DE60023456T2

DE60023456T2 - Peptid auf kollagenbasis zur verhinderung von postoperativen verklebungen

Info

Publication number: DE60023456T2
Application number: DE60023456T
Authority: DE
Inventors: Alain Constancis; Remi Meyrueix
Original assignee: Flamel Technologies SA
Current assignee: Flamel Technologies SA
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2020-03-02
Also published as: EP1156839A1; AU3170200A; ATE307624T1; EP1156839B1; FR2790391B1; FR2790391A1; DE60023456D1; WO2000051661A1; US6790438B1; ES2251971T3

Description

Das Gebiet der Erfindung sind medizinische oder chirurgische, biokompatible, bioresorbierbare Biomaterialien, die bei der Verhinderung von post-operativen Verklebungen von Nutzen sind, insbesondere nach intraperitonealen und pelvischen chirurgischen Eingriffen.
Die Erfindung betrifft ein Mittel, genauer gesagt, jedoch nicht umfassend, einen Film, ein Gel oder eine Flüssigkeit (zum Beispiel durch Zerstäubung anwendbar) zur Verhinderung dieser post-chirurgischen Verklebungen, das aus einem besonderen Kollagen-Peptid besteht, das chemisch modifiziert, in situ vernetzt oder im vernetzten Zustand verwendet wird.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Gewinnung von, unter anderem, dem zuvor erwähnten Mittel.
Eines der Hauptprobleme in der Chirurgie, insbesondere bei der chirurgischen Behandlung des Verdauungstrakts, des Unterleibs und im Bereich der Frauenheilkunde, ist mit der Entstehung post-chirurgischer Verklebungen verbunden (anormale Aneinanderfügung von zwei Gewebeflächen oder -abschnitten, die normalerweise getrennt sind), bedingt durch eine Entzündung und/oder Narbenbildung, die automatisch nach einer Gewebeverletzung entsteht, die durch den Eingriff verursacht wird. Solche verlagerten Verklebungen können unangenehme Auswirkungen haben. So können diese Verklebungen bei der chirurgischen Behandlung des Unterleibs Verstopfungen bewirken. Bei der chirurgischen Behandlung im Bereich der Frauenheilkunde sind die postoperativen Verklebungen im Beckenbereich einer der anerkannten Gründe für die mangelnde Wirksamkeit der chirurgischen Behandlung der Unfruchtbarkeit.
Es wurden chemische und/oder therapeutische Maßnahmen vorgeschlagen, um zu versuchen, dieses Problem zu beheben. Der chemische Ansatz besteht darin, chemische Behandlungsmittel auf die chirurgischen Wunden aufzubringen, die dazu geeignet sind, die physiologischen Erscheinungen Entzündung und Narbenbildung einzuschränken, die die Ursache für die Verklebungen sind. Diese Behandlungsmittel sind Enzyme wie Fibrinolysin und Papase oder auch Produkte wie Phenylbutazon, Prednisolon, Polyvinylpyrrolidon oder Dextrane.
Der physikalische Ansatz besteht darin, die chirurgische Wunde vom umgebenden Gewebe zu isolieren, indem eine physikalische Sperre dazwischen angeordnet wird, die ein faseriger oder nicht-faseriger, gewebter oder nicht gewebter Film oder Verband sein kann oder in Form eines Gels vorliegen kann. Diese physikalische Sperre verhindert die Verklebung während der Narbenbildung. Aber sobald Letztere nicht mehr stattfindet und damit keine Gefahr der Verklebung mehr besteht, stellt diese physikalische Sperre nichts anderes als einen unnötigen, ja sogar störenden, Fremdkörper dar, der in einigen Fällen sogar gefährlich ist.
Daraus folgt, dass die bekannten Mittel gegen Verklebungen aus polymeren Werkstoffen des Typs Polytetrafluorethylen oder Silikon, die, obwohl sie sich hinsichtlich ihrer Eigenschaften gegen Verklebungen bewährt haben, nicht biologisch abbaubar sind und damit bei einem zweiten chirurgischen Eingriff entfernt werden müssen. Diese für den Patienten doppelt traumatisierende Handlungsweise weist als weiteren Nachteil die Verlagerung des Problems der post-chirurgischen Verklebung von einem Gewebebereich in einen anderen auf, der während der zweiten Operation (Laparotomie) geschädigt wird.
So wurde, um es nicht dabei bewenden zu lassen, versucht, Mittel zur Verhinderung von chirurgischen postoperativen Verklebungen zu entwickeln, die aus biologisch abbaubaren (oder bioresorbierbaren) Werkstoffen bestehen, am Ende der Narbenbildung, sobald ihre Sperrfunktion erfüllt worden ist und keine Gefahr der Verklebung mehr besteht.
Da sie die vermuteten Eigenschaften natürlicher Polymere und ihrer Abkömmlinge hinsichtlich biologischer Abbaubarkeit und Biokompatibilität kennen, haben einige Forscher die Verwendung von unter anderem Kollagen-Peptiden (Kollagen, Gelatine), Polysacchariden (Cellulose-Stärke und Abkömmlinge), Mucopolysacchariden als Grundbestandteil von Implantaten oder chirurgischen Prothesen und insbesondere von Sperren gegen post-chirurgische Verklebungen vorgeschlagen.
Johnson & Johnson Products Inc. hat einen bioresorbierbaren Werkstoff auf der Grundlage von oxidierter RegeneratCellulose entwickelt, die als Sperre gegen post-operative Verklebungen geeignet ist und in Form eines Gewebes vorliegt, das eine Dichte von 8 bis 15 mg/cm² und eine Porosität von 10 bis 20 % aufweist. (EP-A-0 213 563). JOHNSON & JOHNSON hat außerdem ein Verfahren zur Herstellung von neutralisierter oxidierter Cellulose entwickelt, deren Unversehrtheit und Zugfestigkeit erhalten sind, in Hinblick auf insbesondere die Verwendung als Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen (EP-A-0 437 095). Weiterführend dazu hat dieses Unternehmen auch einen mehrschichtigen Film aus oxidierter Cellulose und Cellulose entwickelt, der als Sperre gegen post-chirurgische Verklebungen oder Verband geeignet ist (EP-A-0 815 881).
In den Patentschriften US-A-5,017,229 und US-A-5,527,893 offenbaren die Erfinder BURNS et al. von GENZYME CORPORATION eine Sperre zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen, die aus einem polyanionischen Polysaccharid und zwar Carboxymethylcellulose besteht, die derart mit Hyaluronsäure verbunden ist, dass sie ein Gel bildet.
Im Allgemeinen ist die Anwendung kollagener Werkstoffe als Filme zur chirurgischen Verwendung seit langem bekannt. So beschreibt die englische Patentschrift GB-A-1 095 552 von 1964 einen Kollagenfilm, der aus einer Vielzahl nicht gewebter Fäden hergestellt ist.
Die französische Patentschrift FR-A-2 628 634 beschreibt einen Flicken zur Verwendung in der Viszeralchirurgie, der aus einem Biomaterial hergestellt ist, das aus zwei Kollagenschichten hergestellt ist, die übereinander gelegt und eng miteinander verbunden sind, und zwar aus einer porösen klebefähigen Schicht aus faserigem Kollagen und einem Kollagen- und/oder Gelatinefilm. Ziel dieses Flickens ist es, eine gute Vernarbung der Eingeweide zu ermöglichen. Es handelt sich um einen Verband, der zeitweise die wiederherzustellende Eingeweidewand ersetzen soll. Er ist als vollkommen biologisch abbaubar und als geeignet dargestellt, eine hervorragende einschließende und blutstillende Wirkung zu bewirken. Es handelt sich nicht ausdrücklich um eine Anwendung zur Verhinderung post-chirurgischer Verklebungen.
Die Patentanmeldung PCT WO 96/08 277 betrifft die Verwendung von Kollagenmembranen als Prothese zur peritonealen Neubildung. Das betrachtete kollagene Material ist ein Kollagengel, das gegebenenfalls vernetzt, durchsichtig, biokompatibel, nähbar oder zum Klammern geeignet und bioresorbierbar ist. Das verwendete Kollagen ist ein Kollagen mit oder ohne Telopeptide, das gegebenenfalls mit einem Glykosaminoglykan verbunden ist. Es ist festzuhalten, dass das Vernetzungsmittel, das gegebenenfalls eingesetzt wird, eine reaktive chemische Verbindung ist (Glutaraldehyd, Diphenylphosphorylazid, Carbodiimid), die hinsichtlich ihrer Giftigkeit nicht neutral ist.
In der Patentschrift FR-A-2 628 634 ist der Flicken aus zwei Kollagenschichten gebildet, die übereinander gelegt und eng miteinander verbunden sind. Die erste Schicht besteht aus faserigem Kollagen, wodurch ihr eine poröse und klebefähige Beschaffenheit verliehen wird. Die zweite Schicht wird durch Aufkleben eines Kollagen- oder Gelatinefilms auf die erste Schicht aus faserigem Kollagen gewonnen. Dieser Flicken weist laut den Erfindern der Patentschrift PCT WO 96/08277 eine verhältnismäßig geringe mechanische Festigkeit auf. In der Schrift FR-A-2 628 634 wird sich nicht zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen geäußert.
Die europäische Patentanmeldung EP-A-0 686 402 offenbart eine Kollagenmembran zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen, die einen Träger auf Kollagenbasis umfasst, der mit einer Gelatineschicht bedeckt ist, die nicht mit dem Träger vermischt ist. Diese Membran liegt vorzugsweise in gefriergetrockneter Form vor. Das verwendete Kollagen kann mithilfe von Diphenylphosphorylazid (DPPA) vernetzt werden. Auch hier ist die Wahl dieser Art vernetzten Kollagens keine Gute aufgrund der Probleme hinsichtlich der Giftigkeit, die ihr zugrunde liegen.
Die französische Patentanmeldung FR-A-2 759 083 offenbart einen kollagenen Werkstoff, der insbesondere für die Verhinderung von post-operativen Verklebungen geeignet ist. Dieser kollagene Werkstoff ist laut den Erfindern biokompatibel, ungiftig, potenziell haftend und in weniger als einer Woche biologisch abbaubar. Dieser kollagene Werkstoff umfasst Kollagen, das durch oxidative Spaltung und Erhitzen über 37 °C modifiziert und in Gegenwart mindestens eines hydrophilen, makromolekularen Zusatzstoffs vernetzt wird, der gegenüber Kollagen chemisch reaktionsunfähig ist. Das hydrophile Mittel ist beispielsweise Polyethylenglykol oder ein Polysaccharid wie Stärke, Dextran oder Cellulose.
Aus diesem Überblick über den Stand der Technik folgt, dass kein biologisch abbaubarer Werkstoff, insbesondere Cellulose- oder kollagene Werkstoffe, der bisher bei der Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen eingesetzt wird, zufriedenstellend ist, insbesondere aus den im Folgenden aufgeführten Gründen.

• Einige können in Anbetracht ihrer Art der chemischen Vernetzung, beispielsweise unter Verwendung von Aldehyden, eine Restgiftigkeit aufweisen.
• Die biologische Abbaubarkeit kann nicht ausreichend gesteuert werden, dass sie mit dem Erhalt ihrer physikalischen Sperrfunktion zwischen den Geweben während und ausschließlich während der Dauer der Narbenbildung, während der die Gefahr der chirurgischen Verklebung besteht, in Übereinstimmung gebracht werden kann.
• Einige weisen eine sehr geringe mechanische Ausgangsfestigkeit auf.
• Da es sich um kollagene Werkstoffe handelt, können sie nicht als Lösungen hergestellt werden, die über Filter gefiltert werden können, deren Porosität ausreichend niedrig ist, dass biologische Verunreinigungen zurückgehalten werden können (Sterilisation).

Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Mittel auf der Grundlage von Kollagen zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen bereitzustellen, wobei dieses Mittel die Anforderungen zu erfüllen hat, durch die die zuvor erwähnten Nachteile der Werkstoffe nach dem Stand der Technik behoben werden.
Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, ein Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen bereitzustellen, das einen kollagenen Werkstoff umfasst und dazu geeignet ist, als Träger für ein oder mehrere chemische Wirkstoffe gegen post-chirurgische Verklebungen dienen zu können.
Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, ein Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen bereitzustellen, das ein modifiziertes und vernetztes Kollagen umfasst, das in Form eines Films oder einer Membran hergestellt werden kann. Dieser Film oder diese Membran kann aus einem Verbundwerkstoff bestehen, der einerseits chemisch modifiziertes und vernetztes Kollagen umfasst, das den zuvor erwähnten Anforderungen genügt, und andererseits ein vorzugsweise biologisch abbaubares Verstärkungsmaterial, das gewebt oder nicht gewebt, kollagener oder nicht kollagener Art ist.
Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, ein Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen bereitzustellen, das eine flüssige Form aufweist (z.B. zerstäubbare Flüssigkeit oder Gel) mit passender Zähflüssigkeit, das modifiziertes Kollagen umfasst, das wenigstens teilweise nicht vernetzt und in situ auf biologischen Geweben vernetzbar ist.
Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, ein Mittel zur Verhinderung von post- chirurgischen Verklebungen bereitzustellen, das wirtschaftlich ist und einfach gewonnen, gehandhabt und eingesetzt werden kann.
Nachdem sie sich alle diese Ziele gesetzt hatten, haben die Erfinder lang dauernde und aufwändige Untersuchungen und Versuche durchgeführt, an deren Ende sie völlig überraschenderweise und unerwartet ein neues Kollagen-Peptid entwickeln konnten, das chemisch modifiziert und durch Disulfid-Brücken vernetzbar und/oder vernetzt ist, die durch Amid-Bindungen mit den Carboxylgruppen der Asparaginsäuren und Glutaminsäuren der Kollagen-Ketten verbunden sind. Dieses neue vernetzbare/vernetzte Kollagen hat sich als besonders geeignet erwiesen als wesentlicher Bestandteil eines Mittels – das tatsächlich ebenfalls neu ist – zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen.
Daraus folgt, dass die vorliegende Erfindung die zuvor erwähnten Ziele erfüllt, indem unter anderem ein Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen bereitgestellt wird, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Kollagen-Peptid umfasst, das durch Pfropfen von freien oder substituierten Thiol-Funktionen modifiziert ist, das vernetzbar und/oder wenigstens teilweise vernetzt ist, und wobei die Thiol-Funktionen durch Mercaptoamin-Reste bereitgestellt sind, die ausschließlich auf die Asparaginsäuren und Glutaminsäuren der Kollagen-Ketten durch Amid-Bindungen gepfropft sind.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Kollagen-Peptid" insbesondere Kollagen mit (natives) oder ohne Telopeptid, denaturiertes Kollagen sowie Gelatine.
In der US-Patentschrift US 5,412,076 ist ebenfalls vernetzbares Kollagen beschrieben, das durch Pfropfen von Thiol-Funktionen modifiziert ist, die Mercaptoamin-Resten gehören, die am Kollagen durch einen Abstandshalter vom Typ Dicarbonsäure befestigt sind. Die Carboxylfunktionen der Letzteren reagieren mit den Alkoholgruppierungen oder den freien Amin-Gruppierungen des Kollagens. Der Mercaptoamin-Rest reagiert seinerseits über seine freie Amin-Funktion mit den Carboxylgruppierungen, die in der Kollagen-Kette vorhanden sind. Diese Gruppierungen sind somit zweierlei Art: die, die vom Abstandshalter bereitgestellt werden, und die, die natürlich im Kollagen vorkommen, das heißt die von den Asparagin- und Glutaminsäuren.
Im Gegensatz zur US-Patentschrift 5,412,076 weist das Kollagen-Peptid, das in Übereinstimmung mit der Erfindung ausgewählt wurde, die Besonderheit auf, dass die Vernetzbarkeit ausschließlich von den Carboxylresten der Asparagin- und Glutaminsäuren der Kollagen-Kette bereitgestellt wird. Dadurch werden ihm vorteilhafte unerwartete Eigenschaften, in mechanischer Hinsicht, hinsichtlich der Löslichkeit in flüssigen Medien, hinsichtlich des Haftvermögens und in biologischer Hinsicht (biologische Abbaubarkeit) verliehen.
Dieses chemisch modifizierte Kollagen-Peptid kann in mindestens drei verschiedenen Formen vorliegen:

A. Vorläufer mit substituierten Thiol-Funktionen,
B. vernetzbarer Vorläufer mit freien Thiol-Funktionen,
C. -S-S- vernetzte Form.

Form B kann aus Form A gewonnen werden und Form C aus Form B.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Verhinderung von Verklebungen umfasst mindestens eine der Formen A, B oder C. Es ist offensichtlich, dass die Formen A und B insbesondere dem Mittel im Konditionierungs- und Lagerzustand des Mittels vor Anwendung an dem Ort entsprechen, an dem es seiner Funktion gegen Verklebungen Ausdruck verleihen soll. Und in der vernetzten Form C ist dieses Mittel am besten in der Lage, dieser Funktion Ausdruck zu verleihen.
In der vernetzten Form C kann das chemisch modifizierte Kollagen-Peptid, das in die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Mittels einfließt, eine hohe Dichte an Disulfid-Brücken aufweisen, was ihm eine ausgezeichnete Stabilität sowie gute elastische Eigenschaften und eine hohe mechanische Festigkeit verleiht. Ein weiterer Vorteil dieses wohlüberlegt ausgewählten Kollagen-Peptids kommt dadurch zustande, dass sein Vernetzungsgrad steuerbar sein kann. Schließlich schadet die chemische Modifizierung des betrachteten Kollagen-Peptids durch Pfropfen von Mercaptoamin-Resten seiner Biokompatibilität nicht oder wenig.
Die Verwendung dieses Kollagen-Peptids, das zumindest teilweise vernetzt ist (C), als Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen ist vollkommen wohlüberlegt und schöpferisch. Damit steht ein neues Mittel gegen Verklebungen zur Verfügung, das zwischen den Geweben vollkommen wirksam eine Sperre bildet und vom Organismus des Patienten sehr gut vertragen wird. Seine Bioresorbierbarkeit kann derart geregelt werden, dass das Mittel seine Barrierewirkungsfunktion während der Zeit behält, die die Narbenbildung erfordert.
Durch das erfindungsgemäße Mittel können verschiedene gewerbliche Erzeugnisse vom Typ Filme, Gele, zerstäubbare Flüssigkeiten, Verbände, Mullbinden, Umschläge, Salbenverbände usw. hervorgebracht werden.
Eine weitere vorteilhafte Anordnung dieses Mittels ergibt sich aus der Tatsache, dass die Zwischenformen A und B als Lösung vorliegen können, die über Maschen gefiltert werden kann, die kleiner als 0,22 Mikrometer sind. Damit kann schnell und einfach eine Sterilisation erfolgen, die für Produkte unumgänglich ist, die in den lebenden Organismus eingepflanzt werden sollen.
Vorteilhafterweise liegt wenigstens ein Teil des modifizierten Kollagen-Peptids, das Bestandteil des erfindungsgemäßen Mittels ist, in Form eines Vorläufers A vor, auf den Mercaptoamin-Reste gepfropft sind, welche substituierte Thiol-Funktionen tragen, wobei mindestens ein Teil dieser Mercaptoamin-Reste folgende allgemeine Formel (I) aufweist:
worin

• x = 1 oder 2,
• R⁰ = H oder CH₃,
• R¹ H oder COOR³ bedeutet, wobei R³ einen aliphatischen, aromatischen oder alicyclischen Kohlenwasserstoff-Rest, bevorzugt Alkyl, Alkenyl, Aryl, Aralkyl, Alkylaryl, Aralkenyl, Alkenylaryl und noch weiter bevorzugt Methyl oder Ethyl bedeutet;
• R² ein aliphatischer und/oder alicyklischer und/oder aromatischer Rest ist, bevorzugt ein Alkyl- oder ein Acyl-Rest, der gegebenenfalls Schwefel- und/oder Amino-Gruppen enthält, und noch weiter bevorzugt weist R² die folgende Formel (II) auf:
• worin für y, R⁰⁰ und R⁴ dieselbe Definition gilt wie für x, R⁰ et R¹ bezüglich Formel (I) angegeben.

