. Testverfahren
In zumindest einem Aspekt der Erfindung bietet die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen einer chemischen, biochemischen oder biologischen Reaktion. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung eines ersten Reagensgemischs, das ein erstes Reagens mit einer fluoreszierenden Markierung enthält. Ein zweites Reagens wird in das erste Reagensgemisch eingebracht, um ein zweites Reagensgemisch zu bilden. Das zweite Reagens kann im Allgemeinen mit dem ersten Reagens reagieren oder mit ihm in anderer Weise in Wechselwirkung treten, um ein fluoreszierend markiertes Produkt zu erzeugen, dessen Ladung sich im Wesentlichen von jener des ersten Reagens unterscheidet. Die Ausdrücke „unterschiedliche Ladung" oder „im Wesentlichen unterschiedliche Ladung" u.dgl. bedeuten, dass die Nettoladung auf dem Produkt eine andere ist als jene des ersten Reagens – in einem Ausmaß, das den unterschiedlichen Zusammenschluss des Substrats und Produkts mit einer polyionischen Verbindung erlaubt (siehe die hierin gegebenen Ausführungen dazu). Diese unterschiedliche Ladung kann eine Fraktion einer Ladung sein (durchschnittlich über dem gesamten Reagensmolekül). Allerdings unterscheiden sich in bevorzugten Aspekten der Erfindung beim pH-Wert des Tests das Substrat und das Produkt typischerweise um zumindest eine Ladungseinheit voneinander. Beispielsweise besitzt hierin ein Produkt, das eine einzelne positive oder negative Nettoladung trägt, eine wesentlich andere Ladung als das erste Reagens, das eine neutrale Nettoladung aufweist. Vorzugsweise unterscheidet sich ein Produkt mit einer im Wesentlichen anderen Ladung als das erste Reagens hinsichtlich der Nettoladung um zumindest zwei Ladungseinheiten und – in bestimmten Aspekten der Erfindung – um mehr als zwei Ladungsein heiten, z.B. in den nachstehend ausführlich beschriebenen Nucleinsäure-Anwendungen.
Ein Polyion wird mit dem ersten und/oder zweiten Reagensgemisch in Kontakt gebracht, wobei dies vom jeweils durchgeführten Testtyp und der Beschaffenheit des durch die Reaktion von Interesse enthaltenen Produkts abhängt. Da die Reaktion von Interesse ein Produkt mit deutlich anderer Ladung als das Substrat erzeugt, tritt dieses Produkt ganz anders als das Substrat mit dem Polyion in Wechselwirkung, d.h. mit stärkerer oder schwächerer Wechselwirkung/Assoziation. Die Assoziation bzw. deren Fehlen hat einen nachhaltigen Einfluss auf die Fähigkeit des Produkts, emittierte Fluoreszenz zu depolarisieren. Konkret besitzt – wie dies nachstehend ausführlich beschrieben ist – das relativ kleine erste Reagens eine relativ hohe Rotationsdiffusionsrate. Diese ist für die Fähigkeit einer fluoreszierenden Verbindung verantwortlich, depolarisierte Fluoreszenz zu emittieren, wenn sie mit polarisiertem Licht angeregt wird. Die Assoziation einer großen polyionischen Verbindung mit einem kleinen fluoreszierenden Molekül verlangsamt jedoch deutlich die Rotationsdiffusionsrate dieses Moleküls, wodurch auch seine Fähigkeit, depolarisierte Fluoreszenz zu emittieren, eingeschränkt wird.
Der Fluoreszenz-Polarisationsgrad im zweiten Reagensgemisch wird dann mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad aus dem ersten Reagensgemisch verglichen. Durch Vergleichen dieser Werte kann man die Menge an Fluoreszenz quantifizieren, die vom an das Polyion gebundenen Material emittiert wird. Wie dies hierin weiter unten ausführlich erläutert ist, kann dieser Test bedarfsgemäß abgestimmt werden, z.B. durch Einstellen des pH-Werts, der Ionenstärke o.dgl., sodass sich nur eines des ersten Reagens oder Produkts mit dem Polyion zusammenschließen kann. Die Änderung der Fluoreszenzpolarisation dient dazu, ein quantitatives Maß der Menge an erzeugtem Produkt oder verbrauchtem erstem Reagens zu berechnen; sie wird somit zu einem Maß für die Reaktion.
Die Prinzipien, die der Verwendung von Fluoreszenzpolarisations-Messungen als Verfahren zur Bestimmung der Bindung zwischen verschiedenen Molekülen zugrunde liegen, sind relativ unkompliziert. Wenn – kurz gesagt – ein fluoreszierendes Molekül mit einer polarisierten Lichtquelle angeregt wird, sendet das Molekül Fluoreszenzlicht in einer fixierten Ebene aus, d.h. das emittierte Licht ist auch polarisiert, sofern das Molekül räumlich fixiert ist. Da jedoch das Molekül typischerweise im Raum rotiert und kippt, ändert sich die Ebene, in der das fluoreszierende Licht ausgesandt wird, je nach Rotation des Moleküls (auch als Rotationsdiffusion des Moleküls bezeichnet). Anders gesagt ist die emittierte Fluoreszenz im Allgemeinen depolarisiert. Je rascher das Molekül in Lösung rotiert, desto depolarisierter ist es. Umgekehrt ist sie umso weniger depolarisiert oder polarisierter, je langsamer das Molekül in Lösung rotiert. Der Polarisationswert (P) für ein bestimmtes Molekül ist proportional zur „Rotationskorrelationszeit" des Moleküls, d.h. der Zeit, die das Molekül benötigt, um um einen Winkel von 57,3° (1 Radian) zu rotieren. Je kürzer die Rotationskorrelationszeit, desto rascher rotiert das Molekül, und desto weniger Polarisation stellt man fest. Je länger die Rotationskorrelationszeit, desto langsamer rotiert das Molekül, und desto mehr Polarisation stellt man fest. Die Rotationsrelaxationszeit steht in Zusammenhang mit Viskosität (η), absoluter Temperatur (T), Molvolumen (V) und Gaskonstante (R). Die Rotationskorrelationszeit wird im Allgemeinen anhand der folgenden Formel berechnet: Rotationskorrelationszeit = 3η V/RT (1)
Man erkennt aus der obigen Gleichung, dass bei konstant gehaltener Temperatur und Viskosität die Rotationsrelaxationszeit und daher der Polarisationswert direkt mit dem Molvolumen in Verbindung stehen. Daher gilt: Je größer das Molekül, desto höher sein Fluoreszenzpolarisations-Wert; je kleiner das Molekül, desto niedriger sein Fluoreszenzpolarisations-Wert.
Bei der Durchführung von Fluoreszenz-Bindungstests wird ein typischerweise kleines, fluoreszierend markiertes Molekül, z.B. ein Ligand, Antigen usw., mit relativ kurzer Rotationskorrelationszeit dazu verwendet, sich an ein viel größeres Molekül zu binden, z.B. ein Rezeptorprotein, Antikörper usw. mit einer viel längeren Rotationskorrelationszeit. Die Bindung des kleinen markierten Moleküls an das größere Molekül verlängert deutlich die Rotationskorrelationszeit (und reduziert das Rotationsausmaß) der markierten Spezies, d.h. des markierten Komplexes, gegenüber jener des freien, unmarkierten Moleküls. Dies übt einen entsprechenden Einfluss auf den nachweisbaren Polarisationsgrad aus. Konkret weist der markierte Komplex eine viel höhere Fluoreszenzpolarisation auf als das ungebundene markierte Molekül.
Im Allgemeinen wird der Fluoreszenz-Polarisationsgrad unter Heranziehung der folgenden Formel berechnet: P = [I(||) – I(⫠)]/[I(||) + I(⫠)] (2)worin I(||) die in der Ebene parallel zum Anregungslicht detektierte Fluoreszenz ist und I(⫠) die in der Ebene senkrecht zum Anregungslicht detektierte Fluoreszenz ist.
Bei der Durchführung von Screening-Tests, z.B. für potentielle Hemmer, Verstärker, Agonisten oder Antagonisten der jeweiligen Bindungsfunktion, wird die Fluoreszenzpolarisation des Reaktionsgemischs in Gegenwart und Abwesenheit unterschiedlicher Verbindungen verglichen, um zu bestimmen, ob diese Verbindungen einen Einfluss auf die Bindungsfunktion von Interesse ausüben. Insbesondere nimmt in Gegenwart von Inhibitoren der Bindungsfunktion die Fluoreszenzpolarisation ab, je mehr an freiem, markiertem Liganden im Test vorhanden ist. Im Gegenzug führen Verstärker der Bindungsfunktion zu einer Erhöhung der Fluoreszenzpolarisation, je mehr an Komplex und je weniger an freiem, markiertem Liganden im Test vorhanden ist.
Die bevorzugten Verfahren der Erfindung sehen typischerweise die Anwendung von Fluoreszenzpolarisations-Detektion vor, z.B. den Nachweis von Änderungen des Ausmaßes an depolarisierter Fluoreszenz, die nach einer bestimmten Reaktion aus dem Reaktionsgemisch emittiert wird. Andere Fluoreszenzdetektions-Systeme kommen jedoch hierin ebenfalls in Frage. Beispielsweise stellte sich heraus, dass zusätzlich zur Änderung des Ausmaßes an aus dem Reaktionsgemisch emittierter depolarisierter Fluoreszenz die Assoziation der Polyionen in diesem Gemisch den Grad der gesamten Fluoreszenz bzw. die Fluoreszenzintensität, die aus dem Reaktionsgemisch emittiert wird, beeinflussen kann. Somit kann man gemäß den allgemeinsten Aspekten der Erfindung lediglich eine Veränderung in einer Vielzahl an Fluoreszenzeigenschaften nach der Reaktion nachweisen.
Wie oben erwähnt, sehen die Testverfahren der Erfindung typischerweise die Verwendung eines ersten Reagens vor, das eine fluoreszierende Markierungsgruppe enthält. Die Beschaffenheit des ersten Reagens hängt im Allgemeinen von der Art des jeweils durchgeführten Tests ab. Typischerweise kann unter Anwendung der Erfindung eine Vielzahl unterschiedlicher Rests durchgeführt werden, z.B. eine breite Palette an Bindungs- oder anderen assoziativen Tests sowie Tests der enzymatischen Aktivität. Beispiele für die ersten Reagenzien sind demnach hierin ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars, d.h. Antikörper/Antigen-Paare, Rezeptor/Liganden-Paare, komplementäre Nucleinsäuren oder Analoge davon, Bindungsproteine und ihre Bindungsstellen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann das erste Reagens ein Substrat umfassen, das durch die Reaktion von Interesse modifiziert wird, z.B. durch Vergrößerung, Verkleinerung oder Änderung der chemischen Struktur des ersten Reagens. Einige konkrete Beispiele für solche Substrate sind Kinase-Substrate; umfassend phosphorylierbare Gruppen, z.B. Serin-, Threonin- und Tyrosin-Phosphorylierungsstellen u.dgl., phosphorylierte Substrate für Phosphatase-Enzyme, Amino- oder Keto-hältige Substrate, die Amino-Transferasen unterliegen, zu Carboxylen umgewandelte Alkohole (z.B. mittels Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase) sowie Substrate für Sulfatasen, Phosphorylasen, Esterasen, Hydrolasen (z.B. Proteasen), Oxidasen u.dgl.
Das erste Reagens kann entweder positiv oder negativ geladen oder neutral sein, wobei dies von der Beschaffenheit des durchzuführenden Tests abhängt. Die fluoreszierende Markierung des ersten Reagens kann aus einer Vielzahl unterschiedli cher fluoreszierender Markierungsverbindungen ausgewählt sein. Im Allgemeinen sind solche fluoreszierenden Markierungsmaterialien im Handel erhältlich, z.B. bei Molecular Probes (Eugene, OR, USA). Typischerweise eignen sich Fluorescein- oder Rhodaminderivate besonders gut für die hierin beschriebenen Testverfahren. Diese fluoreszierenden Markierungen sind an das erste Reagens gebunden, z.B. in kovalenter Weise mittels allgemein bekannter Bindungschemien. Eine Besprechung von Markierungsgruppen und Chemien findet sich z.B. in WO 98/00231.
Wie oben erwähnt, kommt es zwischen dem zweiten Reagens und dem ersten Reagens allgemein zu einer Reaktion, Wechselwirkung oder sonstigen Assoziation bzw. Bindung, um ein fluoreszierendes Produkt zu erzeugen, das eine im Wesentlichen unterschiedliche Ladung aufweist als das erste Reagens. Wie dies beim ersten Reagens der Fall war, umfasst dieses zweite Reagens gegebenenfalls ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars, z.B. das Mitglied, das mit dem ersten Reagens komplementär ist, sofern das Hybrid der zwei Elemente des Bindungspaars bzw. des ersten und zweiten Reagens eine Ladung trägt bzw. tragen, die eine deutlich andere ist als die Ladung des ersten Reagenselements des Bindungspaars. In vielen Fällen umfasst dies ein zweites geladenes Reagens, während das erste Reagens neutral ist, oder ein zweites stark geladenes Reagens, während das erste Reagens nur mäßig geladen ist. Alternativ dazu bewirkt die Assoziation des ersten und zweiten Reagens eine Konformationsänderung, die zu einem geladenen Produkt führt oder sich an geladene Reste des ersten Reagens bindet bzw. sie maskiert.
Da das durch die Wechselwirkung des ersten und des zweiten Reagens entstehende Produkt eine andere Ladung als das erste Reagens alleine aufweist, tritt es unterschiedlich mit anderen geladenen Molekülen in Wechselwirkung. Insbesondere treten polyionische Verbindungen, die eine beträchtliche Anzahl an Ladungen aufweisen, im Allgemeinen mit geladenen Materialien in einer ladungsabhängigen Weise in Wechselwirkung. Hierin werden große polyionische Verbindungen dazu verwendet, das Produkt (oder – in einigen Fällen – das erste Reagens) mit einer relativ großen Verbindung zu markieren, die die Fähigkeit des Produkts, depolarisierte Fluoreszenz zu emittieren, beeinflusst.
Hierin bevorzugte Polyionen sind Polyaminosäuren, z.B. Proteine, Polypeptide, d.h. Polylysin, Polyhistidin und Polyarginin Andere Polyionen, die gemäß der Erfindung in Frage kommen, sind organische Polyionen, d.h. Polyacrylsäure, Polycarbonsäure, Polyamine (z.B. Polyethylamin), Polysulfonsäuren (z.B. Polystyrolsulfonsäure), Polyphosphorsäure (z.B. Polyvinylphosphorsäure) oder Copolymere davon, z.B. gemischte Polymere dieser Polyaminosäuren u.dgl. Diese Polyionen sind typischerweise im Vergleich zum ersten und/oder zum zweiten Reagens und/oder dem Produkt, das im Test von Interesse verwendet wird, relativ groß. Die Größe des Polyions kann je nach Größe des ersten und/oder zweiten Reagens und/oder des Produkts variieren. Typischerweise besitzt das Polyion eine Größe im Bereich von etwa 5 kD bis etwa 1.000 kD, vorzugsweise von etwa 10 kD bis etwa 200 kD, noch bevorzugter von etwa 10 kD bis etwa 100 kD, auf. Im Fall von Polyaminosäuren bedeutet dies typischerweise ein Polymer mit einer Länge von etwa 50 bis etwa 10.000 Aminosäuremonomeren, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 100 bis ewa 1.000 Monomeren.
