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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis von Mikroorganismen
und insbesondere unabhängige Testvorrichtungen
sowie Verfahren zur Verwendung beim Nachweis und Zählen von
Mikroorganismen in verschiedenartigen Proben, wie z.B. Lebensmitteln,
klinischen Präparaten
und Umweltproben.
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Stand der
Technik
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Der
Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, ist in verschiedenen
großtechnischen Bereichen,
einschließlich
der Lebensmittel- und Getränkeindustrie,
von Bedeutung. So ist beispielsweise die Notwendigkeit, Lebensmittel
und Wasser auf krankheitserregende Bakterien zu durchsuchen, entscheidend, um
die Sicherheit des Verbrauchers zu gewährleisten. Bei der Bestimmung
der Niveaus bestimmter Bakterienfamilien handelt es sich um einen
allgemein angewandten Ansatz zur Abschätzung der Haltbarkeit und der mikrobiellen
Akzeptanz von Lebensmittelprodukten sowie des hygienischen Zustands
der zu deren Herstellung verwendeten Verarbeitungsgeräte und Rohmaterialien.
Die Diagnose mikrobieller Infektionen beruht ebenso auf dem Nachweis
des verursachenden Organismus bzw. der verursachenden Organismen.
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Es
gibt viele bekannte Verfahren zum Nachweis von Bakterien. So können beispielsweise
Bakteriophagen, bei denen es sich um bakterieninfizierende Viren
handelt, eingesetzt werden. Dabei kann das Vorhandensein der Bakteriophagen,
der infizierten Bakterien oder das Fehlen davon nachgewiesen werden.
Diese bekannten Verfahren weisen verschiedene Nachteile auf. So
kann beispielsweise die zu testende Probe oder die verwendete Gerätschaft
im Zuge der Handhabung der Probe kontaminiert werden. Ein weiteres
Problem betrifft die Leichtigkeit der Verwendung der damit verbundenen
Nachweisvorrichtung. Noch ein weiteres angetroffenes Problem besteht
in der Zeit, die zum Nachweis eines Mikroorganismus benötigt wird.
Ein weiteres potentielles Problem wiederum besteht darin, die Bestandteile
des Tests, wie beispielsweise Phagen oder Helferbakterien, „in Schach
zu halten", um die
unvermeidliche Infizierung der Umgebung zu verhindern. Aus der WO-A-94/26414
sind eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von
Bindungstests zur Bestimmung von Zielnukleinsäuren bekannt. Die Vorrichtung
weist drei Kammern auf, die voneinander jeweils durch einen brechbaren
Verschluß getrennt
sind, der aufgebrochen werden kann, um eine fluidische Verbindung
zwischen den Kammern herzustellen. Aus US-A-3,290,017 und US-A-5,067,051 sind „Barrier-Mixer" für röhrenförmige Behälter mit
einer in einen ringförmigen
Ring eingelassenen Kugel, wodurch ein drehbarer Verschluß gebildet wird,
der den Behälter
vorübergehend
in zwei getrennte Kompartimente teilt, bekannt. Aus der US-A-5,498,525 ist
ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien bekannt, wobei zur Infektion
der in der Probe enthaltenden Bakterien ein Bakteriophage eingesetzt
wird.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Durch
die vorliegende Erfindung werden Vorrichtungen und Verfahren bereitgestellt,
die dabei helfen, Handhabungsprobleme bei Tests zum Nachweis von
Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert,
zu minimieren. Die Vorrichtungen und Verfahren sind relativ einfach
zu verwenden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird für
relativ schnelle und genaue Ergebnisse in den Verfahren und Vorrichtungen
die Phagenamplifikation verwendet. Somit kann unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Vorrichtungen
und Verfahren der Nachweis von Mikroorganismen in einer unabhängigen,
einfach zu verwendenden Einheit, die relativ schnelle und genaue
Ergebnisse liefert, ausgeführt
werden.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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Bei 1 handelt
es sich um ein Schema einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Ausführliche
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung umfaßt
Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis eines Mikroorganismus (z.B.