In der Praxis sind die auf die Form A des Kollagen-Peptids gepfropften Mercaptoamin-Reste ausgewählt aus der Gruppe der folgenden Reste:
Zur Umwandlung des Vorläufers A, bei dem R²: -S-Kohlenwasserstoff-Rest (substituierte Thiole) entspricht, in den intermediären vernetzbaren Vorläufer B vom Typ Thiol erfolgt eine Reduktion mithilfe von bekannten Reduktionsmitteln wie Merkaptanen (Mercaptoethanol, Mercaptoessigsäure, Mercaptoethylamin, Benzylmercaptan, Thiocresol, Dithiothreitol...) und/oder von reduzierenden Salzen (NaBH₄, Na₂SO₃ ...) und/oder von organischen Reduktionsmitteln (Phosphin).
Somit liegt gemäß einer bevorzugten Eigenschaft der Erfindung wenigstens ein Teil des modifizierten Kollagen-Peptids in einer Form B eines intermediären vernetzbaren Vorläufers vom Typ Thiol vor, auf welchen Mercaptoamin-Reste gepfropft sind, von denen wenigstens ein Teil die zuvor angegebene allgemeine Formel (I) aufweist und worin der Substituent R² Wasserstoff entspricht und worin R³ Wasserstoff oder ein Salz (Na⁺, K⁺, Li⁺) bedeuten kann, außer den Kohlenwasserstoffgruppierungen, so wie sie oben in der Legende von Formel (I) definiert sind, vorausgesetzt, dass der Schutz des Esters aufgehoben wird.
In Bezug auf vernetzbare Vorläufer B vom Typ Thiol, die der Formel (I) entsprechen, worin R² = H, erfolgt ihre Umwandlung in das vernetzte Kollagen-Peptid C (Vernetzung) durch Oxidation der Thiole unter Bildung von Disulfid-Brücken. Dadurch wird ein dreidimensionales Kollagennetz gewonnen, das in physiologischen Medien unlöslich und in reduzierenden Medien löslich ist, durch die die Disulfid-Brücken reduziert werden können. Diese Oxidation kann in Gegenwart des Sauerstoffs der Luft von selbst ablaufen, vorzugsweise in einem schwach basischen Medium und gegebenenfalls in Gegenwart von zusätzlichen Oxidationsmitteln wie Wasserstoffperoxid oder Iodverbindungen (Iodlösung, Betadin).
Somit liegt gemäß einer bevorzugten Art und Weise des erfindungsgemäßen Mittels wenigstens ein Teil des modifizierten Kollagen-Peptids in einer vernetzten Form C vor, welche Kollagen-Ketten umfasst, die miteinander durch Disulfid-Brücken verbunden sind, wobei die Schwefelatome, welche die Brücken bilden, Mercaptoamin-Resten gehören, die ausschließlich auf die Asparaginsäuren und Glutaminsäuren der Kollagen-Ketten über Amid-Bindungen gepfropft sind.
Noch bevorzugter wird das Kollagen-Peptid der Form C aus dem Kollagen-Peptid B erhalten.
Die vernetzten Kollagen-Peptide C weisen einen steuerbaren Vernetzungsgrad auf, indem der Substitutionsgrad der Carboxylgruppen der Asparaginsäure- und Glutaminsäurereste der Kollagen-Ketten verändert wird. Damit steht ein gewisser Handlungsspielraum zur Auswahl der mechanischen Beschaffenheit der Werkstoffe zur Verfügung, die für die angestrebte Anwendung geeignet sind.
Die Disulfid-Brücken dieser vernetzten Kollagen-Peptide C können mithilfe geeigneter Reduktionsmittel reduziert werden, wofür zuvor Beispiele genannt wurden.
Gemäß einer Abwandlung der Erfindung trägt das Kollagen-Peptid A, das vernetzbare Kollagen-Peptid B und/oder das wenigstens teilweise vernetzte Kollagen-Peptid C, das Bestandteil des beanspruchten Mittels ist, ebenfalls Pfropf-Gruppen G, die an wenigstens einem Teil der freien Amin-Gruppen der Kollagen-Ketten über Amid-Bindungen befestigt sind, wobei G ein Acyl-Rest ist, der eine Kohlenwasserstoff-Einheit umfasst, wobei Mercaptoamin-Reste, insbesondere solche wie oben definiert, ausgeschlossen sind, wobei diese Einheit gegebenenfalls Heteroatome (vorteilhafterweise O und/oder N) enthält, bevorzugt ausgewählt ist aus Alkyl und/oder Alkenyl und/oder alicyclischen und/oder aromatischen Resten und noch weiter bevorzugt aus Gruppierungen, die eine gegebenenfalls ungesättigte Alkylkette umfassen, die 1 bis 22 Kohlenstoffatome aufweist, oder die folgende Formel (III) aufweisen:
worin:
R⁵ = H oder CH₃;
R⁶ = H, ein linearer oder verzweigter Alkylrest und bevorzugt Methyl ist;
Z = 0, 1 oder 2 und n > 0.
Diese zusätzliche Funktionalisierung an den Aminogruppen der Lysine kann den modifizierten Kollagen-Peptiden eine zusätzliche Fähigkeit zur Vernetzung verleihen oder auch eine hydrophile oder hydrophobe, sogar oberflächenaktive Beschaffenheit. Es ist auch vorstellbar, dass diese Funktionalisierung durch die Verankerung eines Wirkstoffs, der bei der betreffenden Anwendung zum Beispiel ein oder mehrere chemische Wirkstoffe zur Behandlung gegen Verklebungen sein könnte, therapeutische Ziele hat.
Gemäß einer vorteilhaften Eigenschaft der Erfindung modifiziert die Pfropf-Gruppe G, die an den freien Aminen der Kollagen-Kette des vernetzten Kollagen-Peptids befestigt ist, die hydrophile/hydrophobe Beschaffenheit des Produkts, wodurch die Eigenschaften hinsichtlich Quellung, mechanischer Festigkeit und Abbaukinetik abgestimmt werden können.
Was die Gewinnung eines Kollagenvorläufers A betrifft, der Mercaptoamin-Reste (I) trägt, besteht sie im Wesentlichen daraus, das Kollagen-Peptid in Lösung mit mindestens einem Vorläufer eines Mercaptoamin-Rests zur Reaktion zu bringen, dessen Thiol-Funktion und die optionale Carboxyl-Funktion blockiert sind, in Gegenwart mindestens eines Pfropfmittels, vorzugsweise aus der Gruppe von Produkten ausgewählt, die Carboxyl-Gruppierungen aktivieren, vorzugsweise aus Carbodiimiden. Die Bedingungen zur Gewinnung werden derart ausgewählt, dass das Pfropfen des Mercaptoamin-Rests an den freien Carbonsäure-Gruppen der Asparaginsäure- und Glutaminsäurereste der Kollagen-Kette erfolgt.
Zu diesem Zweck muss der zu pfropfende Vorläufer eine freie Amin-Funktion aufweisen, die mit den COOH des Kollagens reagieren kann, um eine Amid-Bindung zu bilden. Dieser Vorläufer ist zum Beispiel ein Cystein, ein Homocystein oder ein Cysteamin, dessen Thiol-Funktion und die optionale Carbonsäure-Funktion richtig geschützt (ist) sind. Ein wirksames Mittel zum Schutz der Thiol-Funktion besteht darin, als zu pfropfenden Cysteinrest Cystin, Homocystin oder Cystamin auszuwählen, die alle drei eine Disulfid-Brücke aufweisen, die die Mercapto-Funktion stabilisiert. Als weiteres Mittel zum Schutz der Letzteren kann jede herkömmliche Funktion zum Schutz von Thiolen gewählt werden, die im Fachgebiet bekannt ist (siehe zum Beispiel "Greene: Protecting Groups in Organic Chemistry, WILEY, 1975").
Die COOH-Funktionen ihrerseits können mithilfe einer Schutzgruppe oder jeder anderen organischen Funktion geschützt werden, die eine beliebige vorteilhafte Eigenschaft mit sich bringen kann (PEG, hydrophobe oder hydrophile oder geladene Gruppierungen).
Gemäß einer vorteilhaften Anordnung der Erfindung weist der Vorläufer des zu pfropfenden Mercaptoamin-Rests eine Formel (IV) auf, die Formel (I) entspricht, die oben angegeben ist und worin die freie Valenz durch einen Substituenten ersetzt ist, der geeignet ist, mit den Carboxyl-Funktionen der Asparaginsäuren und Glutaminsäuren der Kollagen-Kette derart zu reagieren, wobei dieser Substituent vorzugsweise Wasserstoff ist, dass die reaktive Funktion ein primä res Amin ist. Die Vorläufer von Formel (IV), die insbesondere bevorzugt sind, sind Cystamin (I.1), Cystindimethylester (I.2) und Cystindiethylester (I.3), die alle drei eine Disulfid-Brücke umfassen, die die Mercapto-Funktion schützt.
In der Praxis erfolgt das Pfropfen des Mercaptoamin-Rests durch Auflösen des Kollagen-Peptids und anschließend des Vorläufers des zu pfropfenden Mercaptoamin-Rests in einem geeigneten Lösungsmittel. Dies kann zum Beispiel Wasser (vorzugsweise) oder ein organisches Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO), N-Methylpyrrolidon (NMP) oder andere sein. Der Vorläufer des zu pfropfenden Mercaptoamin-Rests ist immer mit einem starken Überschuss vorhanden, um zu verhindern, dass das aktivierte Kollagen mit den Aminen reagiert, die in seiner eigenen Hauptkette vorhanden sind.
Der Reaktionslösung wird anschließend ein Kopplungsmittel wie ein Carbodiimid zugegeben und das Pfropfen ermöglicht, während das Medium für einige Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird.
Diese Kollagen-Peptide A, die mit Mercaptoamin-Resten substituiert sind, die Vorläufer der vernetzbaren Thiolreste sind, sind neue stabile und wasserlösliche Zwischenprodukte. Sie können isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Dialyse, Diafiltration und anschließende Gefriertrocknung oder durch Ausfällung in einem organischen Medium und anschließende Trocknung.
Die intermediären Kollagenvorläufer B vom Typ Thiol, bei denen R² = H, können durch ein Verfahren gewonnen werden, das im Wesentlichen darin besteht, den Schutz der Mercapto-Funktionen der Mercaptoamin-Reste, die auf die modifizierten Kollagen-Peptide A gepfropft sind, wie zuvor angegeben ist, aufzuheben (Umwandlung in Thiole).
Wenn der Schutz oder die Maskierung der Mercapto-Funktionen durch eine Disulfid-Brücke gewährleistet ist (das heißt, wenn die Vorläufer der Pfropf-Gruppen z.B. Cystamin oder Cystin sind), erfolgt die Regeneration der Thiol-Funktion durch Reduktion. Letztere kann mithilfe von Reduktionsmitteln wie Merkaptanen (Mercaptoethanol, Mercaptoessigsäure, Mercaptoethylamin, Benzylmercaptan, Thiolcresol, Dithiothreitol ...) und/oder reduzierenden Salzen (NaBH₄, Na₂SO₃ ...) und/oder organischen Reduktionsmitteln (Phosphin) erfolgen.
Vorteilhafterweise wird die Reduktion der schützenden Disulfid-Brücke mithilfe von Dithiothreitol in einem wässrigen basischen Medium durchgeführt. Nach diesem Schritt wird das gewonnene thiolhaltige Kollagen durch Dialyse/Diafiltration gereinigt und kann, z.B. durch Gefriertrocknung, isoliert werden.
Wie sich bereits aus dem Vorstehenden ergibt, werden die vernetzten Kollagen-Peptide C durch Oxidation der Thiol-Funktionen des vernetzbaren modifizierten Kollagen-Peptids B hergestellt, sodass sich Disulfid-Brücken zwischen den Ketten bilden.
Was die Funktionalisierung der vorgenannten Kollagen-Peptide durch Pfropf-Gruppen G betrifft, die sich in ihrer Beschaffenheit von den Pfropf-Gruppen von Formel (I) (gegebenenfalls hydriert) unterscheiden, die an den COOH der Asparaginsäuren und Glutaminsäuren befestigt sind, besteht sie im Wesentlichen:

• aus der Acylierung zumindest eines Teils der freien Amin-Funktionen der Kollagen-Kette, sodass darauf Pfropf-Gruppen G befestigt werden, die eine Kohlenwasserstoff-Einheit umfassen, wobei Mercaptoamin-Reste, insbesondere solche wie oben definiert, ausgeschlossen sind, wobei diese Einheit gegebenenfalls Heteroatome (vorteilhafterweise O und/oder N) enthält, und bevorzugt ausgewählt ist aus Alkyl und/oder Alkenyl und/oder alicyclischen und/oder aromatischen Resten und noch weiter bevorzugt aus Gruppierungen, die eine gegebenenfalls ungesättigte Alkylkette umfassen oder die folgende Formel (III) aufweisen:
worin: R⁵ = H oder CH₃; R⁶ = H, ein linearer oder verzweigter Alkylrest und bevorzugt Methyl ist; Z = 0, 1 oder 2 und n > 0;
• aus dem Zurreaktionbringen des Kollagen-Peptids in Lösung mit mindestens einem Vorläufer eines Mercaptomin-Rests, dessen Thiol-Funktion und die optionale Carboxyl-Funktion blockiert sind, in Ge genwart mindestens eines Pfropfmittels, vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die Verbindungen umfasst, die Carboxyl-Gruppierungen aktivieren können, vorzugsweise Carbodiimide.

