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1. Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft ein System, Testverfahren und Testvorrichtung,
die affinitätschromatographische
Testtechniken und elektrochemische Quantifizierungstechniken für die Analyse
von einem oder mehreren Analyten in einer Testprobe kombinieren.
Genauer betrifft diese Erfindung ein elektrochemisches quantitatives
Analysesystem zum Bestimmen eines Analyten (z. B. Proteine, Hormone
oder Enzyme, kleine Moleküle,
Polysaccharide, Antikörper,
Nukleinsäuren,
Wirkstoffe, Toxine, Viren oder Virenpartikel, Teile einer Zellwand
und andere Verbindungen, die spezifische oder charakteristische
Marker aufweisen, die ihre Identifizierung erlauben) in einer Festphase
(z. B. einem Teststreifen) durch Messen von elektrochemischen Änderungen
einer oder mehrerer Markierungen, die mit einer markierten Substanz
verbunden sind, die mit der Konzentration des interessierenden Analyten
korreliert werden können.
Der in diesem Analysesystem verwendete Teststreifen umfasst ein
Festphasenaffinitätschromatographiemedium
mit einem elektrochemischen Nachweissystem, das damit verbunden
ist, in dem Flüssigkeitspfad
durch das Medium. Die hierin im folgenden detailliert angegebenen
Erfindungen sind für
die quantitative Analyse von tatsächlich einem jeglichen Analyten
anwendbar, dessen Konzentration mit einer elektroaktiven Spezies
einer elektroaktiven Substanz korreliert werden kann, die in der
Lage ist, eine Änderung
der elektrischen Antwort innerhalb der Umgebung der Testvorrichtung
dieser Erfindung, die einer elektrochemischen Zelle ähnlich ist,
zu zeigen.
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2. Beschreibung des Standes
des Technik
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A. Immunodiagnostika
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Die
immunchemische Analyse auf einen Analyten innerhalb einer Festphase
(Teststreifen) umfasst im allgemeinen einen Test, bei dem ein Analyt,
in einer flüssigen
Probe, und eine markierte Substanz oder ein anderer Reaktionsbestandteil
miteinander in Wechselwirkung treten. Im Kontext des Standes der
Technik wird verstanden, dass eine „markierte Substanz" somit (a) eine Analytik-Mimik, die
mit einem Indikator markiert ist, (b) einen markierten Liganden,
der für
die Wechselwirkung mit dem interessierenden Analyten spezifisch
ist, oder (c) einen Komplex umfassen kann, der durch Wechselwirkung von
(a) oder (b) und noch einem Reaktionsbestandteil ausgebildet ist.
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Die
die markierte Substanz und den Analyten enthaltende Flüssigkeit
wird dann auf eine poröse Folie
oder Membran übertragen,
wo sie durch Diffusions- oder Kapillarwirkung entlang einem Flüssigkeitspfad
der Membran gezogen wird und auf ein oder mehrere Begleittestkitreagenzien
trifft (von denen wenigstens eines innerhalb eines definierten Bereiches
davon immobilisiert ist). Diese markierte Substanz und/oder der
Analyt wird dann durch ein immobilisiertes Begleittestkitreagens
an eine Teststelle gebunden, um einen Komplex auszubilden. Wenn
der Komplex in ausreichender Konzentration vorhanden ist, liefert
er eine erkennbare Veränderung
an einer solchen Stelle. Wo der Indikator ein Pigment ist, wie beispielsweise
ein Metall (z. B. kolloidales Gold), oder alternativ ein farbiges
Latexpartikel, ist die erkennbare Veränderung im allgemeinen mit
dem nackten Auge sichtbar.
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Die
folgenden Patente werden für
diese Art von immunchromatographischem Test typisch betrachtet.
Diese Patente sind in chronologischer Reihenfolge angeordnet und
der Reihenfolge ihrer Diskussion soll was die Patentfähigkeit
der hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindung anbelangt,
keine Bedeutung zugemessen werden.
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Campbell
et al, US-Patent 4,703,017 (auf Becton Dickinson übertragen)
beschreibt ein Testverfahren zum Nachweis eines Analyten mit einem „direkten" oder einem „partikulären" Indikator, genauer einem
Indikator, der mit dem nackten Auge visuell nachgewiesen werden
kann, und somit ein derartiges Testverfahren für die diagnostische Anwendung
zu Hause; oder, alternativ, in einer klinischen Umgebung, wo es
an ausgereifter analytischer Ausrüstung mangelt, akzeptable macht.
Der direkte Indikator der Wahl ist ein Liposom, das ein Pigment
oder ein äquivalentes
Farbmittel enthält.
Das beanspruchte Testverfahren wird als für den Nachweis eines Analyten aus
Urin geeignet beschrieben (z. B. Schwangerschaftstest); und kann
somit einen erhöhten
Titer des Analyten nachweisen. Entsprechend wird ein derartiger
Test als eine semi-quantitative Bestimmung des interessierenden
Analyten betrachtet. Da der Test einen einzigen Schritt umfasst
(z. B. Auftragen der Probe auf den Teststreifen), ist der Test in
der Technik als „Schnell"-Test bezeichnet
worden.
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Rosenstein,
US-Patent 5,591,645 (auf Becton Dickinson übertragen) beschreibt ein immunchromatographisches
Testverfahren, das auf dem in dem gemeinsam übertragenen US-Patent 4,703,017
(von Campbell et al.) basiert. Die Rosenestein-Testvorrichtung umfasst
das gesamte Testkitreagenz in der „gleichen Ebene" des Teststreifens
und fasst das Auftragen der Probe direkt auf den Testsreifen ins
Auge, um die darin enthaltenen Reagenzien zu rekonstituieren und
dadurch die erwünschte
Analyse zu bewirken. Der direkte Indikator der Wahl kann aus einer Anzahl
von äquivalenten
Farbmitteln ausgewählt sein,
jedoch ist kolloidales Gold, das an ein Bindeprotein (z. B. Antikörper oder
Antigen) adsorbiert ist, im allgemeinen bevorzugt. Das beanspruchte
Testverfahren ist als für
den Nachweis von Analyten in Urin geeignet beschrieben (z. B. Schwangerschaftstest); und
somit in der Lage, einen erhöhten
Titer an Analyten nachzuweisen oder den interessierenden Analyten
semiquantitativ zu bestimmen. Da der Test auch einen einzigen Schritt
umfasst (z. B. Auftragen der Probe auf den Teststreifen), ist der
Test in der Technik als ein „Schnell"-Test bezeichnet
worden.
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Swanson
et al, US-Patent 5,073,484 (auf Abbott Laboratories übertragen)
beschreibt ein immunchromatographisches Testverfahren, das mehrere Testzonen
verwendet, wobei eine jede Zone entlang einem gemeinsamen linearen
Flüssigkeitspfad
angeordnet ist. Während
die Testprobe und die Testkitreagenzien entlang dem Flüssigkeitspfad
wandern, wird der interessierende Analyt (der im allgemeinen mit
einem direkten Indikator verbunden ist) an ein immobilisiertes Begleitreagens
in einer jeden der Testzone gebunden. Eine jede der Testzonen ist
bezüglich
eines Standards vorkalibriert und somit korrelierte das Auftreten
von Farbe in einer spezifischen Testzone mit dem Konzentrationsniveau
des Analyten in der Probe. Entsprechend kann die Konzentration des Analyten
in der Probe aus dem Umfang der Farbentwicklung entlang dem Flüssigkeitspfad
der Testvorrichtung abgeschätzt
werden. Da der Test auch einen einzigen Schritt (z. B. Auftragen
der Probe auf den Teststreifen) umfasst, ist der Test in der Technik
als ein „Schnell"-Test bezeichnet
worden.
