DE60024660T2

DE60024660T2 - Menschliche rnase h und entsprechende oligonukleotidverbindungen

Info

Publication number: DE60024660T2
Application number: DE60024660T
Authority: DE
Inventors: T. Stanley CROOKE; F. Walter LIMA; Hongjiang Wu; Muthiah Manoharan
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2020-09-30
Also published as: EP1222309A1; EP1222309B1; US20070292875A1; US20040102618A1; US6617442B1; EP1222309A4; DE60024660T4; AU7621600A; WO2001023613A1; DE60024660D1; ATE312202T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine menschliche Typ-2-RNase-H, die jetzt kloniert, exprimiert und bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt worden ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Oligonukleotidzusammensetzungen, die als Substrate für menschliche RNase-H1 oder menschliche Typ-2-RNase-H dienen können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
RNase-H hydrolysiert RNA in RNA-DNA-Hybriden. Dieses Enzym wurde zuerst im Kalbsthymus identifiziert, ist jedoch danach in einer Vielfalt an Organismen beschrieben worden (Stein, H. und Hausen, P., Science, 1969, 166, 393 bis 395; Hausen, P. und Stein, H., Eur. J. Biochem., 1970, 14, 278 bis 283). RNase-H-Aktivität scheint in Eukaryoten und Bakterien allgegenwärtig zu sein (Itaya, M. und Kondo, K., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4.443 bis 4.449; Itaya et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 227, 438 bis 445; Kanaya, S. und Itaya, M., J. Biol. Chem., 1992, 267, 10.184 bis 10.192; Busen, W., J. Biol. Chem., 1980, 255, 9.434 bis 9.443; Rong, Y. W. und Carl, P. L., 1990, Biochemistry 29, 383 bis 389; Eder et al., Biochimie, 1993 75, 123 bis 126). Obwohl RNasen-H eine Familie von Proteinen mit unterschiedlichem Molekulargewicht bilden, scheinen die nukleolytische Aktivität und die Substratanforderungen der verschiedenen Isotypen ähnlich zu sein. Beispielsweise wirken alle RNasen-H, die bisher untersucht wurden, als Endonukleasen, wobei sie begrenzte Sequenzspezifität aufweisen und zweiwertige Kationen benötigen (z.B. Mg²⁺, Mn²⁺), um Spaltprodukte mit 5'-Phosphat- und 3'- Hydroxyltermini zu erzeugen (Crouch, R. J. und Dirksen, M. L., Nuclease, Linn, S. M. und Roberts, R. J., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY 1982, 211 bis 241).
Außer ihrer natürlichen Rolle bei der DNA-Replikation wurde auch gezeigt, dass RNase-H in der Lage ist, die RNA-Komponente bestimmter Oligonukleotid-RNA-Duplices zu spalten. Während viele Mechanismen für die durch Oligonukleotid vermittelte Destabilisierung von Ziel-RNA vorgeschlagen wurden, ist der primäre Mechanismus, von dem angenommen wird, dass durch ihn Antisense-Oligonukleotide eine Verringerung von Ziel-RNA-Gehalten verursachen, diese RNase-H-Wirkung (Monia et al., J. Biol. Chem., 1993, 266:13, 14.514 bis 14.522). In-vitro-Assays haben gezeigt, dass Oligonukleotide, die keine Substrate für RNase-H sind, die Proteintranslation hemmen können (Blake et al., Biochemistry, 1985, 24, 6.139 bis 6.145) und dass Oligonukleotide die Proteintranslation in Kaninchen-Reticulozytextrakten, die geringe RNase-H-Aktivität aufweisen, hemmen. Eine wirksamere Hemmung wurde jedoch in Systemen festgestellt, die RNase-H-Aktivität unterstützten (Walder, R. Y. und Walder, J. A., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1988, 85, 5.011 bis 5.015; Gagnor et al., Nucleic Acid Res., 1987, 15, 10.419 bis 10.436; Cazenave et al., Nucleic Acid Res., 1989, 17, 4.255 bis 4.273; und Dash et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7.896 bis 7. 900.
Oligonukleotide, die gewöhnlich als „Antisense-Oligonukleotide" bezeichnet werden, umfassen Nukleotidsequenzen, die hinsichtlich der Identität und Anzahl ausreichend sind, eine spezifische Hybridisierung mit einer bestimmten Nukleinsäure zu bewirken. Diese Nukleinsäure oder das (die) Protein(e), das (die) sie codiert, wird im Allgemeinen als das „Ziel" bezeichnet.
Oligonukleotide werden im Allgemeinen so gestaltet, dass sie entweder direkt an die mRNA, die aus einem vorgewählten Genziel transkribiert ist, oder an einen gewählten DNA-Teil desselben binden, wodurch die Menge an Protein, das von der mRNA translatiert wird, bzw. die Menge an mRNA, die aus dem Gen transkribiert wird, abgewandelt wird. Antisense-Oligonukleotide können als Forschungswerkzeuge, diagnostische Hilfsmittel und therapeutische Agenzien benutzt werden.
Das „Zielen" eines Oligonukleotids auf die assoziierte Nukleinsäure bezieht sich im Zusammenhang mit dieser Erfindung auch auf ein Mehrschrittverfahren, das gewöhnlich mit der Identifizierung der Nukleinsäuresequenz beginnt, deren Funktion abgewandelt werden soll. Dies kann beispielsweise ein zelluläres Gen (oder mRNA, die aus dem Gen transkribiert ist), dessen Expression mit einem bestimmten Störungs- oder Krankheitszustand verbunden ist, oder eine fremde Nukleinsäure von einem infektiösen Agens sein. Das Verfahren des Zielens umfasst auch die Bestimmung eines Ortes bzw. von Orten innerhalb dieses Gens, damit die Oligonukleotid-Wechselwirkung derart erfolgt, dass sich die gewünschte Wirkung, entweder Nachweis oder Abwandlung der Expression des Proteins, ergeben wird.
RNase-H1 von E. coli ist das am besten gekennzeichnete Mitglied der RNase-H-Familie. Die 3-dimensionale Struktur von E.-coli-RNase-HI ist mittels Röntgenkristallographie bestimmt worden, und die Schlüsselaminosäuren, die beim Binden und der Katalyse beteiligt sind, sind durch ortsgerichtete Mutagenese identifiziert worden (Nakamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 11.535 bis 11.539; Katayanagi et al., Nature, 1990, 347, 306 bis 309; Yang et al., Science, 1990, 249, 1.398 bis 1.405; Kanaya et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 11.621 bis 11.627). Das Enzym weist zwei deutliche strukturelle Domänen auf. Die Hauptdomäne besteht aus vier α-Helices und einem großen β-Blatt, das von drei antiparallelen β-Strängen gebildet ist. Der Mg²⁺-Bindungsort befindet sich auf dem β-Blatt und besteht aus drei Aminosäuren, Asp-10, Glu-48 und Gly-11 (Katayanagi et al., Proteins: Struct., Funct., Genet., 1993, 17, 337 bis 346). Dieses Strukturmotiv des Mg²⁺-Bindungsortes, umgeben von β-Strängen, ist ähnlich demjenigen in DNase I (Suck, D. und Oefner, C., Nature, 1986, 321, 620 bis 625). Es wird angenommen, dass die Nebendomäne die vorherrschende Bindungsregion des Enzyms bildet und aus einer α-Helix besteht, die mit einer Schleife endet. Die Schleifenregion ist durch ein Cluster von positiv geladenen Aminosäuren gebildet, von denen angenommen wird, dass sie elektrostatisch an die kleine Furche des DNA/RNA-Heteroduplexsubstrats binden. Obwohl die Konformation des RNA/DNA-Substrats variieren kann, in Abhängigkeit von der Sequenzzusammensetzung von der A-Form zur B-Form, nehmen RNA/DNA-Heteroduplices im Allgemeinen eine A-förmige Geometrie an (Pardi et al., Biochemistry, 1981, 20, 3.986 bis 3.996; Hall, K. B. und Mclaughlin, L. W., Biochemistry, 1991, 30, 10.606 bis 10.613; Lane et al., Eur. J. Biochem., 1993, 215, 297 bis 306). Die gesamte Bindungswechselwirkung scheint eine einzelne helikale Windung des Substratduplexes zu umfassen. Vor kurzem sind die Bindungskennzeichen, die Substratanforderungen, die Spaltprodukte und Auswirkungen verschiedener chemischer Modifikationen der Substrate auf die kinetischen Kennzeichen von E.-coli-RNase-HI eingehender untersucht worden (Crooke, S. T. et al., Biochem. J., 1995, 312, 599 bis 608; Lima, W. F. und Crooke, S. T., Biochemistry, 1997, 36, 390 bis 398; Lima, W. F. et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 18.191 bis 18.199; Tidd, D. M. und Worenius, H. M., Br. J. Cancer, 1989, 60, 343; Tidd, D. M. et al., Anti-Cancer Drug Des., 1988, 3, 117.
Außer der RNase-HI ist eine zweite E.-coli-RNase-H, RNase-HII, kloniert und gekennzeichnet worden (Itaya, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8.587 bis 8.591). Sie umfasst 213 Aminosäuren, während RNase-HI 155 Aminosäuren lang ist. E-coli-RNase-HIM weist nur 17 % Homologie zu E.-coli-RNase-HI auf. Eine RNase-H, die aus S. typhimurium kloniert wurde, unterschied sich von E.-coli-RNase-HI nur in 11 Positionen und wies eine Länge von 155 Aminosäuren auf (Itaya, M. und Kondo K., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4.443 bis 4.449; Itaya et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 227, 438 bis 445). Ein Enzym, das von S. cerevisae kloniert wurde, war zu 30 % homolog zu E.-coli-RNase-HI (Itaya, M. und Kondo K., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4.443 bis 4.449; Itaya et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 227, 438 bis 445). Somit hat bis heute kein Enzym, das von einer anderen Spezies als E. coli kloniert wurde, wesentliche Homologie zu E.-coli-RNase-HII aufgewiesen.
Proteine, die RNase-H-Aktivität aufweisen, sind ebenfalls aus einer Anzahl von Viren, anderen Bakterien und Hefe kloniert und gereinigt worden (Wintersberger, U. Pharmac. Ther., 1990, 48, 259 bis 280). In vielen Fällen scheinen Proteine mit RNase-H-Aktivität Fusionsproteine zu sein, in denen RNase-H und das Amino- oder Carboxyl-Ende des anderen Enzyms, oftmals eine DNA- oder RNA-Polymerase, vereinigt sind. Es ist durchweg festgestellt worden, dass die RNase-H-Domäne in hohem Maße homolog zu E.-coli-RNase-HI ist; da aber die anderen Domänen wesentlich variieren, variieren die Molekulargewichte und anderen Kennzeichen der Fusionsproteine stark.
In höheren Eukaryoten sind auf der Grundlage von Unterschieden im Molekulargewicht, den Wirkungen zweiwertiger Kationen, der Empfindlichkeit gegenüber Sulfhydrylagenzien und der immunologischen Kreuzreaktivität zwei Klassen von RNasen-H definiert worden (Busen et al., Eur. J. Biochem., 1977, 74, 203 bis 208). Von RNase-H-Typ-1-Enzymen wurde berichtet, dass sie Molekulargewichte im Bereich von 68 bis 90 kDa aufweisen, entweder durch Mn²⁺ oder durch Mg²⁺ aktiviert werden und gegenüber Sulfhydrylagenzien unempfindlich sind. Im Gegensatz dazu ist von RNase-H-Typ-2-Enzymen berichtet worden, dass sie Molekulargewichte im Bereich von 31 bis 45 kDa aufweisen, Mg²⁺ benötigen, in hohem Maße empfindlich gegenüber Sulfhydrylagenzien sind und von Mn²⁺ gehemmt werden (Busen, W., und Hausen, P., Eur. J. Biochem., 1975, 52, 179 bis 190; Kane, C. M., Biochemistry, 1988, 27, 3. 187 bis 3. 196; Busen, W., J. Biol. Chem., 1982, 257, 7.106 bis 7.108).
Ein Enzym mit Typ-2-RNase-H-Kennzeichen ist aus menschlicher Plazenta bis fast zur Homogenität gereinigt worden (Frank et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5.247 bis 5.254). Dieses Protein weist ein Molekulargewicht von etwa 33 kDa auf und ist in einem pH-Wert-Bereich von 6,5 bis 10 aktiv, bei einem pH-Wert-Optimum von 8,5 bis 9. Das Enzym benötigt Mg²⁺ und wird von Mn²⁺ und n-Ethylmaleimid gehemmt. Die Produkte von Spaltungsreaktionen weisen 3'-Hydroxyl- und 5'-Phosphat-Termini auf.
Trotz der wesentlichen Informationen über Angehörige der RNase-Familie und des Klonierens einer Anzahl viraler, prokaryotischer und Hefegene mit RNase-H-Aktivität war bisher keine Säugetier-RNase-H kloniert worden. Dies hat Bemühungen behindert, die Struktur des Enzyms bzw. der Enzyme, ihre Verbreitung und die Funktionen, zu denen sie dienen können, zu verstehen.
