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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ophthalmische Zubereitungen und insbesondere
ophthalmische Zubereitungen zur Anwendung als ein Supplement des
Tränenfilms,
die einen Mucinbestandteil aufweisen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Ursprüngliche
Beschreibungen und Modelle des Tränenfilms erläutern den
Tränenfilm
als einen Tränenfilm,
der drei unterschiedliche Schichten aufweist, und der ein von Wasser-dominierter
dreischichtiger Tränenfilm
ist. Eine der Schichten weist eine Mucinschicht auf, die in erster
Linie dazu dient, die hydrophobe Augenoberfläche hydrophil zu machen, so
dass die wässrige
Schicht, die den Großteil
des Tränenfilms
ausmacht, gleichmäßig über das
Auge verteilt wird.
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Aktuelle
Arbeiten auf diesem Gebiet haben gezeigt, dass das klassische Modell
des vom Wasser-dominierten Tränenfilms
durch die wahrscheinlichere Konzeption eines Mucin-dominierten Gels
ersetzt worden ist. Dieses Gel weist die höchste Konzentration an Mucin
an der epithelialen Oberfläche
der Hornhaut und der Bindehaut auf, und die Konzentration des Mucins
nimmt schrittweise in weiter entfernt liegenden Bereichen des Tränenfilms
ab. Bei diesem Modell ist die Anwesenheit des Mucins bedeutsam für die Struktur,
die Stabilität
und die Funktion des gesamten Tränenfilms.
Neuere Studien des Tränenfilms
unter Einsatz der Laserinterferometrie und der konfokalen Mikroskopie
konnten die gesamte Gelschicht einschließen, wobei gezeigt werden konnte,
dass der menschliche Tränenfilm
30 bis 40 μm
dick ist, was mehr als viermal dicker ist als früher angenommen wurde.
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Basierend
auf der Physiologie des Tränenfilms
und von klinischen Beobachtungen werden Abnormalitäten des
Tränenfilms
durch Fokussieren auf ein spezifisches Defizit gekennzeichnet, z.B.
ein Defizit der wässrigen
Tränen,
Keraconjunctivitis sicca (KCS), ein Defizit des Mucins, eine Abnormalität des Lipids,
eine beeinträchtigte
Funktion des Augenlids oder eine Epitheliopathie. Obwohl klinisch
nützlich,
hat das stark vereinfachte Konzept des Mangels eines Bestandteiles
des Tränenfilms
als die Ursache des trockenen Auges den Weg zu komplexeren Betrachtungen
der Krankheit der Augenoberfläche
geebnet, die Folgendes beinhaltet: (1) die Gesundheit und die Regulierung
verschiedener Drüsen,
die zur Sekretion des Tränenfilms
beitragen, (2) Veränderungen
in dem Tränenfilm
selbst, z.B. in der Osmolalität
und dem Gehalt an Entzündungsvermittlern,
und (3) was als "letzter
gemeinsamer Weg" angesehen
wird, nämlich
die darauf folgenden Veränderungen
der Augenoberfläche.
In der Tat ziehen viele Kliniker und Autoren den Terminus "Erkrankung der Augenoberfläche" dem Terminus "trockenes Auge" für die Veränderung
der Augenoberfläche
vor, was auch immer die originäre
Ursache dessen ist, was in bedeutsamen Anzeichen und Symptomen des
trockenen Auges resultiert. Die Unannehmlichkeit der Erkrankung
der Augenoberfläche äußert sich
in Augensymptomen, wie Trockenheit, Sandigkeit, Brennen, Jucken
oder Kratzen, mit unterschiedlichen Variationen bei unterschiedlichen
Personen. Diese Symptome können
auch durch Faktoren wie Umweltbedingungen und das Tragen von Kontaktlinsen verschlimmert
werden. Die Kombination von unterschiedlichen klinischen Anzeichen
und Symptomen wurde auch als Syndrom des trockenen Auges bezeichnet.
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Im
Laufe der vergangenen zwanzig bis dreißig Jahre wurden mehrere Versuche
unternommen, um eine effektive und dauerhafte Behandlung der Symptome
des trockenen Auges, insbesondere bei Patienten mit milder bis schwerer
KCS, zu schaffen. Diese Versuche des Standes der Technik können aufgrund
ihrer physikalischen Beschaffenheit so kategorisiert werden: Salben,
Emulsionen, feste Bestandteile und Lösungen oder Gele auf Wasserbasis.
Salben sind im Allgemeinen wasserfreie Zubereitungen, die auf Gemischen
von weißem
Petrolatum und Mineralöl
basieren. Da diese Formulierungen fettig sind und das Blickfeld
trüben,
werden sie nicht breit angewendet, außer in Fällen von schweren Symptomen,
und diese sind im Wesentlichen auf die Applikation in der Nacht
kurz vor dem Schlafen begrenzt. Formulierungen auf Emulsionsbasis
zur Behandlung der Symptome des trockenen Auges sind innerhalb der
letzten zehn Jahre verstärkt
zum Vorschein gekommen. Ein Ansatz ist in einer Serie von US-Patenten
beschrieben, nämlich
5,578,586; 5,371,108; 5,294,607; 5,278,151 und 4,914,088. Diese
Patente lehren Verfahren und Zusammensetzungen zum Reduzieren des
Verdampfens der wässrigen
Schicht von der Augenoberfläche.
Das Verfahren beinhaltet die Anwendung einer Mischung eines beladenen
Phospholipids und eines unpolaren Öls am Auge, vorzugsweise in Form
einer fein verteilten Öl-in-Wasser Emulsion.
Ein anderer Ansatz ist in den US-Patenten 4,818,537 und 4,804,539
beschrieben, wo Liposomzusammensetzungen in Form von Emulsionen
beansprucht werden, um eine erhöhte
Retention an der Augenoberfläche
zu erhalten, und dadurch eine Milderung der Symptome des trockenen
Auges zu schaffen.
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Feste
Bauteile, in Form von Augeneinsätzen,
wurden für
dauerhafte symptomatische Abhilfe des trockenen Auges verwendet.
Diese Bestandteile werden in das Auge eingeführt und werden langsam gelöst oder erodiert,
um einen verdickten Augentränenfilm
zu erhalten. Oftmals finden die Patienten diese Bestandteile schwer
einzuführen,
und wenn diese an Ort und Stelle sind, neigen diese Bestandteile
dazu, unkomfortabel zu sein. Beispiele dieser Technologie sind in
den US-Patenten 5,518,732; 4,343,787 und 4,287,175 gegeben.
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Die
am meisten empfehlenswerte und kommerziell erfolgreichste Methodologie
zur Behandlung der Symptome des trockenen Auges sind Lösungen oder
Gele auf Wasserbasis. Für
die Patienten sind Augentropfen bequem und einfach anzuwenden im
Vergleich zu den zuvor erwähnten
Optionen. Zur Zeit sind mindestens dreißig künstliche Tränenprodukte auf dem Markt zur
Auswahl vorhanden. Die "aktiven" Bestandteile der
meisten in der heutigen Zeit erhältlichen
künstlichen
Tränenformulierungen
sind übliche
wasserlösliche
oder dispergierbare Polymere wie: Hydroxyethylcellulose; Hydroxypropylmethylcellulose;
Methylcellulose; Carboxymethylcellulose; Polyvinylalkohol; Polyvinylpyrrolidon;
Polyethylenglycol; Carbomere und Poloxamere.
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Die
zur Zeit vermarkteten Produkte schaffen provisorische – in der
Regel in Minuten gemessene – Abhilfe
der Symptome und sind rein palliativ ohne dauerhafte Wirkung. In
der Tat, wäre,
um eine Abhilfe der Symptome bei milden bis schweren Fällen beizubehalten,
ein unpraktisches Zeitschema der Dosen notwendig. Bei konservierten
Lösungen
kann die Häufigkeit
der Einträufelungen
von selbst zu Anzeichen und Symptomen von Reizung führen, und
macht es notwendig, teure und unhandliche Verpackungen zum Zuführen von
Einheitsdosen zu verwenden.
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Neue
Patentliteratur zeigt ein fortgesetztes Interesse an weiterführenden
synthetisch basierten künstlichen
Tränenlösungen.
