DE60018616T2

DE60018616T2 - Digital Amplification

Info

Publication number: DE60018616T2
Application number: DE60018616T
Authority: DE
Inventors: W. Kenneth KINZLER; Bert Vogelstein
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2020-08-01
Also published as: US6753147B2; CA2376929C; US20080241830A1; US7915015B2; EP1255856A2; EP1255856B1; US20100209921A1; CA2756673C; WO2001009386A2; DE60018616D1; AU6502800A; AU781440B2; US9970058B2; US20020090629A1; CA2756673A1; US20180327858A1; JP4653366B2; JP2003511009A; US20050130176A1; CA2756675C

Description

Diese Erfindung betrifft diagnostische Genanalysen. Sie betrifft insbesondere das Bestimmen von genetischen Änderungen und die Genexpression.
Ausschließlich Mutationen der Keimlingslinie wurden in der klassischen Genetik für das Krankheitsverständnis als wichtig betrachtet. Durch die Erkenntnis, dass somatische Mutationen die Hauptursache von Krebs (1) darstellen und ebenso eine Rolle beim Altern spielen können, sind neu genetische Prinzipien entstanden. Diese Entdeckungen haben eine Fülle an neuen Möglichkeiten für die Behandlung von Patienten sowie für die Grundlagenforschung bei der Pathogenese von Neoplasie bereitgestellt. Viele von diesen Möglichkeiten hängen allerdings von dem Bestimmen einer kleinen Anzahl von Mutanten-enthaltenden Zellen in einem großen Überschuss von gewöhnlichen Zellen ab. Beispiele beinhalten das Bestimmen von neoplastischen Zellen in Urin (4), Stuhl (5,6) und Sputum (7,8) von Patienten mit jeweils Blasen-, Kolonrektum- und Lungenkrebs. In einigen Fällen wurde ein derartiges Bestimmen bei einem Zustand als möglich gezeigt, bei dem die Primärtumoren immer noch heilbar und die Patienten asymptomatisch sind. Mutantensequenzen der DNA von neoplastischen Zellen wurden ebenso in dem Blut von Krebspatienten (9–11) gefunden. Das Bestimmen einer verbleibenden Krankheit in Lymphknoten oder chirurgischen Margen kann bei einer Vorhersage von Nutzen sein, welche Patienten am ehesten von einer weiteren Therapie (12–14) Nutzen ziehen könnten. Eine Analyse der frühen Auswirkungen von Karzinogen hängt, von einem Standpunkt der Grundlagenforschung aus, häufig von der Möglichkeit ab kleine Populationen von Mutantenzellen (15–17) zu bestimmen.
Aufgrund der Wichtigkeit dieser Angelegenheit bei derartig vielen Situationen, wurden viele nützliche Verfahren zum Bestimmen von Mutationen entwickelt. Die DNA Sequenzierung stellt den Standard der Wahl für das Bestimmen von Keimlingslinienmutationen dar, ist allerdings nur von Nutzen, wenn der Anteil an mutierten Allelen mehr als ~20% (18,19) beträgt. Mutantenspezifische Oligonukleotide können manchmal zum Bestimmen von Mutationen verwendet werden, die in einem kleineren Anteil der analysierten Zellen vorliegen, wobei das Signal-Rausch Verhältnis, das Mutanten und Wildtyptemplat unterscheidet, allerdings variabel (20–22) ist. Das Verwenden von Mutanten-spezifischen Primern oder der Verdau von Produkten der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit spezifischen Restriktionsendonukleasen stellen äußerst empfindliche Verfahren für ein Bestimmen derartiger Mutationen dar, wobei es allerdings schwierig ist mit diesen Verfahren (23–28) den Anteil an Mutantenmolekülen in der Start-Population zu quantifizieren. Andere innovative Ansätze zum Bestimmen von somatischen Mutationen wurden rezensiert (23–28). Eine Hauptschwierigkeit mit diesen Verfahren besteht darin, das es schwierig oder unmöglich ist, das Vorhandensein von irgendwelchen Mutation, die identifiziert wurden, unabhängig zu bestätigen.
Daher besteht im Stand der Technik ein Bedarf an Verfahren zum genauen und quantitativen Bestimmen von Gensequenzen in gemischten Populationen von Sequenzen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in dem Bereitstellen von Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit einer ausgewählten Gensequenz in einer Population von Gensequenzen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von molekularen Signalsonden, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von Nutzen sind.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden durch das Bereitstellen eines Verfahrens zum Bestimmen der Anwesenheit einer ausgewählten Gensequenz in einer Population von Gensequenzen gelöst. Eine Nukleinsäuremoleküle umfassende biologische Probe wird zur Bildung eines Satzes von Assayproben verdünnt. Die Templatmoleküle ein den Assayproben werden zur Bildung einer Population von amplifizierten Molekülen in den Assayproben des Satzes amplifiziert. Die amplifizierten Moleküle in den Assayproben des Satzes werden dann zum Bestimmen einer ersten Anzahl von Assayproben, die die ausgewählte Gensequenz enthalten, und einer zweiten Anzahl von Assayproben analysiert, die eine Referenz-Gensequenz enthalten. Die erste Anzahle wird dann mit der zweiten Anzahl verglichen, um ein Verhältnis zu ermitteln, das die Zusammensetzung der biologischen Probe widerspiegelt.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen des Verhältnisses einer ausgewählten Gensequenz in einer Population von Gensequenzen dar. Templatmoleküle in einem mehrere Assayproben umfassenden Satz werden zur Bildung einer Population von amplifizierten Molekülen in jeder der Assayproben des Satzes amplifiziert. Die amplifizierten Moleküle in den Assayproben des Satzes werden zum Bestimmen einer ersten Anzahl von Assayproben a, die die ausgewählte Gensequenz enthalten, und einer zweiten Anzahl von Assayproben analysiert, die eine Referenz-Gensequenz enthalten. Die erste Anzahl wird mit der zweiten Anzahl verglichen, um ein Verhältnis zu ermitteln, das die Zusammensetzung der biologischen Probe widerspiegelt.
Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine molekulare Signalsonde bereitgestellt. Sie umfasst ein Oligonukleotid mit einer Stamm-Schleifen Struktur mit einem fluoreszierenden Farbstoff an einem der 5' oder 3' Enden und einem Quenchagens an dem entgegengesetzten 5' oder 3' Ende. Die Schleife besteht aus 16 Basenpaaren und weist eine T_m von 50–51°C auf. Der Stamm besteht aus 4 Basenpaaren mit einer Sequenz 5'-CACG-3'.
Ein zweiter Typ einer molekularen Signalsonde wird in einer anderen Ausführungsform bereitgestellt. Sie umfasst ein Oligonukleotid mit einer Stamm-Schleifen Struktur mit einem fluoreszierenden Farbstoff an einem der 5' oder 3' Enden und einem Quenchagens an dem entgegengesetzten 5' oder 3' Ende. Die Schleife besteht aus 19–20 Basenpaaren und weist eine T_m von 54–56°C auf. Der Stamm besteht aus 4 Basenpaaren mit einer Sequenz 5'-CACG-3'.
Eine andere Ausführungsform stellt die zwei Typen von molekularen Signalsonden entweder zusammengemischt bereit oder in einem unterteilten Behälter, wie einem Kit, bereit. Die Erfindung stellt daher die Technik mit dem Mittel bereit, um quantitative Abschätzungen von bestimmten DNA oder RNA Sequenzen in gemischten Populationen von Sequenzen unter Verwendung von digitalen (binären Signalen) zu erzielen.