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May
et al, US-Patent 5,602,040 (auf Unilever Patent Holdings übertragen)
beschreibt ein immunchromatographisches Testverfahren, das analog
ist zu den in den oben diskutierten Patenten von Campbell et al
und Rosenstein. Einer der Hauptunterschiede, die von May et al identifiziert
und beansprucht worden sind, ist die Lyophilisierung eines Zuckers
zusammen mit dem direkten Indikator in der Probeaufnahmestelle.
Es wird berichtet, dass der Zuckerzusatz erforderlich ist, um die
Rekonstitution des lyophilisierten Indikators zu bedingen und erlaubt
dadurch seine Wechselwirkung mit dem Analyten in der Probe.
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Mit
der beschränkten
Ausnahme der Anpassung der vorstehenden Schnelltests an den Nachweis
eines erhöhten
Analytentiters sind diese Schnelltests im allgemeinen für eine präzise quantitative Überwachung
eines Analytentiters ungeeignet oder für den quantitativen Nachweis
und die Differenzierung von mehr als einem Analyten innerhalb einer einzelnen
Testumgebung ungeeignet.
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B. Instrumentelle Analyse
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Die
Analyse von Fluidproben hat traditionell auch die Verwendung einer
Ausrüstung
und das Messen von Änderungen
des elektrischen Potentials und/oder Stroms an einer gegebenen Stelle/Elektrode
umfasst. Typischerweise wird die elektrische Messung auf eine zweite
Elektrode bezogen und eine Anzahl von Messungen über ein gegebenes Intervall und/oder
einen definierten Bereich an Zuständen durchgeführt.
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Die
folgenden Patente werden als für
diese Art von elektrochemischer Analyse typisch betrachtet. Diese
Patente sind in chronologischer Reihenfolge angeordnet und der Reihenfolge
der Diskussion oder ihrer relativen Bedeutung hinsichtlich der Patentfähigkeit
der hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindung soll keine
Bedeutung beigemessen werden.
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Wang
US-Patent 5,292,423 (übertragen
auf New Mexico State University Technology Transfer Corp.) beschreibt
ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Spurenmetallanalyse von
Fluidproben (z. B. Trinkwasser, Blut, Urin etc.) mittels einer initialen
Adsorbtion des Spurenmetalls aus einer Fluidprobe auf eine siebgedruckte
Kohlenstoff (Arbeits-)-Elektrode, die mit Quecksilber vorbeschichtet
worden war. Die Wang-Testplattform
verwendet auch wenigstens eine zusätzliche (Referenz-)-Elektrode.
Die Elektrode mit dem Spurenmetall wurde danach einer Analyse durch
entweder inverse Voltametrie (ASV) oder potentiometrische Inverspolarographie
(PSA) unterzogen. Die berichteten Vorteile des Verfahrens und der Vorrichtung
nach Wang umfassen die Fähigkeit,
seine Erfindung auf das Testen von Probenfluiden im Feld vor Ort
auf vermutete Verschmutzungen mit einer Einwegtestvorrichtung anzupassen.
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Brooks
US-Patent 5,753,517 (übertragen
auf die University of British Columbia) beschreibt einen quantitativen
immunchromatographischen Test unter Verwendung einer Vorrichtung
zum Nachweis eines partikulären
Latexindikators gemäß den mit
der sogenannten RAMPTM-Technologie verbundenen
Vorgehensweisen. Gemäß Brooks
et al verwendet die RAMPTM-Technologie Latexpartikel
in einer Art und Weise ähnlich
den Enzymen in ELISA-Tests.
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In
der auf der RAMPTM-Technologie basierten
Analyse wird ein Teststreifen mit zwei distinkten fluoreszenzmarkierten
Indikatoren in eine Kartusche gegeben und eine Fluidprobe auf den
Teststreifen aufgetragen. Der interessierende Analyt wechselwirkt
mit einem der Indikatoren, was einen fluoreszierenden Komplex ausbildet,
der in der Testzone des Teststreifens gebunden ist, während der
zweite Indikator innerhalb des Teststreifens intakt bleibt (um einen
inneren Standard bereitzustellen). Die RAMPTM-Technologie
ist somit in der Lage, den fluoreszierenden Komplex von dem internen
Standard zu differenzieren und dadurch in der Lage, die Menge an Analyten
in der Probe zu bestimmen.
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Brooks
et al. alternatives System zum Durchführen seiner Analyse fasst die
Verwendung von optischen Nachweisverfahren (Lichtstreuung) und Messen
von Änderungen
der elektrischen Leitfähigkeit oder
des Widerstands ins Auge. In einer der vorgeschlagenen Alternativen
fasst Brooks et al. (
US 5,753,517 ,
Spalte 7, Zeilen 7–19
einschließlich)
die quantitative Messung des interessierenden Analyten durch den
elektrochemischen Nachweis eines aus einem Komplex abgetrennten
elektroaktiven Agens ins Auge, wie beispielsweise Wismuth, Gallium
oder Tellurionen, das mit dem interessierenden Analyten verbunden
ist. Gemäß Brooks
et al. umfasst eine dieser Alternativen die Verwendung eines Konjugates
aus Chelatbildner und Protein als ein Indikator für den interessierenden
Analyten, und der Nachweis desselben fasst das Hinzugeben einer
sauren Lösung
zur Abtrennung der Metallmarkierung als Ionen für eine spätere quantitative Mengenbestimmung
durch inverse Voltametrie ins Auge (wie von Hayes et al., Anal.
Chem. 66: 1860–1865
(1994) beschrieben).
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Durst
US Patent 5,789,154 (auf Cornell Research Foundation Inc. übertragen)
beschreibt einen liposomenverstärkten
Immunassay und eine Testvorrichtung, und Durst
US 5,753,519 (übertragen auf Cornell Research
Foundation Inc.) beschreibt einen liposomenverstärkten Immunaggregationstest
und eine Testvorrichtung.
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Die
folgende veröffentlichte
technische Literatur wird als typisch für diese Art von elektrochemischer
Analyse betrachtet. Diese Veröffentlichungen sind
in chronologischer Reihenfolge angeordnet und der Reihenfolge ihrer
Diskussion oder ihrer relativen Bedeutung für die Patentfähigkeit
der hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindung soll keine
Bedeutung beigemessen werden.
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Elektrochemische
Techniken, die mit affinitätschromatographischen
Reaktionen verbunden waren, stellten infolge ihres stabilen und
empfindlichen Signals, niedrigerer Nachweisgrenze, einfacher Handhabung
und Kosteneffektivität
Herausforderungen dar. Grundlegende Studien von Henieman et al. (Hayes,
F.H. et al., Anal. Chem., 66, 1860–1865 (1994)) stellten die
Verwendung von Metallionenmarkierungen für heterogene Immunassays mit
inversem Voltametrie (ASV)-Nachweis dar. Derartige Immunoassays
umfassten das kovalente Verbinden eines Chelatbildners mit einem
Protein, um als Chelon für die
Metallmarkierung zu dienen. Nach einem kompetitiven Gleichgewicht
zwischen dem markierten und dem nicht-markierten Protein für den Antikörper (immobilisiert
auf der Oberfläche
eines Polyesterröhrchens),
wurde die Metallmarkierung abgetrennt und in eine elektrochemische
Zelle für
einen ASV-Nachweis mit einer Elektrode mit hängendem Quecksilbertropfen
(HMDE) und einer entgasten Lösung überführt. M.B.G
Garcia und A.C. Garcia (Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 38,
389–395
(1995)) beschreiben ein adsorptives Voltametrie-Verfahren für die Bestimmung
von kolloidalem Gold. Wang et al. (Wang J., Anal. Chem., 70, 1682–1685 (1998))
verwendeten einen antikörperbeschichteten
siebgedruckten Messfühler,
führten
das gesamte Testprotokoll direkt auf der Oberfläche des Einwegstreifens durch
und verwendeten den hochempfindlichen potentiometrischen Voltametriemodus
zum Nachweisen der abgespaltenen Metallionenmarkierung in Mikroliterlösungen.