Zum Beispiel lehrt das US-Patent 5,460,834 die Verwendung von Hydroxypropylmethylcellulose
zusammen mit anderen Inhaltsstoffen als eine ophthalmische Lösung, und
die PCT-Veröffentlichung
WO 98/11875 beschreibt die Verwendung von Polyvinylpyrrolidon in
Kombination mit anderen Bestandteilen, um die Trockenheit des Auges
zu lindern.
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Die
Fachwelt hat erkannt, dass eine ophthalmische Lösung eine effektive und dauerhafte
Behandlung der Symptome des trockenen Auges schaffen muss. Ein Bemühen zum
Erreichen dieser Ziele ist, eine Lösung mit maßgeschneiderten rheologischen
Eigenschaften zu schaffen, nämlich
eine hoch viskose Lösung,
die unter Beanspruchung nachgibt oder fließt. Beispiele dieser Bemühungen sind
in den US-Patenten 5,075,104 und 5,209,927 beschrieben, in denen
die rheologischen Eigenschaften der ophthalmischen Lösung durch
Verwendung von Carbomerpolymeren erreicht wurden. Es wurde herausgefunden,
dass diese Carbopolymere bio-adhäsiv
sind, wie in den US-Patenten 5,225,196; 5,188,828; 4,983,392 und
4,615,697 beschrieben. Es wird angenommen, dass die bio-adhäsiven Eigenschaften
des Carbomers zu längeren
Retentionszeiten im Auge beitragen. In der Tat lehren die US-Patente
5,075,104 und 5,209,927, dass die Carbomerpolymere durch Bewahren
oder Wiederherstellen des normalen Feuchtigkeits-Gleichgewichts
der epithelialen Zellen funktionieren, wobei die Hornhaut in einer
Art geschützt
wird, die ähnlich
zu der ist, von der man glaubt, dass sie durch den Mucinbestand teil
der normalen Tränen
geschaffen wird. Deswegen können
in der Theorie die Polymere zusätzlich
dazu, dass sie im Auge gut gehalten werden und eine Schmierung schaffen,
als ein Mucinersatz beim Syndrom des trockenen Auges funktionieren,
und zwar dort, wo ein Mangel oder eine Abwesenheit des natürlichen
Mucinbestandteiles der normalen Tränen vorliegt.
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Polymere,
die Mucin-ähnliche
Eigenschaften zeigen, werden oft als "mucomimetisch" bezeichnet. Meistens ist die in diesem
Fachgebiet durch solche "mucomimetische" Polymere beigebrachte
Eigenschaft schlicht und einfach die Viskosität. Obwohl es zutreffend ist,
dass eine viskose Lösung
ein wenig länger
im Auge bleiben wird, ist es die Viskoelastizität und weniger die Viskosität des gelbildenden
Mucins des Tränenfilms,
die entscheidend für
dessen Schutzfunktion während
des Blinzelns ist. Zusätzliche
Schmierung und Schutz vor dem Trockenwerden und das physische Trauma
der Augenoberfläche
an sich kommt von dem transmembranen, auf der Oberfläche des
Epitheliums der ganzen Augenoberfläche gebildeten Mucins. Es wurde
auch vorgeschlagen, dass dieses transmembrae Mucin eine entscheidende
Rolle in der Verteilung und der Bewahrung der Struktur des Tränenfilms,
durch dessen Wechselwirkung mit den abgesonderten gelbildenden Mucinen
des Tränenfilms
spielt.
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Mucine
sind die wichtigsten Bestandteile in dem Tränenfilm zum Fördern der
Schmierung während
des Blinzelvorganges. Die Schergeschwindigkeit kann während des
Blinzelns sehr hoch sein. Dabei werden die Zellen beschädigt und
nachfolgend treten Beschwerden auf, wenn die während des Blinzelns erzeugten Scherkräfte auf
die epitheliale Oberfläche übertragen
werden. Zwei rheologische Bedingungen können die Wirkung der durch
Blinzeln verursachten Scherkräfte
mildern. Erstens, Verringerung der Scherung (kein Newton'sches Verhalten)
des Tränenfilms
bei Erhöhung
der Scherkräfte
resultiert in einer Reduzierung der Scheinviskosität. Zweitens,
die mit der Scherkraft verbundene Energie kann teilweise durch den
elastischen Bestandteil des Tränenfilms
absorbiert werden. Diese rheologischen Bedingungen werden durch
die viskoelastischen Eigenschaften der Mucinabsonderungen des Auges
geschaffen, und zwar sowohl in der Gradienten-Konzentration der
Fluidschicht als auch im nahe der epithelialen Oberfläche vorhandenen
Gels. Als Ergebnis kann während
der Augenbewegung das Mucin durch den Tränenfilm auf den Belastungsgradienten
wirken und die Scherkraft auf der Zelloberfläche auf nahe Null reduzieren.
Aktuell kommerzielle künstliche
Tränenprodukte
erzielen nicht die Viskositätseigenschaften
der menschlichen Tränen
und zeigen sehr begrenzte Retentionszeiten und Schmiereffekte im
Auge.
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Die
Suche nach Mucin-artigen Polymeren hat sich auf dem Gebiet der Biopolymere
mit besonderem Schwerpunkt auf die natürlich vorkommenden Polysaccharide
ausgedehnt. Ein Polymer, die Hyaluronsäure, und ihr Natriumsalz haben
innerhalb der letzten Jahre sehr große Aufmerksamkeit erhalten.
In der Tat wurde ein kommerzielles Erzeugnis, Hylashield®,
das auf Natriumhyaluronat mit großer Molekularmasse basiert,
erfolgreich als eine Lösung
zur Behandlung der Trockenheit des Auges vermarktet. Die Verwendung
der Hyaluronsäure
in Zusammensetzungen von künstlichen
Tränenlösungen ist
auch in den US-Patenten 5,460,834 und 5,106,615 gelehrt. Andere
Polysaccharide, wie Carrageenan, Tamaringummi und Keratansulfat,
wurden zur Verwendung in künstlichen
Tränenlösungen beansprucht,
wie das in den US-Patenten 5,403,841 und 5,460,834 und in der PCT-Publikation WO
97/28787 offenbart wurde. Zusätzlich
wurden Polysaccharide wie Alginat, Dextran, Scleroglucan und Xanthan
verwendet oder wurden für
die Anwendung bei ophthalmischen Lösungen vorgeschlagen.
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Der
Stand der Technik erkennt eindeutig die Wichtigkeit des Mucins in
dem natürlichen
Tränenfluid
als ein Feuchtigkeitsmittel, Bildner des viskoelastischen Gels,
Schmiermittel und Barriere gegenüber
bakterieller Adhäsion.
Ein doch begrenzter Erfolg mit so vielen unterschiedlichen synthetischen
und substituierten Polymeren zeigt, dass das Ergänzen des Tränenfluids mit einem kompatiblen
Mucin aus einer exogenen Quelle eine mehr direkte und bevorzugte
Methode zum Angehen der Bedienungen des trockenen Auges erscheint. Ein
Teil des Problems bei der Entwicklung der Veränderungen der Augenoberfläche bei
der Krankheit des trockenen Auges kann die Dehydratisierung des
Schleimgels und eine daran anschließende Veränderung der Mucinschichten
der Augenoberfläche
sein. Durch Ergänzung
des Tränenfluids
mit Mucin in einer wässrigen Lösung sollte
man erwarten, dass die natürliche
oberflächliche
Mucinschicht des Auges beibehalten wird, und zwar sowohl durch die
Addition der zusätzlichen
Mucinmoleküle
als auch durch die durch das wässrige
Bindemittel geschaffene Hydratisierung.
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Möglicherweise
ist ein Grund dafür,
dass auf Mucin basierte ophthalmische Lösungen nicht entwickelt wurden,
die begrenzte kommerzielle Verfügbarkeit
des Mucins. Mucine, die erhältlich
sind, werden teilweise aus submaxillären Rinderdrüsen oder
Eingeweiden von Schweinen isoliert. Diese Nebenprodukte der Fleisch verarbeitenden
Industrie werden von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) und
Worthington Biochemical Corp. (Freehold, NJ) vertrieben. Das beachtenswerteste
Problem der zur Zeit erhältlichen
kommerziellen Mucine ist ihre sehr schlechte Qualität. Zum Beispiel
ergibt eine Fraktionierung des BSM-Mucins von Sigma durch SDS-PAGE,
dass das Präparat
stark durch Proteine mit niederem Molekulargewicht verunreinigt
ist, die entweder degradiertes Mucin sind oder Proteine sind, die
ohne Bezug zu Mucin stehen.