1. Schema einer experimentellen Zeichnung. (A) Die grundlegenden zwei Schritte sind einbezogen: Eine PCR auf verdünnte DNA Proben wird gefolgt von einer Zugabe von fluoreszierenden Sonden, die zwischen WT und Mutanten Allelen unterscheiden, und nachfolgender Fluorimetrie. (B) Prinzip der molekularen Signalanalyse. In der Stamm-Schleifen Konfiguration wird eine Fluoreszenz eines Farbstoffes at dem 5' Ende der Oligonukleotidsonde durch eine Dabcylgruppe am 3' Ende gequencht. Der Farbstoff wird bei einer Hybridisierung an ein Template von dem Quencher getrennt, was zu einer verstärkten Fluoreszenz führt. Modifiziert von Marras et al.. (C) Oligonukleotid Gestaltung. Die Primer F1 und R1 werden zur Amplifikation des Genombereichs von Interesse verwendet. Der Primer INT wird zur Erzeugung einzelsträngiger DNA aus den wsprünglichen PCR Produkten während eines nachfolgenden asymmetrischen PCR Schrittes (siehe Material und Methoden) verwendet. MB-RED ist ein molekulares Signal, das ein geeignetes PCR Produkt, ob es WT oder Mutante an den in Frage gestellten Codons ist, nachweist. MB-GREEN ist ein molekulares Signal, das vorzugsweise das WT PCR Produkt nachweist.
2. Unterscheidung zwischen WT und Mutanten PCR Produkten durch molekulare Signale. Zehn einzelne PCR Produkte, die jeweils aus ~50 Genomäquivalenten von DNA von die angezeigten Mutationen von c-Ki-Ras enthaltenden Zellen erzeugt wurden, wurden mit den in dem Text beschriebenen molekularen Signalsonden analysiert. Repräsentative Beispiele der zur molekularen Signalanalyse verwendeten PCR Produkte wurden gereinigt und unmittelbar sequenziert. In den Fällen mit Gly12Cys und Gly12Arg Mutationen, die nicht-neoplastische Zellen in dem Tumor kontaminieren, werden als wahrscheinlich für die vergleichsweise geringen Verhältnisse angesehen. In den Fällen mit Gly12Ser und Gly12Asp lagen offensichtlich zwei oder mehr Allele des Mutanten c-Ki-Ras für jedes WT Allel vor; wobei beide diese Tumore aneuploid waren.
3. Nachweisen von Dig-PCR Produkten mit MB-RED. Spezifische Fluoreszenzeinheiten von repräsentativen Vertiefungen (wells) eines Experiments, das Kolon-Rektale Krebszellen mit Gly12Asp oder Gly13Asp Mutationen des c-Ki-Ras Gens einsetzt. Vertiefungen mit Werten >10.000 sind gelb schattiert. Polyacrylamid Gel Elektrophoresanalyse der PCR Produkte von ausgewählten Vertiefungen werden gezeigt. Vertiefungen mit Fluoreszenzwerten <3500 wiesen kein PCR Produkt der korrekten Größe auf, wohingegen Vertiefungen mit Fluoreszenz werten >10.000 SFU immer PCR Produkte von 129 bp enthielten. Nicht-spezifische Produkte, die während der großen Anzahl von für die Dig-PCR benötigten Zyklen erzeugt wurden, hatten keinen Einfluss auf die Fluoreszenzanalyse. M1 und M2 sind molekulare Gewichtsmarker, die zur Größenbestimmung der links (in Basenpaaren) angezeigten Fragmente verwendet werden.
4. Unterscheidung von WT von Mutanten PCR Produkten, die in der Dig-PCR erhalten werden. RED/GREEN Verhältnisse wurden aus der Fluoreszenz von MB-RED und MB-GREEN, wie in Material und Methoden beschrieben, bestimmt. Die gezeigten Vertiefungen sind die gleichen wie jene, die in 3 gezeigt werden. Die Sequenzen der PCR Produkte der gezeigten Vertiefungen wurden, wie in Material und Methoden beschrieben, bestimmt. Die Vertiefungen mit RED/GREEN Verhältnissen >3,0 enthielten jeweils Mutanten Sequenzen, wohingegen jene mit RED/GREEN Verhältnissen von ~1,0 WT Sequenzen enthielten.
5. Dig-PCR von DNA einer Stuhlprobe. Die in dem Versuch verwendeten 384 Vertiefungen sind angezeigt. Die blau gefärbten enthielten 25 Genomäquivalente von DNA von gewöhnlichen Zellen. Jedes den diesen wird mit MB-RED und den RED/GREEN Verhältnissen positiv aufgeführten betrugen 1,0 +/– 0,1 (durchschnittliche +/– 1 Standardabweichung). Die gelb gefärbten Vertiefungen enthielten keine Templat-DNA und jedes war mit MB-RED (d.h. Fluoreszenz <3500 Fluoreszenzeinheiten) negativ. Die anderen 288 Vertiefungen enthielten verdünnte DNA aus der Stuhlprobe, die durch eine alkalische Extraktion erstellt wird. (Rubeck et al., 1998, BioTechniques 25:588–592.) Die mit MB-RED als positiv aufgeführten wurden entweder rot oder grün in Abhängigkeit von deren RED/GREEN Verhältnissen gefärbt. PCR Produkte der angezeigten Vertiefungen wurden für eine automatisierte Sequenzanalyse verwendet.
Das von den vorliegenden Erfindern erdachte Verfahren schließt ein einzelnes Amplifizieren kleiner Anzahlen von Templatmolekülen derart ein, dass die sich ergebenden Produkte einen Anteil der Analytsequenz aufweisen, der durch die gewählten Nachweismittel nachgewiesen werden kann. Die Homogenizität dieser Amplifikationsprodukte macht sie zur Unterscheidung durch bestehende Verfahren einfach.
Das Verfahren benötigt ein einfaches und zuverlässiges Analysieren einer großen Anzahl von amplifizierten Produkten. Verfahren für derartige Abschätzungen wurden entwickelt, wobei die Ausgabe eine digitale Ausgabe des Anteils von Mutantenallelen in der analysierten Population bereitstellt.
Die biologische Probe wird bis zu einem Punkt verdünnt, bei dem eine praktisch verwendbare Anzahl der verdünnten Proben einen Anteil der ausgewählten Gensequenz (Analyt) relativ zu den gesamten Templatmolekülen derart enthält, dass das verwendete Analyseverfahren den Analyten nachweisen kann. Eine praktisch verwendbare Anzahl von verdünnten Proben häng von dem Aufwand des Analyseverfahrens ab. Es würde für gewöhnlich wünschenswert sein, dass mindestens 1/50 der verdünnten Proben einen nachweisbaren Anteil des Analyten aufweisen.
Mindestens 1/10, 1/5, 3/10, 2/5, 1/2, 3/5, 7/10, 4/5 oder 9/10 der verdünnten Proben können einen nachweisbaren Anteil des Analyten aufweisen. Je höher der Anteil der Proben, die nützliche Informationen bereitstellen, desto wirtschaftlicher wird der gesamte Assay ausfallen. Eine Über-Verdünnung wird ebenso zu einem Verlust an Wirtschaftlichkeit führen, indem viele Proben analysiert werden und kein Signal bereitstellen. Ein besonders bevorzugter Verdünnungsgrad ist bis zu einem Punkt, an dem jede der Assayproben durchschnittlich ein halbes Templat aufweist. Die Verdünnung kann von mehreren konzentrierten Proben durchgeführt werden. Alle Proben können amplifizierbare Templatmoleküle enthalten. Jede Assayprobe wird wünschenswerterweise vor einer Amplifikation weniger als einhundert oder weniger als zehn Templatmoleküle enthalten.