Bakterien, Hefe, Pilze und Viren, wie z.B. Bakteriophagen), insbesondere
Bakterien. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung
die Verwendung der Phagenamplifikation zum Nachweis von Bakterien. In
einem Aspekt beinhaltet das Verfahren die Verwendung einer Vorrichtung
mit wenigstens zwei durch einen drehbaren Verschluß (d.h.
einer Komponente, wie z.B. einem Ventil, die zwei Kompartimente
trennt, um so ein Auslaufen zu verhindern) getrennten Kammern, wobei
nach Drehung des Verschlusses die beiden Kammern in Kommunikation
stehen. Vorzugsweise liegt diese Vorrichtung in Form einer Röhre vor,
deren Querschnitt verschiedene Formen aufweisen kann, obwohl andere
Konstruktionen (z.B. rechtwinklige oder kreisförmige Röhren, Kanäle auf einem flachen Substrat
oder mikroreplizierte Strukturen) vorstellbar sind. Durch die vorliegende
Vorrichtung wird die potentielle Kontamination der Probe verringert.
Aufgrund ihrer Unabhängigkeit
ist sie weiterhin zweckmäßig und
einfach zu verwenden.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Vorrichtungen
und Verfahren wird die Wechselwirkung zwischen Bakteriophagen und
Bakterien ausgenutzt. Sie lassen sich zum Testen und zum Nachweis
von Bakterien oder Bakteriophagen in einer Probe, zum Bestimmen
der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber antibakteriellen Agentien
und/oder zum Bestimmen der Wirksamkeit viruzider Agentien verwenden.
Dabei können
sowohl qualitative als auch quantitative Tests durchgeführt werden.
Mit den Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung können Verfahren,
wie z.B. die im US-Patent Nr. 5,498,525 (Rees et al.) beschriebenen,
durchgeführt
werden.
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Bevorzugte
erfindungsgemäße Verfahren
beruhen auf der Beziehung von spezifischer Erkennung und Bindung,
die bei der Infektion eines Bakteriums mit einem Bakteriophagen
entsteht. Dabei injiziert der Bakteriophage seine Nukleinsäure in das
Wirtsbakterium, das dann zur Replikation des gebildeten „Phagen" und dann nach Aufbrechen
des Wirts zur Infektion zusätzlicher
Bakterien (z.B. Helferbakterien) genutzt wird. Sobald der Phage
die Zelle spezifisch infiziert und seine Nukleinsäure injiziert
hat, ist er vor der extrazellulären Umgebung
geschützt.
Somit können
diejenigen Phagen, die kein Bakterium spezifisch infiziert haben,
abgetötet
werden. Nichtgebundener Phage läßt sich
mit verschiedenen Verfahren entfernen oder abtöten. Zu diesen gehören beispielsweise
die Verwendung viruzider Agentien oder Wärme oder das Entfernen von
Chemikalien, die für
die Phagenstabilität
essentiell sind. Die Anzahl an geschützten und replikationsfähigen Bakteriophagen, die
entstehen können,
kann für
deren direkten Nachweis ausreichen. Andererseits läßt sich
die Anzahl erhöhen,
indem sie auf einem Vermehrungswirt über den benötigten Zeitraum (dieser kann
kurz sein, da die Phagengenerationszeiten weniger als 1 Stunde betragen
und 10–1000
Nachkommen produziert werden) gezüchtet werden. Obschon die obige
Beschreibung für
Phagen gilt, die einen lytischen Weg zeigen, ist dem Fachmann ersichtlich,
daß sich
lysogene Phagen ebenso in den Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden
Erfindung einsetzen lassen.
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Der
Phagennachweis läßt sich
mit einer Reihe von Verfahren durchführen. Zu diesen gehören beispielsweise
immunologische Verfahren, wobei ein Antikörper gegen einige Bestandteile
des Phagen verwendet wird, Verfahren, bei denen eine Nukleinsäuresonde
für das
Phagengenom verwendet wird, oder mittels Plaque-Test. Als Alternative
können
beim Nachweis Trübungsänderungen,
Plaquebildung ebenso Farb-, Lumineszenz- oder Fluoreszenzänderungen beteiligt sein. Ein
Verfahren beruht auf der Entdeckung, daß ein Bakterium mittels genetischer
Modifikation konstruiert werden kann, das das Potential zur Produktion
eines nachweisbaren Signals (Gen bzw. Gene, das bzw. die für einen
leicht nachweisbaren Phänotyp
codieren) bei Infektion des Bakteriums mit einem Phagen besitzt.