Die gemäß der Erfindung verwendeten Polyionen sind im Allgemeinen fähig, mit den anderen Komponenten des Reaktionsgemischs in einer nichtspezifischen, ladungsabhängigen Weise miteinander in Wechselwirkung zu treten. Unter nichtspezifischer Wechselwirkung ist hierin zu verstehen, dass die erfindungsgemäß verwendeten Polyionen die Gegenwart einer spezifischen Erkennungsstelle im Produkt (oder Substrat) nicht benötigen. Diese nichtspezifische Wechselwirkung sorgt demnach für einen weiteren Anwendungsbereich der Tests der Erfindung. Wie bereits erwähnt, tritt das Polyion mit dem Produkt (oder Substrat) in ladungsabhängiger Weise in Wechselwirkung. In der Folge kann dies im Fall titrierbarer Polyionen Pufferbedingungen erforderlich machen, die die Gegenwart der in dieser Wechselwirkung verwendeten Ladungen erlauben. Typischerweise besitzen polyionische Materialien vorzugsweise einen isoelektrischen Punkt (pI), der ein signifikantes Ladungsausmaß beim jeweils für die Testbedingungen vorgesehenen pH-Wert bietet. Typischerweise liegen Puffer, in denen die Tests der Erfindung durchgeführt werden, im physiologisch relevanten Bereich, d.h. von etwa pH 6 bis etwa pH 8, in dem die polyionischen Verbindungen eine ausreichende Ladung besitzen, um mit geladenen Reagenzien in Wechselwirkung zu treten. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig ist, kann man im Allgemeinen das Ladungsausmaß und somit den Grad an Wechselwirkung zwischen einem Polyion und einem Produkt (oder Substrat) einstellen, indem der Puffer, in dem sich diese Elemente befinden, eingestellt wird, wodurch die Ladungsmenge des Polyions und/oder des Produkts beeinflusst wird. Routine-Reaktionsabstimmungen können auch dazu dienen, jeden beliebigen Test zu optimieren, sodass optimale Reaktionsraten sowie Wechselwirkung zwischen der polyionischen Komponente und dem Produkt (oder Substrat) gegeben sind.
Die Wechselwirkung zwischen dem Polyion und dem fluoreszierenden Produkt, die sich von seiner Wechselwirkung mit dem fluoreszierenden ersten Reagens unterscheidet, wird dann als Mittel verwendet, die Menge an erzeugtem Produkt zu vergleichen. Konkret emittiert eine relativ kleine fluoreszierende Verbindung, z.B. das erste Reagens, im Allgemeinen relativ depolarisierte Fluoreszenz, wenn sie durch polarisiertes Anregungslicht angeregt wird. Dies ist im Allgemeinen auf die raschere Rotationsdiffusion oder den „Spin" dieser kleineren Verbindungen zurückzuführen. Größere Verbindungen hingegen besitzen einen langsameren Spin und emittieren wahrscheinlicher relativ polarisierte Fluoreszenz, wenn sie durch eine polarisierte Anregungslichtquelle angeregt werden. Durch Markieren des Produkts mit einer großen Markierung in Form eines Polyions verändert man die Fähigkeit des Produkts, depolarisierte Fluoreszenz zu emittieren, substanziell. Diese Eigenschaft wird dann detektiert und als Maß für die Reaktion des ersten und des zweiten Reagens quantifiziert. Typischerweise bietet die detektierte Fluoreszenzpolarisation bzw. der P-Wert ein Maß für das Verhältnis zwischen gebundener und freier Markierung, obwohl Testergebnisse auch als Differenz zwischen Prä-Reaktions-Fluoreszenzpolarisation und Post-Reaktions-Fluoreszenzpolarisation ermittelt werden können, wobei die Differenz ein Indikator für die Rate und/oder Vollständigkeit der Reaktion ist.
1 ist eine schematische und allgemeine Darstellung der Testverfahren der Erfindung. Diese Abbildungen dienen lediglich der Veranschaulichung und sind keinesfalls einschränkend. Wie aus 1 ersichtlich, ist ein fluoreszierend markiertes erstes Reagens 102 bereitgestellt. Das erste Reagens besitzt eine relativ rasche Rota tionsdiffusionsrate. Das erste Reagens 102 wird mit einem zweiten Reagens, z.B. Enzym I, in Kontakt gebracht, das entweder die Zugabe vermittelt oder selbst eine geladene Gruppe 104 darstellt, die sich mit dem ersten Reagens 102 verbindet, um ein geladenes Produkt 106 zu ergeben. Das resultierende geladene Produkt besitzt typischerweise eine Rotationsdiffusionsrate, die sich nicht wesentlich von jener des ersten Reagens unterscheidet.
Das Produkt wird dann mit einem relativ großen Polyion 108 kontaktiert, das sich mit dem geladenen fluoreszierenden Produkt 106 assoziiert. Das resultierende Polyion/geladene fluoreszierende Produkt 110 besitzt eine deutlich niedrigere Diffusionsrate als das ursprüngliche erste Reagens. Wie oben erwähnt, ist diese Differenz der Rotationsdiffusionsrate quantitativ messbar, z.B. unter Einsatz von Fluoreszenzpolarisations-Detektionsverfahren.
Obwohl die hierin erläuterten Verfahren allgemein in Bezug auf das Polyion beschrieben werden, das sich mit dem Produkt der Reaktion von Interesse zusammenschließt, können sie auch in entgegengesetzter Richtung durchgeführt werden. Konkret wird das erste Reagens gegebenenfalls mit dem Polyion assoziiert – mit allen Eigenschaften, die dies nach sich zieht. Die Reaktion von Interesse ändert dann bei der Erzeugung eines Produkts die Ladung des ersten Reagens. Das Produkt weist dann im Vergleich zum ersten Reagens reduzierte oder eliminierte Wechselwirkung mit dem Polyion auf. Diese reduzierte Wechselwirkung führt dann zu einer Änderung der Fähigkeit des Produkts, polarisierte Fluoreszenz zu emittieren (im Vergleich mit dem ersten Reagens). In einigen Fällen kann dies erfordern, dass der Test in einem heterogenen Format stattfindet, d.h. dass das Polyion nach Ablauf der Reaktion von Interesse zugesetzt wird; dies ist auf den möglichen störenden Einfluss des Polyions auf die Reaktion von Interesse zurückzuführen. Verfahren zur Durchführung der erfindungsgemäßen Tests in homo- und heterogenem Format werden nachstehend ausführlich beschrieben.
Der Fluoreszenz-Polarisationsgrad bietet dann ein Maß für die Menge an fluoreszierender Markierung, die an das Polyion gebunden ist, z.B. als Verhältnis zwischen ge bundener und freier Markierung. Typischerweise sind die Fluoreszenzpolarisations-Daten als Verhältnis zwischen der Differenz paralleler und vertikaler Fluoreszenzemissionen und der Summe dieser Fluoreszenzemissionen angeführt. Somit gilt: Je kleiner die Differenz zwischen diesen Fluoreszenzemissionen, z.B. je depolarisierter die Emissionen, desto kleiner der Polarisationswert. Polarisiertere Emissionen liefern jedoch höhere Werte. Wie oben angeführt, wird beim Vergleichen der Testergebnisse der Polarisationswert (P) für das Reaktionsgemisch bestimmt. Der Anteil an gebundener, z.B. mit dem Polyion assoziierter, Fluoreszenz wird folgendermaßen bestimmt: Fb = (P – Pf)/(Pb – Pf) (3)worin P_b der P-Wert der gebundenen Spezies ist und P_f der P-Wert der freien Spezies ist. Somit kann der Polarisationswert als ein absolutes quantitatives Maß für das Verhältnis zwischen Produkt und Substrat herangezogen werden, wobei man den P-Wert für vollständig gebundene Markierung und vollständig freie Markierung bereits ermittelt hat bzw. ihn kennt. Alternativ dazu kann man – wie oben erwähnt – die Fluoreszenzpolarisation vor und nach der Reaktion messen und den Unterschied zwischen den beiden als Indikator für die Menge an erzeugtem Produkt heranziehen. Wie oben erwähnt, funktionieren die Testverfahren auch für das umgekehrte Testformat, z.B. wenn das Polyion mit dem ersten Reagens, aber nicht mit dem fluoreszierenden Produkt assoziiert ist. In diesem Fall wird die Differenz zwischen der Fluores- zenzpolarisation des ersten Reagens und des Produkts bestimmt.
Der P-Wert dient als Indikator für die Reaktion von Interesse, z.B. indem er die Menge an erzeugtem Produkt anzeigt. Wie dies ausführlicher weiter unten erläutert wird, kann man, sobald eine Testreaktion quantifizierbar ist, diesen Test einigen unterschiedlichen Anwendungen zuführen, z.B. im diagnostischen Bereich, insbesondere aber für das Screening potenzieller Hemmstoffe oder Verstärker der Reaktion von Interesse. Dies eignet sich typischerweise für das Screening von Verbindungsbibliotheken gegen pharmakologisch relevante Ziele, die eine oder mehrere der hierin beschriebenen Reaktionen vorsehen, z.B. Bindung, enzymatische Modifikation u.dgl.
Obwohl hierin allgemein auf die Detektion von Fluoreszenzpolarisation Bezug genommen wird, ist zu beachten, dass eine Vielzahl an Detektionssystemen möglich ist, die die Rotationsrate eines Moleküls oder die Translation bzw. seitliche Diffusion eines Moleküls (betrifft die Molekülgröße) detektieren. Beispiele für Verfahren zum Detektieren der Rotation eines Moleküls sind z.B. Kernmagnetresonanz-Spektroskopie, Elektronenspin-Resonanzspektroskopie und Triplettzustand-Extinktionsanisotropie. Beispiele für Verfahren zum Detektieren der Translationsrate von Molekülen sind z.B. Fluoreszenzkorrelations-Spektroskopie, Fluoreszenzwiederfindung nach Lichtbleichen und Magnetresonanz-Spinaustausch-Spektroskopien.
Wie mehrmals oben erwähnt, können die allgemeinen Verfahren und Systeme der Erfindung dazu verwendet werden, eine Vielzahl unterschiedlicher Arten biologisch oder biochemisch relevanter Reaktionen zu untersuchen, z.B. Enzym-vermittelte Reaktionen, Bindungsreaktionen und Hybridisierungsreaktionen.
Im Fall von Bindungsreaktionen wird das erste Reagens, das eine fluoreszierende Markierung trägt, mit einem zweiten Reagens kontaktiert, das sich an das erste Reagens bindet, um ein fluoreszierend markiertes Produkt zu liefern. Das zweite Reagens enthält typischerweise eine Ladung, sodass das Produkt, das aus der Bindung des zweiten Reagens an das erste Reagens entsteht, eine Ladung besitzt, die sich deutlich von jener des ersten Reagens alleine unterscheidet.
Ein einfaches Beispiel für einen solchen Bindungstest ist ein Nucleinsäure-Hybridisierungstest. Konkret untersucht man bei der Bestimmung der Gegenwart einer bestimmten Nucleinsäuresequenz oder -Teilsequenz in einer Probe oder Zielnucleinsäure häufig die Zielnucleinsäure mit kürzeren Nucleinsäuresonden, die eine Nucleotidsequenz aufweisen, die komplementär zur Sequenz oder Teilsequenz von Interesse im Ziel ist und somit an sie hybridisieren kann. Wenn die Sonde an die Zielsequenz hybridisiert, wird die Gegenwart der Teilsequenz von Interesse angezeigt. Bereits beschriebene Verfahren mit hohem Durchsatz erforderten im Allgemeinen, dass zumindest eine der Sonde oder der Zielsequenz immobilisiert ist, z.B. auf einem festen Träger oder an einer bestimmten Position in einer Oligonucleotid-Anordnung (siehe US-Patente 5.143.854 und 5.744.305). Zwar wurden bereits einige auf Lösung basierende Hybridisierungs-Detektionsverfahren beschrieben, doch erforderten sie typischerweise speziell synthetisierte Reagenzien für die zu untersuchende Sequenz, z.B. FRET-Farbstoffpaare, molekulare Signale o.dgl.
Das erste Reagens ist hierin typischerweise ein im Wesentlichen ungeladener oder positiv geladener Nucleinsäureanalog, der eine fluoreszierende Markierung trägt. Geeignete Nucleinsäureanaloge sind allgemein bekannt; Beispiele dafür sind Peptidnucleinsäuren (PNA), Methylphosphonatpolymere und kationische Nucleinsäureanaloge. PNA umfassen im Allgemeinen ein ungeladenes Peptidrückgrat, auf dem Nucleobasen angeordnet sind – im Gegensatz zu den stark geladenene Glykophosphat-Rückgraten von Nulcleinsäuremolekülen. PNA sind infolge ihrer. allgemeinen Erhältlichkeit im Handel und ihrer günstigen Hybridisierungseigenschaften in Bezug auf komplementäre Nucleinsäurestränge, z.B. höhere Schmelzpunkte usw., typischerweise vorzuziehen. Da diese Nucleinsäureanaloge neutral oder in einigen Fällen positiv geladen sind, bilden sie keine auf Ladung beruhende Verbindung mit der Polykationenkomponente des Tests, die im Fall von Nucleinsäuretests der Erfindung aus positiv geladenen Polyionen besteht. Für die Zwecke der Erfindung ist zu beachten, dass ein wichtiges Merkmal des Nucleinsäureanalogs seine Unfähigkeit ist, getrennt mit der Polyionenkomponente in Wechselwirkung zu treten. Typischerweise bedeutet dies, dass der Nucleinsäureanalog im Wesentlichen ungeladen ist, z.B. eine für die Wechselwirkung mit dem Polyion unzureichende Ladung aufweist. Natürlich besitzt in vielen Fällen der Analog eine bestimmte Ladung, z.B. assoziiert mit einer fluoreszierenden Markierung, oder die gleiche Art an Nettoladung wie das Polyion, z.B. entweder positiv oder negativ, um Wechselwirkung zu verhindern. Beispielsweise kann im Fall von Nucleinsäuretests der Analog im Allgemeinen positiv geladen oder im Wesentlichen ungeladen sein.
Da Nucleinsäuren stark geladene Spezies sind, wird ein im Wesentlichen ungeladenes oder positiv geladenes Nucleinsäureanalog als erstes Reagens verwendet. Dies ermöglicht die Differenzierung zwischen der freien Sonde und der Sonde, die infolge der Ladung auf dem Hybrid hybridisiert ist, von Gegenwart der Zielsequenz. Obwohl sich das Polyion mit der Gesamtheit der Zielsequenz zusammenschließt, z.B. mit jenem Teil, der nicht an die Sonde hybridisiert, ist diese Wechselwirkung für den Forscher unsichtbar, da das Ergebnis dieser Wechselwirkung keine fluoreszierende Markierung trägt. Dieser Nucleinsäure-Hybridisierungstest ist schematisch in 2 dargestellt.
Wie zu erkennen ist, wird eine Zielnucleinsäure 202 (schematisch dargestellt) mit einer fluoreszierenden Sonde 204 untersucht (die fluoreszierende Markierung ist als * angezeigt), die typischerweise einen positiv geladenen oder im Wesentlichen ungeladenen Nucleinsäureanalog, z.B. eine PNA-Sonde, umfasst. Die Sonde ist ausgewählt, um zu einer bestimmten Nucleotidsequenz komplementär zu sein, z.B. mit der Sequenz von Interesse, sodass die Sonde selektiv an diese Sequenz hybridisiert, wenn sie in der Zielnucleinsäure 202 vorhanden ist. In ihrer individuellen Form besitzt die Sonde aufgrund ihrer kleinen Größe eine relativ hohe Rotationsdiffusionsrate, wie dies schematisch durch den Pfeil 206 dargestellt ist, wodurch mehr stark depolarisierte Fluoreszenz emittiert wird.