Digitale Amplifikation kann zum Nachweis von Mutationen verwendet werden, die bei relativ geringen Graden in den zu analysierenden Proben vorliegen. Die Nachweisgrenze wird durch Anzahl von Vertiefungen, die analysiert werden können, und der intrinsischen Mutationsrate der zur Amplifikation verwendeten Polymerase festgelegt. PCR Platten mit 384 Vertiefungen sind im Handel verfügbar und Platten mit 1536 Vertiefungen zeichnen sich ab und ermöglichen theoretisch Sensitivitäten zum Mutationsnachweis bei dem 0,1 % Grad. Es ist ebenso möglich, das eine digitale Amplifikation im Mikroarray Format durchgeführt werden kann, was die Sensitivität möglicherweise durch eine weitere Größenordnung erhöht. Diese Sensitivität kann letztendlich durch Polymerasefehler begrenzt werden. Die effektive Fehlerrate bei der PCR wie unter unseren Bedingungen durchgeführt betrug <0,3%, d.h. dass in Kontrollversuchen mit DNA aus gewöhnlichen Zellen keine von PCR Produkten enthaltenden 340 Vertiefungen RED/GREEN Verhältnisse von >3,0 aufwies. Irgendeine einzelne Mutation (wie eine G- nach C-Transversion an der zweiten Position des Codons 12 von c-Ki-Ras) wird erwartet in <1 aus 50 Polymerase-erzeugten Mutanten (es liegen mindestens 50 Basensubstitutionen in Codon 12 und 13 oder umgebend vor, was zu hohen RED/GREEN Verhältnissen führen sollte) aufzutreten. Ein Bestimmen der Sequenz der wahrscheinlichen Mutanten in den positiven Vertiefungen durch wie hier durchgeführtes unmittelbares Sequenzieren oder durch irgendeines der anderen Verfahren stellt eine eindeutige Validierung einer voraussichtlichen Mutation bereit: ein signifikanter Anteil der in einzelnen Vertiefungen gefundenen Mutationen sollte identisch sein, wenn die Mutationen in vivo auftreten. Eine Signifikanz kann durch strenge statistische Analyse ermittelt werden, indem positive Signale gemäß Poisson Wahrscheinlichkeiten verteilt sein sollten. Die Fehlerrate in bestimmten digitalen Amplifikationsversuchen kann darüber hinaus durch ein Ausführen einer digitalen Amplifikation auf DNA Template von gewöhnlichen Zellen genau bestimmt werden.
Digitale Amplifikation kann ebenso einfach auf aus RNA Templaten erzeugte RT-PCR Produkte als auch auf genomische DNA angewendet werden. Der Anteil an wahlweise gespleisten oder Mutanten Transkripten eines Gens kann unter Verwendung photolumineszierender Sonden einfach bestimmt werden, die für jedes der erzeugten PCR Produkte spezifisch sind. Digitale Amplifikation kann ähnlich dazu verwendet werden, um relative Grade einer Genexpression in einer RNA Population zu quantifizieren. Für diese Amplifikation würde jede Vertiefung Primer enthalten, die zur Amplifikation eines konstitutiv exprimierten Referenz-Transkripts, gleichfalls als für das Versuchstranskript spezifischen Primer verwendet werden. Eine photolumineszierende Sonde würde dann zum Nachweis von PCR Produkten von dem Referenz-Transkript und eine zweite photolumineszierende Sonde würde für das Testtranskript verwendet werden. Die Anzahl an Vertiefungen, in denen das Testtranskript amplifiziert ist, geteilt durch die Anzahl an Vertiefungen, in denen das Referenz-Transkript amplifiziert ist, stellt ein quantitatives Maß der Genexpression dar. Eine andere Gruppe von Beispielen beinhaltet die Untersuchungen des allelischen Status, wenn zwei Mutationen bei der Sequenzanalyse einer gewöhnlichen DNA Probe beobachtet werden. Zur Unterscheidung, ob eine Variante in jedem Allel (gegenüber beide in einem Allel auftretend) vorliegt, wird im Allgemeinen eine Klonierung der PCR Produkte durchgeführt. Der hier beschriebene Ansatz würde durch Beseitigung der Notwendigkeit einer Klonierung die Analyse vereinfachen. Andere mögliche Anwendungen der digitalen Amplifikation sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Wenn das Ziel in der Quantifizierung des Anteils der zwei relativ allgemeinen Allele oder Transkripte eher als in der Bestimmung seltener Allele liegt, stellen Verfahren wie jene, die TaqMan und Echtzeit PCR verwenden, eine ausgezeichnete Alternative zur Verwendung von molekularen Signalen bereit. Vorteile der Echtzeit PCR Verfahren beinhalten deren Einfachheit und die Möglichkeit viele Proben gleichzeitig zu analysieren. Die digitale Amplifikation kann sich allerdings für jene Anwendungen als nützlich erweisen bei denen die erwarteten Unterschiede gering ausfallen (beispielsweise nur ~2-fach, wie es bei allelischen Ungleichgewichten (55) auftritt).
Die letztendliche Anwendung der digitalen Amplifikation beruht in ihrer Möglichkeit die intrinsisch exponentielle Natur der PCR auf einen lineare umzuwandeln. Sie sollte sich daher für Versuche nützlich erweisen, die das Untersuchen von einzelnen Allelen, seltenen Varianten/Mutationen, oder einer quantitativen Analyse von PCR Produkten erfordern.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist jede verdünnte Probe durchschnittlich ein halbes Templat-Molekül auf. Dies entspricht einer Hälfte der verdünnten Proben, die ein Templat-Molekül aufweisen. Dies kann durch Amplifikation empirisch bestimmt werden. Entweder der Analyt (ausgewählte Gensequenz) oder die Referenz-Gensequenz können für diese Bestimmung ausgewählt werden. Sofern das verwendete Analyseverfahren Analyt, der in einem Grad von 20% vorliegt, nachweisen kann, dann muss so verdünnt werden, dass eine bedeutende Anzahl der verdünnten Assayproben mehr als 20% Analyt enthalten. Falls das verwendete Analyseverfahren 100% Analyt zum Nachweis benötigt, dann wird eine Verdünnung bis zu dem einzelnen Templat-Molekül-Grad notwendig sein.
Um eine Verdünnung bis zu ungefähr einem einzelnen Templat-Molekül-Grad zu erhalten, kann derartig verdünnt werden, dass zwischen 0,1 und 0,9 der Assayproben ein Amplifikationsprodukt ergeben. Die Verdünnung wird mehr bevorzugt bis zwischen 0,1 und 0,6 und mehr bevorzugt bis zwischen 0,3 und 0,5 der Assayproben durchgeführt, die ein Amplifikationsprodukt ergeben.
Das digitale Amplifikationsverfahren benötigt eine Analyse einer großen Anzahl von Proben, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Vorzugsweise werden mindestens zehn verdünnte Assayproben amplifiziert und analysiert. Mehr bevorzugt werden mindestens 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 500 oder 1000 verdünnte Assayproben amplifiziert und analysiert. Wie bei jedem Verfahren wird sich die Genauigkeit der Bestimmung mit einer steigenden Anzahl von Proben bis zu einem Punkt verbessern. Da eine große Anzahl von Assayproben analysiert werden muss, ist es wünschenswert die manipulativen Schritte, insbesondere Probenübertragungsschritte zu verringern. Daher ist es bevorzugt, dass die Schritte der Amplifikation und Analyse im gleichen Behälter durchgeführt werden. Dies macht das Verfahren zu einem in-situ oder "Ein-Topf' Verfahren.
Die Anzahl an verschiedenen Situationen, bei denen das digitale Amplifikationsverfahren eine Anwendung finden wird, ist groß. Einigen von diesen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Das Verfahren kann, wie in den Beispielen gezeigt, verwendet werden, um eine Tumormutation in einer Population von Zellen zu finden, die nicht bloß aus Tumorzellen besteht.