In der vorliegenden Erfindung sind eine cDNA von menschlicher RNase-H mit Typ-2-Kennzeichen und das Protein, dass von dieser exprimiert wird, bereitgestellt.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Oligonukleotide bereit, die als Substrate für menschliche RNase-H1 dienen können. Diese Oligonukleotide sind Oligonukleotide mit gemischter Sequenz, die wenigstens zwei Teile umfassen, wobei ein erster Teil in der Lage ist, die Spaltung einer komplementären Ziel-RNA durch menschliche RNase-H1 zu unterstützen, und ein weiterer Teil nicht in der Lage ist, solch eine Spaltung durch menschliche RNase-H1 zu unterstützen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Oligonukleotid mit gemischter Sequenz bereit, das wenigstens 12 Nukleotide umfasst und ein 3'-Ende und ein 5'-Ende aufweist, wobei das Oligonukleotid in einen ersten Teil und einen weiteren Teil unterteilt ist,
wobei der erste Teil in der Lage ist, die Spaltung einer komplementären Ziel-RNA durch menschliches RNase-H1-Polypeptid zu unterstützen,
der weitere Teil nicht in der Lage ist, die Spaltung durch RNase-H zu unterstützen;
wobei der erste Teil wenigstens 6 Nukleotide umfasst und in dem Oligonukleotid so angeordnet ist, dass wenigstens eines der 6 Nukleotide 8 bis 12 Nukleotide von dem 3'-Ende des Oligonukleotids liegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid wenigstens eine CA-Nukleotidsequenz. In einer anderen Ausführungsform umfasst der erste Teil des Oligonukleotids mit gemischter Sequenz der vorliegenden Erfindung Nukleotide, die eine B-Form-Konformationsgeometrie aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform sind alle Nukleotide des ersten Teils des Oligonukleotids 2'-Desoxyribonukleotide. In einer noch weiteren Ausführungsform ist jedes der Nukleotide des ersten Teils des Oligonukleotids ein 2'-F-Arabinonukleotid oder ein 2'-OH-Arabinonukleotid. In einer noch anderen Ausführungsform sind die Nukleotide des ersten Teils durch Phosphat-, Phosphorothioat-, Phosphorodithioat- oder Boranophosphatbindungen zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint. In einer noch weiteren Ausführungsform sind alle Nukleotide des weiteren Teils des Oligonukleotids durch 3'-5'-Phosphodiester-, 2'-5'-Phosphodiester-, Phosphorothioat-, Sp-Phosphorothioat-, Rp-Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, 3'-Desoxy-3'-aminophosphoroamidat-, 3'-Methylenphosphonat-, Methylen(methylimino)-, Dimethylhydrazino-, Amid-3-, Amid-4- oder Boranophosphat-Bindungen zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint.
Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Identifizieren von Agenzien bereitzustellen, welche die Aktivität und/oder Gehalte menschlicher RNase-H1 abändern. Gemäß diesem Gesichtspunkt sind die Polynukleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung für biologische, klinische und Forschungszwecke nützlich. Beispielsweise sind die Polynukleotide und Polypeptide zum Bestimmen der Wechselwirkung von menschlicher RNase-H1 und Antisense-Oligonukleotiden und zum Identifizieren von Mitteln zum Erhöhen dieser Wechselwirkung nützlich, sodass Antisense-Oligonukleotide beim Hemmen ihrer Ziel-mRNA wirksamer sind.
Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Voraussagen der Wirksamkeit einer Antisense-Therapie einer gewählten Krankheit bereitzustellen, welches das Messen des Gehaltes oder der Aktivität von menschlicher RNase-H in einer Zielzelle der Antisense-Therapie umfasst. In ähnlicher Weise können Oligonukleotide durchmustert werden, um diejenigen Oligonukleotide zu identifizieren, die wirksame Antisense-Agenzien sind, indem das Binden des Oligonukleotids an die menschliche RNase-H1 gemessen wird.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Auswirkungen von Bedingungen auf die Aktivität menschlicher RNase-H1.
2 zeigt eine denaturierende Polyacrylamidgel-Analyse der Spaltung eines 17-meren RNA-DNA-Gapmer-Duxplexes durch menschliche RNase-H1.
3 zeigt die Analyse der Spaltung einer 25meren Ras-RNA, die mit Phosphodiester-Oligodesoxynukleotiden unterschiedlicher Längen hybridisiert ist, durch menschliche RNase-H1.
4 zeigt die Analyse der Spaltung von RNA-DNA-Duplices mit verschiedenen Sequenzen, Längen und 3'- oder 5'-Überhängen durch menschliche RNase-H1. Die Sequenz, die durch G dargestellt ist, entspricht der SEQ ID NO: 33.
5 zeigt die Produkt- und Prozessivitätsanalyse der Spaltung von 17-meren Ras-RNA-DNA-Duplices durch menschliche RNase-H1.
6 stellt die primäre Sequenz der menschlichen Typ-2-RNase-H (286 Aminosäuren; SEQ ID NO: 1) und Sequenzvergleiche mit Huhn- (293 Aminosäuren; SEQ ID NO: 2), Hefe- (348 Aminosäuren; SEQ ID NO: 3) und E.-coli-RNase-H1 (155 Aminosäuren; SEQ ID NO: 4) sowie einem EST-abgeleiteten Maus-RNase-H-Homologen (Genbank-Zugangs-Nr. AA389926 and AA518920; SEQ ID NO: 5) bereit. Fettschrift zeigt Aminosäurereste an, die mit denjenigen beim Menschen identisch sind. „@" zeigt die konservierten Aminosäurereste an, die in den E.-coli-RNase-H1-Mg²⁺-Bindungsort und das katalytische Zentrum (Asp-10, Gly-11, Glu-48 und Asp-70) einbezogen sind. „*" zeigt die konservierten Reste an, die in E.-coli-RNasen-H1 zur Substratbindung einbezogen sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Eine menschliche Typ-2-RNase-H ist nun kloniert und exprimiert worden. Das Enzym, das durch diese cDNA codiert wird, ist gegenüber einsträngiger RNA, einsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA inaktiv. Dieses Enzym spaltet jedoch die RNA in einem RNA/DNA-Duplex und die RNA in einem Duplex, der RNA und ein chimäres Oligonukleotid mit 2'-Methoxyflanken und einer 5-Desoxynukleotid-Zentrallücke umfasst. Die Geschwindigkeit der Spaltung der RNA, die mit diesem sogenannten „Desoxy-Gapmer" einen Duplex bildet, war bedeutend geringer als diejenige, die bei dem vollständigen RNA/DNA-Duplex festgestellt wurde. Diese Eigenschaften stimmen mit denjenigen überein, die für E.-coli-RNase-H1 beschrieben sind (Crooke et al., Biochem. J., 1995, 312, 599 bis 608; Lima, W. F. und Crooke, S. T., Biochemistry, 1997, 36, 390 bis 398). Sie stimmen auch mit den Eigenschaften eines menschlichen Typ-2-RNase-H-Proteins überein, das aus Plazenta gereinigt wurde, da das Molekulargewicht (32 kDa) demjenigen ähnlich ist, das von Frank et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5.247 bis 5.254) angegeben ist, und das Enzym von Mn²⁺ gehemmt wird. Somit sind gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung isolierte Polynukleotide bereitgestellt, die menschliche Typ-2-RNase-H-Polypeptide codieren, welche die abgeleitete Aminosäuresequenz von 6 aufweisen. „Polynukleotide" soll jede beliebige Form von RNA oder DNA, wie z.B. mRNA oder cDNA bzw. genomische DNA, die durch Klonieren erhalten oder durch gut bekannte chemische Techniken synthetisch hergestellt wird, umfassen. DNA kann doppel- oder einsträngig sein. Einsträngige DNA kann den codierenden oder Sense-Strang oder den nichtcodierenden oder Antisense-Strang umfassen.
Verfahren zum Isolieren eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung durch Kloniertechniken sind gut bekannt. Um beispielsweise die cDNA zu erhalten, die in ATCC-Depot-Nr. 98.536 enthalten ist, wurden Primer auf Grundlage einer Suche in der XREF-Datenbank benutzt. Eine cDNA von etwa 1 kb, die dem terminalen Carboxy-Teil des Proteins entspricht, wurde mittels 3'-RACE kloniert. Sieben positive Klone wurden durch Durchmustern einer Leber-cDNA-Bibliothek mit dieser 1-kb-cDNA isoliert. Die beiden längsten Klone waren 1.698 und 1.168 Basenpaare. Sie weisen die gleiche untranslatierte 5'-Region und proteincodierende Sequenz auf, unterscheiden sich jedoch in der Länge der 3'-UTR. Ein einzelner Leserahmen, der ein Protein aus 286 Aminosäuren codiert (berechnete Masse: 32.029,04 Da) wurde identifiziert (6). Das vorgeschlagene Startcodon stimmt mit der Translations-Startkonsenssequenz bei Säugetieren überein, die von Kozak, M., J. Cell Biol., 1989, 108, 229 bis 241, beschrieben ist und der ein In-Frame-Stoppcodon vorangeht. Bemühungen cDNA mit längeren 5'-UTR sowohl aus menschlicher Leber- als auch Lymphozyt-cDNA mittels 5'-RACE zu klonieren, schlugen fehl, was anzeigt, dass der Klon mit 1.698 Basenpaaren die volle Länge aufwies.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung die Nukleinsäuresequenz der cDNA, die in der ATCC-Depot-Nr. 98.536 enthalten ist. Das Depot von E. coli DH5α, enthaltend ein BLUESCRIPT^®-Plasmid, das eine menschliche Typ-2-RNase-H-cDNA enthält, erfolgte bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland, 20.852, USA, am 4. Sep. 1997, und ihm wurde die ATCC-Depot-Nr. 98.536 zugewiesen. Das deponierte Material ist eine Kultur von E. coli DH5α, enthaltend ein BLUESCRIPT^®-Plasmid (Stratagene, La Jolla, CR), das die volle Länge menschlicher Typ-2-RNAse-H-cDNA enthält. Das Depot ist gemäß den vertraglichen Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung des Depots von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens erfolgt. Die Kultur wird nach Erteilung dieses Patents unwiderrufbar und ohne Einschränkung der Öffentlichkeit freigegeben. Die Sequenz des Polynukleotids, die in dem deponierten Material enthalten ist, und die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von diesem codiert wird, sind im Falle irgendeines Konfliktes hinsichtlich der Sequenzen, die hierin bereitgestellt sind, maßgebend. Wie dem Fachmann nach dieser Offenbarung offensichtlich sein wird, können Polynukleotide der vorliegenden Erfindung aufgrund der Entartung des genetischen Codes jedoch andere Nukleinsäuresequenzen umfassen, die das Polypeptid von 6 und Derivate, Varianten oder aktive Bruchstücke davon codieren.
Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft die Polypeptide, die von den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung codiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung die abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlicher Typ-2-RNase-H, die in 6 als SEQ ID NO: 1 bereitgestellt ist. „Polypeptid" sollen jedoch auch Bruchstücke, Derivate und Analoge der SEQ ID NO: 1 umfassen, welche Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität und/oder Funktion wie menschliche Typ-2-RNase-H behalten. Alternativ können Polypeptide der vorliegenden Erfindung ihre Fähigkeit behalten, an einen Antisense-RNA-Duplex zu binden, obwohl sie in anderen Kapazitäten nicht als aktive RNase-H-Enzyme wirken. In einer anderen Ausführungsform können Polypeptide der vorliegenden Erfindung Nukleaseaktivität behalten, jedoch ohne Spezifität für den RNA-Teil eines RNA/DNA-Duplexes. Zu Polypeptiden der vorliegenden Erfindung gehören rekombinante Polypeptide, isolierte natürliche Polypeptide und synthetische Polypeptide und Bruchstücke davon, welche eine oder mehrere der oben beschriebenen Aktivitäten behalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid rekombinant hergestellt, am stärksten bevorzugt von der Kultur E. coli mit der ATCC-Depot-Nr. 98.536. Rekombinante menschliche RNase-H, die mit Histidin-Codons vereinigt ist (His-Tag; in der vorliegenden Ausführungsform wurden sechs Histidin-Codons benutzt), exprimiert in E. coli, kann durch Chromatographie mit Ni-NTA, gefolgt von C4-Umkehrphasen-HPLC bequem bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt werden. Das gereinigte rekombinante Polypeptid mit der SEQ ID NO: 1 ist in hohem Maße homolog zu E.-coli-RNase-H und weist eine fast 34%ige Aminosäurenidentität mit E.-coli-RNase-H1 auf. In 6 werden die Proteinsequenzen, die von menschlicher RNase-H-cDNA (SEQ ID NO: 1) abgeleitet sind, mit denjenigen vom Huhn (SEQ ID NO: 2), von Hefe (SEQ ID NO: 3) und von E.-coli-RNase-HI (Genbank-Zugangs-Nr. 1.786.408; SEQ ID NO: 4) sowie einem EST-abgeleiteten Maus-RNase-H-Homologen (Genbank-Zugangs-Nr. AA389.926 und AA518.920; SEQ ID NO: 5) verglichen. Die abgeleitete Aminosäuresequenz menschlicher RNase-H (SEQ ID NO: 1) weist starke Homologie zu Hefe (21,8 % Aminosäurenidentität), Huhn (59 %), E.-coli-RNase-HI (33,6 %) und dem Maus-EST-Homologen (84,3 %) auf. Sie sind alle kleine Proteine (< 40 kDa) und ihre geschätzten pI betragen alle 8,7 und mehr. Ferner sind die Aminosäurereste in E.-coli-RNase-HI, von denen angenommen wird, dass sie in den Mg²⁺-Bindungsort, das katalytische Zentrum und die Substratbindungsregion einbezogen sind, in der Sequenz der klonierten menschlichen RNase-H (6) vollständig konserviert.