Die im Feld I abgebildete Reaktion stellt den Fall dar, wenn die Zielsequenz 202 die Sequenz von Interesse enthält, sodass die Sonde 204 an die Zielsequenz 202 hybridisiert, um ein erstes Hybrid 208 zu bilden. Da das Hybrid größer als die Sonde ist, bewirkt diese Hybridisierungsreaktion eine Reduktion der Rotationsdiffusionsrate der fluoreszierend markierten Verbindung (in diesem Fall des Hybrids), wie dies anhand des Pfeils 210 ersichtlich ist. Infolge der flexiblen Beschaffenheit von Nucleinsäuren sowie der nur inkrementalen Zunahme der Größe des Hybrids im Verhältnis zu jener des Ziels ist diese Reduktion jedoch möglicherweise nicht substanziell und auch nicht leicht detektierbar. Gemäß den Verfahren der Erfindung wird allerdings dieses Signal (P) durch Zugabe einer polyionischen Verbindung 212 zum Hybrid wirkungsvoll verstärkt. Genauer gesagt sind Nucleinsäuren, d.h. die Zielsequenz, aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphat/Zucker-Rückgrate stark geladene Spezies. Somit besteht diese Ladung selbst dann, wenn die Nucleinsäure in doppelsträngiger Form vorliegt.
Wenn eine polyionische Verbindung, z.B. Polykation 212, d.h. Polylysin, dem Hybrid 208 zugesetzt wird, schließt sie sich mit dem Hybrid 208 in einem assoziativen Komplex 214 zusammen, wodurch die Rotationsdiffusion des gesamten Komplexes 214 substanziell reduziert wird, wie dies der Pfeil 222 schematisch darstellt. Diese Differenz wird leichter detektiert.
Im Gegensatz dazu stellt die in Feld II zu sehende Reaktion den Fall dar, wenn die Zielsequenz 202 nicht die Sequenz von Interesse enthält, die komplementär zur Sequenz der fluoreszierenden Sonde 204 ist. Als solche sind die Sonde und die Zielsequenz nicht in der Lage zu hybridisieren, und die Rotationsdiffusion der fluoreszierenden Komponente (der unhybridisierten Sonde) bleibt unverändert (siehe Pfeil 216). Wenn das polykationische Polyion der Reaktion zugesetzt wird, schließt es sich wieder mit der stark geladenen Zielsequenz als assoziativer Komplex zusammen. Doch das Polykation schließt sich infolge der ungeladenen oder gleich geladenen Beschaffenheit der fluoreszierenden Sonde 204 nicht mit dieser zusammen. Die Rotationsdiffusion der fluoreszierenden Verbindung (der unhybridisierten Sonde 204) bleibt als solche unverändert, wie dies durch den Pfeil 220 angezeigt ist. In der Folge werden – falls Hybridisierung eintritt, d.h. die Sequenz von Interesse im Ziel vorhanden ist – die Fluoreszenzemissionen aus der Reaktion (bei Anregung durch polarisiertes Anregungslicht) im Vergleich zur unhybridisierten Sonde substanziell polarisiert. Findet hingegen keine Hybridisierung statt, d.h. ist die Sequenz von Interesse nicht vorhanden, erfolgt keine Änderung des Fluoreszenz-Polarisationsgrads. Dem zufolge wird eine Änderung der Fluoreszenzpolarisation ein Indikator der Gegenwart der Sequenz von Interesse.
Die Verfahren und Systeme der Erfindung eignen sich auch zur Durchführung einer Vielzahl anderer Bindungstests, bei denen der resultierende Komplex eine deutlich unterschiedliche Ladung als jene des fluoreszierend markierten Elements des Bindungspaars besitzt. Beispielsweise dienen in einem Rezeptor-Bindungstest, in dem neutraler fluoreszierender Ligand an den geladenen unmarkierten Rezeptor gebunden wird, die Verfahren der Erfindung dazu, ein Fluoreszenzpolarisations-Signal aus dem Komplex zu verstärken, indem eine große polyionische Verbindung mit diesem Komplex assoziiert wird. Genauer gesagt liefert der Komplex selbst zwar eine Fluoreszenzpolarisations-Reaktion (siehe Beschreibung hierin), doch der Komplex mit der assoziierten polyionischen Verbindung ist deutlich größer. Es ist zu beachten, dass eine Vielzahl an Bindungstests gemäß der Erfindung durchgeführt werden kann. Eine noch größere Anzahl an Tests kann problemlos so konzipiert sein, dass sie in Einklang mit diesen Verfahren funktionieren, z.B. wenn der gebundene Komplex eine im Wesentlichen unterschiedliche Ladung besitzt als ein fluoreszierend markiertes freies Element des Endkomplexes.
Die Verfahren und Systeme der Erfindung finden auch bei der Untersuchung enzymatischer Aktivität Anwendung, wobei diese Aktivität ein Produkt erzeugt, das eine deutlich andere Ladung aufweist als das Substrat, auf das das Enzym einwirkte. Ein Beispiel für eine Klasse von Enzymtests, die für die Verfahren und Systeme der Erfindung in Frage kommen, ist eines, in dem Phosphatgruppen geeigneten Substraten zugegeben oder aus ihnen entfernt werden, z.B. Kinase- und Phosphatase-Tests. Das Interesse an diesen Aktivitäten ist beträchtlich, da sie eine Rolle bei der Vermittlung einer großen Anzahl unterschiedlicher biologisch relevanter in vivo-Reaktionen spielen. Insbesondere sind Kinase- und Phosphatase-Reaktionen häufig Vorläufer- oder Zwischensignal-Ereignisse in komplexen zellulären Entwicklungen wie z.B. Überleben und Proliferation. Ihre Aktivitäten sind bei der Behandlung von Krankheiten von besonderem Interesse, wenn diese Entwicklungen unerwünscht sind, z.B. Krebs u.dgl.
Wie oben erwähnt, kommt die Erfindung besonders für die Untersuchung auf Aktivität von Kinase-Enzymen in Frage. Kinase-Enzyme funktionieren typischerweise solcherart, dass eine Phosphatgruppe einem phosphorylierbaren Substrat zugesetzt wird, z.B. Protein, Peptid, Nucleosid, Kohlehydrat usw. Da Phosphatgruppen stark geladen sind, führt ihre Zugabe zu einem bestimmten Substrat typischerweise zu einer substanziellen Änderung der Ladung des Produkts im Verhältnis zum Substrat. Wie im Fall der oben angeführten Tests kann diese Änderung der Ladung des Produkts im Vergleich zu jener des Substrats durch Zusetzen einer polyionischen Verbindung ausgenützt werden, die eine signifikante Differenz der Fluoreszenzpolarisation des Produkts im Vergleich zum Substrat bewirkt.
Zusammenfassend gesagt ist ein phosphorylierbares Substrat mit einer fluoreszierenden Markierungsgruppe versehen (siehe oben). Das phosphorylierbare Substrat kann neutral oder geladen sein. Bevorzugte Substrate sind unter den relevanten Testbedingungen neutral. Es sind zahlreiche phosphorylierbare Substrate im Handel erhältlich. Beispielsweise ist Rhodamin-markiertes Substrat für Protein-Kinase A (PKA) allgemein bei Promega Inc. erhältlich, während andere fluoreszierende phosphorylierbare Substrate von Research Genetics, Inc. bezogen werden können.
Da das fluoreszierende phosphorylierbare Substrat typischerweise relativ klein ist, z.B. weniger als etwa 2 kD, besitzt es eine relativ hohe Rotationsdiffusionsrate und emittiert dadurch bei Anregung mit polarisiertem Licht depolarisierte Fluoreszenz. Bei In-Kontakt-Bringen mit einem Kinase-Enzym in Gegenwart eines Phosphatdonors, z.B. ATP, wird das Substrat phosphoryliert, wodurch zwei zusätzliche negative Ladungen für jedes inkorporierte Phosphat gebildet werden. Diese Netto-2-Ladung bildet insbesondere im Fall des zuvor ungeladenen Substrats eine Grundlage für die Wechselwirkung des Produkts mit einer polyionischen Verbindung, z.B. einem Polykation wie etwa Polylysin oder Polyhistidin. Sobald sich das Polyion mit dem phosphorylierten Substrat verbindet, verlangsamt es die Rotationsdiffusionsrate signifikant, wodurch die Rate der Fluoreszenzdepolarisation reduziert und z.B. der Fluores zenzpolarisations-Wert erhöht wird. Diese Veränderung der Polarisation wird dann detektiert und zur Quantifizierung der Kinase-Reaktion verwendet.
3 ist eine schematische Abbildung dieser Reaktion. Wie aus der Figur ersichtlich, wird ein fluoreszierend markiertes phosphorylierbares Substrat 302 mit einem Kinase-Enzym 306 in Gegenwart von Phosphat 304, z.B. in Form von ATP, in Kontakt gebracht. Die Reaktion liefert das phosphoryliertes Produkt 308. Sowohl das fluoreszierende Substrat 302 als auch das phosphorylierte fluoreszierende Produkt 308 besitzen infolge ihrer geringen Größe relativ hohe Rotationsdiffusionsraten. Das fluoreszierende phosphorylierte Produkt wird dann mit einem Polykation kontaktiert. Bevorzugte Polykationen sind Polyaminosäuren wie etwa Polylsin, Polyhistidin o.dgl., wobei Polyhistidin am bevorzugtesten ist. Das Polykation assoziiert dann mit dem negativ geladenen, phosphorylierten, fluoreszierenden Produkt, wodurch seine Größe und Rotationsdiffusionsrate erheblich beeinflusst werden; die Detektion erfolgt dann so, wie dies an mehreren Stellen hierin beschrieben ist. Es ist zu beachten, dass die polyionische Komponente alternativ dazu ein großes Molekül umfassen kann, z.B. ein Protein o.dgl., mit dem mehrwertige Metallkationen verbunden sind, die z.B. aus Fe³⁺, Ca²⁺, Ni²⁺ und Zn²⁺ ausgewählt sind. Beispiele für derartige Moleküle sind Metallchelatproteine, die diese Ionen chelatisieren, o.dgl. Genauer gesagt besitzen diese Metallionen relativ hohe Affinität für Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelgruppen. In der Folge können sie einem großen Molekül (z.B. einem Polyion) signifikante Bindungsaffinität beispielsweise für Phosphatgruppen in Nucleinsäu- ren oder phosphorylierten Substraten u.dgl. sowie für andere Gruppen mit Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelgruppen verleihen, was zur Wechselwirkung führt, die dazu dient, die Rotationsdiffusionsrate einer fluoreszierenden Spezies deutlich zu senken, wie dies hierin beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung eignet sich ebenso zur Untersuchung der entgegengesetzten Richtung, genauer gesagt der Phosphatase-Reaktion, die eine Phosphatgruppe aus einem phosphorylierten Substrat entfernt. Diese Reaktion folgt im Wesentlichen dem umgekehrten Weg aus 3 und ist schematisch in 4 dargestellt. Kurz gesagt wird die fluoreszierende phosphorylierte Verbindung 308, die in diesem Fall das Substrat ist, mit der polykationischen Verbindung 310 in Kontakt gebracht, um den assoziativen Komplex 312 zu ergeben, worin sich das Polykation mit den durch die Phosphatgruppe gebildeten Ladungen verbindet. Wie oben in Bezug auf 3 erwähnt, besitzt dieser Komplex eine niedrige Rotationsdiffusionsrate. Wenn auf diesen Komplex ein Phosphatase-Enzym 414 einwirkt, führt dies zur Abspaltung der geladenen Posphatgruppe und ihres assoziierten Polykations 404 aus der fluoreszierenden Verbindung 302, die in diesem Fall das Produkt ist. Wenn das fluoreszierende Produkt frei von der großen polykationischen Verbindung ist, besitzt es eine stark erhöhte Rotationsdiffusionsrate und emittiert z.B. mehr depolarisierte Fluoreszenz. Wiederum wird diese Veränderung der Fluoreszenzpolarisation gemäß den hierin beschriebenen Verfahren detektiert. Wie oben erwähnt, findet in einigen Fällen der Test vorzugsweise in einem heterogenen Format statt, z.B. wenn die polyionische Komponente nach der Reaktion von Interesse zugesetzt wird, um jegliche unerwünschten Auswirkungen der Gegenwart des Polyions in der Reaktion zu unterbinden.
Während die Fähigkeit, eine Vielzahl an Tests durchzuführen, an sich nützlich ist, stellen die konkreten Anwendungen, denen diese Tests typischerweise zugeführt werden können, den größten Wert der Erfindung dar. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit, die Wirkungen potenzieller pharmazeutischer Verbindungskandidaten auf die verschiedenen oben beschriebenen Aktivitäten zu untersuchen. Konkret werden in pharmazeutischen Analyseprozessen große Bibliotheken chemischer Verbindungen allgemein gegen pharmakologisch relevante Ziele gescreent. Diese Ziele umfassen Rezeptoren, Enzyme, Transporter u.dgl. Es wurden zahlreiche unterschiedliche Screeningtests und -systeme beschrieben; siehe z.B. WO 98/00231.
Zusammenfassend gesagt erfolgt eine bestimme biologisch oder biochemisch relevante Reaktion in Gegenwart und Abwesenheit einer zu screenenden Verbindung, und es wird dann die Wirkung der Verbindung ermittelt. Wenn die Reaktion durch die Gegenwart der Testverbindung verlangsamt oder blockiert wird, wird die Verbindung als Hemmstoff (Inhibitor) der Reaktion identifiziert. Wenn hingegen die Reaktion in Gegenwart der Testverbindung rascher oder in einem größeren Ausmaß abläuft, wird die Verbindung als Verstärker der Reaktion identifiziert. Diese Screeningtests erfolgen dann für eine große Anzahl unterschiedlicher Verbindungen (entweder nacheinander oder gleichzeitig), um die Entdeckung potenzieller Effektoren der Reaktion von Interesse zu beschleunigen.
III. Testsysteme
Die vorliegende Erfindung bietet auch Testsysteme zur Durchführung der oben beschriebenen Verfahren. Typischerweis umfassen die hierin erläuterten Testsysteme ein Fluidbehältnis, in das die Reagenzien zur Durchführung des Tests befüllt werden. Das Fluidbehältnis enthält typischerweise eine erste Reaktionszone mit einem darin befindlichen ersten Reagensgemisch, das ein erstes Reagens mit einer fluoreszierenden Markierung, ein zweites Reagens, das mit dem ersten Reagens reagiert, um ein Fluoreszenz-markiertes Produkt zu erzeugen, das eine deutlich unterschiedliche Ladung besitzt als das erste Reagens, und eine polyionische Verbindung umfasst.
5 ist eine schematische Darstellung des gesamten Testsystems zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung. Kurz gesagt enthält das gesamte System 500 ein Reaktionsbehältnis 502 (siehe oben). Ein Detektor oder Detektionssystem 504 grenzt an das Behältnis an und steht in Sensorkommunikation damit. Der Ausdruck „steht in Sensorkommunikation" bezieht sch hierin im Allgemeinen auf den Detektor, der relativ zum Behältnis solcherart positioniert ist, dass er in der Lage ist, ein bestimmtes Signal aus diesem Behältnis zu empfangen. Im Fall optischer Detektoren, z.B. Fluoreszenz- oder Fluoreszenzpolarisations-Detektoren, bedeutet Sensorkommunikation typischerweise, dass der Detektor ausreichend nahe dem Behältnis angeordnet ist, dass optische Signale wie etwa Fluoreszenzsignale dem Detektor übertragen werden, sodass eine adäquate Detektion dieser Signale gegeben ist. Üblicherweise wird dabei eine Linse, ein Strahlengang oder ein anderes Detektionselement, z.B. ein CCD, verwendet, welches Element auf einen relevanten Abschnitt des Behältnisses fokussiert ist, um diese optischen Signale wirksam zu erfassen und aufzuzeichnen.
Der Detektor 504 ist typischerweise mit einer entsprechenden Datenspeicher- und/oder Analyseeinheit wie z.B. einem Computer oder einem anderen Prozessor verbunden, der im Allgemeinen zur Speicherung, Analyse und Anzeige der vom Behältnis erhaltenen Daten in einer für den Benutzer verständlichen Form fähig ist; ein Beispiel dafür ist die Anzeige 508. In bestimmten Ausführungsformen, z.B. jenen unter Verwendung von Mikrofluidikbehältern, ist der Computer 506 gegebenenfalls mit einer geeigneten Steuereinheit 510 verbunden, die die Bewegung von Fluidmaterialien innerhalb der Kanäle des Behältnisses der Mikrofluidikvorrichtung und/oder die relative Position des Behältnisses 502 und des Detektors 504 regelt, z.B. mittels einer x-y-z-Umsetzerstufe.