Eine Sonde für eine bestimmte Mutation muss nicht, wie in den Beispielen beschrieben, verwendet werden, wobei aber eine Verringerung eines Bindens an eine Wildtypsonde als ein Indikator für die Anwesenheit einer oder mehrerer Mutationen verwendet werden kann. Chromosomale Translokationen, die für Leukämie oder Lymphome kennzeichnend sind, können als ein Maß der Effizienz einer Therapie nachgewiesen werden. Genamplifikationen sind für bestimmte Krankheitszustände kennzeichnend. Diese können unter Verwendung digitaler Amplifikation gemessen werden. Gespleiste Formen eines Transkripts können alternativ relativ zu anderen Formen des Transkripts unter Verwendung digitaler Amplifikation von aus mRNA hergestellter cDNA nachgewiesen und quantifiziert werden. Ähnlich dazu, kann man unter Verwendung von aus mRNA hergestellter cDNA relative Grade einer Transkription von zwei verschiedenen Genen bestimmen. Man kann digitale Amplifikation zur Unterscheidung zwischen einer Situation verwenden, bei der ein Allel zwei Mutationen trägt und eine Mutation auf jedem der zwei Allele in einem Individuum getragen wird. Allelische Ungleichgewichte resultieren häufig aus einem Krankheitszustand. Diese können unter Verwendung digitaler Amplifikation nachgewiesen werden.
Biologische Proben, die als das Ausgangsmaterial für die Analyse verwendet werden können, können aus irgendeiner Gewebe- oder Körper-Probe bestehen, aus denen DNA oder mRNA isoliert werden kann. Bevorzugte Quellen beinhalten Stuhl, Blut und Lymphknoten. Die biologische Probe ist vorzugsweise ein zellfreies Lysat.
Molekulare Signalsonden gemäß der vorliegenden Erfindung können irgendeinen fluoreszierenden Rest als nachweisbaren Rest einsetzen. Für gewöhnlich sind diese Farbstoffe. Häufig sind diese fluoreszierende Farbstoffe. Photolumineszenz ist irgendein Verfahren, bei dem ein Material durch Strahlung wie Licht angeregt wird, zu einem angeregten elektronischen oder Schwingungs-Zustand angehoben wird und anschließend die Anregungsenergie als ein Photon oder Licht wieder-aussendet. Solche Prozesse beinhalten Fluoreszenz, die eine Emission bedeutet, die ein Absinken von einem angeregten Zustand mit gepaarten Elektronen (ein "Singlet" Zustand) oder ungepaarten Elektronen (ein "Triplet" Zustand zu einem niedrigeren Zustand mit der gleichen Multiplizität begleitet, d.h. ein quantenmechanisch "erlaubter" Übergang. Photolumineszenz beinhaltet ebenso Phosphoreszenz, die eine Emission bedeutet, die eine Absinken von einem angeregten Triplet oder Singlet Zustand zu einem niedrigeren Zustand verschiedener Multiplizität bedeutet, d.h. ein quantemechanisch "verbotener" Übergang. Im Vergleich zu "erlaubten" Übergängen hängen "verbotene" Übergänge mit vergleichsweise langen Lebenszeiten des angeregten Zustands zusammen.
Das Quenchen der Photolumineszenz kann mittels mehrerer Verfahren analysiert werden, die sich in erster Linie bezüglich Signalweitergabe unterscheiden. Ein Quenchen kann als Änderungen in der Intensität einer Photolumineszenz oder als Änderungen im Verhältnis von Photolumineszenz-Lebenszeiten oder sogar als Änderungen in der Polarsierung (Anisotropie) der Photolumineszenz weitergegeben werden. Der Fachmann wird erkennen, dass die Messtechnik zur Messung dieser verschiedenen photolumineszierenden Reaktionen bekannt ist. Die besonderen ratiometrischen bzw. radiometrischen (ratiometric) Verfahren zur Analyse des Quenchens in den folgenden Beispielen sollten nicht angesehen werden die Erfindung auf irgendeine bestimmte Form der Signalweitergabe zu begenzend. Ratiometrische Messungen der Photolumineszenz Intensität kann die Messung der Intensitätsänderungen, Photolumineszenz Lebenszeiten oder sogar Polarisierung (Anisotropie) beinhalten.
Obgleich die Arbeitsbeispiele die Verwendung von molekularen Signalsonden als das Mittel zur Analyse der amplifizierten verdünnten Proben zeigen, können gleichermaßen andere Techniken verwendet werden. Diese beinhalten Sequenzieren, Gelelektrophorese, Hybridisierung mit anderen Arten von Sonden, einschließlich TaqMan^TM (doppelt-markierte fluoreszierende) Sonden (Perkin Elmer Corp./ Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien), Pyren-markierte Sonden und andere biochemische Assays.
Die vorstehende Offenbarung beschreibt im Allgemeinen die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann unter Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden, die ausschließlich zum Zweck einer Veranschaulichung bereitgestellt wurden und nicht beabsichtigen, den Bereich der Erfindung zu begrenzen.
Beispiel 1
Schritt 1: PCR Amplifikationen. Die in diesem Abschnitt beschriebenen besten PCR Bedingungen wurden durch Verändern der in den Ergebnissen beschriebenen Parameter bestimmt. PCR wurde in 7ul Volumen in Polypropylen PCR-Platten mit 96 Vertiefungen (Marsh Biomedical Products, Rochester, NY durchgeführt. Die Zusammensetzung der Reaktionen war: 67 mM Tris, pH 8.8, 16,6 mM NH₄SO₄, 6,7 mM MgCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM TTP, 6% DMSO, 1 uM primer F1, 1 uM primer R1, 0,05 Einheiten/ul Platinum Taq Polymerase (Life Technologies, Inc.), und "ein halbes Genomäquivalent" DNA. Zum Bestimmen der Menge an DNA, die einem halben Genomäquivalent entspricht, wurden DNA Proben seriell verdünnt und mittels PCR getestet. Die Menge, die in der Hälfte der Vertiefungen Amplifikationsprodukte erzeugte, für gewöhnlich ~1,5 pg Gesamt-DNA, wurde als "ein halbes Genomäquivalent" festgelegt und in jeder Vertiefung anschließender digitaler Amplifikationsversuche eingesetzt. Fünfzig ul leichtes Mineralöl (Sigma M-3516) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Reaktion wurden in einem HybAid Thermal Cycler bei den folgenden Temperaturen durchgeführt: Denaturierung bei 94° für eine Min.; 60 Zyklen von 94° für 15 sek., 55° für 15 sek., 70° für 15 sek. und 70° für fünf Minuten.
Die Reaktionen wurden unverzüglich ausgewertet oder bei Raumtemperatur für bis zu 36 Stunden vor Fluoreszenzanalyse gelagert.