Die menschliche Typ-2-RNase-H mit der SEQ ID NO: 1 wird ubiquitär exprimiert. Die Northern-Blot-Analyse zeigte, dass das Transkript in allen Geweben und Zelllinien mit Ausnahme der MCR-5-Line reichlich vorhanden war. Die Northern-Blot-Analyse der gesamten RNA von menschlichen Zelllinien und Poly-A, die RNA aus menschlichem Gewebe enthielt, unter Verwendung der Sonde mit der vollen Länge von 1,7 kb oder einer 332-Nukleotid-Sonde, welche die 5'-UTR und die Codierregion von menschlicher RNase-H-cDNA enthielt, ließ zwei stark positive Banden mit einer Länge von etwa 1,2 und 5,5 kb und zwei weniger intensive Banden mit einer ungefähren Länge von 1,7 und 4,0 kb in den meisten Zelllinien und Geweben erkennen. Die Analyse mit der 332-Nukleotid-Sonde zeigte, dass die 5,5-kb-Bande die 5'-UTR und einen Teil der Codierregion enthielt, was nahelegt, dass diese Bande ein vorbehandeltes oder teilweise behandeltes Transkript oder möglicherweise ein alternativ gesplissenes Transkript darstellt. Mittelgroße Banden können Behandlungszwischenprodukte darstellen. Die 1,2-kb-Bande stellt die Transkripte mit voller Länge dar. Die längeren Transkripte können Behandlungszwischenprodukte oder alternativ gesplissene Transkripte sein.
RNase-H wird in den meisten geprüften Zelllinien exprimiert; nur MRC5, eine Brustkrebs-Zelllinie, zeigte sehr niedrige Gehalte an RNase-H. Eine Vielfalt anderer bösartiger Zelllinien, einschließlich derjenigen der Blasen- (T24), Brust- (T-47D, HS578T), Lungen- (A549), Prostata- (LNCap, DU145) und myeloischer Abstammungslinie (HL-60) sowie die normalen Endothelzellen (HUVEC) exprimierten RNase-H. Ferner exprimierten alle geprüften normalen menschlichen Gewebe RNase-H. Wiederum waren größere Transkripte sowie das 1,2-kb-Transkript, das die reife mRNA für RNase-H zu sein scheint, vorhanden. Die Normalisierung auf Basis von G3PDH-Gehalten zeigte, dass die Expression in allen geprüften Geweben verhältnismäßig übereinstimmend war.
Die Southern-Blot-Analyse von EcoRI-verdauter genomischer DNA vom Menschen und verschiedenen Säugetieren und Hefe, die mit der 1,7-kb-Sonde sondiert wurden, zeigt, dass vier EcoRI-Verdauungsprodukte menschlicher genomischer DNA (2,4, 4,6, 6,0, 8,0 Kb) mit der 1,7-kb-Sonde hybridisierten. Der Blot, der erneut sondiert mit einer 430-Nukleotid-Sonde, die dem C-terminalen Teil des Proteins entspricht, zeigte nur ein 4,6-kbp-EcoRI-Verdauungsprodukt, das hybridisiert war. Diese Daten zeigen an, dass es nur eine Genkopie für RNase-H gibt und dass die Größe des Gens mehr als 10 kb beträgt. Sowohl die Sonde mit voller Länge als auch die kürzere Sonde hybridisierten stark zu einem EcoRI-Verdauungsprodukt von genomischer Hefe-DNA (etwa 5 kb groß), was einen hohen Grad an Konservierung anzeigt. Diese Sonden hybridisierten auch zu dem Verdauungsprodukt vom Affen, jedoch zu keinem der anderen geprüften Säugetier-Genom-DNA, einschließlich der Maus, die zu der menschlichen RNase-H-Sequenz in hohem Maße homolog ist.
Ein rekombinantes menschliches RNase-H-(His-Tag-Fusionsprotein)-Polypeptid der vorliegenden Erfindung wurde in E. coli exprimiert und mittels Ni-NTA-Agarosekügelchen, gefolgt von C4-Umkehrphasen-Säulenchromatographie gereinigt. Ein 36-kDa-Protein wurde nach Renaturierung cogereinigt und seine Aktivität gemessen. Die Gegenwart des His-Tag wurde mittels Western-Blot-Analysen mit einem anti-Penta-Histidin-Antikörper (Qiagen, Deutschland) bestätigt. Renaturierte rekombinante menschliche RNase-H wies RNase-H-Aktivität auf. Inkubation von 10 ng gereinigter renaturierter RNase-H mit RNA/DNA-Substrat für 2 Stunden führte zur Spaltung von 40 % des Substrats. Das Enzym spaltete auch RNA in einem Oligonukleotid/RNA-Duplex, in dem das Oligonukleotid ein Gapmer mit einer 5-Desoxynukleotid-Lücke war, jedoch mit einer viel geringeren Geschwindigkeit als das vollständige RNA/DNA-Substrat. Dies stimmt mit Beobachtungen an E.-coli-RNase-HI überein (Lima, W. F. und Crooke, S. T., Biochemistry, 1997, 36, 390 bis 398). Es war gegenüber einsträngigen RNA- oder doppelsträngigen RNA-Substraten inaktiv und wurde durch Mn²⁺ gehemmt. Das Molekulargewicht (≈ 36 kDa) und die Hemmung durch Mn²⁺ zeigen an, dass das klonierte Enzym in hohem Maße homolog zu E.-coli-RNase-HI ist und Eigenschaften aufweist, die mit denjenigen, die der menschlichen Typ-2-RNase-H zugeschriebenen werden, übereinstimmen.
Die Spaltorte in der RNA in dem vollständigen RNA/DNA-Substrat und den Gapmer/RNA-Duplices (worin das Oligonukleotid-Gapmer eine 5-Desoxynukleotid-Lücke aufwies); die von dem rekombinanten Enzym herrührten, wurden bestimmt. In dem vollständigen RNA/DNA-Duplex war der Haupt-Spaltort in der Nähe der Mitte des Substrates, mit Anzeichen für wenige bedeutende Spaltorte 3' zu dem primären Spaltort. Der primäre Spaltort bei dem Gapmer/RNA-Duplex war quer durch das Nukleotid in Nachbarschaft zu der Verbindung des 2'-Methoxyflügels und der Oligodesoxynukleotid-Lücke, die dem 3'-Ende der RNA am nächsten ist. Somit ergab das Enzym einen Haupt-Spaltort in der Mitte des RNA/DNA-Substrates und weniger bedeutende Spaltungen zur 3'-Seite des Haupt-Spaltortes. Die Verschiebung seines Haupt-Spaltortes zu dem Nukleotid in Apposition zu der DNA-2'-Methoxyverbindung des 2'-Methoxyflügels an dem 5'-Ende des chimären Oligonukleotids stimmt überein mit den Beobachtungen an E.-coli-RNase-HI (Crooke et al. (1995) Biochem. J. 312, 599 bis 608; Lima, W. F. und Crooke, S. T. (1997) Biochemistry 36, 390 bis 398). Die Tatsache, dass das Enzym in einem 5-Desoxy-Gap-Duplex an einem einzelnen Ort spaltet, zeigt an, dass das Enzym eine katalytische Region mit Abmessungen aufweist, die ähnlich denjenigen von E.-coli-RNase HI sind.
Demgemäß ist die Expression großer Mengen eines gereinigten menschlichen RNase-H-Polypeptids der vorliegenden Erfindung zum Kennzeichnen der Aktivitäten einer Säugetierform dieses Enzyms nützlich. Außerdem stellen die Polynukleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung ein Mittel zum Identifizieren von Agenzien, welche die Funktion von Antisense-Oligonukleotiden in menschlichen Zellen und Geweben verstärken, bereit.
Beispielsweise kann eine Wirtszelle genetisch so verändert werden, dass Polynukleotide eingebunden und Polypeptide der vorliegenden Erfindung exprimiert werden. Polynukleotide können unter Benutzung einer beliebigen Anzahl gut bekannter Techniken, wie z.B. Infektion, Transduktion, Transfektion oder Transformation, in eine Wirtszelle eingeführt werden. Das Polynukleotid kann allein oder in Verbindung mit einem zweiten Polynukleotid, das einen auswählbaren Marker codiert, eingeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Wirt eine Säugetierzelle. Solche Wirtszellen können dann nicht nur zur Herstellung von menschlicher Typ-2-RNase-H benutzt werden, sondern auch um Agenzien zu identifizieren, welche die Grade an Expression oder Aktivität menschlicher Typ-2-RNase-H in der Zelle erhöhen oder erniedrigen. In diesen Assays würde die Wirtszelle einem Agens ausgesetzt werden, von dem angenommen wird, dass es die Grade an Expression oder Aktivität menschlicher Typ-2-RNase-H in den Zellen ändert. Der Gehalt oder die Aktivität menschlicher Typ-2-RNase in der Zelle würde dann in der Gegenwart und in der Abwesenheit des Agens bestimmt. Dem Fachmann sind Assays zur Bestimmung von Proteingehalten einer Zelle gut bekannt, und dazu gehören Radioimmunoassays, kompetitive Bindungsassays, die Western-Blot-Analyse und enzymgekoppelte Immunabsorptionsassays (ELISA), sind aber nicht auf diese beschränkt. Verfahren zum Bestimmen der Erhöhung der Aktivität des Enzyms und insbesondere der erhöhten Spaltung eines Antisense-mRNA-Duplexes können gemäß den Lehren von Beispiel 5 durchgeführt werden. Agenzien, die als Induktoren des Gehaltes oder der Aktivität dieses Enzyms identifiziert sind, können zum Erhöhen der Wirksamkeit von Antisense-Oligonukleotid-Therapien nützlich sein.
Die vorliegenden Erfindung betrifft auch prognostische Assays, wobei die Gehalte von RNase in einem Zelltyp zum Voraussagen der Wirksamkeit einer Antisense-Oligonukleotid-Therapie in spezifischen Zielzellen benutzt werden können. Von hohen Gehalten an RNase in einem gewählten Zelltyp wird erhofft, dass sie im Vergleich zu geringeren Anteilen von RNase in einem gewählten Zelltyp mit höherer Wirksamkeit korrelieren, was eine geringe Spaltung der mRNA nach Binden mit dem Antisense-Oligonukleotid ergeben kann. Beispielsweise wies die MRC5-Brustkrebs-Zelllinie im Vergleich zu anderen bösartigen Zelltypen sehr niedrige Gehalte an RNase-H auf. Demgemäß kann gewünscht werden, in diesem Zelltyp Antisense-Verbindungen zu benutzen, die hinsichtlich ihrer Wirksamkeit nicht von der RNase-H-Aktivität abhängen.
In ähnlicher Weise können Oligonukleotide durchmustert werden, um diejenigen zu identifizieren, die wirksame Antisense-Agenzien sind, indem menschliche Typ-2-RNase-H mit einem Oligonukleotid kontaktiert und das Binden des Oligonukleotids an die menschliche Typ-2-RNase-H gemessen wird. Verfahren zum Bestimmen des Bindens von zwei Molekülen sind in dem Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform das Oligonukleotid radioaktiv markiert werden und das Binden des Oligonukleotids an menschliche Typ-2-RNase-H mittels Autoradiographie bestimmt werden. Alternativ können Fusionsproteine menschlicher Typ-2-RNase-H mit Glutathion-S-Transferase oder kleinen Peptid-Tags hergestellt und an einer festen Phase, wie z.B. Kügelchen, immobilisiert werden. Markierte oder unmarkierte Oligonukleotide, die hinsichtlich des Bindens an dieses Enzym durchmustert werden sollen, können dann mit der festen Phase inkubiert werden. Oligonukleotide, die an das Enzym binden, das an der festen Phase immobilisiert ist, können dann entweder durch Erfassen des gebunden Markers oder durch spezifisches Eluieren des gebundenen Oligonukleotids von der festen Phase identifiziert werden. In ein anderes Verfahren ist das Durchmustern von Oligonukleotid-Bibliotheken auf Bindungspartner einbezogen. Rekombinante, mit Tag versehene (tagged) oder markierte menschliche Typ-2-RNase-H wird benutzt, um aus der Bibliothek Oligonukleotide auszuwählen, die mit dem Enzym wechselwirken. Das Sequenzieren der Oligonukleotide führt zur Identifizierung derjenigen Oligonukleotide, die als Antisense-Agenzien wirksamer sein werden.
Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind aus einer Vielzahl von Nukleotiden gebildet, die zusammen über Internukleotidbindungen vereint sind. Obwohl die Nukleotide in den Oligonukleotiden zusammen als eine Einheit vereint sind, gehören die einzelnen Nukleotide der Oligonukleotide mehreren Typen an. Jeder dieser Typen trägt zu einzigartigen Eigenschaften des Oligonukleotids bei. Nukleotide eines ersten Typs sind zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint, die einen ersten Teil des Oligonukleotids bildet. Die restlichen Nukleotide sind von wenigstens einem weiteren Typ und befinden sich in einem oder mehreren restlichen Teilen oder Orten innerhalb des Oligonukleotids. Somit umfassen die Oligonukleotide der Erfindung einen Nukleotidteil, der einen Satz an Merkmalen beiträgt, und einen weiteren Teil (oder Teile), der einen anderen Satz an Merkmalen beiträgt.
Ein Merkmal, das wünschenswert ist, ist das Auslösen von RNase-H-Aktivität. Zum Auslösen von RNase-H-Aktivität ist ein Teil der Oligonukleotide der Erfindung so gewählt, dass er B-förmige Konformationsgeometrie aufweist. Die Nukleotide für diesen B-Form-Teil sind so gewählt, dass sie spezifisch Ribopentofuranosyl- und Arabinopentofuranosyl-Nukleotide enthalten. 2'-Desoxy-erythro-pentafuranosyl-Nukleotide weisen ebenfalls B-Form-Geometrie auf und lösen RNase-H-Aktivität aus. Obwohl sie nicht spezifisch ausgeschlossen sind, bilden solche 2'-Desoxy-erythropentafuranosyl-Nukleotide, wenn sie in den B-Form-Teil eines Oligonukleotids der Erfindung einbezogen sind, vorzugsweise nicht die Gesamtheit der Nukleotide dieses B- Form-Teils des Oligonukleotids, sondern sollten in Verbindung mit Ribonukleotiden oder Arabinonukleotiden benutzt werden. Wie hierin benutzt, ist in die B-Form-Geometrie sowohl die C2'-endo- als auch die O4'-endo-Wellung einbezogen, und die Ribo- und Arabinonukleotide, die zur Einbeziehung in den Oligonukleotid-B-Form-Teil gewählt sind, sind so gewählt, dass sie diejenigen Nukleotide sind, die C2'-endo-Konformation aufweisen, oder diejenigen Nukleotide sind, die O4'-endo-Konformation aufweisen. Dies stimmt überein mit Berger et. al., Nucleic Acids Research, 1998, 26, 2.473 bis 2.480, der darauf hinwies, dass bei der Erwägung der Furanose-Konformationen, in welchen sich Nukleotide und Nukleotide befinden, der Gesichtspunkt der B-Form auch bei einem O4'-endo-Wellungs-Beitrag gegeben sein sollte.
A-Form-Nukleotide sind Nukleotide, die C3'-endo-Wellung aufweisen, auch bekannt als North oder Northern Pucker. Außer den oben erwähnten B-Form-Nukleotiden können die A-Form-Nukleotide Nukleotide mit C3'-endo-Wellung oder Nukleotide sein, die sich an dem 3'-Terminus, an dem 5'-Terminus oder sowohl an dem 3'- als auch an dem 5'-Terminus des Oligonukleotids befinden. Alternativ können die A-Form-Nukleotide beide in einer C3'-endo-Wellung vorliegen und sich an den Enden, oder Termini, des Oligonukleotids befinden. Beim Auswählen von Nukleotiden, die C3'-endo-Wellung aufweisen, oder beim Auswählen von Nukleotiden für das 3'- oder 5'-Ende des Oligonukleotids werden die Bindungsaffinität und die Nukleasebeständigkeitseigenschaften berücksichtigt, die solche Nukleotide dem resultierenden Oligonukleotid verleihen müssen.
Nukleotide, die für den 3'- oder den 5'-Terminus der Oligonukleotide der Erfindung gewählt sind, sind so gewählt, dass sie dem Oligonukleotid Nukleasebeständigkeit verleihen. Diese Nukleasebeständigkeit kann auch durch verschiedene Mechanismen erreicht werden, einschließlich Modifikationen der Zuckerteile der Nukleotideinheiten des Oligonukleotids, Modifikation der Internukleotidbindungen oder Modifikation sowohl des Zuckers und als auch der Internukleotidbindungen.
Eine besonders nützliche Gruppe von Nukleotiden zur Benutzung zum Erhöhen der Nukleasebeständigkeit an den Termini von Oligonukleotiden sind diejenigen, die 2'-O-Alkylamino-Gruppen aufweisen. Die Aminogruppen solcher Nukleotide können Gruppen sein, die bei physiologischem pH-Wert protoniert sind. Dazu gehören Amine, monoalkylsubstituierte Amine, dialkylsubstituierte Amine und heterocyclische Amine, wie z.B. Imidazol. Besonders nützlich sind die Niederalkylamine einschließlich 2'-O-Ethylamin und 2'-O-Propylamin. Solche O-Alkylamine können auch in die 3'-Position des 3'-Terminus-Nukleotids einbezogen sein. Daher könnte das 3'-Terminus-Nukleotid sowohl einen 2'- als auch einen 3'-O-Alkylamino-Substituenten aufweisen.
Beim Auswählen hinsichtlich Nukleasebeständigkeit ist es wichtig, die Bindungsaffinität nicht zu beeinträchtigen. Von bestimmten Bindungen auf Basis von Phosphor ist gezeigt worden, dass sie die Nukleasebeständigkeit erhöhen. Die oben beschriebene Phosphorothioat-Bindung erhöht die Nukleasebeständigkeit, verursacht jedoch auch einen Verlust an Bindungsaffinität. Daher werden zur Benutzung in dieser Erfindung, wenn Phosphorothioat-Internukleotidbindungen benutzt werden, andere Modifikationen an Nukleotideinheiten vorgenommen werden, welche die Bindungsaffinität erhöhen, um den verringerten Affinitätsbeitrag durch die Phosphorothioat-Bindungen auszugleichen.
Zu anderen Bindungen auf Basis von Phosphor mit erhöhter Nukleasebeständigkeit, welche die Bindungsaffinität nicht beeinträchtigen, gehören 3'-Methylenphosphonat- und 3'-Desoxy-3'-amino-phosphoroamidat-Bindungen. Eine weitere Klasse von Bindungen, die Nukleasebeständigkeit beitragen, die Bindungsaffinität aber nicht beeinträchtigen, sind von Nichtphosphat-Natur. Von diesen sind Methylen(methylimino)-Bindungen, Dimethylhydrazino-Bindungen und Amin-3- und Amid-4-Bindungen, wie beschrieben (Freier and Altmann, Nucleic Acid Research, 1997, 25, 4.429 bis 4.443), bevorzugt.
Beim Entwerfen von Oligonukleotiden mit verbesserten Bindungsaffinitäten muss eine Anzahl möglicher Gesichtspunkte berücksichtigt werden. Es scheint, dass ein wirkungsvoller Ansatz zum Aufbauen modifizierter Oligonukleotide mit sehr hoher RNA-Bindungsaffinität die Kombination von zwei oder mehr verschiedenen Typen von Modifikationen ist, von denen jede vorteilhaft zu verschiedenen Faktoren beiträgt, die für Bindungsaffinität wichtig sein könnten.
Freier und Altmann, Nucleic Acids Research, (1997) 25:4.429 bis 4.443, haben jüngst eine Untersuchung des Einflusses struktureller Modifikationen an Oligonukleotiden auf die Stabilität ihrer Duplices mit Ziel-RNA veröffentlicht. In dieser Untersuchung überprüften die Autoren eine Reihe von Oligonukleotiden, die mehr als 200 verschiedene Modifikationen enthielten, die synthetisiert und deren Hybridisierungsaffinität und T_m festgestellt worden waren. Zu untersuchten Zucker-Modifikationen gehörten Substitutionen in der 2'-Position des Zuckers, 3'-Substitution, Austausch des 4'-Sauerstoffs, die Benutzung bicyclischer Zucker und Ersatz mit viergliedrigen Ringen. Es wurden auch mehrere Nukleobasen-Modifikationen einschließlich Substitutionen in der 5- oder 6-Position von Thymin, Modifikationen des Pyrimidin-Heterocyclus und Modifikationen des Purin-Heterocyclus untersucht. Auch wurden zahlreiche Rückgrat-Modifikationen einschließlich Rückgraten, die Phosphor trugen, Rückgraten, die kein Phosphoratom trugen, Rückgraten, die neutral waren, untersucht.
Vier allgemeine Ansätze könnten benutzt werden, um die Hybridisierung von Oligonukleotiden mit RNA-Zielen zu verbessern. Dazu gehören: Vororganisation der Zucker und Phosphate des Oligodesoxynukleotid-Stranges zu Konformationen, die für die Hybridbildung günstig sind, Verbessern des Stapelns von Nukleobasen durch Hinzufügen polarisierbarer Gruppen zu den Heterocyclusbasen der Nukleotide des Oligonukleotids, Vergrößern der Zahl an H-Bindungen, die zur A-U-Paarbildung verfügbar sind, und Neutralisation von Rückgratladung, um das Beseitigen unerwünschter Abstoßungswechselwirkungen zu erleichtern. Wir haben festgestellt, dass der erste davon, Vororganisation der Zucker und Phosphate des Oligodesoxynukleotid-Stranges zu Konformationen, die für die Hybridbildung günstig sind, ein bevorzugtes Verfahren zum Erzielen verbesserter Bindungsaffinität ist. Er kann ferner in Kombination mit den anderen drei Ansätzen benutzt werden.
Zucker in DNA:RNA-Hybridduplices nehmen häufig eine C3'-endo-Konformation an. Daher sollten Modifikationen, die das Konformationsgleichgewicht der Zuckereinheiten in dem Einzelstrang zu dieser Konformation verschieben, den Antisense-Strang zum Binden an RNA vororganisieren. Von den verschiedenen Zuckermodifikationen, die in der Literatur untersucht und beschrieben wurden, verschiebt die Einbindung elektronegativer Substituenten, wie z.B. 2'- Fluor oder 2'-Alkoxy, die Zuckerkonformation zu der 3'-endo-(Northern)-Wellungs-Konformation. Dies organisiert ein Oligonukleotid, in das solche Modifikationen eingebunden sind, so vor, dass es eine A-Form-Konformationsgeometrie aufweist. Diese A-Form-Konformation ergibt erhöhte Bindungsaffinität des Oligonukleotids zu einem Ziel-RNA-Strang.
Wie hierin benutzt, beziehen sich die Ausdrücke „Substituent" und „Substituentengruppe" auf Gruppen, die an Nukleoside der Erfindung angehängt sind. Substituentengruppen sind vorzugsweise an gewählte Zuckereinheiten angehängt, können alternativ aber an gewählte heterocyclische Baseneinheiten angehängt sind. Gewählte Nukleoside können Substituentengruppen sowohl an der heterocyclischen Base als auch an der Zuckereinheit aufweisen, jedoch ist eine einzelne Substituentengruppe in der 2'-, 3'- oder 5'-Position des Zuckers bevorzugt, wobei die 2'-Position besonders bevorzugt ist.
Zu Substituentengruppen gehören Fluor, O-Alkyl, O-Alkylamino, O-Alkylalkoxy, O-Alkylaminoalkyl, O-Alkylimidazol und Polyether mit der Formel (O-Alkyl)_m, wobei m 1 bis etwa 10 ist. Von diesen Polyethern sind lineare und cyclische Polyethylenglycole (PEG) und PEG-haltige Gruppen, wie z.B. Kronenether, und diejenigen, die von Ouchi et al. (Drug Design and Discovery 1992, 9, 93), Ravasio et al. (J. Org. Chem. 1991, 56, 4.329) und Delgardo et. al. (Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249) offenbart sind, die durch Bezugnahme alle in ihrer Gesamtheit hierin eingebunden sind, bevorzugt. Weitere Zuckermodifikationen sind in Cook, P. D., Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 585 bis 607 offenbart. Die Fluor-, O-Alkyl-, O-Alkylamino-, O-Alkylimidazol-, O-Alkylaminoalkyl- und Alkylamino- Substitution sind in der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 08/398,901, eingereicht am 6. März 1995, mit der Bezeichnung Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions, die durch Bezugnahme hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden ist, beschrieben.