Der Phage löst
dabei die Signalerzeugung aus, und somit läßt sich das Vorhandensein des
Phagen (und damit des ihn schützenden
Bakteriums) empfindlich und leicht nachweisen. Diese Bakterien,
die als Reporter-Bakterien bezeichnet werden, sind im US-Patent
Nr. 5,498,525 (Rees et al.) ausführlicher
beschrieben.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Vorrichtung beim Nachweis von Bakterien (Zielbakterien)
verwendet. Dabei gibt man Bakteriophagen zu einer Testprobe, um
die Zielbakterien in der Testprobe zu infizieren, tötet die
extrazellulären
Bakteriophagen mit einem Antivirusmittel (oder einem Gemisch aus
Antivirusmitteln) ab, neutralisiert das Antivirusmittel (beispielsweise
mit einem Puffer) und amplifiziert die Bakteriophagen, wodurch die
Plaquebildung sowie der Nachweis unter den phageninfizierten Zielbakterien
mit Hilfe eines Rasens aus bakteriellen Helferzellen erleichtert
werden. Dieser lytische Phagenzyklus in Bakterien mit Plaquebildung
als Endpunkt wird im folgenden als „Phagenamplifikationstest" („Phage
Amplification Assay", PAA)
bezeichnet. Die relativen Mengen der verschiedenen in solch einem
Test verwendeten Reagentien sind dem Fachmann bekannt und im US-Patent
Nr. 5,498,525 (Rees et al.) offenbart. Die Testergebnisse der Plaquebildung
lassen sich schnell, typischerweise innerhalb von etwa 4 Stunden
bis etwa 6 Stunden, ablesen, wobei eine Bestätigung nötigenfalls nach 24 Stunden
erfolgen kann. Herkömmliche
Verfahren zum Zählen
von Bakterien benötigen üblicherweise
etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden Wachstum.
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Als
geeignete Bakteriophagen zum Nachweis von Zielbakterien kommen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Coli-Phage, Salmonella-Phage, Listeria-Phage, Campylobacter-Phage,
Bacillus-Phage, Enterococcus-Phage,
Pseudomonus-Phage, Staphylococcus-Phage, Mycobacterium-Phage, Shigella-Phage,
Streptococcus-Phage,
Corynebacterium-Phage und Vibrio-cholerae-Phage in Frage. Derartige
Phagen sind typischerweise bei der American Type Culture Collection
erhältlich
oder lassen sich natürlicherweise
isolieren und lassen sich beispielsweise in Form lyophilisierter
Pellets verwenden.
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Zur
Abtötung
der extrazellulären
Bakteriophagen werden geeignete antivirale Agentien in den erfindungsgemäßen Verfahren
und Vorrichtungen verwendet. Dazu gehören, ohne darauf beschränkt zu sein,
Eisensalze, Kupfersalze, Blattextrakte, Granatapfelschalenextrakte
sowie organische Säuren,
wie zum Beispiel ungesättigte
Fettsäuren.
Beispiele für
antivirale Agentien sind in der Internationalen Veröffentlichung
Nr. 95/22254 und im US-Patent Nr. 5,840,308 (Jassim et al.) offenbart.
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Zur
Amplifikation der Bakteriophagen und vorzugsweise zur Bereitstellung
von Enzymen für
den Nachweis werden geeignete bakterielle Helferzellen verwendet.
Bei solchen bakteriellen Helferzellen kann es sich um die Zielbakterien
oder um davon verschiedene Bakterien handeln. Sie sollten vorzugsweise
mit den Zielbakterien eng verwandt sein, so daß sie sich mit dem gewählten Bakteriophagen
infizieren lassen. Zu den bakteriellen Helferzellen gehören beispielsweise,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, Zielbakterien wie zum Beispiel E. coli-, Salmonella-, Listeria-,
Campylobacter-, Bacillus-, Enterococcus-, Pseudomonus-, Staphylococcus-,
Mycobacterium-, Shigella-, Streptococcus-, Corynebacterium- und
Vibrio-Bakterien, ebenso wie abgeschwächte Versionen davon.