Damit sie durch Acylierung mit den freien Amin-Funktionen der Lysine der Kollagen-Kette reagieren können, müssen die Vorläufer der Pfropf-Gruppen G mindestens eine aktivierbare Carbonsäure-Funktion aufweisen.
Die Acylierungsreaktion und die Kopplungsreaktion von Amin-Funktionen mit den Carboxylgruppen, die Proteinen gehören, sind dem Fachmann im Bereich der Proteinbiochemie bekannt. Für ausführlichere Angaben hierzu wird insbesondere auf folgende Arbeiten verwiesen:

• „Techniques in protein chemistry" R. L. LUNDBLAD Chap. 10–14,
• „Chemistry of protein conjugation and cross-linking" S. S. WONG, Boca raton, CRC Press, 1993, Chap. 2.

Nach dieser Beschreibung des Produkts und wesentlichen Bestandteils des erfindungsgemäßen Mittels sind im Folgenden Einzelheiten zu den physikalischen Eigenschaften, dem Herstellungsverfahren und der Verwendungsweise dieses Mittels zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen angegeben.
Gemäß einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels liegt es in Form eines Films vor.
Unter dem Begriff „Film" wird im Sinn der vorliegenden Erfindung ein Material in Form einer Folie verstanden, dessen Oberfläche deutlich größer als die Stärke ist.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels liegt es in Form eines faserigen, gewebten oder nicht gewebten Materials vor, vorzugsweise in gewebter Form und noch weiter bevorzugt in gewebter Form mit gestrickten Maschen.
Als Beispiel für erfindungsgemäße Mittel, die aus faserigen kollagenen Werkstoffen bestehen, können gewebte und/oder gestrickte und/oder geflochtene Tücher oder auch Filze und Matten genannt werden.
Gemäß einer dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels kann es in Form eines Films (oder eines Tuchs) aus einem inhomogenen Verbundwerkstoff vorliegen, wobei ein Verstärkungsmaterial aus einem biologisch abbaubaren Polymer kollagener oder nicht kollagener Art in der Matrix enthalten ist, die aus dem zuvor definierten Kollagen-Peptid besteht. Das Polymer, das das Verstärkungsmaterial bildet, kann das Kollagen-Peptid sein, das gemäß der Erfindung ausgewählt wurde, nicht modifiziertes Kollagen oder weitere biokompatible und biologisch abbaubare Polymere wie Polymere von α-Hydroxycarbonsäuren (z.B. Polymilchsäure und/oder Polyglycolsäure), modifizierte oder nicht-modifizierte Cellulosen oder Stärken. Nicht auszuschließen ist, dass diese enthaltenen Polymere synthetische oder natürliche Polymere sind, die nicht biologisch abbaubar, jedoch biokompatibel sind (z.B. Silikone,....).
Das Verstärkungsmaterial kann in verschiedenen physikalischen Formen vorliegen, z.B.: Füllstoffteilchen oder Faserfüllstoff, Matten, Filze, gewebtes, gestricktes, geflochtenes Material... In der Praxis kann das erfindungsgemäße Mittel zum Beispiel aus einem Verbundfilm bestehen, der eine Kollagen-Peptid-Matrix umfasst, die wenigstens teilweise in vernetzter Form C vorliegt, so wie sie oben definiert ist, und ein Verstärkungsmaterial, das aus einem Gewebe oder einer Matte besteht, das bzw. die Fasern aus Polymeren von α-Hydroxycarbonsäuren umfasst (Polymilchsäure und/oder Polyglycolsäure).
Dieses faserige Verstärkungsmaterial weist zum Beispiel dieselbe Form auf wie die Matrix (beispielsweise rechteckig), wobei es etwas geringere Abmessungen aufweist.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Mittel in Form eines Films vorliegen, der nur auf einer Seite seiner Oberfläche ein faseriges Verstärkungsmaterial aufweist. In der Praxis kann das faserige Verstärkungsmaterial in seinem Mittelbereich ausgehöhlt werden.
Auf jeden Fall ist es vorteilhaft, dass das faserige Verstärkungsmaterial auf mindestens einem Teil des Rands des Verbundfilms so vorliegt, dass ein Bereich geschaffen wird, der dafür geeignet ist, Nähte aufzunehmen.
Ausgehend vom vernetzten Kollagen-Peptid in Form eines Films (gegebenenfalls Verbundfilm) ist es erfindungsgemäß möglich, nähbare Membranen herzustellen, die wirksam bei der Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen sind.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Mittel ein Verbundfilm, dessen Matrix aus vernetztem Kollagen-Peptid besteht und dessen Verstärkungsmaterial in Form eines faserigen, gewebten oder nicht gewebten Materials vorliegt, vorzugsweise in gewebter Form und noch weiter bevorzugt in gewebter Form mit gestrickten Maschen, wobei dieses Verstärkungsmaterial außerdem vorteilhafterweise aus (Co)Polymeren von α-Hydroxycarbonsäuren ausgewählt ist, vorzugsweise Polymilchsäuren und/oder Polyglycolsäuren.
Es ist jedoch erfindungsgemäß ganz und gar vorstellbar, dass das Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen an der Stelle, an der es als Sperre dienen soll, nicht in einer festen Form, sondern in einer flüssigen Form (flüssig oder zähflüssig) angeordnet (angewendet) und/oder implantiert wird. Daraus folgt, dass das Mittel gemäß einer vierten Ausführungsform des Mittels der Erfindung in nicht fester, vernetzbarer und/oder wenigstens teilweise vernetzter Form vorliegt und auf und/oder in einem Träger anwendbar und/oder implantierbar ist.
In diesem Fall ist die nicht feste Form zum Beispiel eine Lösung aus vernetzbarem Kollagen-Peptid (Vorläufer B). Sie wird unmittelbar auf einem Träger angewendet (zum Beispiel biologische Gewebe) und wird anschließend einer Vernetzung unterworfen, durch die ihre Aushärtung zum Gel möglich ist. Die Vernetzung kann in situ durch Wirkung eines oxidierenden chemischen Wirkstoffs erreicht werden, der medizinisch akzeptiert ist, durch den Sauerstoff der Luft oder durch jedes andere Mittel zur Oxidation, das während einem chirurgischen Eingriff einfach eingesetzt werden kann (UV, Elektrokoagulation...).
Bei dieser vierten Ausführungsform kann die nicht feste Form des Kollagen-Peptids, die im erfindungsgemäßen Mittel enthalten ist, vorteilhafterweise in Form einer Flüssigkeit vorliegen, die in Form eines Gels insbesondere durch Oxidation und/oder physikalisch geliert werden kann, das auf einem Träger angewendet werden soll (z.B. biologische Gewebe), wo es seine Wirkung gegen Verklebungen ausübt.
In dieser nicht festen gelierten Form kann das Kollagen-Peptid, gegebenenfalls, jedoch nicht notwendigerweise, teilweise in einer vernetzten Form vorliegen. Es versteht sich jedoch von selbst, dass bei dieser Möglichkeit der Anteil des vernetzten Kollagen-Peptids C im Vergleich zu seinem nicht-vernetzten Vorläufer B derart gewählt ist, dass der feste Aggregatzustand nicht erreicht wird.
Die nicht feste Form (d.h. flüssig) Kollagen-Peptid-Vorläufers, nämlich z.B. eine flüssige Kollagenlösung, kann unmittelbar mithilfe eines Werkzeugs, vorzugsweise einer Spritze oder einem Zerstäuber (Spray) angewendet werden. Somit umfasst gemäß einer vorteilhaften Abwandlung der vierten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels Letzteres wenigstens ein Werkzeug, vorzugsweise eine Spritze oder einen Zerstäuber, zur Lagerung und Anwendung in und/oder auf einem Träger, in der Form eines nicht festen vernetzbaren und/oder wenigstens teilweise vernetzten Kollagen-Peptids, wie sie zuvor definiert ist.
Wenn das erfindungsgemäße Mittel ein Zerstäuber des modifizierten Kollagen-Peptids in flüssiger Form (Spray) ist, kann die Zerstäubung durch ein Pumpe/Düse-System und/oder durch ein gasförmiges Treibmittel gewährleistet werden.
Der Träger kann hier als biologisches Gewebe verstanden werden (beispielsweise tierisch), das verbunden werden soll und/oder behandelt wird, z.B. am lebenden Organismus, um post-chirurgische Verklebungen zu verhindern.
Gegebenenfalls können die Fließeigenschaften der Kollagenlösung durch Zugabe eines natürlichen oder synthetischen Polymers eingestellt werden, das biokompatibel und vorzugsweise biologisch abbaubar ist (zum Beispiel Polysaccharide, Glykosaminoglykane, Proteine oder Glykoproteine, ethoxylierte Polymere wie Polyethylenglykol...).
Wird zur Vernetzung der Lösung ein chemischer Wirkstoff verwendet, wird er vorteilhafterweise aus den Oxidationsmitteln ausgewählt, die üblicherweise in der Medizin verwendet werden, beispielsweise Wasserstoffperoxid.
Mit dieser vierten Ausführungsform des Mittels der Erfindung (Kollagen-Peptid-Flüssigkeit/-Gel) kann ein Verfahren zum Bereitstellen eines Mittels zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen an lebenden Geweben verbunden sein, das dadurch gekenn zeichnet ist, dass es im Wesentlichen aus Folgendem besteht:

• Verwendung eines Kollagenfluids, z.B. einer Lösung, des Kollagen-Peptids der Art, wie sie zuvor definiert wurde;
• Anwendung dieses Fluids auf biologische Gewebe, zum Beispiel mithilfe einer Spritze der eines Zerstäubers;
• und Bewirken einer Vernetzung des Kollagenfluids in situ, zum Beispiel mithilfe eines biokompatiblen Oxidationsmittels (z.B. Sauerstoff der Luft, H₂O₂...).

Gemäß einer ersten Durchführungsart dieses Verfahrens kann das Mischen von Oxidationsmittel und Fluid, zum Beispiel der Kollagenlösung, vor der Aufbringung erfolgen. In diesem Fall ist die angewendete Lösung zum Zeitpunkt der Aufbringung bereits teilweise vernetzt. Die Homogenität des Gemischs Lösung/Oxidationsmittel kann durch eine Anwendungsvorrichtung wie ein Doppelspritzensystem gewährleistet werden, das mit einem Mischkopf versehen ist (ähnliche Vorrichtung wie die, die für biologische Klebstoffe auf der Grundlage von Fibrin verwendet wird), wie ein Doppelzerstäuber, der mit einer Mischdüse versehen ist, oder wie jede andere Vorrichtung, mit der ein homogenes Gemisch gewährleistet werden kann.
Gemäß einer zweiten Durchführungsart dieses Verfahrens erfolgt die Anwendung in zwei Abschnitten. Vorzugsweise erfolgt zuerst die Aufbringung des Fluids, zum Beispiel der flüssigen Kollagenlösung, und anschließend wird die Oxidationslösung aufgebracht.
Jedoch kann die Zugabe auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen.
Gemäß einer fünften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels liegt dieses in Form eines homogenen oder zusammengesetzten Blocks vor, der nicht mit einem Film vergleichbar ist.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen, wie sie zuvor beschrieben sind.
Gemäß einem ersten Weg der Durchführung, der der Herstellung der festen Formen entspricht (beispielsweise homogene oder zusammengesetzte Filme oder Blöcke: erste, dritte und fünfte Ausführungsform), umfasst das Verfahren die folgenden wesentlichen Schritte:

1. Bereitstellen einer bevorzugt wässrigen Lösung von vernetzbarem Vorläufer eines modifizierten Kollagen-Peptids;
2. gegebenenfalls Filtrieren dieser Lösung, um Bestandteile mit einer Größe von 0,8 μm oder größer, bevorzugt größer oder gleich 0,45 μm und noch weiter bevorzugt größer oder gleich 0,2 μm zu entfernen;
3. Formen des Filtrats in die für das herzustellende Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen vorgesehene Konfiguration;
4. gegebenenfalls Gelieren der geformten Lösung bei einem Sättigungsstadium, indem die Temperatur der Lösung unter ihre Geliertemperatur erniedrigt wird;
5. gegebenenfalls Entfernen des Lösungsmittels, vorzugsweise durch Verdampfen;
6. Bewirken der Vernetzung, vorzugsweise durch Oxidation;
7. gegebenenfalls Entfernen des verwendeten optionalen Oxidationsmittels durch aufeinanderfolgendes Spülen;
8. gegebenenfalls Imprägnieren des Materials in vernetztem Zustand oder im Verlauf der Vernetzung mithilfe einer Lösung wenigstens eines Weichmachers (beispielsweise Glycerin, Polyethylenglycol mit niedriger Molekülmasse);
9. gegebenenfalls Trocknen des vernetzten Materials;
10. gegebenenfalls Zuschneiden des Materials zu Abmessungen für die Anwendung;
11. gegebenenfalls Sterilisieren des vernetzten Materials durch Bestrahlen.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens kommt daher, dass es einfach, steril und wirtschaftlich durchgeführt werden kann.
Schritt 1 des Inlösungbringens erfolgt zum Beispiel mithilfe eines Lösungsmittels, das aus sterilem Wasser besteht, bei einer Temperatur zwischen 20 und 50 °C und einem pH-Wert zwischen 6 und 8. Gemäß einer bevorzugten Eigenschaft dieses ersten erfindungsgemäßen Verfahrenswegs weist die in Schritt 1 gebildete Lösung einen Gehalt an vernetzbarem Vorläufer eines Kollagen-Peptids auf, der größer oder gleich 1 % ist und vorzugsweise zwischen 1 und 15 % liegt.
Schritt 2 der Filtration, der fakultativ, jedoch trotzdem bevorzugt ist, ist ein Mittel zur Reinigung, sogar zur Sterilisation der in Schritt 1 gebildeten Lösung. Dank der Wasserlöslichkeit des Vorläufers des vernetzten Kollagen-Peptids, das erfindungsgemäß ausgewählt wurde, ist es möglich, die Vorläuferlösungen über Filter zu filtrieren, deren Porosität unter 0,8 Mikrometer liegt, vorzugsweise % 0,45 Mirkometer und noch bevorzugter in der Größenordnung von 0,2 Mikrometer. Diese Möglichkeit, durch Filtration eine Sterilisation vornehmen zu können, ist ein wichtiger Vorteil in industrieller Hinsicht.
Schritt 3 besteht im Formen der gefilterten Lösung, um einen vernetzten Gegenstand mit kontrollierter Form und Größe zu erhalten. Um Schritt 3 durchzuführen, kann die gefilterte Lösung zum Beispiel in vorzugsweise sterile Formen gegossen werden. Gemäß einer Abwandlung dieses Schritts kann die gefilterte Lösung auch durch Beschichten auf einen ebenen sterilen Träger aufgebracht werden. Gemäß einer weiteren Abwandlung kann das Formen durch Extrudieren der Lösung über eine Form gewährleistet werden, die eine für das vorgesehene Mittel geeignete Form aufweist, zum Beispiel rechteckig. In diesem letzten Fall muss beim Extrudieren eine gewisse Verfestigung erfolgen, damit sie möglich ist.
Die Sättigung der Lösung von Schritt 4 (oder physikalische Gelierung), die fakultativ, jedoch trotzdem bevorzugt ist, besteht darin, die geformte Lösung für mehrere Stunden, ja sogar mehrere Tage, bei einer Temperatur unter ihrer Geliertemperatur oder ihrer Temperatur des Übergangs gelförmig/fest ruhen zu lassen, die im Fall einer wässrigen Kollagen-Peptidlösung zum Beispiel zwischen 20 °C und 30 °C liegen kann.
Die Entfernung des Lösungsmittels, vorzugsweise Wasser, gemäß Schritt 5 ist ein freiwilliger Abschnitt, der während oder nach der Gelierung durchgeführt werden kann, vorzugsweise danach. Es kann sich vorzugsweise um eine Verdampfung bei einer bestimmten Temperatur in optionaler Gegenwart von Trockenmitteln handeln.
Die Vernetzung gemäß Schritt 6 erfolgt an geformten Gegenständen, die gegebenenfalls geliert sind und vorteilhafterweise in trockener Form vorliegen. Die Vernetzung besteht in der Oxidation des Kollagen-Peptid-Vorläufers vom Typ Thiol mithilfe eines Oxidationsmittels wie Iod oder H₂O₂. Nach mehreren Minuten Kontakt mit dem Oxidationsmittel wird vorzugsweise (Schritt 7) das aufeinanderfolgende Spülen der so geformten Gegenstände durchgeführt. Sie können anschließend nach Wunsch in verschiedene Mittel zur Verhinderung von postchirurgischen Verklebungen umgestaltet werden.
Am Ende dieser Schritte befinden sich die erhaltenen vernetzten Materialien in einem hydratisierten Zustand. Sie können gegebenenfalls (Schritt 8) mithilfe eines Weichmachers, der üblicherweise für das Formen von kollagenen Werkstoffen verwendet wird (Glycerin, Polyethylenglycol mit geringer Molekülmasse) imprägniert werden. Der Weichmacher kann auch bereits ab Schritt 1 der Herstellung der Lösung zugegeben werden.
Schließlich können die kollagenen Werkstoffe getrocknet werden (Schritt 9), die mit Weichmacher(n) versehen oder nicht versehen wurden.
Obwohl dieses Verfahren mithilfe steriler Mittel durchgeführt werden kann und gegebenenfalls einen sterilisierenden Filtrationsschritt umfassen kann, kann ein zusätzlicher Sterilisationsschritt (Schritt 10) vorgesehen werden, zum Beispiel mit β-Strahlung.
Die erhaltenen Gegenstände, zum Beispiel die Filme, sind im trockenen Zustand über einen langen Zeitraum stabil und können nach Rehydration in jeder geeigneten wässrigen Flüssigkeit gehandhabt werden.
Gemäß einer Abwandlung dieses ersten Wegs zur Herstellung des Mittels der Erfindung kann zum Beispiel ein Verstärkungsmaterial während Schritt 3 eingebracht werden, entweder durch Gießen der gefilterten Kollagenlösung auf das Verstärkungsmaterial, das sich in der Form befindet, oder auf den Träger, oder durch Aufbringen des Verstärkungsmaterials auf die bereits gegossene und gegebenenfalls gelierte Lösung. Im letzten Fall kann wieder eine zweite Schicht der Kollagenlösung aufgebracht werden. Je nach der Art und Weise, wie das Verstärkungsmaterial eingebracht wird, kann so eine Membran gewonnen werden, die eine „Kollagen-Peptid"seite und eine „Verstärkungsmaterial"seite aufweist oder eine dreischichtige Membran „Kollagen-Peptid/Verstärkungsmaterial/Kollagen-Peptid". Diese Beispiele sind nicht einschränkend und es können weitere Abwandlungen des Verfahrens in Betracht gezogen werden, durch die Verbundwerkstoffe aus dem zuvor definierten Kollagen-Peptid erhalten werden können.
Gemäß einem zweiten Weg der Durchführung, der den nicht festen (flüssigen) Formen der erfindungsgemä ßen Mittel entspricht, umfasst das Verfahren die folgenden wesentlichen Schritte:

1. Bereitstellen einer bevorzugt wässrigen Lösung von vernetzbarem Vorläufer eines modifizierten Kollagen-Peptids;
2. gegebenenfalls Filtrieren dieser Lösung, um Bestandteile mit einer Größe von 0,8 μm oder größer, bevorzugt größer oder gleich 0,45 μm und noch weiter bevorzugt größer oder gleich 0,2 μm zu entfernen;
3. gegebenenfalls Konzentrieren der Lösung;
4. steriles Konditionieren der Lösung in inerter Atmosphäre.

Gemäß einer bevorzugten Eigenschaft dieses zweiten erfindungsgemäßen Verfahrenswegs weist die in Schritt 1 gebildete Lösung einen Gehalt an vernetzbarem Vorläufer eines modifizierten Kollagen-Peptids auf, der größer oder gleich 1 % ist und vorzugsweise zwischen 1 und 15 % liegt und einen pH-Wert aufweist zwischen 4 und 10 und vorzugsweise zwischen 6 und 8.
Während Schritt 1 können der Lösung biokompatible synthetische oder natürliche Polymere oder kleine biokompatible Moleküle zugegeben werden, die die Reologie der Lösung modifizieren können und die Gelierung des Materials verzögern (zum Beispiel Harnstoff).
In der Praxis ist die enthaltene Menge der Polymere derart, dass die Polymere in der vernetzten Endform des Mittels zur Verhinderung zwischen 1 und 50 % der Gesamttrockenmasse ausmachen und vorzugsweise zwischen 1 und 20 %. Schritt 1 wird vorzugsweise unter sterilen Bedingungen unter Verwendung von sterilen Polymeren (Kollagen-Peptid-Vorläufer und optionale zusätzliche Polymere) durchgeführt.
Schritt 2 zur Filtration ist freiwillig und nicht notwendig, wenn Schritt 1 unter sterilen Bedingungen durchgeführt wurde. Findet die Filtration statt, wird sie bei einer Temperatur von über 35 °C und vorzugsweise zwischen 40 und 50 °C durchgeführt.
Schritt 3 zur Konzentration ist freiwillig. Sie erfolgt steril durch teilweises Verdampfen des Lösungsmittels, um konzentrierte Lösungen zu gewinnen, die einen Gehalt an vernetzbarem Vorläufer eines Kollagen-Peptids von zwischen 5 und 30 % und vorzugsweise zwischen 10 und 20 % aufweisen.
Schritt 4 zur Konditionierung wird steril in einer inerten Atmosphäre (Stickstoff oder Argon) durchgeführt. Die Lösung wird in einem Behälter konditioniert, der die endgültige Anwendungsform sein kann (Spritze oder Zerstäuber) oder eine Vorratsflasche.
Es ist festzuhalten, dass die flüssige Form des Mittels bei Raumtemperatur in gelierter Form vorliegen kann. Dieses Gel, das kennzeichnend für Kollagenprodukte ist, kann nach Rühren für einige Sekunden bei 40 °C wieder verflüssigt werden.
Diese Lösung kann schließlich durch Oxidation zu einem chemischen Gel vernetzt werden.
Gemäß einem dritten Weg der Durchführung, bei dem die beiden ersten verbunden werden, wird die kondi tionierte Lösung, die am Ende von Schritt 4 des zweiten Wegs gewonnen wird, auf einem Träger angewendet und es wird eine Vernetzung bewirkt, vorzugsweise mithilfe eines biokompatiblen Oxidationsmittels.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung umfasst die Verwendung der zuvor beschriebenen Mittel (Film, Flüssigkeit/Gel auf der Grundlage des Kollagen-Peptids) zur Verhinderung von postoperativen Verklebungen.
Die Mittel der Erfindung weisen den Vorteil auf, dass sie während des chirurgischen Eingriffs einfach angeordnet werden können. Dies hängt von der physikalischen und chemischen Form des Mittels ab (vernetzte Membran oder nicht-vernetzte flüssige Form).
Die Membranen können zu dem Zeitpunkt, wenn sie benötigt werden, auf die Abmessungen des geschädigten zu schützenden Bereichs zugeschnitten werden. Die Membranen werden zwischen den biologischen Geweben angewendet, die chirurgische Verklebungen bilden könnten. Sie können in trockener Form angeordnet oder kurz vor der Anordnung in physiologischer Kochsalzlösung hydratisiert werden. Durch Nähte oder durch vorheriges Aufbringen eines Klebstoffs für chirurgische Zwecke (auf der Grundlage von Fibrin oder kollagenen Werkstoffen) kann sichergestellt werden, dass sie halten.
Gemäß einer Abwandlung der Verwendung kann die Membran nach einem herkömmlichen chirurgischen Verfahren der Laparoskopie zusammengerollt und mithilfe eines Trokars eingebracht werden.
Was die nicht festen Mittel (Flüssigkeiten/Gele) zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen betrifft, können sie insbesondere auf zwei Arten angewendet werden, die im Folgenden definiert sind.
Gemäß einer ersten Anwendungsweise kann die flüssige Form mithilfe einer Spritze, eines Zerstäubers oder jeder anderen Anwendungsvorrichtung unmittelbar auf die beschädigten Gewebe aufgebracht werden. Je nach Zusammensetzung der Zubereitung und Anwendungsweise kann es notwendig sein, die Lösung für einige Sekunden vor der Anwendung auf 40 °C zu erhitzen. Die Vernetzung wird dann in situ in einem zweiten Schritt durch Anwendung eines oxidierenden chemischen Wirkstoffs gewährleistet, der für chirurgische Zwecke akzeptabel ist, zum Beispiel eine verdünnte Wasserstoffperoxidlösung. Gemäß der Abwandlungen dieser Anwendungsweise können der Sauerstoff der Luft, UV-Strahlen oder andere Energiequellen verwendet werden, die eine Oxidation bewirken können.
Gemäß einer zweiten Anwendungsweise wird die flüssige Form (Vorläufer) des nicht-vernetzten Kollagen-Peptids kurz vor der Anwendung mithilfe einer geeigneten Vorrichtung (Doppelspritze, die mit einem Mischkopf versehen ist, Doppelzerstäuber mit Mischdüse oder anderere Mischvorrichtung) mit einem oxidierenden chemischen Wirkstoff vermischt.
Diese beiden Anwendungsweisen können auch derart angepasst werden, dass sie bei der laparoskopischen Chirurgie verwendet werden können.
Allgemeiner ausgedrückt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die konditionierte Lösung auf einen Träger (biologische Gewebe) aufträgt (z.B. Einspritzen oder Zerstäuben) und eine Vernetzung bewirkt, vorzugsweise durch ein biokompatibles Oxidationsmittel.
Aus der vorstehenden Beschreibung folgt, dass die erfindungsgemäßen Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen zum Beispiel sind:

• entweder feste Mittel wie Filme oder Membranen, die gegebenenfalls zusammengesetzt sind und/oder aus mehreren Schichten bestehen, die im Wesentlichen das Kollagen-Peptid enthalten, das wenigstens teilweise vernetzt ist, so wie oben definiert,
• oder nicht feste Mittel (Flüssigkeiten/Gele), die denselben kollagenen Werkstoff in nicht-vernetzter Form umfassen, der am lebenden Organismus angewendet werden und vernetzen soll, um in situ am Wirkort (biologische Gewebe) die festen Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen zu bilden.

Durch die Beschaffenheit ihres wesentlichen Bestandteils weisen diese Mittel in der vernetzten Form ausgezeichnete Eigenschaften hinsichtlich der mechanischen Festigkeit, als physikalische Sperre gegen Verklebungen, hinsichtlich der Biokompatibilität, der Bioresorbierbarkeit, der Ungiftigkeit und der Herstellung industriell herstellbarer Zubereitungen auf, wobei diese Eigenschaften denen der Mittel nach dem Stand der Technik ganz und gar überlegen sind.
Durch die folgenden Beispiele kann die Erfindung in all ihren Gesichtspunkten verstanden werden und können alle ihre Vorteile und Abwandlungen der Anwendung gezeigt werden.
BEISPIELE
TEIL 1 : SYNTHESE DER MITTEL
BEISPIEL 1: SYNTHESE EINES KOLLAGEN-PEPTIDS (FORM B), DESSEN CARBONSÄUREN DURCH CYSTEIN-ETHYLESTER SUBSTITUIERT SIND (SUBSTITUTIONSGRAD 7 MOLPROZENT DER AMINOSÄUREN).
1) Schritt I: Kopplung (Herstellung von Form A)
25 g Atelokollagen (Typ I + III, aus Kalbshaut gewonnen, 1,3 mmol COOH/g) werden in 2,5 1 Wasser gegeben und die Temperatur des Mediums wird unter Rühren auf 50 °C erhöht. Die so gewonnene 1 % m/v Lösung wird über 0,22 μm filtriert.
Sobald die Temperatur auf 30 °C gesenkt ist, werden 46,5 g Cystindiethylester zugegeben und der pH-Wert wird auf 4,2 eingestellt. Dann werden 12 g 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid zugegeben, und man lässt die Reaktion für 2 h bei 30 °C unter Rühren ablaufen. Das Reaktionsmedium wird auf 5 m/v konzentriert und gegen Wasser dialysiert, um überschüssige Reaktionspartner und die Nebenprodukte der Reaktion zu entfernen.
Das gewonnene Produkt ist ein stabiles Synthesezwischenprodukt. Es handelt sich um ein Kollagen-Peptid (Form A), bei dem ein Teil der Asparaginsäuren und Glutaminsäuren durch Cystindiethylester ersetzt ist. Es kann durch Gefriertrocknung isoliert oder reduziert werden, damit das entsprechende Thiolkollagen (Form B) entsteht.
2) Schritt II: Reduktion (Herstellung von Form B):
Zu dem modifizierten Kollagen-Peptid in Lösung in Wasser bei 5 % m/v, das in Schritt I gewonnen wurde, werden 7,6 g Glycin, 5,8 g 1,4-Dithiothreitol und die Menge 4 N NaOH zugegeben, die ausreicht, um einen pH-Wert von 9,0 zu erreichen. Das Reaktionsmedium wird drei Stunden lang bei 35 °C gerührt. In diesem Abschnitt wird die Lösung mit 6 N HCl auf pH 2 sauer eingestellt, gegen 0,012 N HCl dialysiert, um alle Reaktionspartner und Nebenprodukte der Reaktion zu entfernen und anschließend über 0,22 μm filtriert. Das so gereinigte Produkt wird durch Gefriertrocknung isoliert.
Der Substitutionsgrad wird durch Bestimmung mit 5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB) gemessen, einem Reaktionspartner, der spezifisch für Thiol-Funktionen ist. Diese Bestimmung ist beschrieben in: "Ellman G. L., Tissue sulfhydryl groups, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 82, 70–77".
[SH]: 0,706 mmol/g des Trockenguts, d.h. 7 Molprozent substituierte Aminosäuren.
Die gesamte Synthese kann steril erfolgen, sodass das Produkt am Ende in Form eines sterilen Lyophilisats gewonnen wird.
BEISPIEL 2: HERSTELLUNG EINES FILMS AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN ZUR VERHINDERUNG VON POSTOPERATIVEN VERKLEBUNGEN, MIT IOD VERNETZT.
Schritt 1:
Eine Lösung mit 20 g/l Kollagen-Peptid-Vorläufer gemäß Beispiel 1 wird durch Auflösen des Lyophilisats in sterilem Wasser hergestellt. Bei diesem Beispiel werden 2,0 g Lyophilisat in 98 g sterilem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird in einem geschlossenen Behälter für 15 min bei 40 °C gerührt, um die vollständige Auflösung zu erreichen. Der pH-Wert der Lösung wird mit 1 N Soda bei 25 °C auf 6,5 eingestellt. Die Lösung wird für 10 min bei 40 °C erneut gerührt.
Schritt 2:
Die Lösung wird bei 40 °C über Membranen mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert, anschließend über Membranen mit einer Porengröße von 0,2 μm. Die letzte Filtration erfolgt über sterilen Formen (es können Petrischalen aus Polystyrol verwendet werden).
Schritt 3:
40,0 g filtrierte Lösung werden in zwei Formen von 12 cm × 12 cm gegossen. Die Formen werden wieder geschlossen.
Schritt 4:
Die Sättigung der Lösung, die in einer physikalische Gelierung zum Ausdruck kommt, erfolgt über 24 h bei einer Temperatur von 16 °C ± 1. Diese Temperatur liegt notwendigerweise unter der Temperatur des Gel-Sol-Übergangs. Die Sättigung erfolgt in einem Raum mit Temperaturregelung, wobei sich die Formen auf einer waagerechten Platte befinden.
Schritt 5:
Nach 24 h werden die Deckel von den Formen abgenommen, und es erfolgt über 24 h das Verdampfen der gelierten Lösungen bei der gleichen Temperatur in einem geschlossenen Raum in Gegenwart von Trocknungsmitteln (üblicherweise Sodatabletten). Nach 24 h sind die gewonnenen Filme trocken, klar und glatt.
Schritt 6:
Die Vernetzung der trockenen Filme erfolgt bei 20 °C, indem 30 g Iodalkohollösung dazugegossen werden, die durch Auflösen von 1,0 g Iod in 100 ml Ethanol gewonnen wird, und 30 g Wasser ist notwendig, um einen vernetzten Film zu erhalten. Der vernetzte Film wird aus der Iodlösung entnommen.
Schritt 7:
Es wird nacheinander mit 80 %igen Ethanollösungen und anschließend mit Phosphatpuffer bis zur vollständigen Entfärbung des Films gespült.
Alle verwendeten Lösungen sind steril.
Schritt 8:
Bei diesem Beispiel erfolgt kein Imprägnierungsschritt mit einem Weichmacher.
Schritt 9:
Der Film wird anschließend unter einer Laminarbox über 24 h trocknen gelassen. Der gewonnene getrocknete Film enthält einen Restwassergehalt von etwa 10 %.
Schritt 10:
Der Film wird anschließend einfach auf die der Anwendung entsprechenden Abmessungen zugeschnitten.
Schritt 11:
Jedes Stück wird einzeln in einen Beutel konditioniert, damit es mit R-Strahlung sterilisiert werden kann.
Die gewonnenen Filme sind bei Raumtemperatur mehrere Monate stabil. Nach 24 h in Wasser oder einem Phosphatpuffer bleiben sie stabil und können gehandhabt werden.
BEISPIEL 3: HERSTELLUNG EINES FILMS AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN ZUR VERHINDERUNG VON POSTOPERATIVEN VERKLEBUNGEN, MIT WASSERSTOFFPEROXID VERNETZT.
Das Verfahren ist das Gleiche, ungeachtet der Art des Ausgangsstoffs (Kollagen) als auch des Pfropfgrads des Kollagen-Peptid-Vorläufers. Schritt 1 bis 5 von Beispiel 3 bis zur Gewinnung der trockenen nicht-vernetzten Filme werden wiederholt.
Schritt 6':
Die Vernetzung der trockenen Filme erfolgt bei 20 °C, indem 30 g 0,3 %ige Wasserstoffperoxidlösung in eine wässrige 0,1 m-Ammoniumacetatlösung gegossen werden.
Schritt 7:
Der vernetzte Film wird herausgenommen und nacheinander mit 30 g Phosphatpuffer mit pH 7,4 und 30 g Wasser gespült.
Alle verwendeten Lösungen sind steril.
Schritt 8:
Bei diesem Beispiel erfolgt kein Imprägnierungsschritt mit einem Weichmacher.
Schritt 9:
Der Film wird anschließend unter einer Laminarbox über 24 h trocknen gelassen. Der gewonnene getrocknete Film enthält einen Restwassergehalt von etwa 10 %.
Schritt 10:
Der Film wird anschließend einfach auf die der Anwendung entsprechenden Abmessungen zugeschnitten.
Schritt 11:
Jedes Stück wird einzeln in einen Beutel konditioniert, damit es mit Betastrahlen sterilisiert werden kann. Die gewonnenen Filme sind bei Raumtemperatur stabil. Nach 24 h in Wasser oder einem Phosphatpuffer bleiben sie stabil und können gehandhabt werden.
BEISPIEL 4: ZUGEIGENSCHAFTEN DER FILME, DIE GEMÄSS BEISPIEL 2 GEWONNEN WURDEN.
Die Messungen der mechanischen Eigenschaften der vernetzten Kollagenfilme werden mit einem Universalprüfgerät DY34 von Adamel Lhomargy durchgeführt. Die Filme werden bei Raumtemperatur in einem physiologischen Phosphatpuffer (PBS, pH = 7,4) für 2 h hydratisiert. Anschließend werden sie mit einem sehr scharfen Stanzwerkzeug in Bänder mit den Maßen 4 mm mal 30 mm geschnitten. Die Dicke wird an den hydratisierten Prüfkörpern gemessen. Die Prüfkörper werden an einem Papprahmen befestigt, der dabei hilft, sie in den Spannbacken anzuordnen. Der Filmprüfkörper bleibt hydratisiert. Der Rahmen wird kurz vor dem Zugversuch geschnitten, der bei einer gleichmäßigen Geschwindigkeit von 2 mm/min abläuft.
Der Anfangselastizitätsmodul sowie die Bruchspannung werden anhand der Spannungs-Dehnungskurve unter Verwendung der Abschnitte der hydratisierten Prüfkörper berechnet.
Die Zugeigenschaften der Filme, die gemäß dem Verfahren gewonnen wurden, das unter Beispiel 3 beschrieben ist, hängen vom Ausgangsstoff (Kollagen oder Gelatine) und dem Pfropfgrad der Kollagen-Peptid-Vorläufer ab.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften eines Films, der gemäß Beispiel 2 gewonnen wurde.
BEISPIEL 5: HERSTELLUNG EINES VERNETZTEN VERBUNDFILMS AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN UND SYTHETISCHEM GEWEBE ZUR VERHINDERUNG VON POSTOPERATIVEN VERKLEBUNGEN.
Das Verfahren zur Filmherstellung ist das Gleiche, ungeachtet der Art des Ausgangsstoffs (Kollagen) als auch des Pfropfgrads des Kollagen-Peptid-Vorläufers. Schritt 1 und 2 stimmen genau mit denen überein, die bei Beispiel 3 beschrieben sind.
Schritt 3 ist folgendermaßen abgewandelt.
Ein synthetisches Gewebe (beispielsweise im Handel erhältliches biologisch abbaubares Polyestergewebe, mit den Maßen 10 × 10 cm² und einer Dicke von etwa 200 μm) wird in jeder Form (12 × 12 cm²) angeordnet.
40,0 g filtrierte Lösung werden auf das Gewebe gegossen. Die Formen werden wieder geschlossen.
Schritt 4 und 5 stimmen genau mit denen überein, die bei Beispiel 3 beschrieben sind.
Die Oxidation kann mit einer Iodlösung oder Wasserstoffperoxid erfolgen. Schritt 6 bis 11 stimmen je nach gewähltem Verfahren mit denen überein, die bei Beispiel 3 oder Beispiel 4 beschrieben sind.
Die gewonnenen Filme sind bei Raumtemperatur stabil. Nach 24 h in Wasser oder einem Phosphatpuffer bleiben sie stabil und können gehandhabt werden. Sie weisen mechanische Eigenschaften auf, die denen der nicht-verstärkten Membranen überlegen sind. Sie weisen außerdem eine sehr gute Reißfestigkeit auf, durch den sie sehr leicht genäht werden können. Sie können zusammengerollt werden, wodurch sie in Trokare eingeführt werden können.
BEISPIEL 6: HERSTELLUNG EINER FLÜSSIGEN FORM AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN ZUR VERHINDERUNG POSTOPERATIVER VERKLEBUNGEN, DAS IN SITU VERNETZBAR IST.
Das Verfahren zur Herstellung der flüssigen Form ist das Gleiche, ungeachtet der Art des Ausgangsstoffs (Kollagen) als auch des Pfropfgrads des Kollagen-Peptid-Vorläufers.
Bei diesem Beispiel liegt der Kollagen-Peptid-Vorläufer (Beispiel 1) in Form eines sterilen Lyophilisats vor.
Schritt 1:
Eine Lösung mit 85 g/l modifiziertem Kollagen wird durch Auflösen des Lyophilisats (Beispiel 1) unter sterilen Bedingungen in sterilem Wasser hergestellt. Bei diesem Beispiel werden 1,50 g Lyophilisat mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 11 % in 8,3 g sterilem Wasser aufgelöst (vorher mit sterilem Stickstoffstrom entgast). Die Lösung wird in einem geschlossenen Behälter für 15 min bei 45 °C gerührt, um die vollständige Auflösung zu erreichen. Der pH-Wert der Lösung wird mit 5,9 ml 0,1 N Soda auf 7 eingestellt, die durch Filtration über 0,2 Mikrometer sterilisiert sind.
Schritt 2 und 3:
Bei diesem Beispiel finden keine Filtrations- und Konzentrationsschritte statt, da das Ausgangslyophilisat steril ist und mit der angestrebten Endkonzentration unter sterilen Bedingungen in Lösung gebracht wird.
Schritt 4:
Die Lösung wird in hermetisch verschlossene sterile Spritzen je 1 ml aufgeteilt.
BEISPIEL 7:
Es wird alles wiederholt, mit dem Unterschied, dass die Lösung bei Schritt 4 nicht in Spritzen, sondern in einer Zerstäuberflasche steril konditioniert wird.
TEIL II: BIOLOGISCHE BEWERTUNG BEISPIEL 8: ERPROBUNG EINES ERFINDUNGSGEMÄßEN KOLLAGENFILMS, WIE ER IN BEISPIEL 3 GEWONNEN WIRD.
Das Ziel dieser Untersuchung besteht darin, die Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Kollagenfilms, so wie er in Beispiel 3 gewonnen wird, hinsichtlich der Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen zu bewerten.
Diese Untersuchung erfolgt an weiblichen Ratten, an einer peritonealen Stelle, über einen Beobachtungszeitraum von mindestens 2 Wochen.
Die Wirksamkeit des Produkts wird durch makroskopische Beobachtung möglicher Verklebungen an den Anwendungsstellen bewertet. Es werden untersucht: die Häufigkeit, Größe und Schwere der ausgebildeten Verklebungen.
Im Bereich der Gebärmutterhörner und eines parietalen Fensters werden bei weiblichen Ratten traumatische Verletzungen der peritonealen Serosa erzeugt.
Der Film wird derart angeordnet, dass die erzeugten parietalen und Gebärmutterverletzungen über einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen getrennt werden. Bei jeder weiblichen Ratte werden eine Vergleichsstelle und eine Teststelle angelegt.
Nach den mindestens 2 Wochen werden die Tiere durch Einspritzen einer tödlichen Barbituratdosis geopfert.
Die Schwere der Verklebungen wird mit einer Einteilung von 0 bis 3 bewertet:

– 0: keine Verklebungen,
– 1: unauffällige Verklebungen, die durch stumpfe Durchtrennung gelöst werden können,
– 2: mäßige Verklebungen, die eine teilweise scharfe Durchtrennung erfordern,
– 3: ernsthafte Verklebungen, die nicht ohne umfangreiche scharfe Durchtrennung gelöst werden können.

Um die Ergebnisse auszudrücken, werden die Einteilungen der 10 Vergleichsstellen zusammengezählt und wird anschließend der Durchschnitt ermittelt. Dieser Durchschnittswert entspricht damit der mittleren Schwere der Verklebungen.
Bei den Vergleichsstellen beträgt der erhaltene Durchschnitt 2,2. Außerdem weisen alle untersuchten Stellen Verklebungen auf 95 % der Fläche der Verletzung auf.
Bei den Teststellen beträgt die mittlere Einteilung 0,22.
Es ist festzuhalten, dass nur 3 Stellen von 10 untersuchten Stellen Verklebungen aufwiesen und dass die Verklebungen nur auf etwa 10 % der Fläche der Verletzung vorhanden waren.
Schlussfolgernd wird eine Verringerung der Stärke der Verklebungen um 90 % erhalten. Sowie eine sehr starke Verringerung der Anzahl und der Fläche dieser Verklebungen.
BEISPIEL 9: ERPROBUNG EINES ERFINDUNGSGEMÄßEN FILMS AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN/GEWEBE, WIE ER IN BEISPIEL 5 GEWONNEN WIRD.
Das Ziel dieser Untersuchung besteht darin, die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Films aus modifiziertem Kollagen/Gewebe, der in Beispiel 5 beschrieben ist, hinsichtlich der Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen zu bewerten.
Diese Untersuchung erfolgt an weiblichen Ratten, an einer peritonealen Stelle, über einen Beobachtungszeitraum von mindestens 2 Wochen.
Die Wirksamkeit des Produkts wird durch makroskopische Beobachtung möglicher Verklebungen an den Anwendungsstellen bewertet. Es werden untersucht: die Häufigkeit, Größe und Schwere der ausgebildeten Verklebungen.
Im Bereich der Gebärmutterhörner und eines parietalen Fensters werden bei weiblichen Ratten traumatische Verletzungen der peritonealen Serosa erzeugt. Der Film aus modifiziertem Kollagen/Gewebe wird dann derart angeordnet, dass die erzeugten parietalen und Gebärmutterverletzungen über einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen getrennt werden. Bei jeder weiblichen Ratte werden eine Vergleichsstelle und eine Teststelle angelegt.
Nach den mindestens 2 Wochen werden die Tiere durch Einspritzen einer tödlichen Barbituratdosis geopfert.
Die Schwere der Verklebungen wird mit einer Einteilung von 0 bis 3 bewertet:

– 0: keine Verklebungen,
– 1: unauffällige Verklebungen, die durch stumpfe Durchtrennung gelöst werden können,
– 2: mäßige Verklebungen, die eine teilweise scharfe Durchtrennung erfordern,
3: ernsthafte Verklebungen, die nicht ohne umfangreiche scharfe Durchtrennung gelöst werden können.