Das Behältnis enthält typischerweise auch eine Detektionszone sowie einen Detektor, der mit der Detektionszone in Sensorkommunikation steht. Der erfindungsgemäß verwendete Detektor ist üblicherweise konfiguriert, einen Fluoreszenz-Polarisationsgrad von Reagenzien in der Detektionszone zu detektieren.
Das hierin verwendete Behältnis kann unterschiedliche Formen aufweisen. Beispielsweise kann das Behältnis ein einfaches Reaktionsgefäß, ein Napf, ein Reagenzglas, eine Küvette o.dgl. sein. Alternativ dazu kann das Behältnis eine Kapillare oder einen Kanal – entweder alleine oder als Teil eines integrierten Fluidiksystems – aufweisen, welches System einen oder mehrere Fluidikkanäle, -kammern o.dgl. besitzt.
Wenn es sich um ein einfaches Reaktionsgefäß, einen Napf, ein Reagenzglas, eine Küvette o.dgl. handelt, beziehen sich die Reaktionszone und die Detektionszone typischerweise auf den gleichen Fluid enthaltenden Abschnitt des Behältnisses. Beispielsweise werden innerhalb des Fluid enthaltenden Abschnitts einer Küvette Rea genzien vermischt, umgesetzt und anschließend detektiert. Typischerweise können – um die Durchführung der Tests wie z.B. Screeningtests zu beschleunigen – mehrfach unterteilte Behältnisse verwendet werden. Beispiele dafür sind Platten mit einer Vielzahl an Näpfen ("Wells"), z.B. 96-Napf-, 384-Napf- oder 1536-Napf-Platten.
In Ausführungsformen mit Kapillaren oder Kanälen können die Reaktionszone und die Detektionszone den gleichen Fluid enthaltenden Abschnitt des Behältnisses umfassen. In zahlreichen Aspekten der Erfindung jedoch sind die Reaktionszone und die Detektionszone getrennte Fluid enthaltendende Abschnitte des Behältnisses. Genauer gesagt können Reagenzien in einem Abschnitt des Behältnisses gemischt und umgesetzt und anschließend zu einer getrennten Detektionszone befördert werden, woraufhin die Reaktionsprodukte usw. detektiert werden.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Behältnis eine Mikrofluidikvorrichtung. Der Ausdruck „Mikrofluidikvorrichtung" bezieht sich hierin auf ein Gerät oder eine Körperstruktur, das bzw. die zumindest eine Fluidikkomponente wie z.B. einen Kanal, eine Kammer, einen Napf o.dgl. enthält, die zumindest eine Querschnittsdimension aufweisen, die zwischen etwa 0,1 μm und etwa 500 μm beträgt, wobei diese Kanäle und/oder Kammern oft zumindest eine Querschnittsdimension zwischen etwa 0,1 μm und 200 μm, in einigen Fällen zwischen etwa 0,1 μm und 100 μm, häufig zwischen etwa 0,1 μm und 20 μm, aufweisen. Zu solchen Querschnittsdimensionen zählen z.B. die Breite, die Tiefe, die Höhe, der Durchmesser o.dgl. Ty- pischerweise werden Strukturen mit diesen Dimensionen auch als Strukturen im „Mikromaßstab" bezeichnet. Mikrofluidikvorrichtungen de Erfindung enthalten üblicherweise zumindest eine(n), vorzugsweise mehr als eine(n), Kanal und/oder Kammer, der bzw. die innerhalb einer einzelnen Körperstruktur untergebracht ist. Solche Kanäle/Kammern können getrennt und diskret sein oder alternativ dazu in Fluidkommunikation miteinander stehen. Solche Fluidverbindungen können durch Kanäle, Kanalkreuzungen, Ventile u.dgl. gebildet sein. Kanalkreuzungen können in einigen Formaten vorliegen, z.B. als einander querende Kreuzungen, „T"-Kreuzungen oder beliebige andere Strukturen, die dafür sorgen, dass zwei Kanäle in Fluidkommunikation stehen.
Aufgrund ihrer Steuerbarkeit sind erfindungsgemäße Ausführungsformen mit Mikrofluidikvorrichtungen besonders geeignet, die hierin beschriebenen heterogenen Testformate durchzuführen. Insbesondere werden Reaktionen in einem ersten Bereich des im Mikromaßstab vorliegenden Kanalnetzes durchgeführt. Die Reaktionsprodukte werden dann einem anderen Teil des Kanalnetzes zugeführt, oder es werden zusätzliche Komponenten in den ursprünglichen Bereich des Kanalnetzes gebracht, um sich mit den Reaktionsprodukten zu vermischen. Beispielsweise kann die polyionische Komponente der hierin beschriebenen Testverfahren nach der Reaktion von Interesse zugesetzt werden, um sicherzustellen, dass sie die Reaktion nicht beeinträchtigt. Dank der Mikrofluidiksysteme kann man die verschiedenen Reagenzien präzise durch die Kanäle der Vorrichtung befördern, wodurch ihre genaue Messung und zeitlich richtig abgestimmte Zugabe ermöglicht werden. In einem einfachen Beispiel kann eine Phosphatase-Reaktion auf einem phosphorylierten Substrat in einem ersten Kanalbereich einer Mikrofluidikvorrichtung durchgeführt werden, wodurch eine Phosphatgruppe wie z.B. ATP und unphosphoryliertes Produkt sowie nicht umgesetztes Substrat entstehen. Das Gemisch wird dann mit der polyionischen Komponente vermischt, z.B. Polyhistidin, indem entweder das Reaktionsgemisch in einen getrennten, das Polyion enthaltenden Kanal befördert oder das Polyion in das Reaktionsgemisch im ursprünglichen Kanalsegment eingebracht wird. Das resultierende Gemisch wird dann am Detektionspunkt vorbei bewegt, wo die Fluoreszenzpolarisation gemessen wird.
Die Körperstruktur der hierin beschriebenen Mikrofluidikvorrichtung umfasst typischerweise eine Aggregation zweier oder mehrerer getrennter Komponenten, die dann miteinander verbunden werden, um die Mikrofluidikvorrichtung der Erfindung zu bilden, z.B. mit den hierin beschriebenen Kanälen und/oder Kammern. Üblicherweise werden die vorliegenden Mikrofluidikvorrichtungen als Aggregat von Substratschichten erzeugt. Insbesondere umfassen solche bevorzugten Vorrichtungen einen oberen Abschnitt, einen unteren Abschnitt und einen Innenabschnitt, der im Wesentlichen die Kanäle und Kammern der Vorrichtung definiert.
6 zeigt eine aus zwei Schichten bestehende Körperstruktur 610 für eine Mikrofluidikvorrichtung. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der untere Abschnitt der Vorrichtung 612 ein festes Substrat, das im Wesentlichen in der Struktur planar ist und zumindest eine im Wesentlichen flache Deckfläche 614 besitzt. Eine Vielzahl an Substratmaterialien kann als unterer Abschnitt verwendet werden. Typischerweise werden – da die Vorrichtungen im Mikromaßstab erzeugt werden – Substratmaterialien je nach ihrer Verträglichkeit mit bekannten Mikroproduktionstechniken ausgewählt; Beispiele dafür sind Photolitographie, nasses chemischs Ätzen, Laserablation, Luftabriebtechniken, Spritzgussformen, Prägen u.dgl. Die Substratmaterialien werden auch im Allgemeinen hinsichtlich ihrer Verträglichkeit mit sämtlichen Bedingungen ausgewählt, denen die Mikrofluidikvorrichtungen ausgesetzt sein können, z.B. extremen pH-Werten, Temperaturen, Salzkonzentrationen und angelegten elektrischen Feldern. Demzufolge kann in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung das Substratmaterial Materialien enthalten, die normalerweise in der Halbleiterindustrie Anwendung finden, wo derartige Mikroproduktionstechniken Standard sind; Beispiele dafür sind Substrate auf Silicamaterial-Basis wie etwa Glas, Quarz, Silicium oder Polysilicium sowie andere Substratmaterialien wie etwa Galliumarsenid u.dgl. Im Fall von Halbleitermaterialien ist es oft wünschenswert, eine Isolierbeschichtung z.B. aus Siliciumoxid über dem Substratmaterial vorzusehen, insbesondere in Anwendungen, wo elektrische Felder an die Vorrichtung oder ihren Inhalt angelegt werden sollen.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Substratmaterialien polymere Materialien, z.B. Kunststoffe wie etwa Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat, Polytetrafluorethylen (TEFLON^TM), Polyvinylchlorid (PVC), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polysulfon, Polystyrol, Polymethylpenten, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylidenfluorid, ABS (Acrylnitril-Butadien-Styrol-Copolymer) u.dgl. Solche polymeren Substrate werden unter Anwendung bekannter Mikroproduktionstechniken (siehe oben) oder aus mikroproduzierten Mutterformen unter Anwendung bekannter Formungstechniken wie z.B. Spritzgussformen, Prägen, Stanzen o.dgl. erzeugt. Solche polymeren Substratmaterialien sind aufgrund ihrer problemlosen Herstellung, niedri gen Kosten und Entsorgbarkeit sowie ihrer allgemeinen Trägheit gegenüber den meisten extremen Reaktionsbedingungen vorzuziehen. Wiederum können diese polymeren Materialien behandelte Oberflächen aufweisen, z.B. derivatisierte oder beschichtete Oberflächen, um ihre Nützlichkeit im Mikrofluidiksystem zu erhöhen, z.B. indem die Fluidsteuerung verbessert wird; siehe US-Patent 5.885.470.
Die Kanäle und/oder Kammern der Mikrofluidikvorrichtungen sind typischerweise in der oberen Fläche des unteren Substrats oder Abschnitts 612 ausgebildet, obwohl sie auch gegebenenfalls in der oberen Fläche des unteren Substrats und/oder der unteren Fläche des oberen Substrats ausgebildet sein können; sie werden als Nuten oder Einbuchtungen 616 im Mikromaßstab unter Anwendung der oben beschriebenen Mikroproduktionstechniken ausgebildet. Der obere Abschnitt bzw. das obere Substrat 618 umfasst auch eine erste planare Oberfläche 620 und eine zweite Oberfläche 622 gegenüber der ersten planaren Oberfläche 620. In den erfindungsgemäß hergestellten Mikrofluidikvorrichtungen enthält der obere Abschnitt auch eine Vielzahl an dadurch ausgebildeten Öffnungen, Löchern oder Einlässen 624, z.B. von der ersten planaren Oberfläche 620 zur zweiten Oberfläche 622 gegenüber der ersten planaren Oberfläche.
Die erste planare Oberfläche 620 des oberen Substrats 618 wird dann mit der planaren Oberfläche 614 des unteren Substrats 612 zusammengepasst, d.h. damit in Kontakt gebracht und verbunden, wodurch die Nuten und/oder Einbuchtungen 616 in der Oberfläche des unteren Substrats abgedeckt und abgedichtet werden, um die Kanäle und/oder Kammern (d.h. den Innenabschnitt) der Vorrichtung an der Grenzfläche dieser zwei Komponenten zu bilden. Die Löcher 624 im oberen Abschnitt der Vorrichtung sind solcherart ausgerichtet, dass sie mit zumindest einem/r der Kanäle und/oder Kammern, die im Innenabschnitt der Vorrichtung aus den Nuten oder Einbuchtungen im unteren Substrat gebildet sind, in Kommunikation stehen. In der fertigen Vorrichtung dienen diese Löcher als Reservoirs, um das Einströmen von Fluid oder Material in die Kanäle oder Kammern des Innenabschnitts der Vorrichtung zu erleichtern, und sie stellen auch Öffnungen bereit, an denen die Elektroden in Kontakt mit Fluids innerhalb der Vorrichtung gebracht werden können, wodurch das An legen elektrischer Felder entlang der Kanäle der Vorrichtung ermöglicht und dadurch der Fluidtransport innerhalb der Vorrichtung gesteuert und gelenkt werden kann.
In zahlreichen Ausführungsformen enthalten die Mikrofluidikvorrichtungen ein optisches Detektionsfenster, das über eine(n) oder mehrere Kanäle und/oder Kammern der Vorrichtung angeordnet ist. Optische Detektionsfenser sind typischerweise durchsichtig, sodass sie ein optisches Signal vom Kanal bzw. von der Kammer, über den bzw. die sie angeordnet sind, übertragen können. Optische Detektionsfenster können lediglich ein Bereich einer durchsichtigen Deckschicht sein, z.B. wenn die Deckschicht Glas oder Quarzist, oder aus transparentem Polymermaterial bestehen, z.B. PMMA, Polycarbonat usw. Alternativ dazu können – wenn lichtundurchlässige Substrate zur Herstellung der Vorrichtungen verwendet werden – lichtdurchlässige Detektionsfenster aus den obigen Materialien getrennt in die Vorrichtung eingepasst werden.
Wie dies weiter unten ausführlich erläutert wird, können diese Vorrichtungen einer Vielzahl an Anwendungen zugeführt werden, z.B. Screeningtests mit hohem Durchsatz zur Identifikation von Medikamenten, Immunassays, diagnostischen Verfahren, Genanalysen u.dgl. Die hierin beschriebenen Vorrichtungen enthalten häufig mehrere Probeneinlassöffnungen oder Reservoirs, um mehrere Proben gleichzeitig oder nacheinander einbringen und analysieren zu können. Alternativ dazu können diese Vorrichtungen an eine Probeneinlassöffnung, z.B. einen Pipettor, gekoppelt sein, der mehrere Proben nacheinander in die Vorrichtung einführt. Beispiele für solche Probeneinlasssysteme sind in US-Patent 5.779.868 sowie WO 98/00705 und WO 98/00231 beschrieben. Eine schematische Darstellung der Mikrofluidikvorrichtung mit einem externen Probenpipettor ist in nachstehend erläuterter 7 zu sehen.
Im Fall einiger Substrate wie z.B. Glas, Quarz oder Silicamaterial ist es manchmal wünschenswert, ein Beschichtungsmaterial in den Kanälen der Mikrofluidikvorrichtung vorzusehen. Dies hat vor allem den Grund, um die Wechselwirkung zwischen der Polyionkomponente und der geladenen Oberfläche des Substrats zu reduzieren. Es eignen sich viele verschiedene der bekannten Beschichtungsmaterialien, z.B. Po lymerbeschichtungen, die typischerweise in Elektrophorese-Anwendungen zum Einsatz kommen, z.B. lineare Polyacrylamide wie etwa Polydimethylacrylamide (PDMA) u.dgl. (siehe US-Patente 5.948.227, 5.567.292 und 5.264.101, die alle hierin durch Verweis aufgenommen sind). Solche Polymere können Silicamaterial absorbieren, oder sie können kovalent an der Substratoberfläche befestigt sein, z.B. durch Vorsehen einer Epoxidgruppe auf der Polymerkette (siehe z.B. Chiari et al., HPCE Conference, März 2000), um Oberflächenladungen auf dem Substrat zu maskieren, die mit der polyionischen Spezies im Reaktionsgemisch in Wechselwirkung treten können.
Zusammenfassend gesagt ist eine Mikrofluidikvorrichtung 700, z.B. eine, die der in Bezug auf 6 beschriebenen ähnelt, mit einer Körperstruktur 702 versehen, die ein Netz innerer Kanäle 704 besitzt, die mit einer Reihe von in der Körperstruktur 702 ausgebildeten Reservoirs 706 verbunden sind. Die verschiedenen Reservoirs dienen dazu, Reagenzien in die Kanäle 704 der Vorrichtung einzufüllen. Ein Kapillarelement 708 ist an die Körperstruktur 702 gekoppelt, sodass der Kanal 710, der sich innerhalb des Kapillarelements 708 befindet und entlang desselben verläuft, in Fluidkommunikation mit dem Kanalnetz 704 in der Körperstruktur steht. Dieses Kapillarelement 708 wird dann dazu verwendet, eine Vielzahl unterschiedlicher Proben- oder Testmaterialien nacheinander hinaufzuziehen, um innerhalb der Vorrichtung die Analyse vorzunehmen.