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Bei
solchen Bakteriophagen, antiviralen Agentien und bakteriellen Helferzellen
handelt es sich um biologische Testreagentien, wie sie hier verwendet
werden. Zu weiteren biologischen Testreagentien, die sich in den
Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung einsetzen
lassen, gehören
Stoffwechselregulatoren, selektive Agentien, Proteine, Antikörper, Enzymsubstrate,
Farbstoffe, Pigmente, Indikatorchemiereaktionen, Nährstoffe
oder Kombinationen daraus. Zur Induktion bestimmter nachweisbarer
Enzyme können
Stoffwechselregulatoren zugegeben werden. Zu diesen gehören, ohne
jedoch darauf beschränkt
zu sein, beispielsweise Isopropylthiogalactosid und Glucose. Zur
Selektion des Wachstums eines gewünschten Bakteriums können selektive
Agentien zugegeben werden. Zu diesen gehören beispielsweise, ohne jedoch
darauf beschränkt
zu sein, Gallensäuren
und bestimmte Farbstoffe und Pigmente. Zur Neutralisierung der antiviralen Agentien
können
Proteine zugegeben werden. Zu diesen gehören beispielsweise, ohne jedoch
darauf beschränkt
zu sein, Rinderserumalbumin sowie Eialbumin. Zum Nachweis phagenspezifischer
Proteine und interner Proteine oder anderer Peptide können Antikörper verwendet
werden. Zu diesen gehören
beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, polyklonale oder
monoklonale, gegen spezifische Proteine gerichtete Antikörper, wie
zum Beispiel das Hauptcapsidprotein (major capsid protein). Zum
Nachweis von von den Helferzellen freigesetzten Enzymen über die Produktion
von Farbe, Lumineszenz oder Fluoreszenz können Enzymsubstrate verwendet
werden. Zur Unterstützung
des Wachstums von Bakterien, einschließlich der Helferbakterienzellen,
können
Nährstoffe
zugegeben werden. Dazu gehören
beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Hefeextrakte,
anorganische Salze, Mikronährstoffe
sowie andere Wachstumsmedien oder deren Bestandteile. Zur Hilfe
bei der Sichtbarmachung von Plaques können Farbstoffe und Pigmente
zugegeben werden. Zur Hilfe beim Nachweis von Enzymreaktionen, bei
denen Wasserstoffionen verwendet oder produziert werden, können Indikationschemiereaktionen,
wie zum Beispiel pH-Indikationen,
zugegeben werden. Dazu gehören
beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Sulfonphthaleine,
wie zum Beispiel Phenolrot und Bromthymolblau.
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Die
zur Durchführung
dieses Tests verwendete Vorrichtung ist in besonderer Weise so konstruiert,
daß sie
die oben aufgeführten
Komponenten zur Durchführung
der PAA enthält.
Die Vorrichtung kann eine Reihe von Komponenten und/oder Kompartimenten
aufweisen, die die Trennung dieser Materialien (z.B. in flüssigkeitsdichten
Kompartimenten) und gewünschtenfalls
deren Mischung zur Durchführung
eines Tests gestatten. Eine Vorrichtung, die sich gemäß der vorliegenden
Erfindung verwenden läßt, ist
beispielsweise in den US-Patenten Nrn. 5,067,051 (Ladyjensky), 3,290,017
(Davies) und 5,508,893 (Nowak) offenbart.
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Die
Komponenten der Vorrichtung werden durch das Einsetzen drehbarer
Verschlüsse
(z.B. Ventile) in Kompartimente eingeteilt. Mit Bezug auf 1 weist
eine Vorrichtung 10 wenigstens zwei durch einen Verschluß 16 getrennte
Kammern 12 und 14 auf, was die Kommunikation zwischen
den beiden Kammern (vorzugsweise fluidische Kommunikation) nach
Aktivierung des Verschlusses gestattet. Die Aktivierung erfolgt durch Drehen
(z.B. Schrägstellen)
des Verschlusses (daher: drehbarer Verschluß). Insbesondere wird bei der Aktivierung
des Verschlusses dieser derart gedreht (z.B. nach Anlegen eines
Drucks um ungefähr
90° gedreht),
daß der
Verschluß unbeschädigt bleibt.
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Der
Körper
beziehungsweise die Wände
der Vorrichtung lassen sich aus verschiedenartigen Materialien,
insbesondere einem organischen Polymermaterial (z.B. Polypropylen,
Polyethylen, Polybutyrat, Polyvinylchlorid und Polyurethan), herstellen,
die keine nachteilige Reaktion mit den in den Kompartimenten der
Vorrichtung vorhandenen Reagentien eingehen. Die Vorrichtung besteht
vorzugsweise aus einem flexiblen Material, das durchsichtig, durchscheinend
und undurchsichtig sein kann. Die Verschlüsse können aus verschiedenartigen
Materialien, insbesondere einem organischen Polymermaterial (z.B.