Zu weiteren Substituentengruppen, die für die vorliegende Erfindung zugänglich sind, gehören -SR- und -NR₂-Gruppen, worin jedes R unabhängig Wasserstoff, eine Schutzgruppe oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist. 2'-SR-Nukleoside sind in dem US-Patent Nr. 5,670,633, erteilt am 23. Sept. 1997 offenbart, das durch Bezugnahme hiermit in seiner Gesamtheit eingebunden ist. Die Einbindung von 2'-SR-Monomersynthonen ist von Hamm et al., J. Org. Chem., 1997, 62, 3.415 bis 3.420, offenbart. 2'-NR₂-Nukleoside sind von Goettingen, M., J. Org. Chem., 1996, 61, 6.273 bis 6.281 und Polushin et al., Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3.227 bis 3.230 offenbart.
Zu weiteren typischen Substituentengruppen gehören Wasserstoff, Hydroxyl, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₂₀-Alkenyl, C₂-C₂₀-Alkinyl, Halogen, Amino, Thiol, Keto, Carboxyl, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, O-Alkyl, O-Alkenyl, O-Alkinyl, S-Alkyl, S-Alkenyl, S-Alkinyl, NH-Alkyl, NH-Alkenyl, NH-Alkinyl, N-Dialkyl, O-Aryl, S-Aryl, NH-Aryl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, N-Phthalimido, Imidazol, Azido, Hydrazino, Hydroxylamino, Isocyanato, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Disulfid, Silyl, Aryl, Heterocyclus, Carbocyclus, Interkalator, Reportermolekül, Konjugat, Polyamin, Polyamid, Polyalkylenglycol oder Polyether
oder jede Substituentengruppe, die eine Formel I oder II hat,
worin
Z₀ O, S oder NH ist;
J eine Einfachbindung, O oder C(=O) ist;
E C₁-C₁₀-Alkyl, N(R₁)(R₂), N(R₁)(R₅), N=C(R₁)(R₂), N=C(R₁)(R₅) ist oder eine Formel III oder IV hat;
jedes R₆, R₇, R₈, R₉ und R₁₀ unabhängig Wasserstoff, C(O)R₁₁, substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes C₂-C₁₀-Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes C₂-C₁₀-Alkinyl, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, eine chemische funktionelle Gruppe oder eine Konjugat-Gruppe ist, worin die Substituentengruppen aus Hydroxyl, Amino, Alkoxy, Carboxy, Benzyl, Phenyl, Nitro, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Alkyl, Aryl, Alkenyl und Alkinyl gewählt sind;
oder optional R₇ und R₈ zusammen eine Phthalimidoeinheit mit dem Stickstoffatom bilden, an welches sie angehängt sind;
oder optional R₉ und R₁₀ zusammen eine Phthalimidoeinheit mit dem Stickstoffatom bilden, an welches sie angehängt sind;
jedes R₁₁ unabhängig substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, Trifluormethyl, Cyanoethyloxy, Methoxy, Ethoxy, t-Butoxy, Allyloxy, 9-Fluorenylmethoxy, 2-(Trimethylsilyl)-ethoxy, 2,2,2-Trichlorethoxy, Benzyloxy, Butyryl, iso-Butyryl, Phenyl oder Aryl ist;
R₅ T-L ist,
T eine Bindung oder eine verbindende Einheit ist;
L eine chemische funktionelle Gruppe, eine Konjugatgruppe oder ein festes Trägermaterial ist;
jedes R₁ und R₂ unabhängig H, eine Stickstoffschutzgruppe, substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes C₂-C₁₀-Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes C₂-C₁₀-Alkinyl ist, worin die Substitution OR₃, SR₃, NH₃ ⁺, N(R₃)(R₄), Guanidino oder Acyl ist, worin das Acyl ein Säureamid oder ein Ester ist;
oder R₁ und R₂ zusammen eine Stickstoffschutzgruppe sind oder in einer Ringstruktur vereint sind, die optional ein weiteres Heteroatom umfasst, das aus N und O gewählt ist;
oder R₁, T und L zusammen eine chemische funktionelle Gruppe sind;
jedes R₃ und R₄ unabhängig H, C₁-C₁₀-Alkyl, eine Stickstoffschutzgruppe ist oder R₃ und R₄ zusammen eine Stickstoffschutzgruppe sind;
oder R₃ und R₄ zusammen in einer Ringstruktur vereint sind, die optional ein zusätzliches Heteroatom umfasst, das aus N und O gewählt ist;
Z₄ OX, SX oder N(X)₂ ist;
jedes X unabhängig H, C₁-C₈-Alkyl, C₁-C₈-Halogenalkyl, C(=NH)N(H)R₅, C(=O)N(H)R₅ oder OC(=O)N(H)R₅ ist;
R₅ H oder C₁-C₈-Alkyl ist;
Z₁, Z₂ und Z₃ ein Ringsystem mit etwa 4 bis etwa 7 Kohlenstoffatomen oder mit etwa 3 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Heteroatomen umfassen, worin die Heteroatome gewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel und worin das Ringsystem aliphatisch, ungesättigt aliphatisch, aromatisch oder gesättigt oder ungesättigt heterocyclisch ist;
Z₅ Alkyl oder Halogenalkyl mit etwa 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit etwa 2 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen, N(R₁)(R₂)OR₁, Halogen, SR₁ oder CN ist;
jedes q₁ unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
jedes q₂ unabhängig 0 oder 1 ist;
q₃ 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
q₄ eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
q₅ 0, 1 oder 2 ist; und
vorausgesetzt dass, wenn q₃ 0 ist, q₄ größer als 1 ist.
Typische Substituentengruppen der Formel I sind in der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 09/130,973, eingereicht am 7. Aug. 1998, mit der Bezeichnung „Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides" offenbart, die durch Bezugnahme hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden ist.
Typische cyclische Substituentengruppen der Formel II sind in der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 09/123,108, eingereicht am 27. Juli 1998, mit der Bezeichnung „RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized" offenbart, die durch Bezugnahme hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden ist.
Zu besonders bevorzugten Substituentengruppen gehören O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂ und O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂, worin n und m von 1 bis etwa 10 sind.
Einige bevorzugte oligomere Verbindungen der Erfindung enthalten wenigstens ein Nukleosid mit einer der folgenden Substituentengruppen: C₁- bis C₁₀-Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl, Aralkyl, O-Alkaryl oder O-Aralkyl, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkaryl, Aminoalkylamino, Polyalkylamino, substituiertes Silyl, eine RNA-Spaltgruppe, eine Reportergruppe, ein Interkalator, eine Gruppe zum Verbessern der pharmakokinetischen Eigenschaften einer oligomeren Verbindung oder eine Gruppe zum Verbessern der pharmakodynamischen Eigenschaften einer oligomeren Verbindung und andere Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Zu einer bevorzugten Modifikation gehört 2'-Methoxyethoxy [2'-O-CH₂CH₂OCH₃, auch bekannt als 2'-O-(2-Methoxyethyl) oder 2'-MOE] (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486), d.h. eine Alkoxyalkoxygruppe. Eine weitere bevorzugte Modifikation ist 2'-Dimethylaminooxyethoxy, d.h. eine O(CH₂)₂ON(CH₃)₂-Gruppe, auch bekannt als 2'-DMAOE. Typische Aminooxy-Substituentengruppen sind in der im Miteigentum befindlichen US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 09/344,260, eingereicht am 25. Juni 1999, mit der Bezeichnung „Aminooxy-Functionalized Oligomers"; und einer US-Patentanmeldung mit der Bezeichnung „Aminooxy-Functionalized Oligomers and Methods for Making Same", eingereicht am 9. Aug. 1999, beschrieben, gegenwärtig durch das Rechtsanwalts-Aktenzeichen ISIS-3993 identifiziert, die durch Bezugnahme hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden sind.
Zu anderen bevorzugten Modifikationen gehören 2'-Methoxy (2'-O-CH₃), 2'-Aminopropoxy (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂) und 2'-Fluor (2'-F). Ähnliche Modifikationen können auch in anderen Positionen an Nukleosiden und Oligomeren vorgenommen werden, insbesondere in der 3'-Position des Zuckers am 3'-terminalen Nukleosid oder in 2'-5'-verbundenen Oligomeren und in der 5'-Position von 5'-terminalem Nukleosid.
Oligomere können auch Zuckernachahmungen, wie z.B. Cyclobutyl-Einheiten, anstelle des Pentofuranosylzuckers aufweisen. Zu typischen US-Patenten, welche die Herstellung solcher modifizierten Zuckerstrukturen lehren, gehören die US-Patente 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,0531 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633 und 5,700,920, von denen bestimmte im gemeinschaftlichen Eigentum befindlich sind und die alle durch Bezugnahme hierin eingebunden sind, und die in gemeinschaftlichem Eigentum befindliche US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 08/468,037, eingereicht am 5. Juni 1995, ebenfalls durch Bezugnahme hierin eingebunden, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Typische Guanidino-Substituentengruppen, die in Formel III und IV gezeigt sind, sind in der im Miteigentum befindlichen US-Patentanmeldung 09/349,040 mit der Bezeichnung „Functionalized Oligomers", eingereicht am 7. Juli 1999, offenbart, die durch Bezugnahme hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden ist.
Typische Acetamido-Substituentengruppen sind in einer US-Patentanmeldung mit der Bezeichnung „2'-O-Acetamido Modified Monomers and Oligomers", eingereicht am 19. Aug. 1999, gegenwärtig durch das Rechtsanwalts-Aktenzeichen ISIS-4071 identifiziert, offenbart, die durch Bezugnahme hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden ist.
Typische Dimethylaminoethyloxyethyl-Substituentengruppen sind in einer internationalen Patentanmeldung mit der Bezeichnung „2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Modified Oligonucleotides", eingereicht am 6. Aug. 1999, gegenwärtig durch das Rechtsanwalts-Aktenzeichen ISIS-4045 identifiziert, offenbart, die durch Bezugnahme hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden ist.
Mehrere 2'-Substituentengruppen verleihen dem Zucker eine 3'-endo-Wellung, wenn sie eingebunden sind. Diese Wellungskonformation unterstützt weiter dabei, die T_m des Oligonukleotids mit seinem Ziel zu erhöhen.
Die hohe Bindungsaffinität, die aus der 2'-Substitution resultiert, ist zum Teil dem Umstand zugeschrieben worden, dass die 2'-Substitution eine C3'-endo-Zuckerwellung hervorruft, die dem Oligomer wiederum eine günstige A-förmige Geometrie verleihen kann. Dies ist eine vernünftige Hypothese, da gezeigt wurde, dass die Substitution in der 2'-Position durch eine Vielfalt elektronegativer Gruppen (wie z.B. Fluor und O-Alkyl-Ketten) C3'-endo-Zuckerwellung verursacht (De Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res., 1995, 28, 366 bis 374; Lesnik et al., Biochemistry, 1993, 32, 7.832 bis 7.838).
Außerdem kann bei 2'-Substituenten, die ein Ethylenglycol-Motiv enthalten, eine gauche-Wechselwirkung zwischen den Sauerstoffatomen um die O-C-C-O-Torsion der Seitenkette eine stabilisierende Wirkung auf den Duplex aufweisen (Freier et al., Nucleic Acids Research, (1997) 25:4.429 bis 4.442). Solche Bauche-Wechselwirkungen sind experimentell einige Jahre lang beobachtet worden (Wolfe et al., Acc. Chem. Res., 1972, 5, 102; Abe et al., J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 468). Dieser gauche-Effekt kann zu einer Konfiguration der Seitenkette führen, die für die Duplexbildung günstig ist. Die genaue Natur dieser stabilisierenden Konfiguration ist bisher noch nicht erklärt worden. Obwohl wir nicht an die Theorie gebunden sein möchten, ist es möglich, dass das Halten der O-C-C-O-Torsion in einer einzigen gauche-Konfiguration – und nicht eine zufälligere Verteilung, die in einer Alkyl-Seitenkette erkannt wird – für einen Entropievorteil der Duplexbildung sorgt.
Um die höhere RNA-Affinität von 2'-O-Methoxyethylsubstituierter RNA besser zu verstehen und die Konformationseigenschaften des 2'-O-Methoxyethyl-Substituenten zu untersuchen, wurde ein selbstkomplementäres Dodecamer-Oligonukleotid 2'-O-MOE r(CGCGAAUUCGCG) SEQ ID NO: 13 synthetisiert, kristallisiert und dessen Struktur mit einer Auflösung von 1,7 Angström bestimmt. Die angewendeten Kristallisationsbedingungen waren: 2 mM Oligonukleotid, 50 mM Na-Hepes, pH 6,2 bis 7,5, 10,50 mM MgCl₂, 15 % PEG 400. Die Kristalldaten zeigten: Raumgruppe C2, Zellkonstanten a = 41,2 Å, b = 34,4 Å, c = 46,6 Å, β = 92,4°. Die Auflösung betrug 1,7 Å bei –170 °C. Der aktuelle R-Faktor betrug 20 % (R_free 26 %).