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Die
Patentliteratur ergibt eine Referenz bezüglich der Verwendung des Mucins
in sterilisierten, konservierten und stabilen Lösungen. Das US-Patent 4,438,100
beschreibt Mucin enthaltenden Lösungen
für Applikation
auf empfindlicher Schleimhaut der Mundhöhle, des Nasalsystems und des
Auges. Die in dieser Erfindung verwendeten Mucine sind nicht-menschliche
Säugetier-Mucine,
die ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus bukkalen und Magen-Darm-Mucinen.
In der Tat ist die Quelle dieser Mucine Schleim, eine voll entwickelte
und komplexe Sekretion bestehend aus einer Mischung unterschiedlicher
Mucinmoleküle
sowie aus anderen Proteinen und mit der Absonderung verbundener
Verunreinigungen. Es wird kein Unterschied zwischen abgesonderten
Mucinen und der durch die Zelloberfläche der Mundhöhle oder
der Magen-Darm-Schleimhaut gebildeten Mucine gemacht. Die Erfinder
stellen Beispiele der Mucin enthaltenden Lösungen für Verwendung als künstlicher
Speichel bereit, aber sie zeigen keine Zubereitung von ophthalmischen Lösungen.
Tatsächlich
diskutieren die Erfinder die potenzielle Verwendung der Mucin enthaltenden
ophthalmischen Lösungen
in Verbindung mit der Pflege von Kontaktlinsen. Es ist offensichtlich,
dass die Erfinder die Verwendung des Mucins als eine Tränenergänzung nicht
in Betracht gezogen haben.
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ZUSAMMENFASSENDE
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ophthalmische Zubereitungen zur Verwendung
als Supplement für einen
Tränenfilm.
Spezieller bezieht sich die Erfindung auf eine wässrige Zubereitung, die in
das Auge eingeträufelt
werden kann, oder in der ein Objekt, das in das Auge eingeführt werden
soll, z.B. Kontaktlinsen, Salben oder Festkörper, die in den Bindehautsack
eingebracht werden müssen,
aufbewahrt oder aufgeweicht wird. Die beschriebenen Zubereitungen
werden für
die Behandlung von Krankheiten wie Keraconjunctivitis sicca oder
das Syndrom des trockenen Auges verwendet. Im Allgemeinen sind die
Zubereitungen dieser Erfindung auch effektiv für die Abhilfe der Symptome
der Reizung des Auges, die durch trockene Umweltbedingungen oder
durch Tragen von Kontaktlinsen verursacht werden.
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Insbesondere
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ophthalmische Zubereitungen,
die ähnlich
zu den in der normalen menschlichen Augenoberfläche gefundenen Mucinbestandteilen
sind, sowie auf Verfahren zu ihrer Zubereitung und Aufbewahrung.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Behandlung des
Auges durch topische Anwendung der Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung, falls angezeigt, um eine Schmierung und einen Schutz
der Augenoberfläche
zu schaffen, zur Abhilfe von Trockenheits- und Unannehmlichkeitssymptomen,
die bei Krankenhauspatienten mit trockenem Auge und nachfolgender
traumatischer Verletzung oder Operation vorkommen, und wenn angebracht,
um andere zuvor erwähnte
Wirkungen zu erzielen. In einer bevorzugten Ausbildung werden die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als gepufferte, sterile
wässrige
Lösungen
bereitgestellt. Die betreffenden Zusammensetzungen können unkonserviert (in
einem Einheits-Dosisformat vorliegend) oder konserviert sein.
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In
einem beispielhaften Ausführungsbeispiel
lehrt die vorliegende Erfindung ophthalmische Zubereitungen, die
ein Mucin enthalten, das von Säugetiermilch
stammt, vorzugsweise von Kuhmilch, und zwar aufgrund derer relativen
Häufigkeit.
Als andere Quellen dienen Ziegen und andere Säugetiere, aus welchen entsprechende
Mengen der Milchmucine erhalten werden können. Zum Herstellen der ophthalmischen
Erzeugnisse der vorliegenden Erfindung werden andere übliche,
bei ophthalmischen Zubereitungen verwendete Inhaltsstoffe eingesetzt,
um eine Balance der physiologisch akzeptierbaren Eigenschaften zu
schaffen, unabhängig
davon, ob das endgültige
Produkt eine Lösung,
eine Salbe, ein Gel oder ein Feststoff ist.
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Die
zuvor diskutierten und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden vom Fachmann durch die nachfolgende detaillierte
Beschreibung gewürdigt
und verstanden.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Mucine
beziehen sich auf eine Familie an Glycoproteinen mit einem hohem
Molekulargewicht, die durch Becher-Epithelzellen und Nicht-Becher-Epithelzellen
der Schleimhaut abgesondert oder exprimiert werden. Diese Mucine
herrschen bei der Bildung von Schleim vor, eines hoch hydratisierten
Gels mit bestimmter Struktur und Funktion. Neun unterschiedliche
Mucingene (MUC1, 2, 3, 4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, 7 und 8) wurden identifiziert.
Ferner wird jedes von diesen in mehreren Formen in unterschiedlichen
Geweben produziert. Dies suggeriert, dass die Mucine einzigartigen
Gewebe-spezifischen Schutzfunktionen auf der apicalen Oberfläche der
spezialisierten Epithelzellen dienen.
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Im
menschlichen Auge wurden aus den konjunktivalen Isolaten die sekretorischen
Mucine MUC2, MUC4 und MUC5AC detektiert (durch Transkripte auf dem
Niveau der Nucleinsäuren),
und nur MUC5AC wurde an konjunktivalen Becherzellen lokalisiert.
Das transmembrane Mucin MUC1 ist mit den Zellmembranen der gesamten
Hornhaut und der konjunktivalen Epitheloberfläche verknüpft, mit Ausnahme der Becherzellen.
Qualitative und quantitative Analysen der Augenmucine sind schwierig,
weil es bisher keine bestimmten Untersuchungen für individuelle Augenmucine
gibt, und es ist wenig über
den Mechanismus oder den Syntheseumfang oder die sekretorische Regulation
dieser Mucine bekannt. Ein oder mehrere Calcium-abhängige Prozesse,
mit Beteiligung mehrerer Sekretagogume, wie Prostanoide, autonome
Transmitter und Neuropeptide wurden untersucht.
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Die
abgesonderten Augenmucine sind relativ große Moleküle, die eine wesentliche Rolle
in der gelbildenden Natur des Tränenfilms
spielen. Das Modell, bei dem der größte Teil des Tränenfilms
als hydratisiertes Schleimgel anstatt als wässrige Schichten dargestellt
ist, bekommt zunehmende Akzeptanz. Die Viskoelastizität des Tränenfilms
stammt von der spezifischen Struktur und der gelbildenden Eigenschaften
der Augenmucine, und erlaubt es dem Tränenfilm die Scherkraft des
Blinzelns, die anderenfalls die Augenoberfläche reizen und beschädigen würde, zu
absorbieren. Das transmembranane Mucin dient andererseits mehr als
eine schützende
Schicht an der jeweiligen zellenartigen Oberfläche des Epithels des Auges,
und funktioniert zum direkten Schutz und zur Schmierung der Augenoberfläche, sowie
zum Verankern des stark hydratisierten Gels (Schleim) der gelbildenden
Mucine des Tränenfilms,
wodurch die Verteilung und die Stabilität des Tränenfilms über die Augenoberfläche unterstützt wird.
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Es
ist bekannt, dass die oben genannten Mucine geschichtete Schichten
auf der Oberfläche
der Schleimmembrane, wie z.B. im Darm, bilden, wobei sie den Fluss
und die Wechselwirkung der schützenden Schicht
und deren Inhalte mit der zellförmigen
Oberfläche
des Epithels beeinflussen. Es wird erwartet, dass der Mangel an
einer Art des Mucins das Schmieren, den Schutzwall und andere Funktionen
der anderen Mucine in der Schleimoberfläche beeinflusst.