Beispiel 2
Schritt 2: Fluoreszenzanalyse. 3,5 ul einer Lösung mit der folgenden Zusammensetzung wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt: 67 mM Tris, pH 8.8, 16,6 mM NH₄SO₄, 6,7 mM MgCl₂, 10 mM β-mercaptoethanol, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM TTP, 6% DMSO, 5 uM primer INT, 1 uM MB-GREEN, 1 uM MB-RED, 0,1 Einheiten/ul Platinum Taq Polymerase. Die Platten wurden für 20 Sekunden bei 6000g zentrifugiert und die Fluoreszenz bei Anregungs-/Emissions-Wellenlängen von 485nm/530nm für MB-GREEN und 530nm/590nm für MB-RED gelesen. Die Fluoreszenz in Vertiefungen ohne Templat betrug für gewöhnlich 10.000 bis 20.000 Fluoreszenz "Einheiten", wobei um 75% von dem Fluormeterhintergrund herrühren und der Rest von den MB Sonden. Die Platten wurden anschließend in einen Thermal Cycler zur asymmetrischen Amplifikation bei den folgenden Temperaturen platziert: 94° für eine Minute; 10–15 Zyklen von 94° für 15 sek., 55° für 15 sek., 70° für 15 sek.; 94° für eine Minute und 60° für fünf Minuten. Die Platten wurden anschließend bei Raumtemperatur für zehn bis sechzig Minuten inkubiert und die Fluoreszenz wie vorstehend beschrieben gemessen. Spezifische Fluoreszenz wurde als der Unterschied zwischen Fluoreszenz vor und nach der asymmetrischen Amplifikation festgelegt. RED/GREEN Verhältnisse wurden als die spezifische Fluoreszenz von MB-RED geteilt durch die von MB-GREEN festgelegt. RED/GREEN Verhältnisse wurden auf das Verhältnis normalisiert, das die Positivkontrollen (25 Genomäquivalente DNA von gewöhnlichen Zellen, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben) aufweisen. Wir haben gefunden, dass die Befähigung der MB Sonden zwischen WT und Mutanten Sequenzen unter unseren Bedingungen zu unterscheiden nicht aus Versuchen zuverlässig bestimmt werden konnte, in denen sie durch Hybridisierung an vergleichsweise kurze komplementäre Einzelstrang-Oligonukleotide getestet wurden und dass gegenwärtige PCR Produkte für die Validierung eingesetzt werden mussten.
Beispiel 3
Oligonukleotide und DNA Sequenzierung.

Primer F1: 5'-CATGTTCTAATATAGTCACATTTTCA-3;
Primer R1: 5'-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGG-3';
Primer INT: 5'-TAGCTGTATCGTCAAGGCAC-3;
MB-RED: 5'-Cy3-CACGGGCCTGCTGAAAATGACTGCGTG-Dabcyl-3;
MB-GREEN: 5'-Fluorescein-CACGGGAGCTGGTGGCGTAGCGTG-Dabcyl-3'.

Molekulare Signale (33, 34) wurden von Midland Scientific und andere Oligonukleotide von Gene Link (Thornwood, NY synthetisiert. Alle wurden zu 50 um in TE (10 mM Tris, pH 8.0/1 mM EDTA) gelöst und bis zur Verwendung eingefroren und im Dunklen gelagert. PCR Produkte wurden unter Verwendung des QIAquick PCR Reinigungskit (Qiagen) gereinigt. Bei den in dem Text beschriebenen maßgeblichen Versuchen wurden 20% des Produkts aus einzelnen Vertiefungen zur Gelektrophorese und 40% für jede Sequenzierreaktion verwendet. Der Sequenzierprimer war 5'-CATTATTTTTATTATAAGGCCTGC-3'. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten ABI Big Dye Terminatoren und einem ABI 377 automatischen Sequenzierer durchgeführt.
Beispiel 4
Dem Versuch zugrunde liegende Prinzipien. Der Versuch wird in 1A dargestellt. Die DNA wird zuerst in Platten mit mehreren Vertiefungen derart verdünnt, dass durchschnittlich ein Templat-Molekül für zwei Vertiefungen vorliegt, und die PCR durchgeführt. Die einzelnen Vertiefungen werden zweitens auf die Anwesenheit von PCR Produkten von Mutanten und WT Sequenz unter Verwendung fluoreszierender Sonden analysiert.
Da die von der Amplifikation einzelner Templat-Moleküle herrührenden PCR Produkte eine homogen Sequenz aufweisen sollten, könnten mehrere Standarttechniken zum Abschätzen ihrer Anwesenheit eingesetzt werden. Auf fluoreszierenden Sonden basierende Technologien, die auf PCR Produkte "in situ" (d.h. in den gleichen Vertiefungen)durchgeführt werden können, sind für diese Anwendung (31, 33–40) besonders gut geeignet. Wir haben zu diesem Zweck (33, 34) die Untersuchung der Nützlichkeit einer derartigen Technologie ausgewählt. MB Sonden sind Oligonukleotide mit Stamm-Schleifen Strukturen, die einen fluoreszierenden Farbstoff an dem 5' Ende und ein Quenchagens (Dabcyl) an dem 3' Ende (1B) enthalten. Der Quenchgrad mittels Fluoreszenzenergie-Resonanztransfer ist zu der 6. Potenz des Abstands zwischen der Dabcyl Gruppe und dem fluoreszierenden Farbstoff umgekehrt proportional. MB Sonden bilden erneut eine Stamm-Schleifen Struktur nach Erhitzen und Abkühlen, die das Fluoreszenzsignal des Farbstoffs (41) quencht. Falls ein PCR Produkt, dessen Sequenz zu der Schleifensequenz komplementär ist, während des Heiz/Kühl-Zyklus anwesend ist, wird eine Hybridisierung des MB an einen Strang des PCR Produkts den Abstand zwischen dem Dabcyl und Farbstoff erhöhen, was zu einer erhöhten Fluoreszenz führt.
Eine schematische Darstellung der für die digitalen Amplifikationen verwendeten Oligonukleotide wird in 1C gezeigt. Zwei nicht-modifizierte Oligonukleotide werden als Primer für die PCR Reaktion verwendet. Zwei MB Sonden, die jeweils mit einem verschiedenen Fluorophor markiert sind, werden zum Nachweisen der PCR Produkte verwendet. MB-GREEN weist einen Schleifenbereich auf, der zu dem Anteil des für Mutationen in Frage stehenden WT PCR Produkts komplementär ist. Mutationen in der entsprechenden Sequenz des PCR Produkts sollten seine Hybridisierung an die MB Sonde (33, 34) maßgeblich behindern. MB-RED weist einen Schleifenbereich auf, der zu einem unterschiedlichen Anteil des PCR Produkts komplementär ist, von dem nicht erwartet wird eine Mutante darzustellen. Es sollte daher ein Signal, sooft eine Vertiefung ein PCR Produkt enthält, erzeugen, obgleich das Produkt WT oder Mutante in dem von MB-GREEN in Frage gestellten Bereich ist. Beide MB Sonden werden zum gleichzeitigen Nachweis der Anwesenheit eine PCR Produkts und seines Mutationsstatus zusammen verwendet.
Praktische Gesichtspunkte. Mehrere Bedingungen wurden zum Festlegen von Bedingungen optimiert, die wiederholbar und allgemein angewendet werden können. Der erste Schritt beinhaltet, wie in 1A ausgeführt, eine Amplifikation von einzelnen Templat-Molekülen. Die meisten Protokolle für eine Amplifikation ausgehend von einer geringen Anzahl von Templat-Molekülen verwenden eine Schachtelungsverfahren (nesting procedure), worin ein sich aus einem Satz von Primern ergebendes Produkt als Templat in einer zweiten Reaktion verwendet wird, die innere Primer verwendet. Da angenommen werden kann, dass viele Anwendungen digitaler Amplifikation hunderte oder tausende einzelner Amplifikationen benötigen, würde eine derartige Schachtelung unbequem sein und könnte zu Kontaminierungsschwierigkeiten führen. Daher wurden Bedingungen gesucht, die eine stabile Amplifikation ohne Schachtelung erzielen würden. Das Wichtigste dieser Bedingungen bezieht die Verwendung einer Polymerase ein, die ausschließlich nach Erhitzen (44,45) aktiviert wurde und optimierten Konzentrationen von dNTP's, Primern, Pufferbestandteilen und der Temperatur. Die in den Beispielen 1–3 angegebenen Bedingungen wurden nach einzelnem Optimieren jeder dieser Bestandteile festgelegt und erwiesen sich für eine Amplifikation mehrerer verschiedener menschlicher Genom-DNA-Sequenzen geeignet. Obgleich die für eine PCR benötige Zeitspanne nicht besonders lang (~2,5 Stunden) war, war die Anzahl der eingesetzten Zyklen hoch und übermäßig im Vergleich zu der Anzahl von Zyklen, die zur Amplifikation des "durchschnittlichen" einzelnen Templat-Moleküls benötigt werden. Die hohe Anzahl an Zyklen war notwendig, da das Templat in einigen Vertiefungen nicht mit der Amplifikation beginnen könnte bis mehrere PCR Zyklen vollständig waren. Die hohe Anzahl an Zyklen stellte sicher, dass jede Vertiefung (nicht einfach die durchschnittliche Vertiefung) eine erhebliche und ungefähr gleiche Menge an PCR Produkt erzeugt, wenn ein Templat-Molekül in ihm vorlag.