Wie für
dezentralisierte Nachweisanwendungen erwünscht bietet ein derartiges
auf dem Chip-Protokoll mehrere Vorteile verglichen mit herkömmlichen
ASV-basierten Immuntests,
einschließlich
vereinfachter Handhabung (z. B. die Beseitigung der Trenn- und Reagenzienvolumina,
Beseitigung toxischer Quecksilbertropfen und einen empfindlicheren
voltametrischen Nachweismodus). Das System von Wang et al. erfordert
vergleichsweise lange Inkubationszeiten für das Vorkonditionieren des
Messfühlers
(vor der Verwendung) und für
die Wechselwirkung mit der Probe; und mehrere Waschschritte, was
beides das Verfahren unpraktisch und beschwerlich macht. A.J. Bäumner und
R.D. Schmid (Biosensors & Bioelectronics,
13, 519–529
(1998)) beschreiben amperometrische Immunmigrationseinwegmessfühler zum
Nachweis von Triazinpestiziden. K.S. Lee et al (Analytica Chimica
Acta, 380, 17–26 (1999))
beschreiben einen elektrochemischen Immunmessfühler für die Bestimmung von Theophyllin.
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ZIELE DER
ERFINDUNG
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Es
ist das Ziel der Erfindung, die obigen und verwandte Nachteile des
Standes der Technik zu beseitigen.
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Genauer
besteht das Hauptziel der Erfindung darin, eine schnelle affinitätschromatographische
elektrochemische Analyse für
die quantitative Bestimmung von interessierenden Analyten anzupassen.
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Es
ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein System bereitzustellen
für die
elektrochemische quantitative Analyse von einem oder mehreren Analyten
in einem Festphasentestformat, das hinsichtlich der leichten Handhabbarkeit
mit schnellen immunchromatographischen Tests vergleichbar ist.
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Es
ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, ein System bereitzustellen
für die
elektrochemische quantitative Analyse von einem oder mehreren Analyten
in einem Festphasentestformat, das ein vereinfachtes Mittel zum
Nachweis von Markierungen durch potentiostatische oder potentiometrische
Messung von Änderungen
innerhalb der Festphase umfasst, die der/den Konzentration(en) einer
oder mehrerer Markierungen innerhalb der Teststelle zuweisbar sind.
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Es
ist ein noch weiteres Ziel dieser Erfindung, ein System bereitzustellen
zur gleichzeitigen elektrochemischen quantitativen Analyse einer üblichen
Testprobe auf mehrere Analyte in einem Festphasentestformat, das
ein vereinfachtes Mittel zum Nachweis einer oder mehrerer Markierungen
umfasst, durch Voltametrie.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
obigen und verwandte Ziele werden durch das elektrochemische quantitative
Analysesystem, das Verfahren und den Teststreifen dieser Erfindung
zum Bestimmen der Konzentration eines Analyten innerhalb einer Festphasentestumgebung
gelöst.
Zu Beginn wird eine Testprobenlösung
und eine markierte Substanz initial unter Testbedingungen in einer
Festphasentestumgebung kontaktiert und dazu veranlasst, darin entlang
einem Flüssigkeitspfad
zu wandern. Unabhängig
von dem Testformat (kompetitiver Test, Sandwich-Test, etc.) wird die markierte Substanz
innerhalb eines abgegrenzten Bereiches der Festphase konzentriert
(gebunden). Im Kontext des Systems und des analytischen Verfahrens
dieser Erfindung kann eine „markierte
Substanz" ein jegliches
geeignetes elektroaktives Material umfassen, das innerhalb eines
abgegrenzten Bereiches der Festphase unter Testbedingungen isoliert
werden kann, oder das eine elektroaktive Komponente innerhalb eines
derartigen abgegrenzten Bereiches abtrennen kann (auch kollektiv
hierin im Folgenden als „elektroaktive
Spezies" bezeichnet);
und derartige elektroaktive Spezies erfahren danach eine elektrochemische
Umwandlung (z. B. Redox), die mit der elektrochemischen quantitativen
Analyse verbunden ist. Die beobachtete Messung (Umwandlung) der elektroaktiven
Spezies kann direkt oder umgekehrt mit der Konzentration des interessierenden
Analyten in der Testprobe in Beziehung gebracht werden (z. B. durch
Vergleich mit einer Standardkurve).
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Zwei
prinzipielle Typen von elektroanalytischen Messungen zur Bestimmung
der Konzentration des interessierenden Analyten sind potentiometrisch
und potentiostatisch. Bei einem jeden dieser analytischen Protokolle
sind zwei Elektroden und eine Kontaktproben(Elektolyt)lösung erforderlich
beteiligt, die zusammen innerhalb des Teststreifens eine Umgebung
bilden, die einer elektrochemischen Zelle ähnlich ist. Die Elektrodenoberfläche ist
somit die Verbindung zwischen dem ionischen Leiter (z. B. Elektrolyten
aus der wässrigen
Fluidprobe, den Testkitreagenzien, etc.) und einem elektrischen
Leiter. Innerhalb dieser Umgebung des Teststreifens, die einer elektrochemischen
Zelle ähnlich
ist, wird die Elektrode, die auf den interessierenden Analyten (oder
eine elektroaktive Substanz, die den interessierenden Analyten anzeigt)
antwortet, als die „Indikator"- oder „Arbeits"-Elektrode bezeichnet,
wohingegen die Elektrode, die bei einem konstanten Potential gehalten
wird, als die „Referenz"-Elektrode bezeichnet
wird (wobei ihre Antwort unabhängig
von der Probenlösung
ist).
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In
einer der Ausführungsformen
dieser Erfindung wird die immobilisierte markierte Substanz mit einem
Trennmittel in Kontakt gebracht, um initial die Abtrennung/Ersetzung
der Markierung von der immobilisierten markierten Substanz innerhalb
dieses abgegrenzten Bereiches zu bedingen. Im Falle einer Metallmarkierung
kann beispielsweise das abgetrennte/ersetzte Metall weiter mit der
Substanz in der Trennreagenslösung
interagieren, um eine Metallfolie (oder Metalloberflächen-aktiven
Komplex) auf der Oberfläche
der Arbeitselektrode innerhalb des abgegrenzten Bereiches der Festphase
auszubilden. Danach wird der abgegrenzte Bereich des affinitätschromatographischen
Teststreifens einer potentiostatischen Messung durch inverse Voltametrie
der Markierung von der Metallfolie (oder des Metalloberflächen-aktiven
Komplexes) auf der Arbeitselektrode unterzogen, was die Markierung
veranlasst, noch eine zweite elektrochemische Umwandlung durchzuführen (Konversion
der Markierung von der reduzierten Form in den oxidierten Zustand).
Diese zweite elektrochemische Umwandlung der Markierung (von dem
reduzierten in den oxidierten Zustand) weist einen charakteristischen
Fingerabdruck auf, der überwacht
werden kann, und, wenn er mit einer Standardkurve verglichen wird,
direkt mit der Konzentration des Analyten in der Probe korrelieren
kann.
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Die
desorbierte Markierung von der Metallfolie (oder dem Metalloberflächen-aktiven
Komplex) und somit der interessierende Analyt kann quantifiziert
werden durch Messung von Veränderungen
innerhalb des abgegrenzten Bereiches des Teststreifens durch potentiostatische
elektrochemische Techniken. Die Besonderheiten dieser elektrochemischen quantitativen
Analyse umfasst das Anlegen eines elektrischen Potentials an dem
abgegrenzten Bereich über
einen definierten Potentialbereich und das Überwachen der Geschwindigkeit
des Elektronentransfers (Stromes) bei einem jeden Potential. Die Änderung
des elektrischen Potentials ist analog zu dem Aufnehmen einer Reihe
von optischen Messungen eines Farbindikators bei unterschiedlichen
Wellenlängen.