Silicon, Gummi, Polyurethan, Polyvinylchlorid) hergestellt werden,
die keine nachteilige Reaktion mit den in den Kompartimenten der
Vorrichtung vorhandenen Reagentien eingehen. Die Verschlüsse können in
Form von Membranen, Scheiben, Ventilen usw. vorliegen. Sie bestehen
typischerweise aus einem festeren Material als dem, das den Körper der Vorrichtung
bildet. Sie lassen sich im Körper
der Vorrichtung mit verschiedenartigen Techniken, einschließlich chemischer
oder mechanischer Techniken (z.B. Ultraschallschweißen oder
Preßpassung),
verankern. Der Körper
der Vorrichtung kann gegebenenfalls Enden aufweisen, die gegebenenfalls
mit einem Verschluß oder
einer Kappe versehen sein können.
Solche Endkappen können
als Teil des Vorrichtungskörpers
oder getrennt davon vorliegen. So läßt sich beispielsweise eine
Kappe verwenden, die aus dem gleichen Material wie das des Körpers oder
aus einem davon verschiedenen Material besteht.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
weist die Vorrichtung wenigstens drei Kammern auf, wobei wenigstens
zwei davon durch einen sich nach Aktivierung drehenden Verschluß getrennt
sind. Wenigstens eine dieser Kammern weist ein oder mehrere biologische
Testreagentien zum Nachweis eines Mikroorganismus auf. Bei dem Testreagens
kann es sich um eine flüssige
Substanz oder eine feste Substanz, wie zum Beispiel ein Pulver,
handeln. In den erfindungsgemäßen Vorrichtungen
lassen sich verschiedene Kombinationen der biologischen Testreagentien
einsetzen. So kann beispielsweise in jeder Kammer ein Gemisch aus
Testreagentien verwendet werden.
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Weiterhin
weist mit Bezug auf 1 eine Vorrichtung wenigstens
drei durch die Verschlüsse 16 und 20 getrennte
Kammern 12, 14 und 18 auf, wodurch die
Kommunikation zwischen benachbarten Kammern gestattet ist. In wenigstens
einer Ausführungsform
weisen die Komponenten Bakteriophagen, eine antivirale Lösung sowie
bakterielle Helferzellen in getrennten Kammern auf. Insbesondere
weist eine erste Kammer 12 Bakteriophagen, eine zweite
Kammer 14 ein antivirales Agens und eine dritte Kammer 18 bakterielle
Helferzellen auf. Wie in 1 gezeigt ist die zweite Kammer 14 vorzugsweise
zwischen der ersten und der dritten Kammer angeordnet. Die zweite
Kammer 14 läßt sich
in zwei Unterkammern 22 und 24 trennen, die jeweils ein
unterschiedliches antivirales Agens aufweisen können und voneinander durch
einen Verschluß 26 getrennt sind.
Die Komponenten können
durch Drehen des Verschlusses bzw. der Verschlüsse zusammengemischt werden,
was das Mischen der Komponenten in wenigstens zwei Kammern gestattet.
Das Mischen der Komponenten, beispielsweise der antiviralen Lösungen,
läßt sich
in dieser Vorrichtung leicht durchführen. Die antivirale Komponente
tötet Viren
ab, doch führt
vorzugsweise zu keiner Schädigung
der infizierten Zielbakterien.
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Bei
der Durchführung
der vorliegenden Erfindung, die auf ein Verfahren zum Nachweis von
Mikroorganismen ausgerichtet ist, werden die folgenden Schritte durchgeführt. Es
wird eine wie oben beschriebene Vorrichtung bereitgestellt. Die
Vorrichtung weist wenigstens zwei voneinander durch einen drehbaren
Verschluß getrennte
Kammern auf, wobei wenigstens eine Kammer ein biologisches Testreagens
aufweist. Insbesondere weist die Vorrichtung wenigstens drei durch
drehbare Verschlüsse
voneinander getrennte Kammern auf, wobei eine erste Kammer Bakteriophagen,
eine zweite Kammer ein antivirales Agens und eine dritte Kammer
bakterielle Helferzellen aufweist, wobei die zweite Kammer zwischen
der ersten und der dritten Kammer angeordnet ist. Eine Probe, von
der man vermutet, daß sie
Mikroorganismen aufweist, beispielsweise Zielbakterienzellen, wird
in die erste Kammer gegeben. Nötigenfalls
wird der Probe Zeit gegeben, mit einem in der ersten Kammer vorhandenen
biologischen Testreagens zu wechselwirken. So gibt man beispielsweise
Bakteriophagen genügend
Zeit, um Zielbakterienzellen zu infizieren. Als Alternative wird
der Verschluß zwischen
einer oder mehrerer der Kammern aktiviert, um den Kontakt zwischen
dem Reagens und der Probe zu gestatten. Weiterhin können für die gewünschte Kommunikation
zwischen Reagentien und Probe weitere Verschlüsse nacheinander aktiviert
werden. So wird beispielsweise der Verschluß zwischen der ersten und der
zweiten Kammer in der in 1 gezeigten bevorzugten Vorrichtung
gedreht, um den Kontakt zwischen dem antiviralen Agens und extrazellulären Bakteriophagen
(d.h. Bakteriophagen, die keinen Mikroorganismus in der Probe infiziert
haben) zu gestatten. Anschließend
wird der Verschluß zwischen
der zweiten und der dritten Kammer gedreht, um den Kontakt zwischen
den bakteriellen Helferzellen und den infizierten Zielbakterienzellen
zu gestatten. Nötigenfalls
lassen sich die bakteriellen Helferzellen und die infizierten Bakterienzellen
hinreichend lange inkubieren, so daß die Bakteriophagen amplifiziert
werden und/oder ein bakteriophagenabhängiges Signal erzeugt wird
(z.B. Lumineszenz).