Um die Ergebnisse auszudrücken, werden die Einteilungen der 10 Vergleichsstellen zusammengezählt und wird anschließend der Durchschnitt ermittelt. Dieser Durchschnittswert entspricht damit der mittleren Schwere der Verklebungen.
Bei den Vergleichsstellen beträgt der erhaltene Durchschnitt 2,2. Außerdem weisen alle untersuchten Stellen Verklebungen auf 0 % der Fläche der Verletzung auf.
Bei den Teststellen beträgt die mittlere Einteilung 0,1.
Es ist festzuhalten, dass nur 3 Stellen von 20 untersuchten Stellen Verklebungen aufwiesen und dass die Verklebungen nur auf etwa 10 % der Fläche der Verletzung vorhanden waren.
Schlussfolgernd wird eine Verringerung der Stärke der Verklebungen um 96 % erhalten. Sowie eine sehr starke Verringerung der Fläche der vorhandenen Verklebungen.
BEISPIEL 10: ERPROBUNG DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN FLÜSSIGEN FORM, WIE SIE IN BEISPIEL 6 GEWONNEN WIRD
Das Ziel dieser Untersuchung besteht darin, die Eigenschaften der erfindungsgemäßen flüssigen Form, die in Beispiel 6 beschrieben ist, hinsichtlich der Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen zu bewerten.
Diese Untersuchung erfolgt an weiblichen Ratten, an einer peritonealen Stelle, über einen Beobachtungszeitraum von mindestens 2 Wochen.
Die Wirksamkeit des Produkts wird durch makroskopische Beobachtung möglicher Verklebungen an den Anwendungsstellen bewertet. Es werden untersucht: die Häufigkeit, Größe und Schwere der ausgebildeten Verklebungen.
Im Bereich der Gebärmutterhörner und eines parietalen Fensters werden bei weiblichen Ratten traumatische Verletzungen der peritonealen Serosa erzeugt. Vor Verwendung der Lösung werden die Spritzen im Wasserbad auf 37 °C erhitzt, um wieder eine zähflüssige Lösung zu gewinnen. Diese Lösung kann auf einem Träger angewendet werden. Durch die Zähflüssigkeit dieser Lösung kann sie eine Ablagerung bilden, wobei gleichzeitig eine ausreichende Dicke gewährleistet ist. 300 μl dieser Lösung werden dann derart angeordnet, dass die erzeugten parietalen und Gebärmutterverletzungen über einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen getrennt werden. Die Vernetzung der Ablagerung erfolgt durch Zerstäuben einer 1 %igen Wasserstoffperoxidlösung. Die Gelierung der Ablagerung erfolgt beinahe sofort. Es wird ein homogenes Kollagenhydrogel erhalten. Bei jeder weibli chen Ratte werden eine Vergleichsstelle und eine Teststelle angelegt.
Nach den mindestens 2 Wochen werden die Tiere durch Einspritzen einer tödlichen Barbituratdosis geopfert.
Die Schwere der Verklebungen wird mit einer Einteilung von 0 bis 3 bewertet:

Um die Ergebnisse auszudrücken, werden die Einteilungen der 10 Vergleichsstellen zusammengezählt und wird anschließend der Durchschnitt ermittelt. Dieser Durchschnittswert entspricht damit der mittleren Schwere der Verklebungen.
Bei den Vergleichsstellen beträgt der erhaltene Durchschnitt 2,2. Außerdem weisen alle untersuchten Stellen Verklebungen auf 90 % der Fläche der Verletzung auf.
Bei den Teststellen (300 μl Kollagenhydrogel) beträgt die mittlere Einteilung 0,7.
Es ist festzuhalten, dass nur 7 Stellen von 10 untersuchten Stellen Verklebungen aufwiesen und dass die Verklebungen nur auf etwa 30 % der Fläche der Verletzung vorhanden waren.
Schlußfolgernd wird eine Verringerung der Stärke der Verklebungen um 70 % erhalten. Sowie eine sehr starke Verringerung der Fläche der vorhandenen Verklebungen.

Claims

Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens ein Kollagen-Peptid umfasst, das durch Pfropfen von freien oder substituierten Thiol-Funktionen modifiziert ist, das vernetzbar und/oder wenigstens teilweise vernetzt ist, und wobei die Thiolfunktionen durch Merkaptoamin-Reste bereitgestellt sind, die ausschließlich auf Asparaginsäuren und Glutaminsäuren der Kollagen-Ketten durch Amid-Bindungen gepfropft sind.
Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Teil des modifizierten Kollagen-Peptids in Form des Vorläufers A vorliegt, auf den Merkaptoamin-Reste gepfropft sind, welche substituierte Thiol-Funktionen tragen, wobei wenigstens ein Teil dieser Merkaptoamin-Reste die folgende allgemeine Formel (I) aufweist:
worin – x = 1 oder 2, - R⁰= H oder CH₃, – R¹ H oder COOR³ bedeutet, wobei R³ einen alipathischen, aromatischen oder alicyklischen Kohlenwasserstoff-Rest, bevorzugt Alkyl, Alkenyl, Aryl, Aralkyl, Alkylaryl, Aralkenyl, Alkenylaryl und noch weiter bevorzugt Methyl oder Ethyl bedeutet, – R² ein alipathischer und/oder alicyklischer und/oder aromatischer Rest ist, bevorzugt Alkyl- oder ein Acyl-Rest, der gegebenenfalls Schwefel- und/oder Aminogruppen enthält und noch weiter bevorzugt weist R² die folgende Formel (II) auf:
– worin für y, R⁰⁰ und R⁴ dieselbe Definition gilt wie für x, R⁰ und R¹ bezüglich Formel (I) angegeben.
Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die auf die Form A des Kollagen-Peptids gepfropften Merkaptoamin-Reste ausgewählt sind aus der Gruppe der folgenden Reste:
Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Teil des Kollagen-Peptids in einer Form B eines intermediären vernetzbaren Vorläufers vom Typ Thiol vorliegt, auf welchen Merkaptoamin-Reste gepfropft sind, von denen wenigstens ein Teil die in Anspruch 2 angegebene allgemeine Formel (I) aufweist und worin R² = H und worin R³ unter anderem Wasserstoff oder ein Kation bedeuten kann, das in der Lage ist, mit COO^– ein Salz zu bilden, wobei dieses Kation bevorzugt Na⁺, K⁺, Li⁺ ist .
Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Teil des Kollagen-Peptids in einer vernetzten Form C vorliegt, welche Kollagen-Ketten umfasst, die miteinander durch Disulfid-Brücken verbunden sind, wobei die Schwefelatome, welche die Brücken bilden, zu Merkaptoamin-Resten gehören, die ausschließlich auf die Asparaginsäuren und Glutaminsäuren der Kollagen-Ketten über Amid-Bindungen gepfropft sind.
Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Peptid der Form C aus dem Kollagen-Peptid B nach Anspruch 4 erhalten ist.
Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Teil des Kollagen-Peptids (A und/oder B und/oder C) ebenfalls Pfropfgruppen G trägt, die an wenigstens einem Teil der freien Amingruppen der Kollagen-Kette über Amid-Bindungen befestigt sind, wobei G ein Acyl-Rest ist, der eine Kohlenwasserstoff-Einheit umfasst, wobei Merkaptoamin-Reste, insbesondere solche wie oben definiert, ausgeschlossen sind, wobei diese Einheit gegebenenfalls Heteroatome (vorteilhafterweise O und/oder N) enthält und bevorzugt ausgewählt ist aus Alkyl und/oder Alkenyl und/oder alicyklischen und/oder aromatischen Resten und noch weiter bevorzugt aus Gruppierungen, die eine gegebenenfalls ungesättigte Alkylkette umfassen oder die folgende Formel (III) aufweisen:
worin – R⁵ = H oder CH₃; – R⁶ = H, ein linearer oder verzweigter Alkylrest und bevorzugt Methyl ist; – z = 0, 1 oder 2 und n > 0.
Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Films vorliegt.
Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Verbundstoff umfasst, der einerseits eine Matrix, die das wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definierte Kollagen-Peptid umfasst und andererseits ein in dieser Matrix enthaltenes Verstärkungsmaterial umfasst, wobei dieses Verstärkungsmaterial aus biologisch abbaubaren Polymeren ausgewählt ist.
Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel in Form eines fasrigen, gewebten oder nicht gewebten Materials, vorzugsweise in gewebter Form und noch weiter bevorzugt in gewebter Form mit gestrickten Maschen vorliegt.
Mittel nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Verstärkungsmaterial ausgewählt ist aus (Co)Polymeren von α-Hydroxy-carbonsäuren, vorzugsweise Polymilchsäuren und/oder Polyglycolsäuren.
Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Films vorliegt, der nur auf einer Seite seiner Oberfläche ein fasriges Verstärkungsmaterial aufweist.
Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es in nicht fester, vernetzbarer und/oder wenigstens teilweise vernetzter Form vorliegt und auf und/oder in einem Träger anwendbar und/oder implantierbar ist.
Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Kollagen-Peptid in flüssiger Form umfasst.
Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Kollagen-Peptid in Gelform umfasst.
Mittel nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens ein Werkzeug umfasst – vorzugsweise eine Spritze oder einen Zerstäuber – zur Lagerung und Anwendung in und/oder auf einem Träger, in Form eines nicht festen (wie in Anspruch 13 definiert) vernetzbaren und/oder wenigstens teilweise vernetzten Kollagen-Peptids.
Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Oxidationsmittel umfasst, das die Vernetzung des Kollagen-Peptids ermöglicht.
Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Verhinderung post-chirurgischer Verklebungen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: 1. Bereitstellen einer bevorzugt wässrigen Lösung von vernetzbarem Vorläufer eines modifizierten Kollagen-Peptids; 2. gegebenenfalls Filtrieren dieser Lösung, um Bestandteile mit einer Größe von 0,8 μm oder größer, bevorzugt größer oder gleich 0,45 μm und noch weiter bevorzugt größer oder gleich 0,2 μm zu entfernen; 3. Formen des Filtrats in die für das herzustellende Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen vorgesehene Konfiguration; 4. gegebenenfalls Gelieren der geformten Lösung bei einem Sättigungsstadium, indem die Temperatur der Lösung unter ihre Geliertemperatur erniedrigt wird; 5. gegebenenfalls Entfernen des Lösungsmittels, vorzugsweise durch Verdampfen; 6. Bewirken der Vernetzung, vorzugsweise durch Oxidation; 7. gegebenenfalls Entfernen des verwendeten optionalen Oxidationsmittels durch aufeinanderfolgendes Spülen; 8. gegebenenfalls Imprägnieren des Materials in vernetztem Zustand oder im Verlauf der Vernetzung mit Hilfe einer Lösung wenigstens eines Weichmachers (beispielsweise: Glycerin, Polyethylenglycol mit geringer Molekülmasse);
gegebenenfalls Trocknen des vernetzten Materials; 10. gegebenenfalls Zuschneiden des Materials zu Abmessungen für die Anwendung; 11. gegebenenfalls Sterilisieren des vernetzten Materials durch Bestrahlen.
Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden wesentlichen Schritte umfasst: 1. Bereitstellen einer bevorzugt wässrigen Lösung von vernetzbarem Vorläufer eines modifizierten Kollagen-Peptids; 2. gegebenenfalls Filtrieren dieser Lösung, um Bestandteile mit einer Größe von 0,8 μm oder größer, bevorzugt größer oder gleich 0,45 μm und noch weiter bevorzugt größer oder gleich 0,2 μm zu entfernen; 3. gegebenenfalls Konzentrieren der Lösung; 4. steriles Konditionieren der Lösung in inerter Atmosphäre.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt 1 gebildete Lösung einen Gehalt an vernetzbarem Vorläufer eines modifizierten Kollagen-Peptids aufweist, der: – größer oder gleich 1% ist, – vorzugsweise zwischen 1 und 15 % liegt.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass man die konditionierte Lösung auf einen Träger aufträgt und eine Vernetzung bewirkt, vorzugsweise durch ein biokompatibles Oxidationsmittel.