Der zweite Schritt in 1A bezieht den Nachweis dieser PCR Produkte ein. Es war notwendig, den Standart MB Sonden Ansatz beträchtlich zu ändern, damit er bei digitalen Amplifikationsanwendungen effizient funktionieren kann. Eine einzelne MB Sonde könnte theoretisch verwendet werden, um jede spezifische Mutation nachzuweisen, die in der in Frage stehenden Sequenz auftreten könnte. Durch Einbezug eines MB entsprechend zu einer WT Sequenz und eines anderen entsprechend zu einer Mutanten Sequenz, würde die Beschaffenheit des PCR Produkts offen gelegt. Obgleich diese Strategie offensichtlich in einigen Fällen benutzt werden könnte, würde sie aufwendig werden, wenn ein Auftreten mehrerer verschiedener Mutationen in der gleichen in Frage gestellten Sequenz erwartet wird. In dem hier untersuchten c-Ki-Ras Gen Beispiel könnten theoretisch beispielsweise zwölf verschiedene Basensubstitutionen, die zu Missense-Mutationen führen, in den Codons 12 und 13 auftreten, wobei mindestens sieben davon in natürlich-auftretendem Humankrebs beobachtet werden. Um alle zwölf Mutationen ebenso wie the WT Sequenz mit einzelnen molekularen Signalen nachzuweisen, würden 13 verschiedene Sonden benötigt werden. Der Einbezug einer derartigen hohen Anzahl von MB Sonden würde die Hintergrundfluoreszenz und Kosten des Assays erhöhen. Wir haben daher versucht eine einzelne Sonde zu entwickeln, die besser mit WT Sequenzen als irgendeiner Mutanten Sequenz in der in Frage stehenden Sequenz reagieren würde. Wir haben gefunden, dass die Länge der Schleifensequenz, ihrer Schmelztemperatur und die Länge und Sequenz des Stamms bei der Bestimmung der Effizienz der Sonden jeweils von Bedeutung waren. Schleifen im Bereich von 14 bis 26 Basen und Stämme in Bereich von 4 bis 6 Basen ebenso wie mehrere Sequenzvariationen sowohl der Stämme als auch Schleifen wurden während des Optimierungsverfahrens getestet. Zur Unterscheidung zwischen WT und Mutanten Sequenzen (MB-GREEN Sonde), haben wir gefunden, dass eine 16 Basenpaar Schleife mit einer Schmelztemperatur (TM) von 50–51° und ein 4 bp Stamm der Sequenz 5'-CACG-3' optimal waren. Für MB-RED Sonden erwiesen sich der gleiche Stamm mit einer 19–20 bp Schleife einer Tm von 54–56° als optimal. Die Unterschiede bei den Schleifengrößen und Schmelztemperaturen zwischen MB-GREEN und MB-RED Sonden widerspiegelten die Tatsache, dass nur die GREEN Sonde, mit einem kürzeren eine derartige Unterscheidung erleichternden Homologiebereich, dazu gestaltet ist zwischen nahe verwandten Sequenzen zu unterscheiden.
Beispiele der Verhältnisse, die in Replikat-Vertiefungen erzielt wurden, die DNA Template von Kolon-Rektal Tumorzellen mit Mutationen des c-Ki-Ras enthielten, werden in 2 gezeigt. In diesem Versuch wurden fünfzig Genomäquivalente DNA jeder Vertiefung vor einer Amplifikation hinzugegeben. Jede von sechs getesteten Mutanten erzielte Verhältnisse einer RED/GREEN Fluoreszenz, die deutlich höher als das Verhältnis waren, das mit DNA von gewöhnlichen Zellen (1,5 bis 3,4 in den Mutanten verglichen mit 1,0 in gewöhnlicher DNA; p < 0,0001 in jedem Fall, Student's t-Test) erzielt wurde. Die Wiederholbarkeit der Verhältnisse ist in dieser Fig. ersichtlich. Unmittelbare DNA Sequenzierung der zur Fluoreszenzanalyse eingesetzten PCR Produkte zeigte, dass die RED/GREEN Verhältnisse von den relativen Anteilen an Mutanten Genen in der Templat-Population (2) abhingen. Die DNA aus Zellen, die ein Mutanten c-Ki-Ras Allel pro jede zwei WT c-Ki-Ras Allele enthalten, ergaben daher ein RED/GREEN Verhältnis von 1,5 (Gly12Arg Mutation), während die Zellen, die drei Mutanten c-Ki-Ras Allele pro WT Allel enthalten, ein Verhältnis von 3,4 (Gly12Asp) aufwiesen. Diese Daten legten nahe, dass Vertiefungen, die nur Mutanten Allele (kein WT) enthalten, Verhältnisse höher als 3,0 erzielen würden, wobei der genaue Wert von der spezifischen Mutation abhängt.
Obgleich dieser Modus für viele Anwendungen der bequemste ist, haben wir es nützlich gefunden MB Sonden hinzuzufügen nachdem die PCR Amplifikation vollständig war (1). Dies ermöglichte es uns eine Standart Fluormeter für Platten mit mehreren Vertiefungen zu verwenden, um folgend eine große Anzahl von Platten mit mehreren Vertiefungen zu analysieren, die vor-gebildete PCR Produkte enthalten, und das Erfordernis nach multiplen Echtzeit PCR Instrumenten zu umgehen. Wir haben zusätzlich gefunden, dass die erhaltenen Fluoreszenzsignale beträchtlich erhöht werden könnten, wenn mehrere Zyklen asymmetrischer, linearer Amplifikation in der Anwesenheit der MB Sonden durchgeführt werden. Eine asymmetrische Amplifikation wurde durch Einbezug eines Überschusses eines einzelnen inneren Primers (Primer INT in 1C) zu der Zeit der Zugabe der MB Sonden erzielt.