Wie oben beschrieben, beruhen die Verfahren und Systeme der Erfindung typischerweise auf einer Änderung im Fluoreszenz-Polarisationsgrad des Reaktionsgemischs, die auf die Reaktion von Interesse zurückzuführen ist. Ein geeignetes Detektionssystem dient typischerweise dazu, polarisierte von depolarisierter emittierter Fluoreszenz zu unterscheiden. Im Allgemeinen detektiert ein derartiges Detektionssystem getrennt Fluoreszenzemissionen, die in der gleichen Ebene wie das polarisierte Anregungslichts emittiert werden, und Fluoreszenzemissionen, die in einer anderen Ebene als jener des Anregungslichts emittiert werden.
Ein Beispiel für ein Detektionssystem ist in 8 dargestellt. Wie aus der Abbildung ersichtlich ist, enthält der Fluoreszenzpolarisations-Detektor eine Lichtquelle 804, die Licht mit einer geeigneten Anregungswellenlänge für die fluoreszierenden Verbindungen erzeugt, die im Testsystem vorhanden sind. Typischerwiese sind kohärente Lichtquelle wie z.B. Laser, Laserdioden u.dgl. aufgrund der hochpolarisierten Beschaffenheit des dadurch produzierten Lichts vorzuziehen. Das Anregungslicht wird durch einen optionalen Polarisationsfilter 806 geleitet, der nur Licht in einer Ebene passieren lässt, z.B. polarisiertes Licht. Das polarisierte Anregungslicht wird dann durch einen Strahlengang wie z.B. einen dichroitischen Spiegel 810 und ein mikroskopisches Objektiv 812 (und gegebenenfalls einen Referenzstrahlteiler 808) gelenkt, sodass das polarisierte Licht auf das Probenbehältnis fokussiert wird (in der Mikrofluidikvorrichtung 802 als Kanal dargestellt), in dem sich die zu untersuchende Probe befindet.
Aus der Probe emittierte Fluoreszenz wird dann, z.B. durch das Objektiv 812, gesammelt und zurück durch den dichroitischen Spiegel 810 geleitet, der die emittierte Fluoreszenz passieren lässt und das reflektierte Anregungslicht reflektiert, wodurch die zwei voneinander getrennt werden. Die emittierte Fluoreszenz wird dann durch einen Strahlteiler 814 gelenkt, wo ein Abschnitt der Fluoreszenz durch einen Filter 816 geleitet wird, der Fluoreszenz herausfiltert, die in einer Ebene liegt, die parallel zur Ebene des Anregungslichts ist, und die vertikale Fluoreszenz auf einen ersten Lichtdetektor 818 lenkt. Der andere Abschnitt der Fluoreszenz wird durch einen Filter 820 geschickt, der die Fluoreszenz herausfiltert, die vertikal zur Ebene des Anregungslichts ist, wodurch die parallel Fluoreszenz auf einen zweiten Lichtdetektor 822 gelenkt wird. In alternativen Ausführungsformen der Erfindung ist der Strahlteiler 814 mit einem polarisierenden Strahlteiler ersetzt, z.B. einem Glan-Prisma, wodurch die Filter 816 und 820 überflüssig sind. Diese Detektoren 818 und 822 sind dann typischerweise an einen geeignetes Aufzeichnungsgerät bzw. einen Prozessor (in 8 nicht dargestellt) gekoppelt, wo das Lichtsignal aufgezeichnet und/oder verarbeitet wird, wie dies nachstehend im Detail beschrieben ist. Elektronenvervielfacherröhren (PMT) sind im Allgemeinen als Lichtdetektoren für die Quantifizierung der Lichtmengen vorzuziehen, doch andere Lichtdetektoren kommen gegebenenfalls auch in Frage, z.B. Photodioden o.dgl.
Der Detektor ist typischerweise an einen Computer oder einen anderen Prozessor gekoppelt, der die Daten aus den Lichtdetektoren empfängt und geeignete Programme enthält, um die Werte aus jedem Detektor zu vergleichen und dadurch den Polarisationsgrad der Probe zu bestimmen. Insbesondere enthält der Computer typischerweise Softwareprogramme, die als Input die Fluoreszenzintensitäten aus jedem der Detektoren erhalten, z.B. für parallele oder vertikale Fluoreszenz. Die Fluoreszenzintensität wird dann für jeden der Detektoren verglichen, um einen Fluoreszenzpolarisations-Wert zu ergeben. Ein Beispiel für einen solchen Vergleich liefert die Gleichung: P = [I[||) – I(⫠)]/[I(||) + I[⫠)]C (4)
Sie entspricht der oben dargestellten, außer dass ein Korrekturfaktor (C) enthalten ist, der bezüglich Polarisationsfehlern des Detektionsinstruments korrigiert. Der Computer bestimmt den Fluoreszenzpolarisations-Wert für die Reaktion von Interesse. Anhand dieses Polarisationswerts und auf der Basis der Polarisationswerte für freie und gebundene Fluoreszenz berechnet der Computer das Verhältnis zwischen gebundener und freier Fluoreszenz. alternativ dazu werden die Polarisationswerte vor und nach der Reaktion verglichen und eine Polarisationsdifferenz (ΔP) ermittelt. Die berechneten Polarisationsdifferenzen können dann als Absolutwerte verwendet wer- den, z.B. um potenzielle Effektoren einer bestimmten Reaktion zu identifizieren, oder sie können mit Polarisationsdifferenzen verglichen werden, die in Gegenwart bekannter Hemmer oder Verstärker der Reaktion von Interesse erhalten werden, um den durch eine bestimmte Verbindung erzielten Grad an Hemmung oder Verstärkung der Reaktion von Interesse zu quantifizieren.
9 ist ein Flussdiagramm für die Prozesse, die vom Computer unter Anwendung der oben beschriebenen Softwareprogramme durchgeführt werden. Wie zu sehen ist, beginnt der programmierte Prozess an Schritt 902, wo der Computer die Fluoreszenzintensitäts-Daten für die nicht umgesetzten Reagenzien in der Reaktionszone (z.B. im Behältnis 502 von 5) aus den zwei Detektoren, z.B. den Detektoren 818 und 820 von 8, erhält. Der Fluoreszenzpolarisations-Wert (P) wird dann in Schritt 904, z.B. in Einklang mit den hierin angeführten Gleichungen, berechnet. In Schritt 906 empfängt der Computer Fluoreszenzintensitäts-Daten für die umgesetzten Reagenzien aus den zwei Detektoren. Wiederum wird – in Schritt 908 – der P-Wert für die umgesetzten Reagenzien berechnet. In Schritt 910 werden die P-Werte für die umgesetzten und nicht umgesetzten Reagenzien verglichen, z.B. wird einer vom anderen subtrahiert, um einen ΔP-Wert für die Reaktion zu liefern. Zu diesem Zeitpunkt kann der ΔP-Wert als Maß der Reaktion, z.B. als ihre Rate oder Vollständigkeit, angezeigt werden. Gegebenenfalls kann jedoch der ΔP-Wert mit einem Standard-ΔP-Wert verglichen werden, d.h. aus einer Reaktion mit bekannter Rate oder Ausmaß an Hemmung oder Verstärkung, z.B. in Schritt 912. Durch diesen Vergleich kann der Computer dann ein quantitatives Maß der Reaktion bzw. ihren Grad an Hemmung oder Verstärkung interpolieren oder extrapolieren, welches quantitative Maß dann dem Forscher angezeigt werden kann, z.B. in Schritt 914. Wie oben erwähnt, kann der Computer gegebenenfalls einen bestimmten Polarisationswert für komplett freie oder komplett gebundene Fluoreszenz enthalten. In diesem Fall ist die Bestimmung von Fluoreszenzdifferenzen nicht notwendig, wodurch mehrere Programmschritte entfallen können. In diesem Fall empfängt der Computer die Fluoreszenzdaten aus dem Detektor für das umgesetzte Gemisch. Der Computer berechnet anschließend lediglich de P-Wert für das Reaktionsgemisch und ermittelt das Verhältnis zwischen gebundener und freier Fluoreszenz (z.B. in Einklang mit der oben angeführten Gleichung (3)). Das Verhältnis dient dann zur Quantifizierung der Reaktion.
Im Fall von Hochdurchsatz-Screeningtestsystemen gibt die Computersoftware gegebenenfalls Informationen über die Korrelation eines bestimmten angezeigten Ergebnisses mit einer bestimmten Probe oder Probenerfassungsposition. Dies ermöglicht es dem Forscher, die in einem beliebigen Test verwendeten Reagenzien zu identifizieren.
10 ist eine schematische Darstellung eines Computers und einer Computerarchitektur, wie sie typischerweise gemäß der Erfindung verwendet werden. Insbe sondere zeigt 10A ein Beispiel für ein Computersystem, das für die Ausführung von Software zur Durchführung der Verfahren der Erfindung oder in Zusammenhang mit den Vorrichtungen und/oder Systemen der Erfindung verwendet werden kann. Das Computersystem 1000 enthält typischerweise eine Anzeige 1002, einen Schirm 1004, ein Gehäuse 1006, eine Tastatur 1008 und eine Maus 1010. Die Maus 1010 kann eine oder mehrere Tasten zur Interaktion mit einer grafischen Benutzeroberfläche (GUI) aufweisen. Das Gehäuse 1006 enthält typischerweise ein CD-ROM-Laufwerk 1012, einen Systemspeicher und eine Festplatte (siehe 10B), die zum Speichern und Abrufen von Softwareprogrammen dienen, die den Computercode umfassen, der die Verfahren der Erfindung umsetzt und/oder den Betrieb der Vorrichtungen und Systeme der Erfindung, Daten zur Verwendung mit der Erfindung usw. steuert. Obwohl die CD-ROM 1014 als Beispiel für ein Computer-lesbares Speichermedium angeführt ist, können auch andere Computer-lesbare Speichermedien verwendet werden, z.B. Disketten, Bänder, Flash-Memory, Systemspeicher und Festplatte(n). Außerdem kann ein Datensignal, das in einer Trägerwelle (z.B. in einem Netzwerk wie etwa Internet, Intranet u.dgl.) enthalten ist, das Computer-lesbare Speichermedium sein.
10B ist ein schematische Darstellung eines Blockdiagramms des oben erläuterten Computersystems 1000. Wie in 10A enthält das Computersystem 1000 einen Monitor bzw. eine Anzeige 1002, eine Tastatur 1008 und eine Maus 1010. Das Computersystem 100 beinhaltet typischerweise auch Subsysteme wie etwa einen zentralen Prozessor 1016, einen Systemspeicher 1018, einen fixen Speicher 1020 (z.B. eine Festplatte), einen beweglichen Speicher 1022 (z.B. ein CD-ROM-Laufwerk), einen Anzeigeadapter 1024, eine Soundkarte 1026, Lautsprecher 1028 und eine Netzwerkschnittstelle 1030. Andere hierin geeignete Computersysteme können weniger oder zusätzliche Subsysteme enthalten. Beispielsweise enthält ein anderes Computersystem gegebenenfalls mehr als einen Prozessor 1014.
Die Systembus-Architektur des Computersystems 1000 ist durch die Pfeile 1032 angezeigt. Diese Pfeile dienen als Veranschaulichung für jedes beliebige Verbindungssystem, das die Subsysteme miteinander verknüpft. Beispielsweise könnte ein loka ler Bus zur Verbindung des zentralen Prozessors mit dem Systemspeicher und Anzeigeadapter verwendet werden. Das in 10A gezeigte Computersystem 1000 ist lediglich ein Beispiel für ein hierin in Frage kommendes Computersystem. Andere Computerarchitekturen mit unterschiedlichen Konfigurationen von Subsystemen können ebenfalls verwendet werden, z.B. „eingebettete" Systeme wie etwa On-Board-Prozessoren auf den Controller-Detektor-Instrumenten und „Internet-Applikations"-Architekturen, in denen das System über eine Internetverbindung mit dem Hauptprozessor verbunden ist.
Das Computersystem enthält typischerweise zweckentsprechende Software, um Benutzeranweisungen zu empfangen – entweder in Form von Benutzereingaben in definierte Parameterfelder, z.B. in einer GUI, oder in Form vorprogrammierter Anweisungen, die z.B. für ein Vielzahl unterschiedlicher Programmschritte vorprogrammiert sind. Die Software wandelt dann diese Anweisungen in geeignete Sprache um, um den Betrieb des optionalen Materialtransportsystems und/oder die Manipulation, Speicherung usw. der aus dem Detektionssystem empfangenen Daten zu steuern. Insbesondere empfängt der Computer typischerweise die Daten aus dem Detektor, interpretiert die Daten und stellt sie in einem oder mehreren für den Benutzer verständlichen oder praktischen Formaten zur Verfügung; Beispiele dafür sind Graphen von Rohdaten, berechnete Dosis-Response-Kurven, Enzym-kinetische Konstanten u.dgl.. Oder der Computer benutzt die Daten, um weitere Steueranweisungen in Einklang mit der Programmierung zu geben, z.B. zur Regelung der Durchflussraten, der herrschenden Temperaturen, der Reagenskonzentrationen usw.
Wie oben beschrieben, wird die Erfindung gegebenenfalls in einer Mikrofluidikvorrichtung oder einem Mikrofluidiksystem durchgeführt. Es ist im Allgemeinen wünschenswert, ein Mittel oder System zur Beförderung von Materialien durch und zwischen den verschiedenen Kanälen, Kammern und Zonen, die in solchen Vorrichtungen vorhanden sind, vorzusehen. Es werden gegebenenfalls viele unterschiedliche Materialtransportverfahren angewendet, die für solche Mikrofluidikvorrichtungen in Frage kommen. Beispielsweise wird in einer bevorzugten Ausführungsform die Materialbeförderung durch die Kanäle einer Vorrichtung durch Anlegen von Druckdifferen tialen über die Kanäle, durch die der Materialfluss erfolgen soll, hervorgerufen. Dies kann durch Anlegen eines positiven Drucks an einem Kanalende oder eines negativen Drucks am anderen Ende stattfinden. In komplexen Kanalnetzen können geregelte Durchflussraten in allen miteinander verbundenen Kanälen durch Vorsehen von Ventilen u.dgl. innerhalb der Vorrichtungsstruktur gesteuert werden, z.B. um die Strömung durch einen bestimmten Kanal zu in Gang zu setzen oder anzuhalten. Alternativ dazu können Kanalwiderstände eingestellt sein, um die Rate, die zeitliche Abstimmung und/oder das Volumen von Materialbewegungen durch unterschiedliche Kanäle – sogar unter einem einzelnen angelegten Druckdifferential (z.B. einem an eine einzelne Kanalöffnung angelegten Vakuum) – zu bestimmen. Beispiele für solche Kanalnetze sind in den US-Patenten 09/238.467 (eingereicht am 28. Januar 1999), 09/233.700 (eingereicht am 19. Januar 1000) und 09/277.367 (eingereicht am 26. März 1999), die hierin alle in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke der Erfindung durch Verweis aufgenommen sind, angeführt.