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Bei
milder bis schwerer Trockenheit des Auges wird die Dichte der Becherzellen
nicht bedeutend reduziert, was darauf hinweist, dass MUC5AC in ausreichenden
Mengen, um auf die gesamten Augenoberfläche verteilt zu werden, normal
produziert wird. Lokalisierte frühe
Veränderungen
der Augenoberfläche
aufgrund der Trockenheit, was durch Anfärben mit Fluoreszin oder Bengalrosa
dargestellt werden kann, können
im Epithel der Hornhaut und in konjuviktalen Oberflächen sichtbar
gemacht werden. Die lokalisierte Beschädigung der Augenoberfläche zeigt,
dass sogar geringere Trockenheit eine bedeutsame Auswirkung auf
die Anwesenheit der funktionellen MUC1 an der Oberfläche des
Epithels des Auges haben kann. Da einer der vorgeschlagenen Funktionen
des MUC1 darin besteht, den anderen, mehr reichlich vorhandenen,
gelbildenden, auf der Augenoberfläche haftenden Augenmucine zu
helfen, kann eine geringe Menge an MUC1 bedeutsam die Stabilität des Tränenfilms
beeinflussen, sogar in der Anwesenheit eines Überflusses an dem durch die
konjunktiven Becher zellen abgesonderten MUCSAC. Wenn Untersuchungen
unter Verwendung der Technik der Impressionscytologie durchgeführt werden,
können
ernsthaftere Veränderungen
der Augenoberfläche
aufgrund von Trockenheit, die in Proben der Plattenepithelmetaplasie
entstehen, erkannt werden, und zwar dass diese ursprünglich in
lokalisierten Bereichen entstehen. Diese mehr pathologischen, lokalisierten
Oberflächenveränderungen
stellen einen weiteren Beweis für
die entscheidende schützende
Funktion von MUC1 dar. Es gibt einige frühe Anzeichen, dass, mit dem
Fortschreiten der mit dem trockenen Auge verbundenen Veränderungen
der Mucine der Augenoberfläche,
wie sie durch immunohistochemische Methoden detektiert werden können, die
Becherzellen selbst versuchen, den Mangel an normaler Expression
von MUC1 ausgleichen, und zwar durch die verbleibenden (Nicht-Becherzellen)
der cornealen und konjunktivalen Oberfläche des Epitheliums, und beginnen
ein MUC1-artiges Molekül
in ihren Sekreten zu exprimieren.
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Obwohl
keine Beweise für
diese Theorie vorhanden sind, glauben wir, dass der in dieser Erfindung
beschriebene besondere Typ des Mucins ein transmembranes Mucin oder
ein Oberflächenmucin
ist, das die Augenoberfläche
schmiert und schützt,
und zwar in der Rolle des natürlichen
transmembranen Mucins, MUC1, das durch die gesamte Epitheloberfläche der
Bindehaut und der Hornhaut exprimiert wird. Durch Ergänzen des Mucins
der natürlichen
epithelialen Oberfläche
wird die Schmierung und der Schutz der Augenoberfläche verbessert,
um die Progression und die damit verbundene Entwicklung der Symptome,
der Veränderungen
des Epithels der Augenoberfläche,
z.B. eine abnehmende Stabilität
des Tränenfilms,
ein erhöhtes
Anfärben
mit Fluoreszin oder Bengalrosa, eine erniedrigte Dichte der Becherzellen
und die Entwicklung der Plattenepithelmetaplasie, die in Zusam menhang
mit der Krankheit der Augenoberfläche gesehen wird, zu verlangsamen. Die
Art der Viskosität
im bevorzugten Ausführungsbeispiel
zielt primär
darauf, die erfindungsgemäße Retention
im Auge an der Augenoberfläche
zu unterstützen,
sowie für
eine Schmierung und einen Komfort in Zusammenhang mit dem Einträufeln zu
schaffen. Viskosität
ist nicht die physikalische Eigenschaft, die der Mucinformulierung
der Erfindung deren "mucomimetische" Funktion verleiht.
Die Erfindung schützt
und schmiert primär die
Augenoberfläche
und wirkt mit den gelbildenden sekretierten Mucinen des Tränenfilms
zusammen, wodurch das Verteilen des Tränenfilms verbessert wird, und
ferner durch Weglassen von Einträufelungszusätzen zum
Tränenfilmvolumen
und durch Hydratisierung der Augenoberfläche. Die "mucomimetischen" Effekte der Erfindung sind folglich
solche des transmembranen Mucins, das an dem Epithelium der Augenoberfläche exprimiert
wird, und nicht gelbildende Mucine, die durch die Becherzellen abgesondert
werden. Zusammengenommen schützen
diese Effekte die Augenoberfläche
vor Trockenheit und absorbieren Scherkräfte des Blinzelns, und unterstützen die
vom Auge selbst abgesonderten gelbildenden Mucine (MUC4 und MUC5)
dahingehend, dass deren viskoelastische Eigenschaften aufrecht erhalten
werden und demzufolge die Struktur und die Stabilität des Tränenfilms,
wobei die Veränderungen
der Augenoberfläche,
die bei Bedingungen des trockenen Auges festgestellt werden, dabei
verlangsamt oder verhindert werden.
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Obwohl
Mucine aus mehreren Quellen erhalten werden können, zeigen sie bei den zuvor
beschriebenen speziellen Molekülen
(MUC1, 2 etc.) ähnliche
Strukturen unter bestimmten Spezien, insbesondere im Hinblick auf
deren Proteinrückgrat.
Sie sind Glycoproteine, die fünfzig
bis achtzig Prozent Kohlenhydrat enthalten. Sie sind große, lang
erstreckte Moleküle
(Molekulargewicht 105 bis 107 Dalton)
mit einem Proteinrückgrat,
an das Oligosaccharide in Form einer Flaschenbürstenkonfiguration angehaftet
sind. Die Oligosaccharidseitenketten oder Borsten können hochvariabel
in ihrem Aufbau sein, was hinweist, dass die mehr Basisfunktionen der
Moleküle
von ihrem Proteinkern stammen. Diese Moleküle können durch Disulfidbrücken vernetzt
sein, um sehr hochmolekulargewichtige Gele auszubilden. MUC1, das
oberflächliche
oder transmembrane Mucinmolekül,
ist das kleinste Mucin und wird als aus sich selbst heraus nicht
als ein gelbildendes Mucin betrachtet. Das Mucin der Erfindung ist
vom Typ MUC1 und stammt von Säugetiermilch,
insbesondere aus Kuhmilch oder Milchnebenprodukten wie Molke, bearbeitete
Molke, süße Molke
oder saure Molke. Die niedrigen Kosten und die Verfügbarkeit
dieser Quelle des vorherrschend transmembranen Mucins (das relativ
wenig Verunreinigungen im Vergleich mit anderen Mucinen aufweist,
die aus Darm oder aus submaxiliaren Drüsen stammen) macht dieses ideal.
Ein weiterer Nachweis, dass diese Quelle natürlich und geeignet ist, wird
in der Tatsache gefunden, dass der humane Milchfettkügelchen-Antikörper (HMFG-1), der spezifisch
für das
MUC1-Kernprotein ist, erfolgreich bei Immunoblotanalysen und Immunohistochemie
eingesetzt werden kann, um das Vorhandensein und die Verteilung
von MUC1 im Auge zu bestimmen. Es liegt auch im Rahmen der Erfindung,
dass der Mucinbestandteil von Milch abgeleitet werden kann, die
von Vieh stammt, wie beispielsweise von Ziegen und dgl.
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Ein
Milchnebenprodukt, vorzugsweise in Form von Molke, wird gereinigt,
um den gewünschten
Mucinbestandteil zu erhalten. Die Molke besteht hauptsächlich aus
Lactose und Proteinen mit einem kleinen prozentualen Anteil des
Mucins. Um den Mucin bestandteil zu gewinnen, werden bekannte Standardfraktionisierungsverfahren
eingesetzt. Diese Verfahren beinhalten Gelfiltrationschromatographie
(Größenausschluss),
Zentrifugieren und Ultrafiltration. Das erhaltene Mucin scheint
eines der MUC1-Kategorie
zu sein und besteht in Form eines komplexen Moleküls mit einem
Molekulargewicht (MW) von 2 × 106 und größer. Diese
Komplexstruktur besteht aus etwa fünfzig Prozent Mucin (2 × 105 MW), das mit einem Protein mit niederem
Molekulargewicht über
Disulfiden verbrückt
ist. Wie bei natürlich
vorkommendem Augenmucin zeigen die in dieser Erfindung beschriebenen
Mucine eine geringe Oberflächenspannung
(Oberflächenaktivität) in wässrigen
Lösungen.