Von dieser Kristallstruktur wird angenommen, dass sie die erste Kristallstruktur eines vollständig modifizierten RNA-Oligonukleotid-Analogen ist. Der Duplex nimmt insgesamt eine A-Form-Konformation an, und alle modifizierten Zucker weisen C3'-endo-Wellung auf. Bei den meisten der 2'-O-Substituenten weist der Torsionswinkel um die A'-B'-Bindung, wie unten in Struktur II gezeigt, der Ethylenglycol-Verknüpfung eine gauche-Konformation auf. Bei 2'-O-MOE sind A' und B' der Struktur II unten Methylen-Einheiten des Ethylteils des MOE; und R' ist der Methoxyteil.
In dem Kristall nimmt der 2'-O-MOE-RNA-Duplex eine derartige allgemeine Orientierung an, dass die kristallographische 2-fach-Rotationsachse nicht mit der molekularen 2-fach-Rotationsachse übereinstimmt. Der Duplex nimmt die erwartete A-Typ-Geometrie an, und alle 24 2'-O-MOE-Substituenten waren in den Elektronendichtekarten bei voller Auflösung sichtbar. Die Elektronendichtekarten sowie die Temperaturfaktoren von Substituentenatomen zeigen in manchen Fällen Flexibilität des 2'-O-MOE-Substituenten an.
Die meisten der 2'-O-MOE-Substituenten weisen eine gauche-Konformation um die C-C-Bindung der Ethylverknüpfung auf. In zwei Fällen wird jedoch eine trans-Konformation um die C-C-Bindung festgestellt. Zu Gitterwechselwirkungen in dem Kristall gehören das Packen von Duplices gegen einander über ihre kleinen Furchen. Daher wird bei einigen Resten die Konformation des 2'-O-Substituenten durch Kontakte zu einem benachbarten Duplex beeinflusst. Im Allgemeinen erzeugen Variationen der Konformation der Substituenten (z.B. g⁺ oder g^– um die C-C-Bindungen) einen Bereich von Wechselwirkungen zwischen Substituenten, sowohl zwischen Strängen, über die kleine Furche, als auch innerhalb von Strängen. An einem Ort befinden sich Atome von Substituenten von zwei Resten über die kleine Furche in van-der-Waals-Kontakt. In ähnlicher Weise kommt es zu einem engen Kontakt zwischen Atomen von Substituenten zweier benachbarter Reste innerhalb des Stranges.
Vorherig bestimmte Kristallstrukturen von A-DNA-Duplices waren für diejenigen, in die isolierte 2'-O-Methyl-T-Reste eingebunden waren. In den Kristallstrukturen, die oben für die 2'-O-MOE angegeben sind, wurde ein konserviertes Hydratationsmuster für die 2'-O-MOE-Reste festgestellt. Ein einzelnes Wassermolekül lässt sich erkennen, das sich zwischen O2', O3' und dem Methoxy-Sauerstoffatom des Substituenten befindet und Kontakt mit allen dreien zwischen 2,9 und 3,4 Å aufweist. Außerdem sind Sauerstoffatome von Substituenten an mehreren anderen Wasserstoffbrückenbindungskontakten beteiligt. Beispielsweise bildet das Methoxy-Sauerstoffatom eines bestimmten 2'-O-Substituenten über ein verbrückendes Wassermolekül eine Wasserstoffbindung zu N3 eines Adenosins vom gegenüberliegenden Strang aus.
In mehreren Fällen ist ein Wassermolekül zwischen den Sauerstoffatomen O2', O3' und OC' modifizierter Nukleoside eingeschlossen. 2'-O-MOE-Substituenten mit trans-Konformation um die C-C-Bindung der Ethylenglycol-Verknüpfung sind mit engen Kontakten zwischen OC' und N2 eines Guanosins des gegenüberliegenden Stranges assoziiert und durch Wasser vermittelt zwischen OC' und N3(G). Diese Kristallstruktur in Kombination mit den verfügbaren thermodynamischen Daten für Duplices, die 2'-O-MOE-modifizierte Stränge enthalten, ermöglicht die weitere detaillierte Struktur-Stabilitäts-Analyse anderer Antisense-Modifikationen.
Bei der Ausweitung der kristallographischen Strukturuntersuchungen wurden Molekülmodellierungsexperimente durchgeführt, um weiter erhöhte Bindungsaffinität von Oligonukleotiden mit 2'-O- Modifikationen der Erfindung zu untersuchen. Die Computersimulationen wurden an den obigen Verbindungen mit der SEQ ID NO: 1 durchgeführt, die 2'-O-Modifikationen der Erfindung aufweisen, die sich an jedem Nukleosid des Oligonukleotids befinden. Die Simulationen wurden an dem Oligonukleotid in wässriger Lösung unter Benutzung der AMBER-Kraftfeldmethode (Cornell et al., J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 5.179 bis 5.197) (Modellierungssoftwarepaket von UCSF, San Francisco, CA) durchgeführt. Die Berechnungen wurden mit einem Indigo2-SGI-Gerät (Silicon Graphics, Mountain View, CA) durchgeführt.
Zu weiteren 2'-O-Modifikationen der Erfindung gehören diejenigen, die eine Ringstruktur aufweisen, in die ein zweiatomiger Teil einbezogen ist, der den Atomen A' und B' von Struktur II entspricht. Die Ringstruktur ist in der 2'-Position einer Zuckereinheit eines oder mehrerer Nukleoside angehängt, die in ein Oligonukleotid eingebunden sind. Der 2'-Sauerstoff des Nukleosids bindet an ein Kohlenstoffatom, das dem Atom A' von Struktur II entspricht. Diese Ringstrukturen können aliphatisch, ungesättigt aliphatisch, aromatisch oder heterocyclisch sein. Ein weiteres Atom des Ringes (das dem Atom B' von Struktur II entspricht) trägt ein weiteres Sauerstoffatom oder ein Schwefel- oder ein Stickstoffatom. Dieses Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom ist mit einem oder mehreren Wasserstoffatomen, Alkyleinheiten oder Halogenalkyl-Einheiten verbunden oder ist Teil einer weiteren chemischen Einheit, wie z.B. einer Ureido-, Carbamat-, Amid- oder Amidin-Einheit. Der Rest der Ringstruktur schränkt die Rotation um die Bindung, die diese beiden Ringatome vereint, ein. Dies unterstützt das Positionieren des „weiteren Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatoms" (Teil der Position R, wie oben beschrieben) derart, dass sich das weitere Atom in großer Nähe zu dem 3'-Sauerstoffatom (O3') des Nukleosids befinden kann.
Die Ringstruktur kann mit einer Gruppe weiter modifiziert sein, die zum Modifizieren der hydrophilen und hydrophoben Eigenschaften des Ringes, an den sie angehängt ist, und somit der Eigenschaften eines Oligonukleotids, das die 2'-O-Modifikationen der Erfindung enthält, nützlich ist. Weitere Gruppen können gewählt werden, wie Gruppen, die in der Lage sind, eine geladene Struktur anzunehmen, z.B. ein Amin. Dies ist zum Modifizieren der Gesamtladung eines Oligonukleotids, das eine 2'-O-Modifikation der Erfindung enthält, besonders nützlich. Wenn ein Oligonukleotid durch geladene Phosphatgruppen, z.B. Phosphorothioat- oder Phosphodiester-Bindungen, verbunden ist, neutralisiert die Anordnung eines Gegenions an der 2'-O-Modifikation, z.B. einer Aminfunktionalität, die Ladung in der örtlichen Umgebung des Nukleotids, das die 2'-O-Modifikation trägt, örtlich. Solch eine Ladungsneutralisation wird die Aufnahme, Zelllokalisierung und andere pharmakokinetische und pharmokodynamische Wirkungen des Oligonukleotids abändern.
Zu bevorzugten Ringstrukturen der Erfindung zur Einbeziehung als einer 2'-O-Modifikation gehören Cyclohexyl-, Cyclopentyl- und Phenylringe sowie heterocyclische Ringe, die räumliche Fußabdrücke aufweisen, die denjenigen von Cyclohexyl-, Cyclopentyl- und Phenylringen ähnlich sind. Besonders bevorzugte 2'-O-Substituentengruppen der Erfindung einschließlich einer Abkürzung für jede sind unten aufgeführt:
2'-O-(trans-2-Methoxy-cyclohexyl) --2'-O-(TMCHL)
2'-O-(trans-2-Methoxy-cyclopentyl) --2'-O-(TMCPL)
2'-O-(trans-2-Ureido-cyclohexyl) --2'-O-(TUCHL)
2'-O-(trans-2-Methoxyphenyl) --2'-O-(2MP)
Strukturelle Einzelheiten von Duplices, in die solche 2'-O-Substituenten eingebunden sind, wurden unter Benutzung des beschriebenen AMBER-Kraftfeldprogrammes in dem Indigo2-SGI-Gerät analysiert. Die simulierte Struktur bewahrte während der gesamten Dauer der Simulation eine stabile A-Form-Geometrie. Die Gegenwart der 2'-Substitutionen verriegelte die Zucker in der C3'-endo-Korformation.
Die Simulation für die TMCHL-Modifikation enthüllte, dass die 2'-O-(TMCHL)-Seitenketten eine direkte Wechselwirkung mit Wassermolekülen, die den Duplex solvatisieren, aufweisen. Die Sauerstoffatome in der 2'-O-(TMCHL)-Seitenkette sind in der Lage, in eine durch Wasser vermittelte Wechselwirkung mit dem 3'-Sauerstoff des Phosphat-Rückgrates zu treten. Die Gegenwart der beiden Sauerstoffatome in der 2'-O-(TMCHL)-Seitenkette ruft günstige gauche-Wechselwirkungen hervor. Durch diese neue Modifikation wird die Barriere für die Rotation um die O-C-C-O-Torsion noch höher. Die vorzugsweise Vororganisation in eine A-Typ-Geometrie erhöht die Bindungsaffinität des 2'-O-(TMCHL) zu der Ziel-RNA. Die verriegelte Seitenkettenkonformation in der 2'-O-(TMCHL)-Gruppe erzeugte eine günstigere Tasche zum Binden von Wassermolekülen. Die Gegenwart dieser Wassermoleküle spielte eine Schlüsselrolle beim Halten der Seitenketten in der bevorzugten gauche-Konformation. Obwohl nicht gewünscht ist, an die Theorie gebunden zu sein, wird das Volumen des Substituenten, die diäquatoriale Orientierung der Substituenten in dem Cyclohexanring, das Hydratationswasser und das Potenzial zum Einschließen von Metallionen in der erzeugten Konformation zusätzlich zu verbesserter Bindungsaffinität und Nukleasebeständigkeit von Oligonukleotiden, in die Nukleoside mit dieser 2'-O-Modifikation eingebunden sind, beitragen.
Wie für die obige TMCHL-Modifikation beschrieben, veranschaulichen identische Computersimulationen der 2'-O-(TMCPL)-, der 2'-O-(2MP)- und 2'-O-(TUCHL)-modifizierten Oligonukleotide in wässriger Lösung auch, dass während der gesamten Dauer der Simulation eine stabile A-Form-Geometrie bewahrt werden wird. Die Gegenwart der 2'-Substitution wird die Zucker in der C3'-endo-Konformation verriegeln, und die Seitenketten werden direkte Wechselwirkung mit Wassermolekülen aufweisen, die den Duplex solvatisieren. Die Sauerstoffatome in den jeweiligen Seitenketten sind in der Lage, eine durch Wasser vermittelte Wechselwirkung mit dem 3'-Sauerstoff des Phosphat-Rückgrates zu erzeugen. Die Gegenwart der beiden Sauerstoffatome in den jeweiligen Seitenketten ruft die günstigen gauche-Wechselwirkungen hervor. Durch die jeweilige Modifikation wird die Barriere für die Rotation um die jeweiligen O-C-C-O-Torsinnen noch weiter erhöht. Die bevorzugte Vororganisation in eine A-Typ-Geometrie wird die Bindungsaffinität der jeweiligen 2'-O-modifizierten Oligonukleotide zu der Ziel-RNA erhöhen. Die verriegelte Seitenkettenkonformation in den jeweiligen Modifikationen wird eine zum Binden von Wassermolekülen günstigere Tasche erzeugen. Die Gegenwart dieser Wassermoleküle spielt eine Schlüsselrolle beim Halten der Seitenketten in der bevorzugten gauche-Konformation. Das Volumen des Substituenten, die diäquatoriale Orientierung der Substituenten in ihren jeweiligen Ringen, das Hydratationswasser und das Potenzial zum Einschließen von Metallionen in der erzeugten Konformation werden alle zu verbesserter Bindungsaffinität und Nukleasebeständigkeit von Oligonukleotiden, in die Nukleoside mit dieser jeweiligen 2'-O-Modifikation eingebunden sind, beitragen.