Alternativ dazu bieten sich für Mikrofluidikanwenungen der Erfindung gesteuerte elektrokinetische Transportsysteme an. Diese Art von elektrokinetischem Transport ist ausführlich in US-Patent 5.858.195 (Ramsey) beschrieben. Derartige elektrokinetische Materialtransport- und Lenkungssysteme sind z.B. jene Systeme, die auf der elektrophoretischen Mobilität geladener Spezies innerhalb des an die Struktur angelegten elektrischen Feldes beruhen. Solche Systeme werden üblicherweise als elektrophoretische Materialtransportsysteme bezeichnet. Andere elektrokinetische Mate- riallenkungs- und Transportsysteme beruhen auf dem elektroosmotischem Fluss von Fluid und Material innerhalb einer Kanal- oder Kammerstruktur, der das Ergebnis des Anlegens eines elektrischen Felds über solche Strukturen ist. Wenn – zusammenfassend beschrieben – ein F1uid in einen Kanal eingebracht wird, der eine Oberfläche besitzt, die geladene funktionelle Gruppen aufweist, z.B. Hydroxylgruppen in Kanälen aus geätztem Glas oder Glasmikrokapillaren, können diese Gruppen ionisieren. Im Fall funktioneller Hydroxylgruppen führt diese Ionisierung, z.B. bei neutralem pH-Wert, zur Freisetzung von Protonen aus der Oberfläche und in das Fluid, wodurch eine Konzentration von Protonen in der Nähe der Fluid/Oberflächen-Grenzfläche oder eine positiv geladene Hülle um die Fluidmasse im Kanal geschaffen wird.
Das Anlegen eines Spannungsgradienten über die Länge des Kanals bewirkt, dass sich die Protonenhülle in Richtung des Spannungsabfalls bewegt, d.h. zur negativen Elektrode.
„Gesteuerte(r) elektrokinetische(r) Materialtransport und -Lenkung" bezieht sich hierin auf oben beschriebene elektrokinetische Systeme, die eine aktive Steuerung der an mehrere, d.h. mehr als zwei, Elektroden angelegten Spannungen vorsehen. Anders gesagt regulieren derartige gesteuerten elektrokinetischen Systeme gleichzeitig Spannungsgradienten, die über zumindest zwei einander kreuzende Kanäle angelegt sind. Insbesondere enthalten die bevorzugten Mikrofluidikvorrichtungen und Mikrofluidiksysteme der Erfindung eine Körperstruktur, die zumindest zwei einander kreuzende Kanäle oder Fluidleitungen enthält, z.B. miteinander verbundene abgeschlossene Kammern, welche Kanäle zumindest drei einander nicht kreuzende Enden besitzen. Der Schnittpunkt der zwei Kanäle ist ein Punkt, an dem zwei oder mehrere Kanäle in Fluidkommunikation miteinander stehen; Beispiele dafür sind T-Kreuzungen, einander querende Kreuzungen, „Wagenrad"-Kreuzungen mehrerer Kanäle oder jede andere Kanalgeometrie, in der zwei oder mehrere Kanäle in derartiger Fluidkommunikation stehen. Ein ungekreuztes Ende eines Kanals ist ein Punkt, an dem ein Kanal endet – aber nicht als Folge der Kreuzung dieses Kanals mit einem anderen Kanal; ein Beispiel dafür ist ein „T"-Kreuzung. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Vorrichtungen zumindest drei einander kreuzende Kanäle mit zumindest vier ungekreuzten Enden. In einer grundlegenden gekreuzten Kanalstruktur, in der ein einzelner horizontaler Kanal von einem einzelnen vertikalen Kanal gekreuzt und geschnitten wird, findet regulierter elektrokinetischer Materialtransport statt, um den Materialfluss durch den Schnittpunkt zu steuern bzw. zu lenken, indem einschränkende Flüsse aus den anderen Kanälen am Schnittpunkt vorgesehen sind. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, ein erstes Material durch den horizontalen Kanal zu befördern, würde man sich z.B. von links nach rechts bewegen, über den Schnittpunkt mit dem vertikalen Kanal. Der einfache elektrokinetische Materialfluss dieses Materials über den Schnittpunkt könnte durch Anlegen eines Spannungsgradienten über die Länge des horizontalen Kanals, d.h. durch Anlegen einer ersten Spannung an das linke Ende dieses Kanals und einer zweiten, nie drigeren Spannung an das rechte Ende dieses Kanals, oder durch Schweben-Lassen des rechten Endes (ohne Anlegen von Spannung) erfolgen. Diese Art von Materialfluss durch den Schnittpunkt würde jedoch zu starker Diffusion am Schnittpunkt führen – dies ist das Ergebnis der natürlichen diffundierenden Eigenschaften des im Medium beförderten Materials wie auch der konvektiven Wirkungen am Schnittpunkt.
Beim gesteuerten elektrokinetischen Materialtransport wird das über den Schnittpunkt beförderte Material durch den schwachen Fluss aus den Seitenkanälen, d.h. dem oberen und unteren Kanal, eingeschränkt. Dies geschieht durch Anlegen eines geringen Spannungsgradienten entlang des Wegs des Materialflusses, z.B. vom oberen oder unteren Ende des vertikalen Kanals, hin zum rechten Ende. Das Ergebnis ist ein „Einzwängen" des Materialflusses am Schnittpunkt, das die Diffusion des Materials in den vertikalen Kanal verhindert. Das „eingeklemmte" Materialvolumen am Schnittpunkt kann dann in den vertikalen Kanal eingespritzt werden, indem ein Spannungsgradient über die Länge des vertikalen Kanals angelegt wird, d.h. vom oberen Ende zum unteren Ende. Um jegliches Austreten von Material aus dem hori- zontalen Kanal während dieses Einspritzvorgangs zu vermeiden, wird ein schwacher Fluss zurück in die Seitenkanäle gelenkt, was einen „Rückzug" des Materials aus dem Schnittpunkt bewirkt.
Zusätzlich zu diesem Merkmal des eingezwängten Einspritzens bedient man sich des gesteuerten elektrokinetischen Materialtransports, um virtuelle Ventile zu bilden, die keine mechanischen oder beweglichen Teile enthalten. In Bezug auf die oben beschriebene querende Kreuzung kann der Materialfluss von einem Kanalsegment in das andere, z.B. vom linken zum rechten Arm des horizontalen Kanals, wirksam reguliert, angehalten und wieder in Gang gesetzt werden, indem für gesteuerten Fluss aus dem vertikalen Kanal, z.B. vom unteren zum oberen Arm des vertikalen Kanals, gesorgt wird. Im „Aus"-Betrieb wird das Material vom linken Arm durch den Schnittpunkt in den oberen Arm befördert, indem ein Spannungsgradient über das linke und das obere Ende angelegt wird. Ein einschränkender Fluss wird vom unteren in den oberen Arm geleitet, indem ein ähnlicher Spannungsgradient über diesen Weg angelegt wird (vom unteren zum oberen Ende). Dosierte Materialmengen wer den dann vom linken Arm in den rechten Arm des horizontalen Kanals abgegeben, indem der angelegte Spannungsgradient von links auf oben bzw. links auf rechts umgeschaltet wird. Die Zeit und der angelegte Spannungsgradient bestimmen die Materialmenge, die auf diese Weise abgegeben wird. Obwohl hierin eine Vierwegkreuzung beschrieben ist, können diese gesteuerten elektrokinetischen Materialtransportsysteme problemlos auf komplexere Kanalnetze angepasst sein, z.B. Anordnungen miteinander verbundener paralleler Kanäle.
Ein Beispiel für ein System unter Anwendung dieser Art von elektrokinetischem Transportsystem in einer Mikrofluidikvorrichtung (wie z.B. in 7) ist aus 11 ersichtlich. Man erkennt, dass ein System 1100 eine Mikrofluidikvorrichtung 700 besitzt, die ein integriertes Pipettor/Kapillarelement 708 enthält. Jedes der elektrischen Zugriffsreservoirs 706 besitzt eine darin angeordnete getrennte Elektrode 1128–1136, die z.B. mit den Fluid in den Reservoirs in Kontakt stehen. Jede der Elektroden 1128–1136 ist operabel an einen elektrischen Regler 508 gekoppelt, der mehrere unterschiedliche Spannungen und/oder Ströme durch die verschiedenen Elektroden führen kann. Eine zusätzliche Elektrode 1138, die auch operabel mit dem Regler 1108 verbunden ist, ist solcherart angeordnet, dass sie in elektrischem Kontakt mit dem zuzuführenden Material steht, z.B. in der aus mehreren Näpfen bestehenden Platte 502, wenn das Kapillarelement 708 in das Material getaucht wird. Beispielsweise kann die Elektrode 1138 eine elektrisch leitende Beschichtung auf der Kapillare 708 sein, die mit einem elektrischen Anschluss verbunden ist, der operabel an den Regler 508 gekoppelt ist. Alternativ dazu kann die Elektrode 1138 einfach einen Elektrodendraht enthalten, der an die Kapillare angrenzt, sodass er gemeinsam mit dem Ende des Kapillarelements 708 in das Probenmaterial eingetaucht bzw. mit ihm in Kontakt gebracht wird. Alternativ dazu kann die Elektrode mit der Materialquelle als leitende Beschichtung auf dem Materialquellennapf oder als leitendes Material, aus dem der Quellennapf erzeugt wurde, verbunden sein. Das Anlegen eines elektrischen Felds erfordert dann lediglich das In-Kontakt-Bringen des elektrischen Anschlusses mit dem Quellennapfmaterial bzw. der Beschichtung. Weitere Materialien werden aus unterschiedlichen Näpfen auf der aus mehreren Näpfen bestehenden Platte 502 durch Bewegen einer oder mehrerer der Platte 502 und/oder Vorrichtung 700 relativ zueinander vor dem Eintauchen des Pipettors 1138 in einen Napf zugeführt. Solche Bewegungen werden üblicherweise ausgeführt, indem eine oder mehrere der Vorrichtung 700 oder der aus mehreren Näpfen bestehenden Platte 502 auf einer Umsetzerstufe positioniert ist bzw. sind, z.B. der schematisch dargestellten x-y-z-Umsetzerstufe 1142.
In einer weiteren optionalen Anwendung können Hybrid-Materialtransportvertahren und -Systeme verwendet werden. Eine Ausführungsform eines solchen Hybridsystems beruht auf der Verwendung elektrokinetischer Kräfte, um Druckdifferentiale innerhalb von Mikrofluidiksystemen zu erzeugen. Solche Hybridsysteme kombinieren die Steuerbarkeit elektrokinetischer Systeme mit den Vorteilen von druckbasierten Systemen, z.B. dem Fehlen elektrophoretischer Vorspannungseffekte. Solche Hybridsysteme sind z.B. in WO 99/16162 beschrieben. Andere Hybridsysteme verwenden gegebenenfalls elektrokinetische Kräfte, um Materialien in einem Abschnitt des Kanalnetzes zu bewegen, während druckbasierte Kräfte in anderen Abschnitten des Kanalnetzes verwendet werden.
Es kann eine Vielzahl anderer Systeme bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, z.B. Rotorsysteme, Dipstick-Systeme, Spotted-Array-Systeme u.dgl.
IV. Sets und Reagenzien
Die Reagenzien zur Durchführung der Verfahren und Tests der Erfindung liegen gegebenenfalls in einem Set vor, um die Anwendung dieser Tests für den Benutzer zu vereinfachen. Solche Sets umfassen typischerweise auch Anleitungen betreffend die Durchführung des vorliegenden Tests und können auch das Fluidbehältnis, z.B. eine Küvette, eine aus mehreren Näpfen bestehende Platte, eine Mikrofluidikvorrichtung usw., in der die Reaktion stattfinden soll, enthalten.
Typischerweise umfassen die im Set enthaltenden Reagenzien das die fluoreszierende Markierung tragende erste Reagens sowie die polyionische Verbindung. Diese Reagenzien können in Fläschchen (zur Messung durch den Benutzer) oder in vorgemessenen Fläschchen oder Ampullen vorliegen, die einfach kombiniert werden, um ein geeignetes Reaktionsgemisch zu ergeben. Die Reagenzien können in flüssiger und/oder lyophilisierter Form vorliegen und gegebenenfalls zweckentsprechende Pufferlösungen zur Verdünnung oder Rehydratation der Reagenzien enthalten. Typischerweise sind alle Reagenzien und Anweisungen in einer einzigen sofort verwendbaren Schachtel, einem einzigen sofort verwendbaren Beutel o.dgl. verpackt.
V. Beispiele
Beispiel 1: Detektion von phosphoryliertem Produkt durch Fluoreszenzpolarisation
Eine Aliquote eines neutral geladenen phosphorylierbaren Substrats (Fluorescein-QSPKKG-CONH₂) wurde über Nacht mit ATP und CDK2 (Cyclin-abhängige Kinase) inkubiert. Das Gemisch wurde durch herkömmliche Kapillarelektrophorese-Verfahren analysiert und zeigte vollständige Umwandlung von Substrat zu Produkt. Ein negativer Vergleich (kein Enzym) wurde ebenfalls vorbereitet. Die zwei Reaktionsgemische wurden in 50 mM TAPS, pH 9,0, Puffer verdünnt (1:40). Die Fluoreszenzpolarisations-Werte wurden durch Anregen der Proben bei 490 nm und Messen der emittierten Fluoreszenz bei 520 nm in einer Küvette eines Fluorimeters gemessen, das zur Messung von Fluoreszenzpolarisation ausgebildet war. Aliquote einer Poly-D-Lysin-Lösung und Wasser wurden zugesetzt (jede zugesetzte Aliquote erhöhte die Poly-D-Lysin-Konzentration um 6 μM). Die Ergebnisse des Tests sind in 12A dargestellt, in der die Fluoreszenzpolarisation der Probe über der Menge an zugesetztem Poly-D-Lysin aufgetragen ist.
Man erkennt, dass die Fluoreszenzpolarisation sowohl des Substrats (Quadrate) als auch des Produkts (Rauten) in Abwesenheit von Polylysin etwa 38 Milli-Polarisationseinheiten (mP) betrug. Nach Zugabe von Polylysin nahm die Fluoreszenzpolarisation des Produkts signifikant zu (auf 72 und dann auf ~ 100 mP nach Zugabe ei nes großen Polylysin-Überschusses). Die Fluoreszenzpolarisation des Substrats erhöhte sich nur auf etwa 42 mP.
Die 12B–12E sind Graphen der Fluoreszenzpolarisation unterschiedlicher Protein-Kinase A- (PKA-) und Protein-Kinase C- (PKC-) Substrate in Anwesenheit steigender Polyarginin-Konzentrationen. Genauer gesagt wurden einige PKC-Substrate und ihre phosphorylierten Derivate auf Fluoreszenzpolarisation in Anwesenheit steigender Polyarginin-Konzentrationen untersucht. Die folgenden Substrate und ihre phosphorylierten Derivate wurden bei Konzentrationen von 125 nM verwendet. Die nicht-phosphorylierten Peptide sind in jeder der 12B–12E durch Quadrate gekennzeichnet, während die phosphorylierten Peptide durch Rauten gekennzeichnet sind. In jedem Fall liefert das phosphorylierte Substrat einen höheren Polarisationsgrad. Die verwendeten Peptide waren:
Beispiel 2: Differenzierung von Produktkonzentrationen mittels Fluoreszenzpolarisation
Es fanden zusätzliche Versuche unter Verwendung von Polyhistidin anstelle von Polylysin statt. In diesem Fall war der verwendete Puffer 50 mM Bis Tris pH 6,5; das Molekulargewicht des verwendeten Polyhistidins betrug 15.800 Dalton (erhältlich bei Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA).
Es wurden Gemische mit variierenden Verhältnissen von Substraten und Produkten zweier Serin/Threonin-Kinasen, CDK2 und Protein-Kinase A (PKA), gebildet. Das CDK-Substrat war das gleiche wie das in obigem Beispiel 1 erwähnte. Das PKA-Substrat war: Fluor-LRRASLG, worin der C-Terminus entweder eine Carboxylgruppe oder eine Carboxyamidgruppe war. Diese Gemische dienten als Modelle für Kinase-Reaktionen bei variierenden Graden der Substratumwandlung. Diesen Gemischen von Substrat und Produkt wurden Aliquote einer Polyhistidinlösung und Wasser zugesetzt. Die Konzentration dieses wässrigen Materials betrug etwa 1,3 mM, und die Endkonzentration lag zwischen 10 und 25 mM.