Milchprodukte und Nebenprodukte können von einer Vielzahl von
kommerziellen Quellen erhalten werden, hauptsächlich aus Käse erzeugenden
Fabriken, einschließlich
Cache Valley Dairy in Logan, Utah und Smith Grocery Stores in Layton,
Utah.
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Die
Menge an von Milch abstammendem Mucin in einer ophthalmischen Formulierung
kann je nach Produkttyp stark variieren. Beispielsweise kann die
Mucinkonzentration in Lösungen
in Zusammenhang mit Kontaktlinsen von etwa 0,001 bis 5,0% Gew.-%
variieren. Bei Trockenem-Auge-Zubereitungen kann der Mucingehalt
von ca. 0,1 Gew.-% bis ca. 10 Gew.-% variieren. Bei einer festen
Augeneinschubzuführvorrichtung kann
der Mucingehalt bis etwa 90 Gew.-% oder größer betragen. Innerhalb jeder
Art an Zubereitung kann die Konzentration variieren abhängig von
Faktoren wie z.B. die Schwere der zu behandelnden Bedingungen des trockenen
Auges, um die besonderen Eigenschaften der Mucinlösung zu
verbessern. Diese Bereiche sind dazu gegeben, um die Lehre der Erfindung
bereitzustellen und sind in keiner Art und Weise so zu verstehen, dass
diese den Rahmen der Erfindung einschränken.
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Die
vorliegenden ophthalmischen Lösungen
beinhalten von Milch abstammendes Mucin entsprechend der Erfindung.
Zusätzlich
können
andere Bestandteile der Erfindung, falls notwendig, eingesetzt werden:
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VISKOSITÄTSMITTEL
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Cellulosederivate
werden üblicherweise
eingesetzt, um die Viskosität
zu erhöhen.
Spezifische Cellulosederivate beinhalten: Hydroxypropylmethylcellulose,
Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose etc.
Manche Polysaccharide können
ebenfalls eingesetzt werden, um die Viskosität von ophthalmischen Lösungen zu
erhöhen
und beinhalten Xantham, Scleroglucam, Carrageenane, Trakan, Hyaluronsäure etc.
Andere nützliche
Viskositätsmittel
beinhalten Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyethylenoxid,
Polyacrylsäure
und vernetzte Polyacrylsäure.
Im Allgemeinen sind die Viskositätsmittel
in einer Menge von 0,1 bis 0,75 Gew.-% der Lösung vorhanden.
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PUFFERMITTEL
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Jegliche
pharmazeutisch akzeptablen Puffersysteme können eingesetzt werden und
beinhalten Phosphate, Borate, Citrate, Acetate und Carbonate in
notwendigen Mengen, um einen pH von ca. 6,0 bis ca. 8,0 einzustellen.
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TONIZITÄTSMITTEL
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Die
Tonizität
der hier beschriebenen ophthalmischen Lösungen kann entweder bezüglich normaler Tränen hypotonisch,
isotonisch oder hypertonisch sein, und zwar unter Einsatz von allgemein üblich verwendeten
Stoffen dazu. Natrium oder Kaliumchlorid sind weit verbreitet, um
die Tonizität
einzustellen. Andere Agenzien beinhalten Dextrose, Manitol, Sorbitol
und Harnstoff.
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BENETZUNGSMITTEL
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Wasserbindende
Verbindungen helfen Feuchtigkeit auf der Augenoberfläche zu erhalten
und beinhalten Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol.
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BEFEUCHTUNGSMITTEL
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Bestimmte
Verbindungen sind nützlich,
um die Befeuchtung der Oberfläche
zu fördern,
sei es die Augenoberfläche
oder die Oberfläche
einer Kontaktlinse. Eine bevorzugte Kategorie sind die Polyoxamere.
Diese Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Polyethylenoxid-Block-Copolymere
stehen von der BASF zur Verfügung. Andere
Verbindungen beinhalten Tetronics®, reverse
Pluronics® und
reverse Tetronics®, ebenfalls von der BASF
zur Verfügung
stehend.
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KONSERVIERUNGSMITTEL
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können
ein Konservierungsmittel in einer wirksamen Menge enthalten. Bekannte Konservierungsmittel
beinhalten Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (BAK), Chlorhexidengluconat
(CHG), Polyhexamethylenbiguanid (PHMB), andere Polyquate und Sorbinsäure. Die betreffenden
Zusammensetzungen können
auch Co-Konservierungsmittel und/oder komplexierende Mittel wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
und deren Salze enthalten.
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ANDERE ZUSÄTZE
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In
manchen Fällen
kann es nützlich
sein, weitere Bestandteile in einer ophthalmischen Lösung aufzunehmen.
Diese beinhalten spezielle Ionen, wie Ca++,
Zn++ und Mg++, Cu++, Selen, Vitamine wie A, C und E, um die
Gesundheit des Auges zu fördern.
Die in der Erfindung beschriebenen Zusammensetzungen können auch als
Vehikel für
das Zuführen
von Arzneimittel dienen. Arzneimittel, die beim Auge oftmals eingesetzt
werden, beinhalten: Anti-Glaucom-Verbindungen, entzündungshemmende
Mittel und infektionshemmende Mittel.
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Wie
zuvor beschrieben, findet die Erfindung insbesondere Einsatz als
schmierende Augentropfen, d.h. eine künstliche Tränenlösung, ein Supplement für den Tränenfilm,
ein Zuführvehikel
für die
topische Verabreichung von ophthalmischen Arzneimitteln. Bei den
meisten Verabreichungen sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als gepufferte,
sterile wässrige
Lösung
bereitgestellt. Typischerweise haben diese Lösungen eine Viskosität von etwa
1 bis 100 cps. Als Lösung
werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in
das Auge in Form eines Augentropfens verteilt. Es ist selbstverständlich,
dass die in Zusammenhang mit der Erfindung beschriebenen Zusammensetzungen
auch als viskose Flüssigkeiten
formuliert werden können,
d.h. mit Visko sitäten
von mehreren hundert bis mehreren tausend cps, als Gele oder als
Salben. Bei diesen Anwendungen wird der Mucinbestandteil in einem
geeignetem Vehikel dispergiert oder gelöst, wie beispielsweise Lubragel,
GRR Lubricating Jelly oder Karajel, alles Markenprodukte der United-Guardian,
Inc., Hauppauge, NY.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können
auch als feste Augeneinsätze
formuliert werden, die sich mit der Zeit auflösen oder erodieren, wenn sie
in den Tränensack
des Auges eingesetzt werden.
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Schwellungsgesteuerte
Freisetzvorrichtungen würden
aus homogen dispergiertem Mucin in einem glasartigen Polymer bestehen,
wie beispielsweise wasserlöslichen
Cellulosen. Wird der Einsatz im Auge platziert, beginnt die Augenflüssigkeit
in die Matrix einzudringen, gefolgt von einem Quellen und schließlich einem Auflösen der
Matrix. Während
der Prozess abläuft,
wird Mucin in das Auge freigesetzt, um über einen langen Zeitraum eine
Linderung der Symptome des trockenen Auges zu bewerkstelligen.
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Erodierbare
Vorrichtungen würden
wiederum aus homogen in einer Polymermatrix verteiltem Mucin bestehen.
In diesem Fall wird das Mucin durch eine chemische Reaktion (Hydrolyse)
freigesetzt, die in einer Solubilisierung des Matrixpolymers resultiert, üblicherweise
an der Oberfläche
der Vorrichtung. Im Allgemeinen ist das Material der Matrix ein
Polyanhydrid oder ein Poly(ortho)ester.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann das Mucin chemisch modifiziert oder vernetzt sein, um als seine
eigene "Matrix" zu fungieren, wobei
Mucin die gesamte oder nahezu die gesamte Vorrichtung beinhaltet,
so dass dadurch die maximale für
das Auge zur Verfügung
stehende Menge an Mucin geschaffen wird.