Das an der Elektrode angelegte elektrische Potential treibt die
targetierten elektroaktive Spezies an (zwingt sie dazu), Elektronen
mit einer gegebenen Geschwindigkeit zu gewinnen oder zu verlieren
(Reduktion bzw. Oxidation), die die Konzentration einer derartigen
elektroaktiven chemischen Spezies angibt. Entsprechend kann der
sich ergebende Strom nicht nur die Geschwindigkeit wiedergeben,
mit der sich die Elektronen über
die Elektronen-/Lösungsgrenzfläche bewegen,
sondern auch (wenn mit einem Standard verglichen) die Konzentration
des Analyten in der Testprobe. Diese potentiostatische Technik kann
daher eine jegliche chemische Spezies messen, die elektroaktiv ist
(z. B. die man in der Umgebung einer elektrochemischen Zelle reduzieren
oder oxidieren kann).
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Eine
der bevorzugten Konstruktionen dieses Teststreifens, die bei dem
elektrochemischen quantitativen Analysesystem der Erfindung nützlich sind, weist
mehrere Komponenten und mehrere funktionale Bereiche auf, (a) um
das Volumen und die Geschwindigkeit der Absorption der Probe durch
den Teststreifen zu steuern; (b) um die gesteuerte Wechselwirkung
der Probe und eine markierte Substanz mit einer immobilisierten
Bindesubstanz innerhalb eines abgegrenzten Bereiches des Teststreifens
aufzunehmen; (c) um die Trennung der markierten Substanz von den
endogenen Komponenten der Probe zu bedingen; (d) für die Konzentrierung
der markierten Substanz innerhalb eines abgegrenzten Bereiches des
Teststreifens für
die elektrochemische Verarbeitung, und (e) für die quantitative Bestimmung des
interessierenden Analyten durch elektrochemische Mittel.
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In
einer weiteren der bevorzugten Ausführungsformen der vorstehenden
Teststreifenkonstruktion kann die Probe und die markierte Substanz
innerhalb eines saugfähigen
Kissens (z. B. Faserglas) kombiniert werden, das in Fluidverbindung
mit einem festphasenaffinitätschromatographischen
Testmedium gehalten wird. Nach der Übertragung der Probe darauf
wird die markierte Substanz rekonstituiert und die sich ergebende
markierte Substanz und/oder ein Komplex davon, der mit dem interessierenden
Analyten ausgebildet wird, in ein derartiges Testmedium gezogen.
Während
dieses Fluid und seine Bestandteile (z. B. Probe, Testkitreagens
und Reaktionsprodukte davon) in und innerhalb des affinitätschromatographischen
Testmediums diffundieren, wird die markierte Substanz an den abgegrenzten
Bereich (hierin im folgenden auch „Teststelle") entlang diesem
Fluidpfad gebunden. Typischerweise kann der abgegrenzte Bereich
durch eine immobilisierte Bindesubstanz definiert werden, die für die Wechselwirkung
mit dem Analyten, einer Analyt-Mimik
oder einem Komplex des Analyten und/oder eines markierten Ligand
spezifisch ist (z. B. durch Binden an ein Epitop auf dem Analyten).
Da der Analyt, die Analyt-Mimik oder ein Komplex aus dem Analyten
und/oder einem markierten Liganden an der Teststelle zunehmend konzentriert
wird, kann er gemessen werden und die Menge davon mit dem Analyten
in der Testprobe korreliert werden.
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Die
Vorteile einer derartigen gesteuerten Potential(potentiostatischen)technik
umfassen hohe Empfindlichkeit, Selektivität für eine elektroaktive Spezies,
einen weiten linearen Bereich, tragbare und mit geringen Kosten
verbundene Instrumentierung und Fähigkeit zur Speziesbestimmung.
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Um
mehrere funktionale Bestandteile innerhalb der einstückigen Vorrichtung
der bevorzugten Teststreifenkonstruktion dieser Erfindung aufzunehmen,
sind alle Bestandteile bevorzugterweise auf einem gemeinsamen Träger oder
Stützschicht
(typischerweise einem inerten Kunststoff, z. B. Mylar) angeordnet
angebracht. Das Substrat dieser Testvorrichtung kann mit einem leitfähigen Material
vorbedruckt sein, um einen elektrischen Kontakt (direktes oder induktives
Koppeln) zwischen dem affinitätschromatographischen
Testmedium des Teststreifens und einem elektrochemischen Analysegerät bereitzustellen,
das so konfiguriert ist, dass es feine elektrische Änderungen
innerhalb des abgegrenzten Bereiches in dem Teststreifen misst.
Wie detaillierter in der folgenden Beschreibung der Figuren dargelegt, ist
diese Stützschicht
typischerweise an zwei oder mehreren Stellen mit einem leitfähigen Material
oder Metallsalz bedruckt, um das auszubilden, was hierin im Folgenden
als „Elektroden" bezeichnet wird.
Diese Elektroden sind räumlich
entlang der Stützschicht so
angeordnet, um mit den abgegrenzten Bereichen des Festphasenmediums
zusammenzufallen. Die Elektrode, die mit dem abgegrenzten Bereich
der Teststelle zusammenfällt,
wird als die „Arbeitselektrode" bezeichnet. Abhängig von
dem elektrochemischen Analyseverfahren erfordert der Teststreifen
im Allgemeinen wenigstens eine zusätzliche Elektrode (z. B. „Referenz"-Elektrode), um die
Platten einer elektrochemischen Zelle auszubilden.
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Nachdem
die markierte Substanz innerhalb des abgegrenzten Bereiches der
Teststelle konzentriert worden ist, kann sie durch eine Anzahl von
elektrochemischen Techniken gemessen werden. Wie oben festgehalten
kann es wünschenswert
sein, vorläufig
eine derartige Messung durchzuführen,
um zuerst die Markierung aus dem Komplex durch ihre „Vor-Konzentrierung" auf der Arbeitselektrode
zu isolieren. Dieser „Vor-Konzentrierungs"-Prozess kann die Trennung/das Ersetzen
der Markierung von dem Komplex und die Bindung der Markierung in
einer reduzierten Form (z. B. Metallfolie (oder Metalloberflächen-aktiver
Komplex)) auf der Arbeitselektrode umfassen, wo sie elektrochemisch
verfügbarer
oder aktiver ist. Nach Abschluss dieses Vor-Konzentrierungsprozesses
kann die sich ergebende Metallfolie (oder der Metalloberflächen-aktive
Komplex) einer potentiostatischen elektrochemischen quantitativen Analyse
durch inverse Voltametrie unterzogen werden. Im Kontext dieses bevorzugten
analytischen Systems (z. B. potentiostatische elektrochemische quantitative
Analyse durch inverse Voltametrie) wird die Markierung unter elektrochemischen
quantitativen analytischen Bedingungen erneut oxidiert und diese
elektrochemische Umwandlung der Markierung (von dem reduzierten
in den oxidierten Zustand) überwacht.