Bevorzugt zur Benutzung als die B-Form-Nukleotide zum Auslösen von RNase-H sind Ribonukleotide, die 2'-Desoxy-2'-S-methyl, 2'-Desoxy-2'-methyl, 2'-Desoxy-2'-amino, 2'-Desoxy-2'-mono- oder -dialkylsubstitutiertes Amino, 2'-Desoxy-2'-fluormethyl, 2'-Desoxy-2'-difluormethyl, 2'-Desoxy-2'-trifluormethyl, 2'-Desoxy-2'-methylen, 2'-Desoxy-2'-fluormethylen, 2'-Desoxy-2'-difluormethylen, 2'-Desoxy-2'-ethyl, 2'-Desoxy-2'-ethylen und 2'-Desoxy-2'-acetylen aufweisen. Diese Nukleotide können alternativ als 2'-SCH₃-Ribonukleotid, 2'-CH₃-Ribonukleotid, 2'-NH₂-Ribonukleotid 2'-NH(C₁-C₂-Alkyl)-Ribonukleotid, 2'-N(C₁-C₂-Alkyl)₂-Ribonukleotid, 2'-CH₂F-Ribonukleotid, 2'-CHF₂-Ribonukleotid, 2'-CF₃-Ribonukleotid, 2'=CH₂-Ribonukleotid, '=CHF-Ribonukleotid, 2'=CF₂-Ribonukleotid, 2'-C₂H₅-Ribonukleotid, 2'-CH=CH₂-Ribonukleotid, 2'-C=CH-Ribonukleotid bezeichnet werden. Ein weiteres nützliches Ribonukleotid ist eines mit einem Ring, der sich in einer käfigartigen Struktur an dem Ribosering befindet, einschließlich 3',O,4'-C-Methylenribonukleotiden. Solche käfigartigen Strukturen werden den Ribosering in der gewünschten Konformation fixieren.
Außerdem sind zur Benutzung als die B-Form-Nukleotide zum Auslösen von RNase-H Arabinonukleotide, die 2'-Desoxy-2'-cyano, 2'-Desoxy-2'-fluor, 2'-Desoxy-2'-chlor, 2'-Desoxy-2'-brom, 2'-Desoxy-2'-azido, 2'-Methoxy aufweisen, und das unmodifizierte Arabinonukleotid (das ein 2'-OH enthält, das nach oben zu der Base des Nukleotids hin ragt) bevorzugt. Diese Arabinonukleotide können alternativ als 2'-CN-Arabinonukleotid, 2'-F-Arabinonukleotid, 2'-Cl-Arabinonukleotid, 2'-Br-Arabinonukleotid, 2'-N₃-Arabinonukleotid, 2'-O-CH₃-Arabinonukleotid und Arabinonukleotid bezeichnet werden.
Solche Nukleotide sind über Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, Boranophosphat- oder Phosphodiester-Bindungen mit einander verbunden; besonders bevorzugt ist die Phosphorothioat-Bindung.
Veranschaulichend für die B-Form-Nukleotide zur Benutzung in der Erfindung ist ein 2'-S-Methyl-(2'-SMe)-Nukleotid, das sich in C2'-endo-Konformation befindet. Es kann mit 2'-O-Methyl-(2'-OMe)-Nukleotiden verglichen werden, die sich in einer C3'-endo-Konformation befinden. Besonders geeignet zur Benutzung zum Vergleichen dieser beiden Nukleotide sind molekulardynamische Untersuchungen unter Benutzung eines SGI-Computers [Silicon Graphics, Mountain View, CA] und des AMBER-Modellierungssoftwarepaketes für Computersimulationen [UCSF, San Francisco, CA].
Ribosekonformationen in C2'-modifizierten Nukleosiden, die S-Methyl-Gruppen enthielten, wurden untersucht. Um den Einfluss von 2'-O-Methyl- und 2'-S-Methyl-Gruppen auf die Konformation von Nukleosiden zu verstehen, bewerteten wir die relativen Energien des 2'-O- und des 2'-S-Methylguanosins zusammen mit normalem Desoxyguanosin und Riboguanosin ausgehend von sowohl C2'-endo- als auch C3'-endo-Konformationen unter Benutzung quantenmechanischer abinitio-Berechnungen. Alle Strukturen waren auf der HF/6-31G*-Stufe voll optimiert, und die Single-Point-Energien mit Elektronenkorrelation wurden auf der MP2/6-31G*//HF/6-31G*-Stufe erhalten. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wird die C2'-endo-Konformation von Desoxyguanosin als 0,6 kcal/mol stabiler eingeschätzt als die C3'-endo-Konformation in der Gasphase. Die konformationelle Bevorzugung der C2'-endogegenüber der C3'-endo-Konformation scheint weniger von der Elektronenkorrelation abzuhängen, wie die MP2/6-31G*//HF/6-31G*-Werte erkennen lassen, die auch denselben Unterschied bei der Energie voraussagen. Bei Riboguanosin wird der gegenläufige Trend festgestellt. Auf der HF/6-31G*- und der MP2/6-31G*//HF/6-31G*-Stufe zeigt sich die C3'-endo-Form von Riboguanosin um etwa 0,65 bzw. 1,41 kcal/mol stabiler als die C2'-endo-Form.
Tabelle 1 Relative Energien* der C3'-endo- und C2'-endo-Konformationen typischer Nukleoside

*Energien in kcal/mol bezogen auf die C2'-endo-Konformation

Tabelle 1 enthält auch die relativen Energien von 2'-O-Methylguanosin und 2'-S-Methylguanosin in C2'-endo- und C3'-endo-Konformation. Diese Daten zeigen, dass die elektronische Natur der C2'-Substitution eine bedeutende Auswirkung auf die relative Stabilität dieser Konformationen aufweist. Die Substitution mit der 2'-O-Methylgruppe erhöht die Bevorzugung der C3'-endo-Konformation (im Vergleich zu Riboguanosin) um etwa 0,4 kcal/mol sowohl auf der HF/6-31G*- als auch der MP2/6-31G*//HF/6-31G*-Stufe. Im Gegensatz dazu kehrt die 2'-S-Methylgruppe den Trend um. Die C2'-endo-Konformation ist auf der HF/6-31G*-Stufe um etwa 2,6 kcal/mol günstiger, während derselbe Unterschied auf der MP2/6-31G*//HF/6-31G*-Stufe auf 1,41 kcal/mol verringert ist. Zum Vergleich, und auch um die Genauigkeit der molekularmechanischen Kraftfeldparameter zu beurteilen, die für die 2'-O-Methyl- und 2'-S-Methyl-substituierten Nukleoside benutzt wurden, haben wir die Gasphasenenergien der Nukleoside berechnet. Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 angegeben sind, zeigen, dass die berechneten relativen Energien dieser Nukleoside qualitativ gut mit den ab-initio-Berechnungen übereinstimmen.
Zusätzliche Berechnungen wurden auch durchgeführt, um die Wirkung der Solvatation auf die relative Stabilität von Nukleosidkonformationen zu messen. Der geschätzte Solvatationseffekt unter Benutzung von HF/6-31G*-Geometrien bestätigt, dass die relative energetische Bevorzugung der vier Nukleoside in der Gasphase auch in der wässrigen Phase bewahrt ist (Tabelle 1). Solvatationseffekte wurden auch unter Benutzung molekulardynamischer Simulationen der Nukleoside in explizitem Wasser untersucht. Anhand dieser Trajektorien kann das Vorherrschen der C2'-endo-Konformation bei Desoxyriboguanosin und 2'-S-Methylriboguanosin festgestellt werden, während Riboguanosin und 2'-O-Methylriboguanosin die C3'-endo-Konformation bevorzugen. Diese Ergebnisse stehen in gutem Einklang mit den verfügbaren NMR-Ergebnissen für 2'-S-Methylribonukleosiden. NMR-Untersuchungen des Zuckerwellungsgleichgewichtes unter Benutzung vicinaler Spinkopplungskonstanten haben gezeigt, dass die Konformation des Zuckerringes in 2'-S-Methylpyrimidin-Nukleosiden einen S-Charakter von durchschnittlich > 75 aufweist, wohingegen die entsprechenden Purin-Analogen eine S-Wellung von durchschnittlich > 90 % aufweisen [Fraser, A., Wheeler, P., Cook, P. D. und Sanghvi, Y. S., J. Heterocycl. Chem., 1993, 30, 1.277 bis 1.287]. Es wurde festgestellt, dass die 2'-S-Methyl-Substitution in Desoxynukleosid der Zuckerkonformation im Vergleich mit Desoxyribonukleosiden mehr konformationelle Festigkeit verleiht.
Strukturelle Merkmale von DNA:RNA-, OMe_DNA:RNA- und SMe_DNA:RNA-Hybriden wurden ebenfalls untersucht. Die mittlere RMS-Abweichung der DNA:RNA-Struktur von den Ausgangshybridkoordinaten zeigt, dass die Struktur über die Dauer der Simulation hinweg mit einer angenäherten mittleren RMS-Abweichung 1,0 Å stabilisiert ist. Diese Abweichung ist zum Teil durch innewohnende Unterschiede in gemittelten Strukturen (d.h. der Ausgangskonformation) und Strukturen im thermischen Gleichgewicht bedingt. Die Änderungen der Zuckerwellungskonformation bei dreien der zentralen Basenpaare dieses Hybrids sind in guter Übereinstimmung mit den Beobachtungen, die bei vorherigen NMR-Untersuchungen gemacht wurden. Die Zucker in dem RNA-Strang bewahren sehr stabile Geometrien in der C3'-endo-Konformation mit Ringwellungswerten von nahezu 0°. Im Gegensatz dazu zeigen die Zucker des DNA-Stranges bedeutende Veränderlichkeit.
Die mittlere RMS-Abweichung der OMe_DNA:RNA beträgt gegenüber der Ausgangs-A-Form-Konformation etwa 1,2 Å, während die SMe_DNA:RNA gegenüber der Ausgangshybridkonformation eine etwas größere Abweichung (etwa 1,8 Å) zeigt. Der SMe_DNA-Strang zeigt auch eine größere Varianz der RMS-Abweichung, was nahelegt, dass die S-Methylgruppe strukturelle Schwankungen hervorrufen kann. Die Zuckerwellungen der RNA-Komplemente bewahren während der gesamten Simulation C3'-endo-Wellung. Wie von den Nukleosid-Berechnungen her erwartet wurde, werden jedoch bedeutende Unterschiede in der Wellung der OMe_DNA- und der SMe_DNA-Stränge festgestellt, wobei der erstgenannte eine C3'-endo- und der letztgenannte eine C1'-exo/C2'-endo-Konformation annehmen.
Auch ist für alle drei Hybridstrukturen eine Analyse der Helixparameter durchgeführt worden, um die Duplexkonformation weiter zu kennzeichnen. Drei der wichtigeren Achsen-Basenpaarparameter, durch die sich die verschiedenen Formen der Duplices unterscheiden, X-Verschiebung, Propellerverdrehung und Neigung, sind in Tabelle 2 angegeben. Eine X-Verschiebung von nahezu null ist gewöhnlich für einen B-Form-Duplex typisch, während eine negative Verschiebung, die ein direktes Maß für die Abweichung der Helix von der Helixachse ist, die Konformation der Struktur stärker A-förmig erscheinen lässt. In A-Form-Duplices variieren diese Werte typischerweise von –4 Å bis –5 Å. Beim Vergleichen dieser Werte von allen drei Hybriden zeigt das SMe_DNA:RNA-Hybrid die größte Abweichung von dem A-Form-Wert, die OMe_DNA:RNA zeigt die kleinste, und die DNA:RNA liegt dazwischen. Ein ähnlicher Trend ist ebenfalls augenscheinlich, wenn die Neigungs- und Propellerverdrehungswerte mit den Parametern der idealen A-Form verglichen werden. Diese Ergebnisse werden ferner durch eine Analyse des Rückgrats und der glycosidischen Torsionswinkel der Hybridstrukturen unterstützt. Glycosidische Winkel (X) von A-Form-Geometrien sind beispielsweise typischerweise in der Nähe von –159°, während B-Form-Werte in der Nähe von –102° liegen. Es wurde festgestellt, dass diese Winkel bei dem OMe_DNA-, DNA- bzw. SMe_DNA-Strang –162°, –133° bzw. –108° betragen. Alle RNA-Komplemente nehmen einen X-Winkel von nahezu –160° an. Außerdem wurden auch „Kurbelwellen"-Transitionen bei den Rückgrat-Torsionen der zentralen UpU-Stufen des RNA-Stranges in den SMe_DNA:RNA- und DNA:RNA-Hybriden festgestellt. Solche Transitionen legen nahe, dass örtliche Konformationsänderungen eintreten können, um eine ungünstigere Gesamtkonformation zu beseitigen. Insgesamt genommen zeigen die Ergebnisse, dass der Grad an A-Charakter in der Reihe OMe_DNA:RNA > DNA:RNA > SMe_DNA:RNA abnimmt, wobei die letzten beiden im Vergleich mit A- und B-Form-Geometrien in stärkerem Maße Zwischenkonformationen annehmen.