Die Fluoreszenzpolarisations-Werte wurden durch Anregen bei 490 nm und Detektieren der emittierten Fluoreszenz bei 520 nm erhalten (beide Substrate waren Fluorescein-markiert). 13 und 14 zeigen die Ergebnisse dieser Versuche. Die 13 und 14 sind Graphen der Fluoreszenzpolarisation in steigenden Konzentrationen von phosphoryliertem Produkt gegenüber Substrat (als prozentuelle Umwandlung angezeigt). Im Fall von 13 sind das Substrat und das Produkt Modellsubstrat/Produkte von CDK2, während 14 ähnliche Daten für PKA-Substrat/Produkt-Gemische (z.B. wie oben beschrieben) veranschaulicht. Man erkennt, dass eine sehr gute lineare Abhängigkeit zwischen dem Fluoreszenzpolarisations-Signal und der prozentuellen Umwandlung von Substrat zu Produkt besteht. Somit eignet sich das Verfahren zur Beobachtung des Verlaufs von Kinase-Reaktionen und auch zum Screenen chemischer Bibliotheken hinsichtlich Kinase-Inhibitoren.
PKA und zusätzliche Protein-Kinasen wurden in ähnlichen Testverfahren untersucht, wobei allerdings auf jede Kinase abgestimmte Substrate und Polyarginin als Polyionkomponente verwendet wurden. Insbesondere wurden fünf unterschiedliche Fluorescein-markierte Peptide hergestellt, die Substrat-Erkennungssequenzen für drei unterschiedliche Serin- oder Tyrosin-Kinase-Enzyme enthalten. Die unterschiedlichen Substrate trugen in ihrem unphosphoryliertem Zustand Nettoladungen von +2 bis –1 bei pH 7,5. Diese Ladungen lieferten daher phosphorylierte Produkte mit Ladungen von 0 bis –3.
Die einzelnen Peptide wurden mit ihren jeweiligen Kinasen in Anwesenheit von ATP behandelt und der Umwandlungsgrad mittels kapillarer elektrophoretischer Trennung von Substrat und Produkt sowie durch Fluoreszenzpolarisation ermittelt. Alle Proben zeigten eine gute Korrelation zwischen den CE- und FP-Detektionsverfahren. Beispielsweise ist die Korrelation zwischen CE- und FP-Detektion für PKBα in 15 dargestellt.
Beispiel 13: Zeitverlaufüberwachung von Enzymreaktionen durch Fluoreszenzpolarisation
Es erfolgte ein weiterer PKA-Test mit variierenden ATP-Konzentrationen (0 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM und 32 μM) in 50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 500 nM Polyarginin, 184 nM PKA und 125 nM Kemptid-Substrat (FI-LRRASLG-COO). Die resultierenden Tests wurden im Lauf der Zeit überwacht, um die Wirksamkeit der Fluoreszenzpolarisations-Detektionsverfahren der Erfindung in Bezug auf die Überwachung von Reaktionszeitverläufen zu ermitteln. 16 ist ein Graph der Fluoreszenzpolarisation über der Reaktionszeit für jede ATP-Konzentration im Reaktionsgemisch. Man erkennt, dass steigende ATP-Konzentrationen im Allgemeinen raschere Reaktionsraten ergeben. In allen Fällen außer beim Vergleich nehmen die Fluoreszenzpolarisations-Messungen mit der Zeit zu. Insbesondere wird mit Fortdauer der Reaktionen aufgrund der zugesetzten Phosphatgruppen mehr und mehr fluoreszierendes Substrat geladen, wodurch stärkere Bindung an Polyarginin ermöglicht und damit in Zusammenhang stehende Änderungen der Fluoreszenzpolarisation (z.B. mehr polarisiert, weniger depolarisiert) hervorgerufen werden. 17-ist ein Graph der anfänglichen Rate über der ATP-Konzentration, der zu einer charakteristischen kinetischen Kurve für die untersuchte Reaktion führt. Diese kinetischen Daten wurden dann in einem Lineweaver-Burke-Graphen (18) verwendet, um den Km-Wert des jeweiligen Kinase-Enzyms zu ermitteln.
Beispiel 4: Untersuchung von Phosphatase-Aktivität durch Fluoreszenzpolarisation
Die Fluoreszenzpolarisations-Detektionsverfahren der Erfindung wurden auch auf die Überwachung des zeitlichen Verlaufs eines Phosphatase-Tests angewendet. Zusammenfassend gesagt wurde ein fluoreszierendes Substrat für ein bekanntes Phosphatase-Enzym in einen Testpuffer von 50 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM DTT, 200 mM NaCl und 300 nM Polyarginin gefüllt. Der relative Fluoreszenzpolarisations-Grad wurde im Lauf der Zeit für eine Vergleichsreaktion (kein Enzym) und ein Reaktionsgemisch mit unterschiedlichen Konzentrationen von Phosphatase-Enzym überwacht. 19 zeigt den Graphen für den Vergleich und die Enzym-Testgemische. Man erkennt, dass die relativen Fluoreszenzpolarisations-Werte im Lauf der Zeit in Gegenwart von Phosphatase-Enzym abnehmen. Insbesondere liefert das Gemisch weniger polarisierte Fluoreszenz im Lauf der Zeit, da weniger Polyarginin mit dem fluoreszierenden Substrat infolge der Entfernung der geladenen Phosphatgruppe auf dem Substrat in Wechselwirkung tritt (erleichtert die Polyarginin-Bindung).
Beispiel 5: Untersuchung von Protease-Aktivität durch Fluoreszenzpolarisation
Die Fluoreszenzpolarisations-Detektionsverfahren der Erfindung wurden auch auf Protease-Tests angewendet. Insbesondere fand ein Chymotrypsin-Test unter Anwendung dieser Verfahren statt, wobei ein neutral geladenes Chymotrypsin-spezifisches Substrat (FI-EGIYGVLFKKK-CONH₂), das eine fluoreszierende Gruppe an einem Ende und einen Polylysinschwanz am anderen Ende trägt, verwendet wurde. Genauer gesagt liefert die Spaltung des obigen Substrats durch Chymotryprin FI-EGIY mit einer Nettoladung von -4 und GVLFKKK mit einer Nettoladung von +4. Wie hierin beschrieben, schließt sich ein Polykation vorzugsweise mit einem hoch negativ geladenen fluoreszierenden Abschnitt der Reaktionsprodukte zusammen, wodurch eine Verlagerung der Fluoreszenzpolarisation dieses markierten Abschnitts eintritt. Der Test erfolgte in 50 mM HEPES-Puffer bei pH 7,5, 5 mM CaCl₂, 500 nM Chymotrypsinsubstrat und 1 μM Polyarginin. Drei getrennte Tests wurden durchgeführt, ein Vergleichslauf ohne Enzym und zwei Testläufe mit unterschiedlichen Enzymkonzentrationen (0,125 μg/ml und 1,25 μg/ml Chymotrypsin). 20 zeigt einen Graphen der Fluoreszenzpolarisation über der Zeit für jeden der einzelnen Testläufe. Wie man sieht, wies der Vergleichslauf (Rauten) keine Zunahme des Fluoreszenzpolarisations-Grads im Lauf der Zeit auf, während die niedrige Chymotrypsin-Konzentration (0,125 μg/ml, große Quadrate, mittlere Linie) und höhere Chymotrypsin-Konzentration (1,25 μg/m1, kleine Quadrate, oberste Linie) steigende Fluoreszenzpolarisations-Grade im Lauf der Zeit aufwiesen; die höhere Enzymkonzentration zeigte eine raschere anfängliche Steigerung. Steigende Fluoreszenzpolarisations-Grade sind ein Indikator für stärkere Wechselwirkung von Polyarginin mit dem negativ geladenen fluoreszierenden Abschnitt des Substrats, sobald der positiv geladene Wert durch Chymotrypsin-Spaltung entfernt ist.
Beispiel 6: Nucleinsäure-Hybridisierungstest mittels Fluoreszenzpolarisations-Detektion
Die Testverfahren wurden auch für die Detektion einer Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktion herangezogen. Dieser Test ist infolge des Fehlens einer zu untersuchenden immobilisierten Zielsequenz besonders interessant. Der gesamte Test fand in Lösung statt.
Ein Fluorescein-markiertes Peptidnucleinsäure-Molekül 202 wurde in Hybridisie- rungsexperimenten mit den DNA-Zielen 192 und 182 verwendet. PNA waren bei der Applied Biosystems Division der Perkin-Elmer Corporation (Foster City, CA, USA) erhältlich. Die Sequenz dieser Moleküle ist nachstehend angeführt. Im Fall des PNA-Moleküls veranschaulicht die angeführte Sequenz die analoge Sequenz eines DNA-Moleküls. Die Sequenzen der drei Moleküle sind wie folgt:
202: 5' FI-O-GTCAAATACTCCA
192: 5' ATGGGCTGGAGTATTTGACCTAATT
182: 5' CGCTGTGGλTGCTGCCTGA
DNA-Sequenz 192 enthält 13 Basen (fett gedruckt), die zur PNA-Sonde 202 voll komplementär sind, während 182 ein nicht-komplementäres Oligonucleotid ist.
Eine Lösung mit 1 μM PNA 202 in 50 mM HEPES, pH 7,5, wurde entweder mit 5 μM 192 oder 5 μM 182 vermischt. Die Gemische wurde bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten lang stehen gelassen und dann in die Küvette eines Fluorimeters gefüllt, das ausgebildet war, die Fluoreszenzpolarisation zu messen. Die Messungen erfolgten bei 490 nm für die Anregung und 520 nm für die Detektion der Fluoreszenzemission. Die Fluoreszenzpolarisations-Werte wurden zunächst in Abwesenheit und dann in Gegenwart von Poly-L-lysinhydrobromid mit einem Molekulargewicht von etwa 70–100 kD (Sigma Chemicals) aufgezeichnet. Das Poly-L-lysin wurde aus einer Stammlösung in Wasser (etwa 440 μM) zugesetzt. Die Endkonzentrationen des Polylysins waren 4,4 und 8,8 μM. Die resultierenden Fluoreszenzpolarisations-Werte sind aus 21 ersichtlich.
Man erkennt, dass ein Polarisationswert von 86 mP für das Gemisch erhalten wurde, das 202 und nicht-komplementäres 182 enthielt. Er stieg in der Gegenwart von Poly-L-lysin auf 140 mP. Im Gegensatz dazu zeigte der 202-Hybrid mit der komplementären 192-Sequenz einen Polarisationswert von etwa 100 mP in Abwesenheit (in 21 nicht zu sehen) und 229 mP in Gegenwart von Poly-L-lysin. Diese Ergebnisse belegen, dass die Fluoreszenzpolarisation in Gegenwart von Poly-L-lysin dazu dienen kann, die Bildung spezifischer PNA/DNA-Hybride in Lösung zu detektieren. Solche Tests werden bei der Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Sequenz innerhalb der Probe häufig eingesetzt, z.B. beim Sequenzieren durch Hybridisierung, bei der Sequenzkontrolle, beim Screening hinsichtlich Sequenzvarianten, z.B. Polymorphismen, d.h. SNP, STR u.dgl.
Beispiel 7: Detektion von Einzelnucleotid-Substitution
Die Testverfahren dienten dazu, die unterschiedliche Hybridisierung einer Nucleinsäuresonde an eine perfekt komplementäre Zielsequenz und eine Zielsequenz mit einer einzelnen Basisvariation, z.B. einem singulären Nucleotid-Polymorphismus (SNP), zu detektieren. Insbesondere wurde die fluoresceinierte PNA-Sonde, die eine zu einer Teilsequenz einer Zielsequenz komplementäre Sequenz aufwies, dazu verwendet, das Ziel inklusive der Teilsequenz und ein Ziel, in dem eine innere Base der Teilsequenz für eine unterschiedliche Base substituiert war, zu sondieren.
Die 5'-3'-Sequenzen der PNA-Sonde (PNA 7637), der DNA-Zielsequenz und der DNA-Zielsequenz mit einer einzelnen Basenfehlübereinstimmung (DNA 245) waren wie folgt:
PNA 7637: Fluorescein-CCTGTAGCA
DNA 24-4: TTGTTGCCAATGCTACAGGCATCGT
DNA 245: TTGTTGCCAATGCTGCAGGCATCGT
Die Teilsequenz der zur PNA-Sonde komplementären DNA-Ziele ist fett gedruckt. Die Position des SNP ist unterstrichen.
Die PNA-Sonde 7637 wurde mit einer Endkonzentration von 250 nM in einem Reaktionsvolumen von 400 μl verwendet. Der verwendete Puffer war 50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl. Die Lösung enthielt auch Poly-L-lysin in einer Menge von etwa 3 μM. 1 μl-Aliquoten der DNA-Ziele 244 und 245 wurde iterativ der PNA-Lösung zugesetzt und die Fluoreszenzpolarisation (Anregung 490 nm, Emission 520 nm) nach der Zugabe jeder Aliquote aufgezeichnet. Die Daten aus diesem Experiment sind in. 22 veranschaulicht. Das Gemisch aus perfekt komplementärem Ziel und Sonde (Rauten) wies deutlich höhere Fluoreszenzpolarisation auf als das Gemisch mit einzelner Basenfehlübereinstimmung (Quadrate) – ein Zeichen dafür, dass ein höherer Hybridisierungsgrad eingetreten ist. Man erkennt auch, dass die Hybridisierung etwa bei einem 1 M-Überschuss der Zielsequenz im perfekt komplementären Beispiel ein Plateau erreichte.
Thermische Denaturierungsexperimente erfolgten in Gegenwart von Polylysin, während die Fluoreszenzpolarisations-Änderungen in den Reaktionsgemischen kontrol liert wurden. Insbesondere wurden drei unterschiedliche DNA-Zielmoleküle mit den folgenden Sequenzen verwendet:
212: GCTGGAGTATTTGACCT (perfekte Übereinstimmung)
214: GCTGGAGTTTTTGACCT (T/T-Fehlübereinstimmung in der Mitte)
215: GCTGGAGTCTTTGACCT (C/T-Fehlübereinstimmung in der Mitte)
Jedes Ziel wurde mit jeder der drei unterschiedlichen fluoresceinierten PNA-Sonden mit den nachstehend angeführten Sequenzen (9-mer, 11-mer und 13-mer) untersucht und steigenden Temperaturen ausgesetzt, während die Fluoreszenzpolarisations-Werte der Gemische überwacht wurden:
188: FI-O-CAAATACTG
201: FI-O-TCAAATACTCC
202: FI-O-GTCAAATACTCCA
Jedes der Reaktionsgemische wurde anschließend steigenden Temperaturen ausgesetzt, während der Fluoreszenzpolarisations-Grad überwacht wurde. Die 23A, B und C zeigen jedes mit jeder der drei unterschiedlichen Sonden untersuchte Ziel. Die Datenpunkte stellen durchschnittliche Daten aus drei getrennten Experimenten dar. Alle Schmelzkurven sind normalisiert, wobei die Schmelzkurven aus den PNA-Sonden alleine von den in Gegenwart der DNA-Zielsequenzen generierten Schmelz- kurven subtrahiert sind.
Wie man erwarten konnte, zeigt sich das Folgende: Je länger die verwendete PNA-Sonde war, desto weiter nach außen wurde die Schmelzkurve geschoben. Insbesondere zeigt 23A einen viel niedrigeren Schmelzpunkt für das Ziel und Sonde (9-mer) als 23B (11-mer) und 23C (13-mer). Außerdem kann man eine klare Unterscheidung zwischen den perfekt übereinstimmenden Hybriden (Rauten) und den Hybriden mit einzelner Basenfehlübereinstimmung (Quadrate und Dreiecke) für jede Zielsequenz treffen, wobei die C/T-Fehlübereinstimmung unter den zwei dargestellten die destabilisierendste ist, d.h. die größte Verschiebung in der Schmelzkurve nach sich zieht. Dieses Beispiel zeigt deutlich die Sensitivität, mit der die hierin beschriebenen Verfahren dabei angewendet werden können, individuelle Nucleotiddifferenzen zwischen Zielsequenzen, z.B. SNP, zu identifizieren.