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Danach
kann das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Zielmikroorganismus
in der Probe nachgewiesen werden. Der Nachweis kann Trübungsänderungen,
Plaquebildung ebenso wie Farb-, Lumineszenz- oder Fluoreszenzbildung
unter Verwendung von Standardtechniken und -geräten beinhalten.
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Zum
Nachweis von Bakterien können
erfindungsgemäß auch andere
Verfahren als ein Nachweisverfahren auf Phagenbasis verwendet werden.
So läßt sich
beispielsweise eine temperaturstabile Nuklease in einem Bakterium,
wie zum Beispiel koagulasepositivem Staphylococcus, unter Verwendung
einer Vorrichtung nachweisen, die ein biologisches Testreagens,
wie zum Beispiel Wachstumsmedien, in einer ersten Kammer, in die
eine Probe, von der man vermutet, daß sie die Zielbakterien enthält, zur
Inkubation und Lyse eingebracht wird, und ein zweites biologisches
Testreagens, wie zum Beispiel einen Indikatorfarbstoff, in einer
benachbarten zweiten Kammer aufweist. Als weiteres Beispiel läßt sich
ein Protein, wie zum Beispiel Galctosidase aus coliformen Bakterien,
unter Verwendung einer Vorrichtung nachweisen, die Wachstumsmedien
in einer ersten Kammer, in die eine Probe, von der man vermutet,
daß sie
die Zielbakterien enthält,
zur Inkubation eingebracht wird, ein galactosidaseinduzierendes
Agens in einer benachbarten zweiten Kammer, sowie ein Enzymsubstrat in
einer benachbarten dritten Kammer zum Nachweis aufweist.
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Zum
Nachweis von von Bakterien verschiedenen Mikroorganismen lassen
sich verschiedene bekannte Verfahren für die Verwendung in den Vorrichtungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung anpassen. So läßt sich
beispielsweise Hefe dadurch nachweisen, daß man ein Probe, von der vermutet
wird, daß sie
Hefe enthält,
in eine Vorrichtung, die eine erste Kammer enthält, die Wachstumsmedien für Hefe sowie
Antibiotika zur Abtötung eventuell
in der Probe vorhandener Bakterien aufweist, und danach in eine
zweite Kammer, die ein Substrat zum Nachweis von alkalischer Phosphotase
enthält,
einbringt.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele werden als Hilfe zum Verständnis der vorliegenden Erfindung
bereitgestellt und sollen nicht als Beschränkung des Umfangs davon verstanden
werden. Falls nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozentangaben
gewichtsbezogen.
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Beispiel 1
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Phagenamplifikationsvorrichtung
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Aus
einer zylinderförmigen
biegsamen Plastikröhre
(aus Polypropylen) wurde eine Vorrichtung konstruiert, die eine
Länge von
128 mm, einen äußeren Durchmesser
von 6,35 mm und eine Röhrenwanddicke von
0,5 mm aufwies (siehe 1). Zum Verschließen der
Vorrichtung sowohl am unteren Ende als auch am oberen Ende wurden
abnehmbare massive Plastikstopfen verwendet. Die Vorrichtung wurde
mittels drehbarer Ventile in Scheibenform aus Silikonkautschuk mit
einer Dicke von 1,9 mm und einem Durchmesser von 5,85 mm in vier
Kammern getrennt. Die Ventile waren zunächst in der Stellung „geschlossen" (senkrecht zur Röhrenwand
und dabei benachbarte Kammern voneinander abschließend), ließen sich
jedoch um etwa 90° in
eine Stellung „offen" (zur Verbindung
benachbarter Kammern) durch Verdrehen mit den Fingern und Manipulation der
Außenfläche der
Vorrichtung drehen. Die vier Kammern der Vorrichtung umfaßten Kammer 12 (618
mm3) am oberen Ende der Röhre, die
zu Kammer 12 benachbarte Kammer 22 (309 mm3) , die zu Kammer 22 benachbarte
Kammer 24 (538 mm3) sowie die Kammer 18 (1747
mm3) am unteren Ende der Röhre. Die
Kammern 22 und 24 wurden durch das Ventil 26,
die Kammern 12 und 22 durch das Ventil 16 und
die Kammern 24 und 18 durch das Ventil 20 getrennt.