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Darüber hinaus
kann bei manchen Ausführungen
in Zusammenhang mit Kontaktlinsen das erfindungsgemäße Mucin
in Lösungen
zum Einweichen oder Konditionieren der Kontaktlinsen inkorporiert
werden sowie bei schmierenden Augentropfen für Träger von Kontaktlinsen.
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In
anderen Ausführungen
kann das Mucin bei der Zuführung
von Arzneimitteln eingesetzt werden. Die häufigste und bequemste Methode
der Zuführung
von Augenarzneimitteln ist im Wege von topischen Augentropfen. Üblicherweise
werden die eingesetzten Lösungsvehikel
rasch durch die Tränenflüssigkeit
verdünnt und
fließen
innerhalb von Minuten vom Auge ab. Diese kurze Einwirkungszeit behindert
die Absorption und somit die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels
im Auge. Oftmals wird die kurze Einwirkungszeit durch starkes Anheben
der Konzentration des Arzneimittels überwunden, um dadurch die Bioverfügbarkeit
zu verbessern. Dies führt
oftmals zu signifikanten unerwünschten
Nebeneffekten aufgrund der systemischen Einwirkungen mancher zur
Zeit verschriebenen Augenarzneimittel.
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Es
wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um die Einwirkungszeit
des Arzneimittelzuführvehikels
auf der Augenoberfläche
zu verbessern und auch die Interaktion oder die Assoziierung des
Arzneimittels mit dem Vehikel. Eine Ausführung, die kommerzialisiert
wurde, besteht in der Verwendung eines vernetzten Carboxy-funktionalen
Polymers wie Carbopol
®, bereitgestellt durch
B. F. Goodrich. Die bioadhäsive
Natur die ses Polymers wurde die Basis für kontrolliert freisetzende
ophthalmische Formulierungen, wie sie in den US-Patenten 4,615,697
und
US 5,188,826 beschrieben
wurden.
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Vernetzte
Carboxy-funktionale Polymere quellen in wässriger Lösung, verbleiben aber als mikrongroße hydratisierte
Partikel. Darüber
hinaus zeigen sie bei neutralem pH eine im Wesentlichen anionische
Natur. Da zahlreiche ophthalmische Arzneimittel, z.B. Timolol und
Pilokarpin, positiv geladen sind, werden sie mit den negativ geladenen
Polymerpartikeln durch elektrostatische Wechselwirkung assoziieren.
Da die hydratisierten Partikel mikroporös sind, kann das Arzneimittel
in die Matrix absorbiert werden. Wird eine solche ophthalmische
Lösung
in das Auge gebracht, so haften die hydratisierten Polymerpartikel
an der Schleimoberfläche
und bewirken eine verlängerte
Einwirkungszeit. Während
dieser Einwirkung wird das Arzneimittel von den hydratisierten Polymerpartikeln
freigesetzt und dadurch wird eine effiziente lokale Zuführung zum
Auge geschaffen.
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Die
Mucine der vorliegenden Erfindung sind per Definition "bioadhäsiv" und enthalten zahlreiche
negative Ladungen. Es wurde auch gezeigt, dass die Mucine der Erfindung
hochmolekulargewichtige Verbindungen sind, die durch Protein-Disulfidbrücken vernetzt
sind. Mit dieser Information kann man erwarten, dass die erfindungsgemäßen Mucine
in einer ähnlichen
Art und Weise wie die vernetzten carboxy-funktionellen Polymere
als ein ophthalmisches Arzneimittelzuführvehikel funktionieren. In
der Praxis können
die erfindungsgemäßen Mucine
bessere Retentionszeiten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Wechselwirkung
nicht nur mit der epithelialen Oberfläche, sondern auch mit den natürlichen
Mucinen im Tränenfilm
schaffen.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert, jedoch
nicht eingeschränkt:
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BEISPIEL 1
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Es
gibt viele Typen an Milchnebenprodukten, die Mucin enthalten und
eine Vielzahl von Verfahren zur Gewinnung von Mucin. Das folgende
Beispiel beschreibt eine detaillierte Prozedur für die Isolierung des Milchmucins
aus der sauren Molke.
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Unkonzentrierte
saure Molke wird nach einem Wärmesterilisationsschritt
durch eine 0,65 æm
Membran filtriert, um die großen
Partikel zu entfernen. Das Permeat wird dann konzentriert und mit
1 M NaCl auf einer Membran mit einem 1.000.000 MW Ausschnitt gewaschen,
um Proteine mit kleinem Molekulargewicht und Lactose zu entfernen.
Die konzentrierte Lösung
wird dann autoclaviert, um die verbliebenen Proteine, außer Mucin,
zu denaturieren. Die denaturierten Proteine werden durch Filtrieren
der Lösung
auf einer 0,22 æm Membran
entfernt. Das Mucin wird dann konzentriert und durch Waschen mit
Wasser auf dem 1.000.000 MW-Filter entsalzt. Die endgültige Ausbeute
des Mucins pro Liter der unkonzentrierten sauren Molke (0,25 g/l) ist
ungefähr
0,25 g.
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BEISPIEL 2
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Das
aus saurer Molke im Beispiel 1 erhaltene Mucin wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
analysiert und es wurden drei Mucinbanden mit Spuren anderer Proteine
gefunden. Die Struktur der Mucinfraktionen wird in Beziehung zum
gesamten Gehalt von Protein, Lipid und Carbohydrat ermittelt. Die Aktivität der Oberfläche und
die Größe des Mucinhydrocolloids
wurde auch ermittelt. Die Ergebnisse der Charakterisierung sind
in Tabelle II dargestellt.
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BEISPIEL 3
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Dieses
Beispiel illustriert die Fähigkeit
der Lösungen
des von Milch abgeleiteten Mucins durch Autoklavierung sterilisiert
werden zu können.
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Es
wurden 20 ml Lösung
von 0,5 Gew.-% Mucin (erhalten aus saurer Molke) in Wasser hergestellt.
Die Lösung
wurde dann durch 5,0 æm
unter sterilen Bedingungen filtriert, und in vier 10 ml Fläschchen
(jeweils 5 ml) geteilt. Die Fläschchen
wurden mit einem Klammer/Septumzusammenbau abgedichtet. Zwei von
den abgedichteten Fläschchen
wurden bei 121°C
für 50
Minuten autoklaviert. Die anderen zwei waren unbehandelte Kontrollmuster.
Stabilitätstests
wurden bei Raumtemperatur und bei 35°C mit autoklavierten Stichproben
und mit den Kontrollmustern im unbehandelten Zustand durchgeführt. Die
Proben wurden wochenweise über
vier Wochen für
jede visuelle Veränderung
oder Unterschiede beobachtet. Die Ergebnisse sind unten in der Tabelle III
zusammengefasst. TABELLE
III
- Kompatibilitätsschlüssel: C – kompatibel, homogen; SI – leicht
inkompatibel, kleiner Niederschlag; I – inkompatibel, großer Niederschlag
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Keine
visuellen Veränderungen
in der Farbe, der Klarheit oder dem Aussehen wurden als Ergebnis
der Autoklavierung bemerkt. Das Ergebnis zeigt, dass das Milch-abgeleitete
Mucin ohne weitere sichtbare Degradation autoklaviert werden kann.
Dieser Befund zeigt, dass die ophthalmischen Lösungen, die auf Milchmucin basieren,
durch einen Autoklavprozess sterilisiert werden können. TABELLE
IV STABILITÄT DER LÖSUNGEN DES
MILCHMUCINS BEI DREI TEMPERATUREN INNERHALB VON 28 TAGEN
- RT
- = Raumtemperatur
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BEISPIEL 4
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Dieses
Beispiel illustriert die Kompatibilität des von Milch abgeleiteten
Mucins mit üblichen
(Monographie) Bestandteilen der ophthalmischen Lösung. Um diese Aufgabe zu erfüllen, wurde
eine von Molke abgeleitete Mucin-basierte Lösung durch Auflösung der
Bestandteile in benötigten
Mengen des USP/NF-gereinigten
H2O (qs bis 100%) hergestellt. Es wurden
insgesamt 20 ml jeder Lösung
hergestellt.