Beispiel 5
Analyse der DNA von Tumorzellen. Die vorstehend beschriebenen Prinzipien und praktischen Erwägungen wurden mit DNA von zwei Kolon-Rektal Krebszelllinien, eine mit einer Mutation im c-Ki-Ras Codon 12 und der anderen im Codon 13, gezeigt. Typische Beispiele der erzielten MB-RED Fluoreszenzwerte werden in 3 gezeigt. Es lag eine eindeutige biphasische Verteilung mit "positiven" Vertiefungen, die Werte höher als 10.000 spezifische Fluoreszenzeinheiten (SFU, wie in Material und Methoden festgelegt) erzielen, und "negativen" Vertiefungen vor, die Werte weniger als 3500 SFU erzielen. Eine Gelelektrophorese von 127 derartiger Vertiefungen zeigte, dass alle positiven Vertiefungen, allerdings keine negativen Vertiefungen, PCR Produkte der erwarteten Größe (3) enthielten. Die RED/GREEN Fluoreszenz-Verhältnisse der positiven Vertiefungen werden in 4 gezeigt. Wiederum wurde eine biphasische Verteilung beobachtet. In dem Versuch mit dem eine Gly12Asp enthaltenden Tumor wiesen 64% der positiven Vertiefungen RED/GREEN Verhältnisse höher als 3, 0 auf, wohingegen die anderen 36% der positiven Vertiefungen RED/GREEN Verhältnisse im Bereich von 0,8 bis 1,1 aufwiesen. Im dem Fall des Tumors mit der Gyl13Asp Mutation wiesen 54% der positiven Vertiefungen RED/GREEN Verhältnisse >3,0 auf, wohingegen die anderen positiven Vertiefungen Verhältnisse im Bereich von 0,9 bis 1,1 erzielten. Die PCR Produkte von 16 positiven Vertiefungen wurden als Sequenziertemplate verwendet (4). Alle Vertiefungen, die ein Verhältnis von höher als 3,0 erzielten, wurden gefunden Mutanten c-Ki-Ras Fragmente der erwarteten Sequenz zu enthalten, während die WT Sequenz in den anderen PCR Produkten gefunden wurde. Die Anwesenheit homogener WT oder Mutanten Sequenz bestätigte, dass die Amplifikationsprodukte für gewöhnlich von einzelnen Templat-Molekülen stammten. Die Verhältnisse von WT zu Mutanten PCR Produkten, die aus dem digitalen Amplifikationsassay bestimmt wurden, waren ebenso mit dem Anteil von Mutanten Allelen einheitlich, die sich von unmittelbarer Sequenzanalyse genomischer DNA der zwei Tumorlinien (2) ableiten.
Digitale Analyse von DNA aus einer Stuhlprobe. Wir analysierten die DNA aus Stuhlproben von Patienten mit Kolon-rektalem Krebs als ein praxisnaheres Beispiel. Ein kennzeichnendes Ergebnis eines derartigen Versuchs wird in 5 gezeigt. Con früheren Analysen von Stuhlproben von Patienten, deren Tumore c-Ki-Ras Genmutationen enthielten, haben wir erwartet, dass 1% bis 10% der aus Stuhlproben aufgereinigten c-Ki-Ras Gene Mutanten sein würden. Wir haben daher einen digitalen Amplifikationsversuch in 384 Vertiefungen eingerichtet. 48 der Vertiefungen enthielten 25 Genomäquivalente DNA (in Material und Methoden festgelegt) aus gewöhnlichen Zellen als Positivkontrollen. Andere 48 Vertiefungen dienten als Negativkontrollen (kein DNA Templat hinzugegeben). Die anderen 288 Vertiefungen enthielten eine geeignete Verdünnung von DNA aus Stuhl. MB-RED Fluoreszenz zeigte an, dass 102 dieser 288 experimentellen Vertiefungen PCR Produkte (durchschnittliche +/– Standartabweichung (s.d.) 47.000 +/– 18.000 SFU) und die anderen 186 Vertiefungen keine (2600 +/– 1500 SFU) enthielten. Die RED/GREEN Verhältnisse der 102 positiven Vertiefungen legten nahe, dass fünf Mutanten c-Ki-Ras Gene mit Verhältnissen im Bereich von 2,1 bis 5,1 enthielten. Die anderen 97 Vertiefungen wiesen Verhältnisse im Bereich von 0,7 bis 1,2 auf, identisch zu denen, die in den Vertiefungen mit Positivkontrollen beobachtet wurden. Um die Beschaffenheit der Mutanten c-Ki-Ras Gene in den fünf positiven Vertiefungen aus Stuhl zu bestimmen, wurden die PCR Produkte unmittelbar sequenziert. Die vier Vertiefungen, die RED/GREEN Verhältnisse größer als 3,0 aufwiesen, setzten sich vollständig aus Mutanten c-Ki-Ras Sequenz (5) zusammen. Die Sequenz von drei dieser PCR Produkte machte Gly12Ala Mutationen (GGT zu GCT in Codon 12) deutlich, während die Sequenz des vierten einen stillen C zu T Übergang an der dritten Position des Codons 13 anzeigte. Dieser Übergang ergab sich vermutlich aus einem PCR Fehler während des ersten ergiebigen Amplifikationszyklus aus einem WT Templat. Die Vertiefung mit einem Verhältnis von 2,1 enthielt eine ~1:1 Mischung von WT und Gly12Ala Mutanten Sequenzen. Daher enthielten 3,9% (4/102) der in dieser Stuhlprobe vorliegenden c-Ki-Ras Allele eine Gly12Ala Mutation. Die Mutantenallele in der Stuhlprobe gingen vermutlich aus dem Kolon-Rektal Krebs des Patienten hervor, da unmittelbare Sequenzierung der aus DNA von dem Krebs erzeugte PCR Produkte die gleiche Gly12Ala Mutation (nicht gezeigt) zeigten.
Literaturnachweis

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Claims

Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses einer ausgewählten Gensequenz in einer Gesamtheit von Gensequenzen umfassend die Schritte von: Verdünnen von Nukleinsäure-Templatmolekülen in einer biologischen Probe, um einen mehrere Assayproben umfassenden Satz zu bilden; Amplifizieren der Templatmoleküle in den Assayproben, um eine Gesamtheit amplifizierter Moleküle in den Assayproben des Satzes zu bilden; Analysieren der amplifizierten Moleküle in den Assayproben des Satzes, um eine erste Anzahl Assayproben zu bestimmen, die die ausgewählte Gensequenz enthalten, und eine zweite Anzahl Assayproben, die eine Referenz-Gensequenz enthalten; Vergleichen der ersten Anzahl mit der zweiten Anzahl zur Ermittlung eines Verhältnisses, das die Zusammensetzung der biologischen Probe widerspiegelt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Verdünnungsschritt ausgeführt wird bis mindestens ein zehntel der Assayproben in dem Satz eine Anzahl (N) Moleküle umfasst, so dass 1/N größer ist als das Verhältnis ausgewählter Gensequenzen zur Gesamtzahl an Gensequenzen, die für den Analyseschritt benötigt werden, um die Gegenwart der ausgewählten Gensequenz zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Verdünnungsschritt ausgeführt wird bis zwischen 0,1 und 0,9 der Assayproben ein Amplifikationsprodukt ergeben, wenn sie einer Polymerase-Ketten-Reaktion unterzogen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Verdünnungsschritt ausgeführt wird bis alle der Assayproben ein Amplifikationsprodukt ergeben, wenn sie einer Polymerase-Ketten-Reaktion unterzogen werden, und jede Assayprobe weniger als 10 Nukleinsäure-Templatmoleküle enthält, die die Referenz Gensequenz enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Verdünnungsschritt ausgeführt wird bis alle der Assayproben ein Amplifikationsprodukt ergeben, wenn sie einer Polymerase-Ketten-Reaktion unterzogen werden, und jede Assayprobe weniger als 100 Nukleinsäure-Templatmoleküle enthält, die die Referenz-Gensequenz enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die biologische Probe zellfrei ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 10 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 50 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 100 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 500 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 1000 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Amplifikationsschritt und der Analyseschritt mit Assayproben in dem gleichen Behälter ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin eine molekulare Signalsonde in dem Analyseschritt verwendet wird, worin eine molekulare Signalsonde ein Oligonukleotid mit einer Stamm-Schleifen Struktur mit einem photolumineszierenden Farbstoff an einem der 5' oder 3' Enden und einem Quenchagens an dem entgegengesetzten 5' oder 3' Ende ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Analyseschritt Gelelektrophorese einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Analyseschritt Hybridisierung an mindestens eine Nukleinsäure einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Analyseschritt Hybridisierung an mindestens zwei Nukleinsäuren einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin zwei molekulare Signalsonden mit jeweils einem verschiedenen photolumineszierenden Farbstoff verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die molekulare Signalsonde eine Wildtyp ausgewählte Gensequenz besser als eine Mutanten ausgewählte Gensequenz nachweist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Amplifikationsschritt ein einzelnes Primerpaar einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Amplifikationsschritt eine Polymerase einsetzt, die ausschließlich nach Erhitzen aktiviert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Amplifikationsschritt mindestens 40 Zyklen Erhitzen und Kühlen einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Amplifikationsschritt mindestens 50 Zyklen Erhitzen und Kühlen einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Amplifikationsschritt mindestens 60 Zyklen Erhitzen und Kühlen einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stuhl, Blut und Lymphknoten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die biologische Probe Blut oder Knochenmark eines Leukämie oder Lymphom Patienten ist, der eine Behandlung gegen Krebs erhalten hat.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ausgewählte Gensequenz ein translokiertes Allel ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ausgewählte Gensequenz ein Wildtyp Allel ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ausgewählte Gensequenz in einem Amplikon liegt, das während neoplastischer Entwicklung amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ausgewählte Gensequenz eine seltene Exonsequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nukleinsäure-Templatmolekül cDNA von RNA Transkripten umfasst und die ausgewählte Gensequenz auf einer cDNA eines ersten Transkripts vorliegt und die Referenz-Gensequenz auf einer cDNA eines zweiten Transkripts vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ausgewählte Gensequenz eine erste Mutation umfasst und die Referenz-Gensequenz eine zweite Mutation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ausgewählte Gensequenz und die Referenz-Gensequenz auf verschiedenen Chromosomen liegen.