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Beispiel 2
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Phagenamplifikationsvorrichtung
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Aus
einer zylinderförmigen
biegsamen Plastikröhre
(aus Polypropylen) wurde eine zweite Vorrichtung konstruiert, die
eine Länge
von 128 mm, einen äußeren Durchmesser
von 8,4 mm und eine Röhrenwanddicke von
0,5 mm aufwies (siehe 1). Zum Verschließen der
Vorrichtung sowohl am unteren Ende als auch am oberen Ende wurden
abnehmbare massive Plastikstopfen verwendet. Die Vorrichtung wurde
mittels drehbarer Ventile in Scheibenform aus thermoplastischen
SANTOPRENE-KautschukTM mit einer Dicke von
1,5 mm und einem Durchmesser von 7,9 mm in vier Kammern getrennt.
Die Ventile waren zunächst
in der Stellung „geschlossen" (senkrecht zur Röhrenwand
und dabei benachbarte Kammern voneinander abschließend), ließen sich
jedoch um etwa 90° in
eine Stellung „offen" (zur Verbindung
benachbarter Kammern) durch Verdrehen mit den Fingern und Manipulation
der Außenfläche der
Vorrichtung drehen. Die vier Kammern der Vorrichtung umfaßten Kammer 12 (1471
mm3) am oberen Ende der Röhre, die
zu Kammer 12 benachbarte Kammer 22 (588 mm3), die zu Kammer 22 benachbarte
Kammer 24 (686 mm3) sowie die Kammer 18 (2549
mm3) am unteren Ende der Röhre. Die
Kammern 12 und 22 wurden durch das Ventil 16,
die Kammern 22 und 24 durch das Ventil 26 und
die Kammern 24 und 18 durch das Ventil 20 getrennt.
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Beispiel 3
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Nachweis und
Zählen
von Bakterien
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Zur
Verwendung beim Nachweis und Zählen
von Bakterien in einer Probe wurde eine Vorrichtung zur Phagenamplifikation
(PAD) wie in Beispiel 1 beschrieben konstruiert. Allerdings wurde
während
der Konstruktion eine als antivirale Komponente dienende 4,8 mM
Lösung (0,5
ml) von Eisensulfat (Produkt Nr. 2070-01, J. T. Baker, Phillipsburg,
NJ, USA) in entionisiertem Wasser in Kammer 24 und eine
als antivirale Komponente dienende 13%ige wäßrige Lösung (0,25 ml) von Granatapfelschalenextrakt
(Pomegranate Rind Extract, PRE) (hergestellt wie in der Internationalen
Veröffentlichung
Nr. WO 95/22,254 (Stewart et al.)) in die Kammer 22 gegeben.
Nach der Konstruktion wurde ein als Bakterien-„Helferzellen" dienendes Pellet
von lyophilisierten E. coli-Bakterien ATCC 13706 (ungefähr 1 × 108 cfu/ml) in die Kammer 18 gegeben.
Die Kammer 12 wurde zur Aufnahme der Testprobe leer gelassen,
und alle Ventile wurden zu Anfang auf die Stellung „geschlossen" gestellt.