Das Stromsignal, das während
dieser Umwandlung (Spitze und Fläche)
erzeugt wird, hängt von
einer Anzahl von Systemvariablen, den Charakteristiken der Metallmarkierung
und der Elektrodengeometrie ab. In einem jeden Fall können diese
Variablen jedoch durch empirische Einstellung optimiert und die
Analysebedingung maßgeschneidert
werden, um den Standardkurven zu entsprechen, die verwendet werden,
um eine elektrische Signalantwort mit einer Analytenkonzentration
zu korrelieren. Genauer ist 4 eine graphische
Darstellung der Stromsignalantwort einer Bleimetallfolie auf einer Kohlenstoffelektrode
für die
inverse Voltametrie von einer niedrigen zu einer hohen Konzentration
von Blei. In ähnlicher
Weise veranschaulicht 5 die Schwankung der Signal(strom)intensität als eine Funktion
der Dauer des „Vor-Konzentrierungs"-Intervalls (vor
der elektrochemischen Analyse) beim Nachweis von Wismuth. Bei der
graphischen Darstellung dieser in 5 gezeigten
Variable ist die Stromsignalintensität umso größer, je länger das Vor-Konzentrierungsintervall
ist (das zwischen 1 und 15 Minuten variierte). Eine ähnliche
Korrelation/Optimierung wird bei analytischen Prozessbedingungen
für eine
jede der Markierungen vorgenommen, die ausgewählt werden, und Standardkurven
für jede
erzeugt, wie angemessen, um mit dem dynamischen Bereich der Zustände und über einen
Konzentrationsbereich zu korrelieren, von denen wahrscheinlich ist,
dass sie für
einen gegebenen Analyten angetroffen werden. 6 zeigt
die Antworten von mehreren Markierungen in einem Nachweisfenster
in einer Lösung,
die Indium, Blei, Kupfer und Wismuth enthält. Unter Verwendung mehrerer
Markierungen können in
dieser Erfindung interessierende Analyten in einer Probenlösung gleichzeitig
quantifiziert werden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist eine perspektivische Darstellung
eines Teststreifenbestandteils des elektrochemischen, quantitativen
Festphasenanalysesystems der Erfindung (A: ein Zweielektrodensystem;
B: ein Dreielektrodensystem).
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2 ist
ein Querschnitt des Teststreifens von 1B entlang
der Ebene 2-2.
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3 ist
eine Darstellung der Testvorrichtung dieser Erfindung.
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4 stellt
graphisch eine Stromsignalantwortskurve eines Wismuth/Quecksilberamalgams auf
einer Kohlenstoffelektrode über
einen Bereich von Konzentration bei inverser Voltametrie dar (1 ng/ml
bis 50 ng/ml prä-konzentrierter
Wismuthmetallmarkierung).
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5 stellt
graphisch eine Stromsignalantwortskurve dar, die die Variation der
Signal (strom)intensität
als eine Funktion der Dauer des „Prä-Konzentrierungs"-Signals (vor der
elektrochemischen Analyse) beim Nachweis von Wismuth veranschaulicht.
In der graphischen Darstellung dieser in 4 gezeigten
Variablen ist die Stromsignalintensität umso größer, je länger das Vor-Konzentrierungsintervall
ist (das von 1 bis 15 Minuten schwankte).
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6 stellt
graphisch eine Stromsignalantwortskurve dar, die die Anworten von
mehreren Markierungen in einem Nachweisfenster in einer Indium-, Blei-,
Kupfer- und Wismuth-Metallmarkierung enthaltenden Lösung veranschaulicht.
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7 stellt
graphisch eine Stromsignalantwortskurve dar, die die elektrochemische
Analyse von Standard-Myoglobin-Antikörperlösungen bei unterschiedlichen
Konzentrationen gemäß dem System,
dem Verfahren und dem Teststreifen (1 & 2)
dieser Erfindung veranschaulicht.
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8 stellt
graphisch eine Stromsignalantwortskurve dar, die sechs Wiederholungsmessungen einer
2,5 ng/ml HBsAg in einer Serumprobe unter Verwendung des Systems,
des Verfahrens und des Teststreifens (1 & 2)
dieser Erfindung veranschaulicht.
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9 stellt
graphisch eine Stromsignalantwortskurve dar, die die Messungen von
HBsAg in einer Serumprobe unter Verwendung eines mit Blei-, Kupfer-
und Wismuth-Ionen markierten HBsAg Antikörpers veranschaulicht.
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10 stellt
graphisch eine Stromsignalantwortskurve dar, die die Messung von
HCG (links), HBsAg (rechts) und Kontrollmarkierung (Mitte) in einer
Serumprobe unter Verwendung des Systems, des Verfahrens und des
Teststreifens (1 & 2) dieser
Erfindung veranschaulicht.
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11 stellt
graphisch eine Stromsignalantwortskurve dar, die den kompetitiven
Nachweis von menschlichem NPOR (25mer Oligonukleotid) veranschaulicht,
A (oben) ist das Signal der leeren Lösung (ohne menschlichem NPOR)
und B (unten) ist das Signal der menschlichem NPOR enthaltenden
Lösung.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG EINSCHLIEßLICH BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Einer
der entscheidenden Vorteile des Systems, des Verfahrens und des
Teststreifens dieser Erfindung ist die einzigartige Fähigkeit,
gleichzeitig eine quantitative elektrochemische Analyse für mehrere
Analyten innerhalb einer gegebenen Testprobe durchzuführen. Somit
ist es möglich,
einen Satz von Tests bezüglich
Drogenmissbrauch mit einer gegebenen Probe durchzuführen, indem
einfach unterschiedliche markierte Substanzen für einen jeden der interessierenden
Analyten innerhalb einer gegebenen Probe verwendet werden. Entsprechend
versteht man, dass die folgende Diskussion nicht beabsichtigt, den
Umfang oder die Anwendung der Erfindung auf die Analyse von einem
einzelnen Analyten zu beschränken,
und eine derartige Beschreibung auf die Analyse eines einzelnen
Analyten nur aus Gründen
des Verständnisses
und der beispielhaften Darstellung beschränkt ist.
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Wie
oben zusammenfassend festgestellt und erneut hervorgehoben ist,
basiert das elektrochemische, quantitative Analysesystem der Erfindung
auf der anfänglichen
Konzentrierung einer markierten Substanz innerhalb eines abgegrenzten
Bereiches einer Festphasentestumgebung; und, danach, Bedingen einer
elektronischen Umwandlung in der Form der Markierung, um ein messbares
elektrisches Signal innerhalb der überwachten Umgebung zu produzieren,
das mit der Menge des Analyten in der Testprobe korreliert werden
kann.
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In
bestimmten Fällen
kann es angemessen sein (als ein Zwischenschritt in der Analyseroutine), die
Markierung von der markierten Substanz zu trennen/zu ersetzen und
sie dadurch umzuwandeln, oder sie zu veranlassen, mit einer weiteren
Substanz zu reagieren, die eine bessere Zugänglichkeit für die elektrochemische
quantitative Analyse erlaubt. Wo beispielsweise die markierte Substanz
mit einem Metall markiert ist (z. B. markierter Ligand), erfordert dessen
Isolierung und Konzentrierung innerhalb des abgegrenzten Bereiches
des Teststreifens im allgemeinen deren Trennung und/oder deren Entfernung aus
ihren Ligandenbestandteilen und ihre Umwandlung oder Umsetzung,
um ihre Umwandlung in eine Form zu bedingen/zu bewirken (z. B. leicht
oxidierbarer oder reduzierbarer Zustand), die für den elektrochemischen Zustand
verglichen mit einem anderen leichter verfügbar ist. In einer der bevorzugten
Ausführungsformen
dieser Erfindung besteht der markierte Ligand aus einer funktionellen
Gruppe, die eine chelatähnliche
Kopplung an die Metallmarkierung ausbildet. Diese Kopplung ist jedoch
pH-empfindlich und somit kann die Metallmarkierung abgetrennt von ersetzt
werden in dem Komplex nach Konzentrierung innerhalb eines abgegrenzten
Bereiches der Festphase, einfach indem sie mit einer saueren Salzlösung kontaktiert
wird.
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Alternativ
kann, wo der markierte Ligand aus einem Indikator (z. B. Metall)
besteht, der in einem Liposom verkapselt ist, wie beispielsweise
in Campbel, et al, US-Patent 4,703,017 (zuvor hierin diskutiert) beschrieben
ist, das wiederum mit einem Liganden konjugiert ist, die Integrität der Liposomenkapsel leicht
mit einer Anzahl üblicher
Lipidlösungsmittel
(z. B. Detergenzien) gestört/abgelöst werden.
Das Metall kann somit von den Ligandenbestandteilen des markierten
Liganden getrennt werden und leichter für seine quantitative Analyse
zugänglich/verfügbar gemacht
werden.