Obwohl die oben erläuterten Tests mit Fluoreszenzpolarisations-Detektion arbeiteten, stellte sich auch heraus, dass diese Testverfahren nach Hybridisierung zu Veränderungen der Fluoreszenzintensität führen. Insbesondere wurden Einzelnucleotid-Substitutionstests wie die oben beschriebenen auf zwei getrennten Nucleinsäuresequenzen durchgeführt. In jedem wurde eine zum Wildtyp komplementäre PNA-Sonde (250 nM) und eine PNA-Sonde mit einer singulären Basensubstitution dazu verwendet, die Zielsequenz zu sondieren (in 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl), gefolgt von Behandlung mit Poly-L-lsin (3,3 μM). Die Gemische wurden steigenden Konzentrationen der Zielsequenz ausgesetzt, und dann wurden die Fluoreszenzpolarisation und die gesamte Fluoreszenzintensität gemessen. 24 ist ein Graph der Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzpolarisation für alle untersuchten perfekten Hybride und Einzelbasen-Fehlübereinstimmungen. Man erkennt, dass sowohl die Fluoreszenzintensität als auch die Fluoreszenzpolarisation eine Grundlage für die Unterscheidung zwischen der perfekten Übereinstimmung und Einzelbasen-Fehlübereinstimmungsreaktionen schaffen.
Sofern nicht anders konkret angeführt, beziehen sich alle hierin genannten Konzentrationswerte auf die Konzentration einer bestimmten Komponente, als diese Kom- ponente einem Gemisch oder einer Lösung zugesetzt wurde – unabhängig von jeglicher Umwandlung, Dissoziation oder Reaktion dieser Komponente, um sie zu verändern oder in eine oder mehrere andere Spezies umzuwandeln, sobald sie dem Gemisch oder der Lösung zugesetzt ist. Die hierin beschriebenen Verfahrensschritte können im Allgemeinen in jeder beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, sofern nicht eine Reihenfolge konkret genannt ist oder sich eine erforderliche Reihenfolge aus dem Kontext der angeführten Schritte ergibt. Typischerweise stellen die angeführten Reihenfolgen von Verfahrensschritten bevorzugte Reihenfolgen dar.
Die vorliegende Erfindung wurde zwar ausführlich veranschaulicht und durch Beispiele erklärt, um so ihre Merkmale klarer und verständlicher darzulegen, doch ist es offenkundig, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.

Claims

Verfahren zum Nachweis einer Reaktion, umfassend: die Bereitstellung eines ersten Reagensgemischs, umfassend ein erstes Reagens mit einer fluoreszierenden Markierung; das Einführen eines zweiten Reagens in das erste Reagensgemisch zur Herstellung eines zweiten Reagensgemischs, wobei das zweite Reagens mit dem ersten Reagens reagiert, um ein fluoreszenzmarkiertes Produkt mit einer anderen Ladung als das erste Reagens zu erzeugen; das Einführen eines Polyions in zumindest eines von erstem und zweitem Reagensgemisch; und das Vergleichen des Fluoreszenz-Polarisationsgrads im zweiten Reagensgemisch mit dem ersten Reagensgemisch.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyion sich mit dem Produkt verbin- det.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das erste Reagens ein nichtgeladenes oder positiv geladenes Nucleinsäure-Analog umfasst und das zweite Reagens eine Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz umfasst, die komplementär zu einer Sequenz des Nucleinsäure-Analogs ist, und das Produkt ein Hybrid aus dem Nucleinsäure-Analog und der Nucleinsäure umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das erste Reagens eine phosphorylierbare Verbindung umfasst und das Produkt ein phosphorylierbares erstes Reagens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das zweite Reagens ein Kinase-Enzym umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, worin die phosphorylierbare Verbindung ein Peptid umfasst, das eine Phosphorylierungsstelle umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das erste Reagens eine phosphorylierbare Verbindung umfasst und das Produkt ein dephosphoryliertes erstes Reagens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das zweite Reagens ein Phosphatase-Enzym umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin das erste Reagens ein fluoreszenzmarkiertes phosphoryliertes Peptid umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das erste Reagens eine erste Polypeptidsequenz umfasst und das Produkt ein Fragment der Polypeptidsequenz umfasst, wobei das Fragment eine andere Ladung als die erste Polypeptidsequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das zweite Reagens ein Hydrolase-Enzym umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Hydrolase-Enzym ein Protease-Enzym umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das erste Reagens einen ersten Kanal entlang transportiert wird und das zweite Reagens in den ersten Kanal eingeführt wird, um sich mit dem ersten Reagens zu vermischen.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das erste und das zweite Reagens über einen zweiten und einen dritten Kanal in den ersten Kanal eingeführt werden, wobei der zweite und der dritte Kanal erste und zweite Enden aufweisen und den ersten Kanal an ihren zweiten Enden kreuzen.
Verfahren nach Abspruch 14, worin die ersten Enden des zweiten und des dritten Kanals in Fluidverbindung zu einem ersten und einem zweiten Reservoir ste hen, wobei das erste und das zweite Reservoir das erste und das zweite Reagens enthalten.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, weiters umfassend: das Richten von Anregungslicht auf das erste Reagens und das Messen des Fluoreszenz-Polarisationsgrads im ersten Reagens; das Richten von Anregungslicht auf das zweite Reagens und das Messen des Fluoreszenz-Polarisationsgrads des zweiten Reagens; und worin der Schritt des Vergleichens die Bestimmung eines ersten Unterschieds zwischen dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad des ersten Reagens und dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad des zweiten Reagensgemischs umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, weiters umfassend das Einführen einer Testverbindung in zumindest eines von erstem Reagens und zweitem Reagensgemisch und die Durchführung des Schritts des Vergleichens in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung, wobei eine Abnahme oder ein Anstieg des ersten Unterschieds im Fluoreszenz-Polarisationsgrad in Gegenwart der Testverbindung in Bezug auf den Unterschied in Abwesenheit der Testverbindung darauf hindeutet, dass die Testverbindung ein Hemmer oder ein Verstärker einer Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Reagens ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das zweite Gemisch einen ersten Kanal entlang transportiert wird und die Testverbindung in den ersten Kanal eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, worin der erste Kanal in Fluidverbindung zu einem Kapillarelement steht oder ein einstückiger Abschnitt davon ist und die Testverbindung von einer Quelle der Testverbindung aus in das Kapillarelement gezogen wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin mehrere verschiedene Testverbindungen getrennt in getrennte Volumina von zumindest einem von erstem Reagens und zweitem Reagensgemisch eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das zweite Reagensgemisch einen ersten Kanal entlang transportiert wird und die mehreren Testverbindungen in den ersten Kanal als diskrete Fluidregionen eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren zur Identifizierung der Gegenwart einer Subsequenz von Nucleotiden in einer Zielnucleinsäure dient und Folgendes umfasst: das Kontaktieren der Zielnucleinsäuresequenz mit einem nichtgeladenen oder positiv geladenen fluoreszenzmarkierten Nucleinsäureanalog in einem ersten Reaktionsgemisch, wobei das Nucleinsäureanalog komplementär zur Subsequenz ist, wodurch das Nucleinsäureanalog zur spezifischen Hybridisierung an die Subsequenz zur Bildung eines ersten Hybrids fähig ist; das Kontaktieren des ersten Reaktionsgemischs mit einem Polyion; und das Vergleichen des Fluoreszenz-Polarisationsgrads des ersten Reaktionsgemischs in Gegenwart des Polyions mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad des Nucleinsäureanalogs in Abwesenheit der Zielnucleinsäuresequenz, wobei ein Anstieg des Fluoreszenz-Polarisationsgrads auf die Gegenwart des ersten Hybrids hinweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 22, worin das Nucleinsäureanalog aus einem Nucleinsäurehomolog mit Peptidrückgrat (PNA), einem Methylphosphonatpolymer und einer kationischen Nucleinsäure ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, worin die Zielnucleinsäuresequenz zumindest einen Locus für einen Einzelnucleotid-Polymorphismus aufweist.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Nucleinsäureanalog komplementär zu einem Allel des Einzelnucleotid-Polymorphismus in der Zielnucleinsäuresequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren dem Nachweis der Phosphorylierung einer phosphorylierbaren Verbindung dient und Folgendes umfasst: das Bereitstellen der phosphorylierbaren Verbindung mit einer fluoreszierenden Markierung; das Kontaktieren der phosphorylierbaren Verbindung mit einem Kinase-Enzym in Gegenwart eines Phosphatdonors in einem ersten Gemisch; das Kontaktieren des ersten Gemischs mit einem Polyion; das Vergleichen des Fluoreszenz-Polarisationsgrads des ersten Gemischs in Gegenwart des Polyions mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad der phosphorylierbaren Verbindung mit der fluoreszierenden Markierung in Abwesenheit des Kinase-Enzyms.
Verfahren nach Anspruch 26, worin sich das Polyion mit dem Produkt verbindet.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin sich das Polyion mit dem ersten Reagens verbindet.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Polyion eine Ladung trägt, die entgegengesetzt zur Ladung des geladenen Produkts ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Polyion. ein Polykation ist.
Verfahren nach Anspruch 30, worin das Polykation eine Polyaminosäure ist.
Verfahren nach Anspruch 31, worin die Polyaminosäure ein Protein umfasst, das sich mit einem von fluoreszierendem Reagens oder Produkt in ladungsabhängiger Weise verbindet.
Verfahren nach Anspruch 31, worin die Polyaminosäure aus Polylysin, Polyhistidin, Polyarginin und Copolymeren davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren dem Nachweis der Phosphorylierung einer phosphorylierbaren Verbindung dient und Folgendes umfasst: das Bereitstellen der phosphorylierbaren Verbindung mit einer fluoreszierenden Markierung; das Kontaktieren der phosphorylierbaren Verbindung mit einem Kinase-Enzym in Gegenwart einer Phosphatgruppe in einem ersten Gemisch; das Kontaktieren des ersten Gemischs mit einem zweiten Reagensgemisch, umfassend ein metallchelatbildendes Protein mit damit verbundenen, aus Fe³⁺, Ca²⁺, Ni²⁺ und Zn²⁺ ausgewählten Metallionen; das Vergleichen des Fluoreszenz-Polarisationsgrads des ersten Gemischs in Gegenwart des zweiten Gemischs mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad der phosphorylierbaren Verbindung mit der fluoreszierenden Markierung in Abwesenheit des Kinase-Enzyms.
Testsystem, umfassend: ein Fluidbehältnis, umfassend: eine erste Reaktionszone, umfassend: ein erstes Reagensgemisch, das ein erstes Reagens mit fluoreszierender Markierung umfasst; ein zweites Reagensgemisch, welches mit dem ersten Reagens reagiert, um ein Fluoreszenz-markiertes Produkt mit einer im Wesentlichen unterschiedlichen Ladung als das erste Reagens herzustellen; und ein Polyion; und eine Detektionszone; und einen Detektor, der in Sensorkommunikation mit der Detektionszone steht, wobei der Detektor so konzipiert ist, dass er den Fluoreszenz-Polarisationsgrad von Reagenzien in der Detektionszone detektiert.
Testsystem nach Anspruch 35, worin das Fluidbehältnis eine Körperstruktur mit zumindest einem darin angeordneten ersten Kanal umfasst, wobei ein Abschnitt des ersten Kanals die Reaktionszone umfasst und ein Abschnitt des ersten Kanals die Detektionszone umfasst.
Testsystem nach Anspruch 35 oder Anspruch 36, weiters umfassend ein Materialtransportsystem zum Transport des ersten Reagens, des zweiten Reagens und des Polyions vom Reaktionszonenabschnitt des ersten Kanals zum Detektionszonenabschnitt des ersten Kanals.
Testsystem nach Anspruch 37, worin das Materialtransportsystem Folgendes umfasst: (a) eine Druck- oder Vakuumquelle, die an einem Endpunkt des ersten Kanals angeschlossen wird, um ein Fluid durch die Reaktionszone hindurch zur Detektionszone zu drängen oder zu ziehen; oder (b) eine elektrische Stromquelle, die mit verschiedenen Punkten im ersten Kanal operativ verbunden ist, um über zumindest einen Abschnitt der Länge des ersten Kanals ein elektrisches Feld anzulegen, wobei das elektrische Feld die Bewegung von Material von der Reaktionszone hin zur Detektionszone bewirkt.
Testsystem nach einem der Ansprüche 35 bis 38, worin das Reaktionsbehältnis eine Vertiefung in einer Mikrowellplatte oder eine Eprouvette umfasst.
Testsystem, umfassend: einen in einer Körperstruktur angeordneten ersten Kanal, wobei der erste Kanal in Fluidverbindung mit Folgendem steht: eine Quelle eines ersten Reagensgemischs, welches ein erstes Reagens mit fluoreszierender Markierung umfasst; eine Quelle eines zweites Reagensgemischs, welches mit dem ersten Reagens reagiert, um ein fluoreszenzmarkiertes Produkt mit einer anderen Ladung als das erste Reagens zu erzeugen; und eine Quelle eines Polyions; ein Materialtransportsystem zum Einführen des ersten Reagens, des zweiten Reagens und des Polyions in den ersten Kanal; und einen Detektor, der in Sensorkommunikation mit der Detektionszone steht, wobei der Detektor so konzipiert ist, dass er den Fluoreszenz-Polarisationsgrad von Reagenzien in der Detektionszone detektiert.
Testsystem nach Anspruch 40, worin die Quelle des ersten Reagens, die Quelle des zweiten Reagens und die Quelle des Polyions ein erstes, ein zweites und ein drittes Reservoir umfassen, die jeweils in der Körperstruktur angeordnet sind, wobei das erste, das zweite und das dritte Reservoir in Fluidverbindung mit dem ersten Kanal stehen.
Testsystem nach Anspruch 41, weiters umfassend eine äußere Probenzieh-Kapillare mit einem sich darin durch diese hindurch erstreckenden Kapillarkanal, wobei der Kapillarkanal ein erstes und ein zweites Ende aufweist und der Kapillarkanal am ersten Ende in Fluidverbindung mit dem ersten Kanal steht und am zweiten Ende offen ist.
Testsystem nach Anspruch 40, weiters umfassend einen mit dem Detektor operativ verbundenen Computer, wobei der Computer programmiert ist, Fluoreszenz-Polarisationsdaten vom Detektor zu empfangen und den Fluoreszenz-Polarisationsgrad des ersten Reagensgemischs mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad des zweiten Reagensgemischs, welches das erste Reagens, das zweite Reagens und ein Polyion umfasst, zu vergleichen.
Set, umfassend: ein Volumen eines ersten Reagens, das eine fluoreszierende Markierung umfasst; ein Volumen eines zweiten Reagens, das mit dem ersten Reagens reagiert, um ein fluoreszenzmarkiertes Produkt mit einer im Wesentlichen anderen Ladung als das erste Reagens zu erzeugen; und ein Volumen eines Polyions; sowie Anweisungen für: die Bestimmung des Fluoreszenz-Polarisationsgrads des ersten Reagens; das Vermischen des ersten Reagens, des zweiten Reagens und des Polyions in einem ersten Gemisch; die Bestimmung des Fluoreszenz-Polarisationsgrads des ersten Reagensgemischs; den Vergleich des Fluoreszenz-Polarisationsgrads des ersten Reagens mit dem Fluoreszenz-Polarisationsgrad des ersten Gemischs.
Set nach Anspruch 44, weiters umfassend ein Fluidbehältnis.
Set nach Anspruch 45, worin das Fluidbehältnis zumindest eine erste Vertiefung in einer Mikrowellplatte, eine Körperstruktur mit zumindest einem ersten darin angeordneten Kanal oder eine Körperstruktur mit mehreren darin angeordneten, sich kreuzenden Kanälen umfasst.