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Die
nicht-viskose Lösung
wurde durch ein 5,0 μm-Spritzenfilter
filtriert, in drei gleiche Volumina geteilt, wovon jedes in 10 ml-Fläschchen
untergebracht wurde, die dann mit einem Klammer/Septumzusammenbau abgedichtet
wurden. Die Fläschchen
wurden bei 121°C
für 50
Minuten autoklaviert, um die Lösung
zu sterilisieren. Die Lösungsproben
wurden dann bei drei Temperaturen: 10°C, Raumtemperatur und 35°C für 28 Tage aufbewahrt.
Die Proben wurden visuell auf Hinweise von Inkompatibilität (Niederschlag)
und Stabilität
(Veränderung
der Farbe) an dem 3., 7., 14. und 28. Tag geprüft. Die Ergebnisse wurden aufgenommen
und sind in der Tabelle IV unter Verwendung des gleichen Kompatibilitätsschlüssels wie
in Tabelle III gezeigt.
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Mit
Hilfe der Daten aus Tabelle IV kann festgestellt werden, dass nur
bei einem Lösungsbestandteil, nämlich Polyethylenglycol,
Inkompatibilität
bemerkt wurde. Die anderen Lösungsmittelbestandteile
waren mit Milch-Mucin kompatibel, und die hergestellten Lösungen waren über 28 Tage
des Haltbarkeitstesters stabil.
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BEISPIEL 5
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Dieses
Beispiel illustriert die Augenkompatibilität des Milch-abgeleiteten Mucins,
wobei eine in-vitro transepitheliales Permeabilitätsprüfung herangezogen
wurde.
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Das
Reizpotenzial des von Milch abgeleiteten Mucins wurde bei sehr hoher
Konzentration, 3,0%, in zwei Puffern ausgetestet. Dieser Gehalt
wurde als charakteristisch für
das obere Konzentrationslimit des Mucins in einer ophthalmischen
Lösung
gewählt.
Die Puffersysteme sind repräsentativ
für solche,
die in einer kommerziellen ophthalmischen Lösung verwendet wurden. Formulierungsdetails
sind in der Tabelle V dargestellt.
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Die
in der Tabelle V beschriebenen Lösungen
wurden den folgenden Experimenten unterworfen, um die potenzielle
Augenirritation der Lösungen
festzustellen. Die experimentellen Methoden befolgen die von R. Tchao
entwickelten Prozeduren, die in "Trans-Epithelial
Permeability of Fluorescein In Vitro as an Assay to Determine Eye
Irritants", Progress
in In Vitro Toxicology, Band 6, 1988, Seiten 271–283 (Mary Ann Liebert, Inc., Publishers,
New York) beschrieben sind, deren Inhalt durch Bezugnahme hier einbezogen
ist. Die Tchao-Technik ist als eine Methode der Ermittlung des Augenreizpotenzials
von Substanzen durch Korrelieren der Beschädigung einer Monoschicht der
Madin-Darby Canine
Kidney (MDCK)-Zellen mit der Beschädigung von Hornepithelzellen.
Die Menge an durch die Zell-Monoschicht durchgehenden Fluorescius
ist eine Funktion der Durchlässigkeit
der Zell-Monoschicht. Höhere
Durchlässigkeit
der Zell-Monoschicht zeigt größere Schäden an den
Kontaktstellen der Applikation der Testlösung, dahingegen zeigt eine
niedrige Durchlässigkeit
der Zell-Monoschicht geringere Schäden an den Kontaktstellen der
Applikation der Testlösung.
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Die
Details des Tests sind nachfolgend dargelegt.
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Herstellung
der Kultur: MDCK-Zellen werden von der ATCC erhalten und in minimal
essentiellem Medium (MEM) gehalten, das mit 10% Kälberserum
mit Eisenzusatz (Hyclone, Utah) ergänzt ist. Die Mutterzellen werden
wöchentlich
mit Verwendung von Trypsin und EDTA passagiert. Die Kulturen wurden
vor der 50. Passage verwendet. Für
den Test wurden 0,5 ml einer Zellsuspension, die 2 × 10 E5-Zellen
enthält,
in Millicell HA 13 mm Einsätze
(Millipore, Bedford, MA) ausgesät.
Die Einsätze
werden in eine Platte mit 24 Vertiefungen platziert und mit 0,5
ml Medium gefüllt.
Zwei Tage nach dem Aussäen
der Zellen werden die Medien sowohl innerhalb als auch außerhalb
der Einsätze
durch frische Medien ersetzt. An Tag 6 nach dem Aussäen werden
die Inserts zum Testen der Lösungen
verwendet. Es hat sich gezeigt, dass der Widerstand, der durch eine
konfluente MDCK-Monoschicht entwickelt wird, bei etwa 600 Ohm/cm2 liegt.
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Test:
Jeder Einsatz wird mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 3 × 1 ml unter
Verwendung von 10 ml-Spritzen ohne Kanüle gespült. Jede Testlösung (0,5
ml) wurde an die Innenseite eines Einsatzes, der in einer frischen
Platte mit 24 Vertiefungen platziert wurde, gegeben. Es werden dreifache
Einsätze
für jede
Testlösung
verwendet. Die Platte mit 24 Vertiefungen mit Einsätzen und
mit Testlösungen
wird in einen befeuchteten Inkubator bei 37°C für 30 Minuten platziert. Jede
Serie der Triplikate wird so gehandhabt, dass eine genaue Zeiteinteilung
der Behandlung ermöglicht
wird. Nach der Inkubation wird nach und nach jeder Einsatz individuell
mit HBSS 5 × 1
ml unter Verwendung einer 10 ml-Spritze gespült, und wird in einer neuen
Platte mit 24 Vertiefungen, die jeweils 0,5 ml HBSS enthalten, platziert.
0,5 ml einer Lösung
von Natriumfluoreszin (3 mg/100 ml) wird zu jedem gespülten Einsatz
hinzugegeben. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten
werden die Einsätze
aus den Vertiefungen entfernt, und die Mengen des Natriumfluoreszin
in jeder der Vertiefungen wird in CytoFluor 2300, mit Anregung bei
540 nm und Emission bei 590 nm gemessen. In jedem Test wird für die Negativkontrolle
HBSS und für
die Positivkontrolle 250 æg/ml
Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet. Es wurde festgestellt, dass
der Assay den Effekt von 50 æg/ml
SDS messen kann, und dass der Einfluss auf die Durchlässigkeit
der Monoschichten linear proportional zu der Kon zentration des SDS
von 50 bis 250 æg/ml
ist. Die Maßeinheiten
der Fluoreszenz (willkürlich)
von jeder Testlösung
wird in Abhängigkeit
von den Testlösungen
geplottet.
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Interpretation
der Ergebnisse: Die Ergebnisse werden als prozentualer Anteil der
SDS-Response gezeigt und mit der HBSS-Response verglichen. Im Allgemeinen,
wenn die Lösung
20% SDS-Response
aufweist, kann die Lösung
leicht reizend sein.
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Die
Ergebnisse des in-vitro-Tests von potenziellen Reizungen sind in
der Tabelle VI zusammen mit den Ergebnissen für die positiven und negativen
Kontrollen vorgelegt. Die positive Kontrolle von 250 ppm Natriumdodecylsulfat
(SDS) ist dafür
bekannt, dass sie deutliche Reizung des menschlichen Auges verursacht.
Für die negative
Kontrolle von im Gleichgewicht befindlicher Hank's Salzlösung ist nicht bekannt, dass
sie eine nachteilige Reaktion im menschlichen Auge auslöst. Die
Ergebnisse sind als eine prozentuale SDS-Response gezeigt, d.h.
SDS = 100% Response. Jede Response, die kleiner als 20% ist, zeigt
kleine oder keine Veränderung des
Gewebes und wird als nicht reizend betrachtet.
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Die
Response von Mucin mit einem Gehalt von 3% ist sehr ähnlich zu
der negativen Kontrolle, und sollte deshalb komplett kompatibel
mit der Augenumgebung sein. Ein Mucin-Gehalt von 0,5% wird als Ausgangspunkt
für Prototypen
der Lösungen
gegen die Trockenheit des Auges gewählt. Mit den obigen Daten schließen wir,
dass eine 0,5%-Konzentration an Mucin komplett mit der Augenumgebung
kompatibel ist und kein Risiko für
Objekte von klinischen Studien darstellt.