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Wo
die elektrochemische quantitative Analyse inverse Voltametrie als
das analytische Verfahren der Wahl verwendet, kann die abgetrennte/ersetzte Metallmarkierung
mit Quecksilberionen in der saueren Salzlösung umgesetzt werden, um ein
Amalgam auf der Arbeitselektrode benachbart dem abgegrenzten Bereich
des Festphasenmediums auszubilden. Die elektrochemische Reaktion
der Metallmarkierung wird danach bei der nachfolgenden elektrochemischen
quantitativen Analyse umgekehrt und die feinen elektrischen Veränderungen
während
einer derartigen Umwandlung überwacht
und mit der Anwesenheit und Konzentration von Analyten in der Testprobe
korreliert.
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Um
die Einfachheit und Tragfähigkeit
des Systems und der Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitzustellen,
verwendet das quantitative Analysesystem dieser Erfindung einen
affinitätschromatographischen
Teststreifen, wobei ein abgegrenzter Bereich davon so konfiguriert
ist, dass er den interessierenden Analyten konzentriert. Die in 1 & 2 dargestellten
Testvorrichtungen sind typische Beispiele einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Testvorrichtung.
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Die
in den 1 & 2 dargestellte
Testvorrichtung besteht initial aus einem affinitätschromatographischen
Teststreifen und einem elektrochemischen Nachweissystem.
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Der
affinitätschromatographische
Teststreifen (10) umfasst eine Vielzahl von diskreten Bereichen;
und besteht, bevorzugterweise, aus einem Verbundwerkstoff aus wenigstens
zwei (2) und bevorzugtererweise drei (3) diskreten Bestandteilen
in Flüssigverbindung
miteinander. Wie in 1 gezeigt umfasst
der Teststreifen ein Probensammelkissen (12) mit der markierten
Substanz (14) (z. B. markierter Ligand oder markierte Analyt-Mimik),
die innerhalb des Probensammelkissens entweder zusammen mit oder
benachbart zu dem Probensammelkissen (12) vorangeordnet
ist, eine Membran (22) mit Substanz (18) (z. B.
Ligand oder Analyt-Mimik), die auf der Membran vorbeschichtet ist,
und ein Absorptionskissen (20), das verwendet wird, um
das Wandern der Probenlösung
zu erzwingen. In den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung
ist die markierte Substanz lyophilisiert (um eine Stabilisierung
derselben vor der Verwendung zu erlauben); und wird danach nach
Kontakt mit der flüssigen
Probe rekonstituiert.
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Im
Kontext des Systems und des analytischen Verfahrens dieser Erfindung
kann eine „markierte
Substanz" ein jegliches
geeignetes elektroaktives Material umfassen, das innerhalb eines
abgegrenzten Bereiches der Festphase unter Testbedingungen isoliert
werden kann, oder das eine elektroaktive Verbindung innerhalb eines
derartigen abgegrenzten Bereiches abtrennen kann (kollektiv hierin auch
als die „elektroaktive
Spezies" bezeichnet)
und, danach, eine elektrochemische Umwandlung (z. B. Redox) erfährt, die
mit der elektrochemischen quantitativen Analyse verbunden ist. Die
beobachtete Messung (Umwandlung) der elektroaktiven Spezies kann
direkt oder indirekt mit der Konzentration des interessierenden
Analyten in der Testprobe in Beziehung gesetzt werden (z. B. durch
Vergleich mit einer Standardkurve).
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Bei
den bevorzugten Ausführungsformen dieser
Erfindung besteht das markierte Testkitreagens typischerweise aus
einem Protein oder Liganden, das/der mit einer Metallmarkierung
verbunden ist. Nach dessen Kontakt mit der Probe wechselwirkt dieses
Metall-markierte Reagens mit dem interessierenden Analyten in der
Probe, um einen Komplex auszubilden. Eine markierte Substanz, die
bei der affinitätschromatographischen
Isolierung/Konzentrierung des interessierenden Analyten verwendet
werden kann, umfasst ein Protein/einen Liganden und eine Metallmarkierung,
die bevorzugterweise hergestellt werden gemäß den in
US 4,732,974 und in der technischen
Literatur beschriebenen Verfahren, Gary, et al, Covalent Attachment
of Chelating Groups to Macromolecules Biochem. And Biophys. Res. Comm.
Band 77, Nr. 2 (1977) Seiten 581–585. Kurz gesagt kann eine
Metallmarkierung mit dem Protein/Liganden konjugiert werden, der
für den
Analyten spezifisch ist, durch anfängliche Modifikation des Proteins/Liganden,
indem kovalent daran eine „exogene Komplexbildnergruppe" gebunden wird, die eine
Affinität
für die
Metallmarkierung aufweist. Die komplexbildenden Gruppen, die für den interessierenden
Metallindikator spezifisch sind, können kovalent direkt an das
Bindeprotein/Liganden gebunden werden oder indirekt durch eine Zwischenprodukt oder
eine Verbindungsgruppe gekoppelt werden. Diese Kopplungsstelle muss
natürlich
von der immunchemisch aktiven Stelle entfernt sein, die für den interessierenden
Analyten spezifisch ist. Metallmarkierungen, die besonders geeignet
sind für
die Verwendung bei der Synthese der markierten Substanzen, die als
die Testkitreagenzien in den Systemen und Verfahren dieser Erfindung
verwendet werden können,
umfassen Mg, Al, Ca, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga,
Sr, Y, Zr, Mo, Tc, Pd, Cd, In, Sn, Sb, Ba, Hf, W, Re, Hg, Tl, Pb,
La, Ce, Rh, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Yd, Th, U, Pu und
deren Isotope.
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Eine
andere der markierten Substanzen, die in der affinitätschromatographischen
Trennung/Konzentrierung des interessierenden Analyten verwendet
werden kann, umfasst eine Analyt-Mimik, die an ein Liposom gekoppelt
ist. Die Herstellung von Liposom-markierten
Immunreagenzien und ihre Verwendung in affinitätschromatographischen Tests
ist gut bekannt und in der technischen Literatur dokumentiert, Roberts,
et al, Investigation of Liposome-Based Immunomigration Sensors for
the Detection of Polychlorinated Biphenyl Anal. Chem., Band 57,
Nr. 5 (Februar 1, 1995) Seiten 482–491.
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Die
markierte Substanz und/oder der Komplex aus der markierten Substanz
und dem Analyten wird durch die Diffusions-/Kapillarwirkung des
Probenauftragungskissens (12) entlang dem Flüssigkeitspfad
des Festphasenaffinitätschromatographiemediums
zu einer stromabwärtigen
Teststelle (18) getragen, wo sie/er konzentriert und immobilisiert wird.
Dies kann in herkömmlicher
Art und Weise erreicht werden durch die Verwendung, beispielsweise, eines
Begleittestkitreagens in der Form eines immobilisierten Bindeproteins
oder anderen Hilfsmittels, das für
die Wechselwirkung mit dem Analyten/Metallkomplex spezifisch ist.
Während
die markierte Substanz und/oder der markierte Komplex entlang dem Flüssigkeitspfad
der Testvorrichtung wandert/diffundiert, trifft sie somit auf die
immobilisierte Bindesubstanz und wird daraufhin gebunden, um sich
an der Teststelle anzureichern. Nach einer geeigneten Reaktionszeit
hat sich ausreichend Analyt/markierte Substanz in dem abgegrenzten
Bereich des Teststreifens angesammelt, um die erforderliche, nachzuweisende
und durch elektrochemische Analyse zu quantifizierende Menge bereitzustellen.
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Das
elektrochemische Nachweissystem (26) wird hergestellt,
indem zwei Elektroden (für
ein Zweielektrodensystem) oder drei Elektroden (für ein Dreielektrodensystem)
auf einem Matrixmaterial aufgedruckt werden (z. B. Mylar, Kunststoff
oder anderes Material, das vergleichsweise elektrisch (nicht-leitend)
isoliert). Ein Träger
(24) mit doppelseitigem Kleber wird verwendet, um den affinitätschromatographischen
Teststreifen und das elektrochemische Nachweissystem zu kombinieren.