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Eine Übernachtkultur
von E. coli ATCC 13706 mit 1 × 108 cfu/ml wurde schrittweise in Lambda-Puffer (hergestellt
wie in Beispiel 4 des US-Patents Nr. 5,498,525 (Rees et al.)) zehnfach
verdünnt
und danach in die Kammer 12 eingebracht, so daß die Kammer
ungefähr
0,1 ml Kulturlösung
enthielt. Zu dieser Probe wurden 10 μl einer Suspension des Bakteriophagen
[φX 174
(ATCC 13706-B1)] in Nutrient Broth (Produkt-Nr. 4311479, BBL, Cockysville,
MD, USA) mit 1 × 1011 pfu/ml gegeben. Man ließ den Bakteriophagen
10 Minuten bei 37°C in
einem Inkubator an die Bakterien adsorbieren. Danach wurde das Ventil 26 geöffnet, und
man ließ die
antiviralen Komponenten der Kammer 22 und 24 2
Minuten bei 23°C
mischen. Nichtadsorbierte Bakteriophagen wurden dann durch Öffnen von
Ventil 16 inaktiviert, wobei man die antivirale Lösung sich
5 Minuten bei 23°C mit
dem Inhalt der Kammer 12 mischen ließ. Die erhaltene Lösung wurde
dann durch Öffnen
des Ventils 20 neutralisiert, wobei die Lösung mit
dem Bakterienpellet in der Kammer 18 5 Minuten bei 23°C zusammengebracht
wurde. Die Endlösung
in der Vorrichtung wurde in ein steriles Plastikröhrchen mit
Schraubverschluß (16 mm × 100 mm),
das 2,5 ml Top-Agar (Standard-Nutrient Broth-Top-Agarmedien für Agar-Überschichtungsverfahren) enthielt, der
bei 42°C
in geschmolzenen Zustand gehalten wurde, überführt. Die Top-Agar-Lösung wurde
auf eine Boden-Agar-Platte
(Standard Nutrient Agar) gegossen und 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Anzahl der Plaques wurde nach 6 Stunden und 24 Stunden gezählt, und
die Ergebnisse für
die Reihe von 8 Verdünnungen
(10–3 bis
10–10)
sind in Tabelle 1 angegeben.
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Eine
negative Kontrollprobe (C-1) wurde auf die gleiche Weise wie oben
beschrieben gefahren, mit der Ausnahme, daß zu der ursprünglichen
Lambda-Puffer-Probe keine E. coli-Bakterien gegeben wurden, um die Wirksamkeit
der Bakteriophagenabtötung
durch die antiviralen Komponenten zu demonstrieren. Eine positive Kontrollprobe
(C-2) wurde auf die gleiche Weise wie oben beschrieben (10–3-Verdünnung) gefahren,
mit der Ausnahme, daß keine
antiviralen Komponenten verwendet wurden. Darüber hinaus wurden die schrittweise verdünnten Proben
der E. coli-Kultur jeweils auf Standard-PETRIFILMTM E.
C.-Platten (3M Company, St. Paul, MN, USA) ausplattiert und gemäß den Anweisungen
des Herstellers inkubiert (24 Stunden bei 37°C). Die Ergebnisse von den Kontrollproben
und von den PETRIFILMTM-Platten-Tests sind
ebenso in Tabelle 1 angegeben.
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Die
Daten der Tabelle 1 zeigen, daß die
Ergebnisse (Verringerung der pfu nach 6 Stunden und 24 Stunden)
bei Verwendung der Vorrichtung aus Beispiel 1 sehr gut mit den von
den Standard-PETRIFILMTM-Platten-Tests erhaltenen
Ergebnissen (Verringerung der cfu nach 24 Stunden) korrelieren.
Dabei wurde festgestellt, daß cfu
auf den PETRIFILMTM-Platten-Tests erst nach
etwa 12 Stunden beobachtet wurden.
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Beispiel 4
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Nachweis und
Zählen
von Bakterien
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Eine
Vorrichtung zur Phagenamplifikation (PAD), wie sie in Beispiel 2
beschrieben ist, wurde mit Reagentien wie in Beispiel 3 beschrieben
gefüllt
und danach zum Nachweis und Zählen
von E. coli-Bakterien wie in Beispiel 3 beschrieben eingesetzt.
Die Anzahl an pfu („PAD-Verfahren") und die Anzahl
an cfu („PETRIFILMTM- Platten-Verfahren") wurden gezählt, und
die Ergebnisse für
die Reihe von 8 Verdünnungen
(10–3 bis 10–1)
sind in Tabelle 2 angegeben.
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Die
Daten der Tabelle 2 zeigen, daß die
Ergebnisse (Verringerung der pfu nach 6 Stunden und 24 Stunden)
bei Verwendung der Vorrichtung aus Beispiel 2 sehr gut mit den von
den Standard-PETRIFILMTM-Platten-Tests erhaltenen
Ergebnissen (Verringerung der cfu nach 24 Stunden) korrelieren.
Dabei wurde festgestellt, daß cfu
auf den PETRIFILMTM-Platten-Tests erst nach
etwa 12 Stunden beobachtet wurden.