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BEISPIEL 6
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Das
folgende Beispiel illustriert die Verwendung des Milch-abgeleiteten
Mucins in zwei unterschiedlichen Formulierungen. Die Formulierungen
wurden für
eine Woche bei drei Temperaturen bewahrt. Die Formulierungen und
die physikalischen Eigenschaften sind in der Tabelle VII dargelegt.
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Aus
den Ergebnissen wird ersichtlich, dass die physikalischen Eigenschaften
von Lösung
A und B über einen
einwöchentlichen
Alterungsprozess stabil sind.
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BEISPIEL 7
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Die
Behandlung des trockenen Auges und anderer Augenbeschwerden involviert
sehr oft die Verwendung einer Salbe oder eines Gels. Die Salbe oder
das Gel können
entweder wasserlös lich
oder wasserunlöslich
(Petrolatum-basiert) sein. Dieses Beispiel verwendet ein wasserlösliches
Gelpolymer, nämlich
Polyglycerylmethacrylat als das Vehikel, um das von Milch abgeleitete
Mucin in die Augenumgebung zu bringen. Die Gele dieser Art können von
United-Guardian, Inc.; Hauppauge, NY, unter dem Markennamen Lubragels(r)
erhalten werden. Die folgenden Formulierungen (in Gew.-%) wurden
durch Vereinigung aller Inhaltsstoffe, außer Lubragel(r), in wässriger
Phase hergestellt. Das Lubragel(r) wurde dann mit der wässrigen
Phase vermischt, um das Endprodukt zu erzeugen. Die folgenden Formulierungen
sind repräsentativ
für Milch-abgeleitete
Mucin-basierte Gele, Salben und viskose Flüssigkeiten für ophthalmische
Verwendung (Tabelle VIII).
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Die
obigen Ergebnisse zeigen die Verwendbarkeit des von Milch abgeleiteten
Mucins, in ophthalmische Überbringungs-Vehikel
mit unterschiedlichen Viskositäten
inkorporiert werden zu können.
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BEISPIEL 8
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Die
folgenden Formulierungen (in Gew.-%) illustrieren die Verwendung
des Mucins als ein interaktiver Bestandteil bei kationischen Arzneimitteln,
in Glaucoma-Augentropfen (Tabelle IX).
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Die
vorliegenden Formulierungen werden durch Auflösung aller Bestandteile in
deionisiertem Wasser in entsprechenden Mengen hergestellt. Nach
der kompletten Auflösung
der Bestandteile wird die Formulierung mindestens noch zwei Stunden
gerührt,
bevor die Eigenschaften gemessen werden.
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Die
obigen Ergebnisse demonstrieren die Verwendung des von Milch abgeleiteten
Mucins als ein Überbringungs-Vehikel
für ophthalmische
Arzneimittel.
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BEISPIEL 9
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Die
folgenden Formulierungen (in Gew.-%) illustrieren die Verwendung
des Milchmucins in Spül-,
Einweich- und Desinfektionslösungen
für weiche
Kontaktlinsen (Tabelle X).
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Die
dargestellten Formulierungen werden durch Auflösung aller Bestandteile in
den benötigten
Mengen in deionisiertem Wasser hergestellt. Nach der kompletten
Auflösung
der Bestandteile wird die Formulierung mindestens noch zwei Stunden
gerührt,
bevor die Eigenschaften gemessen werden.
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Die
obigen Ergebnisse zeigen die Fähigkeit
des Milch-abgeleiteten
Mucins als einen aktiven Bestandteil in Lösungen für weiche Kontaktlinsen.
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BEISPIEL 10
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Die
folgenden Formulierungen (in Gew.-%) illustrieren die Verwendung
des Milchmucins für
das Rückfeuchten
der Kontaktlinsen im Auge und für
Schmierlösungen
(Tabelle XI).
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Die
vorliegenden Formulierungen werden durch Auflösung aller Bestandteile der
benötigten
Mengen in deionisiertem Wasser hergestellt. Nach der kompletten
Auflösung
der Bestandteile wird die Formulierung mindestens noch zwei Stunden
gerührt,
bevor die Eigenschaften gemessen werden.
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Die
obigen Ergebnisse demonstrieren die Fähigkeit des von Milch abgeleiteten
Mucins als einen aktiven Bestandteil in rückfeuchtenden/schmierenden
Lösungen
für Kontaktlinsen.
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BEISPIEL 11
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Das
Milchmucin dieser Erfindung findet eine besondere Nützlichkeit
als Konservierungslösung
für weiche
Kontaktlinsen. Die folgenden Zubereitungen illustrieren die Verwendung
des Mucins in einer Konservierungslösung für Kontaktlinsen (Tabelle XII).
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Die
vorliegenden Formulierungen wurden durch Auflösen aller Bestandteile in der
benötigten
Menge in deionisiertem Wasser hergestellt. Nach der kompletten Auflösung der
Bestandteile wird die Formulierung mindestens noch zwei Stunden
gerührt,
bevor die Eigenschaften gemessen werden.
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Die
obigen Ergebnisse demonstrieren die Einsatzfähigkeit des von Milch abgeleiteten
Mucins als aktiver Bestandteil in einer Konservierungslösung für Kontaktlinsen.
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BEISPIEL 12
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Die
folgenden Formulierungen (in Gew.-%) illustrieren die Verwendung
des Milchmucins als eine Behandlungslösung für das trockene Auge (Tabelle
XIII).
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Die
Formulierungen werden durch Auflösung
aller Bestandteile in deionisiertem Wasser hergestellt. Nach der
kompletten Auflösung
der Bestandteile wird die Formulierung noch mindestens zwei Stunden
gerührt,
bevor die Eigenschaften gemessen werden.
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Die
obigen Lösungen
wurden durch ein 0,22 Mikrofilter in einem sterilen Raum in die
Fläschchen
der Augentropfen filtriert. Die Lösungen wurden dann in die Augen
von zwei Testpersonen in einer klinisch kontrollierten Sitzung platziert.
Die Augen der Testpersonen wurden durch die Spaltlampe eines Biomikroskops
nach der Einträufelung
der Tropfen der Testlösungen
monitoriert. Auch ein Keeler Tearscope wurde zur Observation der
Wirkungen auf den Tränenfilm
der Testpersonen verwendet.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER VORGÄNGE
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Die
Lösungen
A und B (Konzentrationen von 0,5 und 1,0%) wurden bei Testperson
1 ohne eingesetzte RGP-Kontaktlinsen getestet, dann wurden die Kontaktlinsen
nach Einweichen in A für
ein paar Minuten in das Ruge platziert. Die Versuche waren für die Person
1 beidseitig. Bei der Person 2 wurde A in ein Auge eingeträufelt und
Visine Tears wurden in das andere Auge eingeträufelt.
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Die
Zugabe von einem Tropfen zu den Augen, sowohl mit als auch ohne
Kontaktlinsen, zeigte keine nachteilige Reaktion, einschließlich keine
Symptome einer Reizung, des Wahrnehmungsgefühls eines Fremdkörpers, der
Trockenheit, der Abnahme der Sicht, und keine Zeichen von Hornhautödemen, konjunktivalen
Rötungen,
und konjunktivalen Ödemen,
oder Absonderung. Es wurde keine punktuelle Färbung bei Zusatz von Fluorescin-Farbstoff
beobachtet. Zusätzlich
gab es keine Erythema oder Ödeme
der Adnexa durch externe Prüfung.
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Eine
Prüfung
des Tränenfilms
unter Verwendung des Keller Tearscopes ergab einen leicht stabileren Tränenfilm
als angezeigt bei Auftreten und Bewegen eines Interblinkfilms und
ein überwiegend
blaues Lipidmuster von mehr gleichmäßiger Wellenerscheinung. Das
ist zutreffend für
alle Augen, die den Mucintropfen bekommen haben, konnte aber nicht
festgestellt werden, wenn Visine Tears bei Person 2 OS eingeträufelt wurde.
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Obwohl
die Anzahl der beobachteten Augen begrenzt war, zeigen die wichtigen
Initialuntersuchungsergebnisse, dass die Mucintropfen keine nachteiligen
Reaktionen, wie oben aufgelistet, oder gar Unannehmlichkeiten verursachen.
Diese Feststellungen, die einen stabileren und/oder dickeren Tränenfilm
beschreiben, sind vorteilhaft.