In dem Träger
ist ein Loch zwischen dem elektrochemischen Nachweissystem und der
Testzone (18) in der Membran vorhanden.
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Der
Nachweis und die Messung der Menge des Analyten in der Probe wird
erreicht vermittels einer Ausrüstung,
die feine elektrochemische Änderungen
messen kann, die mit einer elektroaktiven Spezies verbunden sind,
wie z. B. Änderungen
des Stroms oder der Spannung, die durch die Umwandlung einer derartigen
Spezies von der reduzierten zu einer oxidierten Form bedingt werden.
In der Praxis kann dies durch Einführen des Affinitätschromatographieteststreifens
dieser Erfindung in eine geeignete Messvorrichtung bewerkstelligt
werden und dadurch die Vorrichtung an die Elektroden (26)
an der Teststelle (18) elektrisch gekoppelt werden. Die
elektrische Kopplung des Überwachungsinstrumentes
mit dem Affinitätschromatographieteststreifen
kann durch direktes (physikalischer Kontakt) oder indirektes (induktives) Koppeln
des Instrumentes mit den Elektroden erfolgen, die mit dem abgegrenzten
Bereicht/Teststreifen der Testvorrichtung verbunden sind. Die Testvorrichtung
ist auch elektrisch gleichzeitig mit dem Teststreifen an einer anderen
Stelle (28) gekoppelt, um einen Referenzpunkt oder internen
Standard zum Vergleich von Ablesungen an der Teststelle bereitzustellen.
Danach wird ein elektrisches Potential an der Teststelle angelegt,
um die Markierung anzuregen bzw. von einer Form/von einem Zustand
in einen anderen umzuwandeln, und eine derartige Umwandlung wird überwacht.
Diese Umwandlung manifestiert sich in einer Anzahl von Wegen, abhängig von
der Art und/oder Größenordnung
der an der Teststelle angelegten elektrischen Kraft und anderen
Systemvariablen betreffend die Vor-Konzentrierung und die inhärenten Merkmale
der Markierung.
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Eine
weitere Konstruktion für
diese Testvorrichtung ist in 3 dargestellt,
wobei der affinitätschromatographische
Teststreifen und das elektrochemische Nachweissystem innerhalb eines
Gehäuses angeordnet
sind, das aus einem Isolator (30), einem Oberteil oder
einer Abdeckung (32) und einem Bodenteil oder Bodenplatte
(34) besteht; wobei das Bodenteil angepasst ist, um an
die Abdeckung gekoppelt zu werden, um den affinitätschromatographischen
Teststreifen und das elektrochemische Nachweissystem abzudichten
und darin zu schützen
und somit eine verfälschungssichere
Umgebung bereitzustellen. Der Isolator (30) weist eine
Trichterform auf und ist angepasst, um Testkitreagenzien auf die Teststelle
zu leiten und danach durch ein Loch in der Abdeckung des Gehäuses in
das Gehäuse
eingeführt
zu werden, wobei er aus einem definierten Bereich der Membran innerhalb
der Nachweiszone (Teststelle) einen definierten Bereich ausstanzt,
um einen abgegrenzten Bereich (Volumen) der Membran hinsichtlich
des Volumens des Testkitreagens zum Vorkonzentrieren des Indikators
zu isolieren.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele definieren, beschreiben und veranschaulichen
eine Anzahl der bevorzugten Ausführungsformen
der Testkitreagenzien und elektrochemischen Analyseverfahren dieser
Erfindung weiter. Vorrichtungen und Techniken, die bei der Synthesen
der in diesen Beispielen beschriebenen/verwendeten Materialien verwendet
werden, sind Standard, sofern nicht anders angegeben. Teile und
Prozentzahlen, die in diesen Beispielen auftauchen, sind auf das
Gewicht bezogen, sofern nicht anders angegeben.
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BEISPIEL 1
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1. Herstellung von Ionen-markierten
Proteinen (z. B. Antikörper
und Antigen)
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Diethylentriaminpentaessigsäure und
Triethylamin wurden in Wasser unter vorsichtigem Erhitzen gelöst. Die
sich ergebende Lösung
wurde lyophilisiert, um einen glasigen Rückstand zu ergeben und dann
wurde dieser Rückstand
in Acetonitril unter vorsichtigem Erhitzen gelöst. Diese Lösung wurde zu Isobutylchlorformat
in einem Eisbad unter Rühren
für die
gesamte Reaktion hinzugegeben. Das sich ergebende Anhydrid Diethylentriaminpentaessigsäure wurde
dann mit Protein in einer Schutzlösung mit einem bestimmten molaren
Verhältnis
bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann gegen
einen Zitratpuffer dialysiert. Ein Überschuss an Markierungslösung wurde
zu der dialysierten Lösung
hinzugegeben und bei Raumtemperatur inkubiert. Das markierte Protein
wurde gegen phosphatgepufferte Lösung
dialysiert. Die Proteine (AntiHBsAg-Ab, AntiHCG-Ab, AntiMyoglobin-Ab,
AntiTropin I-Ab, G-SAG, IgG-Fc, HIV und HCV etc.) wurden gut durch
Metallionen (z. B. Wismuth, Blei, Indium, Thallium und Kupfer) unter
Verwendung der obigen Verfahren in unserem Labor markiert. Das markierte
Protein wurde verwendet, um einen Festphasen- und affinitätschromatographischen-Teststreifen herzustellen.
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2. Herstellung
der Aaffinitätschromatographiefestphasentestvorrichtung
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Zwei
leitfähige
Abscheidungen oder Bereiche (für
ein Zweielektrodensystem) entsprechend der Teststelle (Kohlenstofftintenelektrode)
und die Referenzstelle (Ag/AgCl-Tintenelektrode)
werden mittels Tintenstrahl auf ein Polyesterblättchen gedruckt. Die Größe eines
jeden bedruckten Bereiches beträgt
4 × 4mm
und ist etwa 5/1000 Zoll (0,0127 cm) dick.
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Eine
Membran mit einem immobilisierten Liganden, der an der Teststelle
(Nachweiszone) vorangeordnet ist, wurde auf die Rückseite
laminiert, um die Teststelle über
dem Kohlenstofftintenelektrodensystem auszurichten. Ein Glasfaserkissen
(das die Markierungs/das Ligandenkonjugat enhält) und Überschussflüssigkeitsabsorptionsmedium
werden jeweils relativ zu einem jeden Ende des Laminates angeordnet,
um den zusammengebauten Teststreifen auszubilden. Die gemäß diesem
Beispiel hergestellte Testvorrichtung ist in den 1, 2 & 3 dargestellt.
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3. Messen
des Analyten
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Im
Verlauf der Durchführung
eines Tests auf HCG, HBsAg, Myoglobin oder mehrere Analyten unter
Verwendung des/der vorstehenden Metallionen-markierten Liganden
und der Affinitätschromatographiefestphasentestvorrichtung
wird zuerst eine flüssige
Probe auf den Probenauftragungsbereich aufgetragen, gefolgt von
der Wanderung der flüssigen
Probe durch Kapillarwirkung entlang dem affinitätschromatographischen Streifen
zu dem anderen Ende des affinitätschromatographischen
Streifens. Während
die Flüssigkeit
innerhalb des Probenauftragungskissen wandert und den/die markierten
Liganden, der/die darin enthalten ist, rekonstituiert, reagiert/reagieren
der Analyt/die Analyten in der Probe mit dem/den markierten Liganden
unter Ausbildung eines oder mehrerer Komplexe, der/die zu dem affinitätschromatographischen
Testmedium überführt und darin
hineingezogen wird/werden. Wenn der Komplex den Nachweisbereich
(Teststelle) erreicht, reagieren die Analyten in dem Komplex mit
dem/den immobilisierten Liganden in dem Nachweisbereich unter Ausbildung
eines oder mehrerer markierten Liganden-Analyten-Liganden-Komplex(es),
während die
nicht-gebundenen Bestandteile und Flüssigkeitsfraktionen weiter
in das Absorbtionsmedium am gegenüberliegenden Ende der Vorrichtung
gezogen werden und dorthin fließen.