Molekulare Signalsonde umfassend: ein Oligonukleotid mit einer Stamm-Schleifen Struktur, das einen photolumineszierenden Farbstoff an einem der 5' oder 3' Ende und ein Quenchagens an dem entgegengesetzten 5' oder 3' Ende aufweist, worin die Schleife aus 16 Basenpaaren besteht, worin die Schleife eine T_m von 50–51°C aufweist und der Stamm aus 4 Basenpaaren mit einer Sequenz 5'-CACG-3' besteht.
Sonde nach Anspruch 33, worin die molekulare Signalsonde eine Wildtyp ausgewählte Gensequenz besser als eine Mutanten ausgewählte Gensequenz nachweist.
Sonde nach Anspruch 33, worin die molekulare Signalsonde eine Mutanten-Gensequenz besser als eine Wildtyp-Gensequenz nachweist.
Molekulare Signalsonde umfassend: ein Oligonukleotid mit einer Stamm-Schleifen Struktur, das einen photolumineszierenden Farbstoff an einem der 5' oder 3' Ende und ein Quenchagens an dem entgegengesetzten 5' oder 3' Ende aufweist, worin die Schleife aus 19–20 Basenpaaren besteht, worin die Schleife eine T_m von 54–56°C aufweist und der Stamm aus 4 Basenpaaren mit einer Sequenz 5'-CACG-3' besteht.
Ein Paar molekularer Signalsonden umfassend: eine erste molekulare Signalsonde, die ein Oligonukleotid mit einer Stamm-Schleifen Struktur ist, das einen photolumineszierenden Farbstoff an einem der 5' oder 3' Ende und ein Quenchagens an dem entgegengesetzten 5' oder 3' Ende aufweist, worin die Schleife aus 16 Basenpaaren mit einer T_m von 50–51°C besteht und der Stamm aus 4 Basenpaaren mit einer Sequenz 5'-CACG-3' besteht; und eine zweite molekulare Signalsonde, die ein Oligonukleotid mit einer Stamm-Schleifen Struktur ist, das einen photolumineszierenden Farbstoff an einem der 5' oder 3' Ende und ein Quenchagens an dem entgegengesetzten 5' oder 3' Ende aufweist, worin die Schleife aus 19–20 Basenpaaren mit einer T_m von 54–56°C besteht und der Stamm aus 4 Basenpaaren mit einer Sequenz 5'-CACG-3' besteht; worin der erste und der zweite photolumineszierende Farbstoff verschieden sind.
Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses einer ausgewählten Gensequenz in einer Gesamtheit von Gensequenzen umfassend die Schritte von: Amplifizieren von Templatmolekülen in einem mehrere Assayproben umfassenden Satz, um eine Gesamtheit amplifizierter Moleküle in jedem der Assayproben des Satzes zu bilden; Analysieren der amplifizierten Moleküle in den Assayproben des Satzes, um eine erste Anzahl Assayproben zu bestimmen, die die ausgewählte Gensequenz enthalten, und eine zweite Anzahl Assayproben, die eine Referenz-Gensequenz enthalten, worin mindestens ein fünfzigstel der Assayproben in dem Satz eine Anzahl (N) Moleküle umfasst, so dass 1/N größer ist als das Verhältnis ausgewählter Gensequenzen zur Gesamtzahl an Gensequenzen, die zur Bestimmung der Gegenwart der ausgewählten Gensequenz benötigt werden; Vergleichen der ersten Anzahl mit der zweiten Anzahl zur Ermittlung eines Verhältnisses, das die Zusammensetzung der biologischen Probe widerspiegelt.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 10 ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 50 ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 100 ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 500 ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die Anzahl Assayproben in dem Satz größer als 1000 ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Amplifikationsschritt und der Analyseschritt mit Assayproben in dem gleichen Behälter ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 38, worin eine molekulare Signalsonde in dem Analyseschritt verwendet wird, worin eine molekulare Signalsonde ein Oligonukleotid mit einer Stamm-Schleifen Struktur mit einem photolumineszierenden Farbstoff an einem der 5' oder 3' Enden und einem Quenchagens an dem entgegengesetzten 5' oder 3' Ende ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Analyseschritt Gelelektrophorese einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Analyseschritt Hybridisierung an mindestens eine Nukleinsäure einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Analyseschritt Hybridisierung an mindestens zwei Nukleinsäuren einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 45, worin zwei molekulare Signalsonden mit jeweils einem verschiedenen photolumineszierenden Farbstoff verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 45, worin die molekulare Signalsonde eine Wildtyp ausgewählte Gensequenz besser als eine Mutanten ausgewählte Gensequenz nachweist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Amplifikationsschritt ein einzelnes Primerpaar einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Amplifikationsschritt eine Polymerase einsetzt, die ausschließlich nach Erhitzen aktiviert ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Amplifikationsschritt mindestens 40 Zyklen Erhitzen und Kühlen einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Amplifikationsschritt mindestens 50 Zyklen Erhitzen und Kühlen einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Amplifikationsschritt mindestens 60 Zyklen Erhitzen und Kühlen einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die Templatmoleküle aus einer Körperprobe erhalten werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stuhl, Blut und Lymphknoten.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die Templatmoleküle aus einer Körperprobe eines Leukämie oder Lymphom Patienten werden, der eine Behandlung gegen Krebs erhalten hat, wobei die Körperprobe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blut und Knochenmark.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die ausgewählte Gensequenz ein translokiertes Allel ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die ausgewählte Gensequenz ein Wildtyp Allel ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die ausgewählte Gensequenz in einem Amplikon liegt, das während der neoplastischen Entwicklung amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die ausgewählte Gensequenz eine seltene Exonsequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin das Nukleinsäure-Templatmolekül cDNA von RNA Transkripten umfasst und die ausgewählte Gensequenz auf einer cDNA eines ersten Transkripts vorliegt und die Referenz-Gensequenz auf einer cDNA eines zweiten Transkripts vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die ausgewählte Gensequenz eine erste Mutation umfasst und die Referenz-Gensequenz eine zweite Mutation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 38, worin die ausgewählte Gensequenz und die Referenz-Gensequenz auf verschiedenen Chromosomen liegen.