Die Ausbildung des Komplexes in dem Nachweisbereich wird dann aufgezeichnet
und die markierenden Metallionen durch Rechteckwellenvoltametrie
(SWSV) quantifiziert. Wie oben beschrieben umfasst dieses Voltametrieverfahren
das Vorkonzentrieren oder (Bildung adsorptiver Akkumulation eines
oberflächenaktiven
Komplexes) und Bestimmung des Metallions.
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Die
vorerwähnte
Analyse ist besonders vorteilhaft, wo die Testprobe eine trübe Lösung ist,
die traditionellere optische Messtechniken stört, wie beispielsweise Blut
oder Harnstoffprobenlösung. 7 veranschaulicht
graphisch eine elektrochemische Analyse einer Standard-Myoglobinantikörperlösung bei
unterschiedlichen Konzentrationen gemäß dem System, dem Verfahren
und der Testvorrichtung (3) dieser Erfindung. Die niedrigen
Nachweisgrenzen und Empfindlichkeit des Tests beruht, teilweise,
auf dem hohen molaren Markierungsverhältnis von Bleiionen zu dem
Anti-Myoglobinantikörper und
der Dauer des Vorkonzentrierungsintervall des Bleis auf der Arbeitselektrode. 8 zeigt
wiederholte Messungen von 2,5 ng/ml HBsAg in Serumprobe gemäß dem System,
dem Verfahren und der Testvorrichtung (3) der Erfindung.
Eine wiederholbare Antwort wird über
sechs wiederholte Messungen beobachtet. Der gleichzeitige Nachweis
für mehrere
interessierende Analyten ist mit dem System, dem Verfahren und der
Testvorrichtung (3) dieser Erfindung auch möglich. 9 ist
die Antwort von HBsAg in einer Serumprobe unter Verwendung eines
mit Blei-, Kupfer- und Wismuth-Ionen markierten HBsAg-Antikörpers, wobei
ein anderes Ion in der Antwortkurve gesehen werden kann, die zeigt,
dass die Komplexe (anti-HbsAg Antikörper-HbsAg Antigen-anti-HbsAg
Antikörper-anti-HBsAg
Antikörper, markiert
mit verschiedenen Metallionenkomplexen) gebildet und in der Testzone
nachgewiesen wurden. 10 ist ein gleichzeitiger Nachweis
für HCG
(links) und HBsAg (rechts) in einer Serumprobe unter Verwendung
des Systems, des Verfahrens und der Testvorrichtung (3)
dieser Erfindung; die Spitze in der Mitte ist ein Kontrolltest,
der zeigt, dass die Vorrichtung funktioniert.
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BEISPIEL 2
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Nukleinsäuren (Oligonukleotide,
DNA und RNA)-Messfühler
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1. Herstellung von Ionen-markiertem
Oligonukleotid
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Diethylentriaminpentaessigsäure und
Triethylamin wurden in Wasser unter vorsichtigem Erhitzen gelöst. Die
sich ergebende Lösung
wurde lyophilisiert, um einen glasigen Rückstand zu ergeben und dann
wurde dieser Rückstand
in Acetonitril unter vorsichtigem Erhitzen gelöst. Diese Lösung wurde zu Isobutyslchlorformat
in einem Eisbad unter Rühren während der
gesamten Reaktion hinzugegeben. Das sich ergebende Anhydrid Diethylentriaminpentaessigsäure wurde
dann mit Oligonukleotiden in einem bestimmten molaren Verhältnis bei
Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann gegen
einen Trispuffer dialysiert. Ein Überschuss an Markierungslösung wurde
zu der dialysierten Lösung hinzugegeben
und bei Raumtemperatur inkubiert. Das markierte Oligonukletoid wurde
wieder gegen Tris-Pufferlösung
dialysiert. Das markierte Oligonukleotid wurde verwendet, um einen
Testphasen- und Affinitätstestmessfühler herzustellen.
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2. Herstellung
von Affinitätschromatographiefestphasentestvorrichtung
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Zwei
leitfähige
Abscheidungen oder Bereiche (für
ein Zweielektrodensystem) entsprechend der Teststelle (Kohlenstofftintenelektrode)
und der Referenzstelle (Ag/AgCl-Tintenelektrode)
werden mittels Tintenstrahl auf ein Polyesterplättchen gedruckt. Die Größe einer
jeden bedruckten Fläche
beträgt
~ 4 × 4mm
und ist etwa 5/1000 Zoll (0,0127 cm) dick.
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Eine
Membran mit einem an der Teststelle (Nachweiszone) vorangeordneten
immobilisierten Liganden, wurde auf die Rückseite laminiert, um die Teststelle über dem
Kohlenstofftintenelektrodensystem auszurichten. Ein Glasfaserkissen,
(das das Konjugat aus Markierung und Oligonukleotid enthält) und Überschussflüssigkeitsabsorptionsmedium
werden jeweils relativ zu einem jeden Ende des Laminats angeordnet,
um den zusammengebauten Teststreifen auszubilden. Die gemäß diesem
Beispiel hergestellte Testvorrichtung ist in den 1, 2 & 3 dargestellt.
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3. Messen
von menschlichem NPOR
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Im
Verlauf der Durchführung
eines Test auf menschlichen NPOR unter Verwendung des vorstehenden
Metallionen-markierten Oligonukleotids und der Affinitätschromatographiefestphasentestvorrichtung
wird zuerst eine Flüssigkeitsprobe,
die das interessierende Oligonukleotid enthält, auf den Probenauftragungsbereich
aufgetragen, gefolgt von der Wanderung der flüssigen Probe durch Kapillarwirkung
entlang dem affinitätschromatographischen Streifen
zu dem anderen Ende des affinitätschromatographischen
Streifens. Während
die Flüssigkeit
innerhalb des Probenauftragungskissens wandert, wird das in dem
Kontaktkissen eingebettete markierte Oligonukleotid ausgetragen
und wechselwirkt in kompetitiver Weise mit dem Oligonukleotid, das
an der Testzone beschichtet und komplementär zu dem interessierenden Oligonukleotid
ist, in der Probenlösung,
wodurch ein Komplex aus markiertem Oligonukleotid-Komplementoligonukleotid
und ein Komplex aus Oligonukleotid-Komplementoligonukleotid ausgebildet
wird, während
die ungebundenen Bestandteile und die Flüssigkeitsfraktion weiterhin
in das Absorbtionsmedium an dem gegenüberliegenden Ende der Vorrichtung
gezogen werden und dort hineinfließen. Die Ausbildung der Komplexe
in der Nachweisregion wird dann registriert und die markierenden Metallionen
durch die Rechteckwellenvoltammetrie (SWSV) quantifiziert. Wie oben
beschrieben umfasst dieses Voltametrieverfahren die Vor-Konzentrierung (oder
Ausbildung von adsorptiver Akkumulation eines oberflächenaktiven
Komplexes) und Bestimmung der Metallionen. 11 zeigt
den kompetitiven Nachweis von menschlichem NPOR (25 mer Oligonukleotid)
unter Verwendung des Systems, des Verfahrens und der Testvorrichtung
(3) dieser Erfindung. A (oben) ist das Signal einer
leeren Lösung (ohne
menschlichen NPOR) und B (unten) ist das Signal einer Lösung, die
menschlichen NPOR enthält. Dieses
Ergebnis liefert ein Verfahren zum Nachweisen und Sequenzieren von
DNA.