Tabelle 2 Mittlere Helixparameter, abgeleitet aus den letzten 500 ps der Simulationsdauer (anerkannte A- und B-Form-Werte sind zum Vergleich angegeben)
Die Stabilität von C2'-modifizierten DNA:RNA-Hybriden wurde bestimmt. Obwohl die Gesamtstabilität der DNA:RNA-Hybride von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich Sequenzabhängigkeiten und des Puringehaltes in den DNA- oder RNA-Strängen, sind DNA:RNA-Hybride gewöhnlich weniger stabil als RNA:RNA-Duplices und in einigen Fällen sogar weniger stabil als DNA:DNA-Duplices. Die verfügbaren experimentellen Daten schreiben die herabgesetzte Stabilität von DNA:RNA-Hybriden weitgehend dessen Zwischenkonformationsnatur zwischen DNA:DNA-(B-Familie)- und RNA:RNA-(A-Familie)-Duplices zu. Die thermodynamische Gesamtstabilität von Nukleinsäureduplices kann von verschiedenen Faktoren herrühren, einschließlich der Konformation des Rückgrats, Basenpaarungs- und Stapelwechselwirkungen. Obwohl es schwierig ist, die einzelnen thermodynamischen Beiträge zu der Gesamtstabilisierung des Duplexes festzustellen, ist es vernünftig zu argumentieren, dass die Hauptfaktoren, welche die erhöhte Stabilität von Hybridduplices begünstigen, bessere Stapelwechselwirkungen (elektrostatische [π]-[π]-Wechselwirkungen) und günstigere Furchenabmessungen für die Hydratisierung sind. Es ist gezeigt worden, dass die C2'-S-Methyl-Substitution den Hybridduplex destabilisiert. Die bemerkbaren Unterschiede der Anstiegswerte bei den drei Hybriden können eine gewisse Erklärung liefern. Während die 2'-S-Methylgruppe durch hohe Anstiegswerte (≈ 3,2 Å) einen starken Einfluss auf das Verringern der Basenstapelung aufweist, macht die 2'-O-Methylgruppe die Gesamtstruktur kompakter mit einem Anstiegswert, der dem von A-Form-Duplices gleich ist (≈ 2,6 Å). Trotz seiner insgesamt A-förmigen strukturellen Merkmale besitzt die SMe_DNA:RNA-Hybridstruktur einen mittleren Anstiegswert von 3,2 Å, der demjenigen von B-Familie-Duplices ziemlich nahe kommt. Tatsächlich kann festgestellt werden, dass einige örtliche Basenstufen (CG-Stufen) ungewöhnlich hohe Anstiegswerte aufweisen (sogar bis zu 4,5 Å). Daher kann die größere Destabilisierung von 2'-S-Methyl-substituierten DNA:RNA-Hybriden zum Teil schwachen Stapelungswechselwirkungen zugeschrieben werden.
Es ist postuliert worden, dass RNase-H an die kleine Furche von RNA:DNA-Hybridkomplexen bindet, was eine Zwischenweite der kleinen Furche zwischen idealer A- und B-Form-Geometrie erfordert, um Wechselwirkungen zwischen den Zuckerphosphat-Rückgratatomen und der RNase-H zu optimieren. Eine gründliche Untersuchung der gemittelten Strukturen der Hybridkomplexe unter Benutzung von Computersimulationen enthüllt eine bedeutende Variation der Weitenabmessungen der kleinen Furche, wie in Tabelle 3 gezeigt. Während die O-Methyl-Substitution im Vergleich zu dem normalen DNA:RNA-Komplex zu einer leichten Erhöhung der Weite der kleinen Furche führt, führt die S-Methyl-Substitution zu einer generellen Zusammenziehung (etwa 0,9 Å). Diese Änderungen sind höchstwahrscheinlich durch die bevorzugte Zuckerwellung bedingt, die bei den Antisense-Strängen wahrgenommen wird, die entweder A- oder B-förmige Einzelstrangkonformationen bewirkt. Außer auf Veränderungen der kleinen Furche weisen die Ergebnisse auch auf mögliche Unterschiede in der räumlichen Gestalt der kleinen Furche auf. Die O-Methyl-Gruppe zeigt in die kleine Furche, wohingegen die S-Methyl-Gruppe weg, zur großen Furche hin gerichtet ist. Wesentlichen ist die S-Methyl-Gruppe infolge der C2'-endo-Wellung durch die Basen in die große Furche umgekehrt.
Tabelle 3 Weite der kleinen Furche, gemittelt aus den letzten 500 ps der Simulationsdauer
Außer den oben beschriebenen Modifikationen können die Nukleotide der Oligonukleotide der Erfindung eine Vielfalt an anderen Modifikationen aufweisen, sofern diese anderen Modifikationen die oben beschriebenen Eigenschaften nicht bedeutend beeinträchtigen. Daher können Nukleotide, die in die Oligonukleotide der Erfindung eingebunden sind, Zuckerteile aufweisen, die natürlich vorkommenden Zuckern oder modifizierten Zuckern entsprechen. Zu typischen modifizierten Zuckern gehören carbocyclische oder acyclische Zucker, Zucker mit Substituentengruppen in ihrer 2'-Position, Zucker mit Substituentengruppen in ihrer 3'-Position und Zucker mit Substituenten anstelle eines oder mehrerer Wasserstoffatome des Zuckers. Andere veränderte Baseneinheiten und veränderte Zuckereinheiten sind in der US-Patentschrift Nr. 3,687,808 und der PCT-Anmeldung PCT/US89/02323 offenbart.
Zu veränderten Baseneinheiten oder veränderten Zuckereinheiten gehören auch andere Modifikationen, die mit dem Gedanken dieser Erfindung im Einklang stehen. Solche Oligonukleotide sind am besten als strukturell unterscheidbar von, dennoch funktionell untereinander austauschbar mit, natürlich vorkommenden oder synthetischen Wildtyp-Oligonukleotiden beschrieben. Alle solche Oligonukleotide sind von dieser Erfindung umfasst, sofern sie in wirksamer Weise dazu dienen, die Struktur eines gewünschten RNA- oder DNA-Stranges nachzuahmen. Zu einer Klasse typischer Basenmodifikationen gehört tricyclisches Cytosinanalog, bezeichnet als „G-Klammer" (Lin et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8.531). Dieses Analoge bildet vier Wasserstoffbrückenbindungen zu einem komplementären Guanin (G) innerhalb einer Helix aus, indem es gleichzeitig die Watson-Crick- und Hoogsteen-Flächen des G als Ziel erkennt. Wenn diese G-Klammer-Modifikation in Phosphorothioat-Oligonukleotide eingebunden ist, erhöht sie die Antisense-Stärke in Zellkultur drastisch. Die Oligonukleotide der Erfindung können auch Phenoxazinsubstituierte Basen des Typs umfassen, der von Flanagan et al., Nat. Biotechnol. 1999, 17(1), 48 bis 52 offenbart ist. Weitere Modifikationen können auch in anderen Positionen in dem Oligonukleotid, insbesondere in der 3'-Position des Zuckers am 3'-terminalen Nukleotid und der 5'-Position des 5'-terminalen Nukleosids vorgenommen werden. Beispielsweise ist in eine weitere Modifikation der Oligonukleotide der Erfindung das chemische Binden einer oder mehrerer Einheiten oder Konjugate an das Oligonukleotid einbezogen, welche die Aktivität, Zellverteilung oder Zellaufnahme des Oligonukleotids erhöhen. Zu solchen Einheiten gehören Lipid-Einheiten, wie z.B. eine Cholesterin-Einheit (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6.553), Cholsäure (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1.053), einen Thioether, z.B. Hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1993, 3, 2.765), ein Thiocholesterin (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), eine aliphatische Kette, z.B. Dodecandiol- oder Undecylreste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), ein Phospholipid, z.B. Di-hexadecyl-rac-glycerin oder Triethylammonium-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3.651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3.777), ein Polyamin oder eine Polyethylenglycol-Kette (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969) oder Adamantanessigsäure (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3.651), eine Palmityl-Einheit (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1.264, 229) oder eine Octadecylamin- oder Hexylamino-carbonyl-oxycholesterin-Einheit (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), sind aber nicht auf diese beschränkt.
Menschliche RNase-H1 weist eine starke Positionsbevorzugung bei der Spaltung auf, d.h. sie spaltet 8 bis 12 Nukleotide von dem 5'-RNA:3'-DNA-Terminus des Duplexes. Innerhalb des bevorzugten Spaltortes weist das Enzym eine mäßige Sequenzbevorzugung auf, wobei GU ein bevorzugtes Dinukleotid ist. Die RNA:DNA-Duplex-Mindestlänge, die Spaltung unterstützt, beträgt 6 Basenpaare, und die RNA:DNA-Mindest-„Lückengröße", die Spaltung unterstützt, beträgt 5 Basenpaare.
Eigenschaften gereinigter menschlicher RNase-H1
Die Auswirkungen unterschiedlicher Reaktionsbedingungen auf die Aktivität menschlicher RNase-H1 wurden beurteilt (1). Der optimale pH-Wert für das Enzym betrug sowohl in Tris-HCl- als auch in Phosphatpuffern 7,0 bis 8,0. Bei pH-Werten oberhalb von 8,0 war die Enzymaktivität verringert. Dies könnte jedoch durch die Instabilität des Substrats oder durch Einwirkungen auf das Enzym oder durch beides bedingt sein. Um den möglichen Beitrag von Änderungen der Ionenstärke auf die bei unterschiedlichen pH-Werten festgestellten Aktivitäten zu beurteilen, wurden zwei Puffer, NaHPO₄ und Tris-HCl, bei einem pH-Wert von 7,0 untersucht und ergaben die gleiche Enzymaktivität, obwohl die Ionenstärken unterschiedlich waren. Die Enzymaktivität wurde durch Erhöhen der Ionenstärke (1B) und durch N-Ethylmaleamid (1C) gehemmt. Die Enzymaktivität erhöhte sich, wenn die Temperatur von 25 auf 42 °C erhöht wurde (1D). Mg²⁺ stimulierte die Enzymaktivität, wobei die optimale Konzentration 1 mM betrug. In höheren Konzentrationen wirkte Mg²⁺ hemmend (1E). In der Gegenwart von 1 mM Mg²⁺ wirkte Mn²⁺ in allen geprüften Konzentrationen hemmend (1F). Das gereinigte Enzym war ziemlich stabil und leicht zu handhaben. Tatsächlich konnte das Enzym ohne bedeutenden Verlust an Aktivität gesiedet und rasch oder langsam abgekühlt werden (1D). Die Anfangsgeschwindigkeiten der Spaltung wurden für vier Duplexsubstrate gleichzeitig untersucht. Die Anfangsgeschwindigkeit der Spaltung bei einem Phosphodiester-DNA:RNA-Duplex betrug 1.050 ± 203 pmol·l^–1·min^–1 (Tabelle 4A). Die Anfangsgeschwindigkeit der Spaltung bei einem Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotid-Duplex war etwa viermal größer als diejenige desselben Duplexes, der ein Phosphodiester-Rntisense-Oligodesoxynukleotid umfasste (Tabelle 4A). Die Anfangsgeschwindigkeiten für 17-mer- und 20-mer-Substrate mit verschiedenen Sequenzen waren gleich (Tabelle 4B). Wenn jedoch ein 25-mer-Heteroduplex, der die 17-mer-Sequenz im Zentrum des Duplexes enthielt, verdaut wurde (RNA 3), war die Geschwindigkeit um 50 % höher. Interessant ist, dass die Km des Enzyms bei dem 25-mer-Duplex 40 % geringer war als diejenige bei dem 17-mer, während die Vmax bei beiden Duplices dieselbe waren (siehe Tabelle 6), was nahelegt, dass mit der Vergrößerung der Länge eine große Anzahl von Spaltorten verfügbar ist, was eine Erhöhung der Anzahl an produktiven Bindungswechselwirkungen zwischen dem Enzym und dem Substrat ergibt. Infolgedessen ist bei dem längeren Duplex eine niedrigere Substratkonzentration erforderlich, um eine Spaltgeschwindigkeit zu erzielen, die derjenigen bei dem kürzeren Duplex gleich ist.
Um die Substratspezifität menschlicher RNase-H1 besser zu kennzeichnen, wurden Duplices untersucht, in denen das Antisense-Oligonukleotid in der 2'-Position modifiziert war. Wie vorher für E.-coli-RNase-H1 beschrieben, war menschliche RNase-H1 nicht in der Lage, Substrate mit 2'-Modifikationen an dem Spaltort des Antisense-DNA-Stranges oder des Sense-RNA-Stranges zu spalten (Tabelle 5). Beispielsweise betrug die Anfangsgeschwindigkeit der Spaltung eines Duplexes, der ein Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotid und dessen Komplement enthielt, 3.400 pmol·l^–1·min^–1, während diejenige seines 2'-Propoxymodifizierten Analogen nicht nachweisbar war (Tabelle 5). Ein Duplex, der einen vollständig modifizierten 2'-Methoxy-Antisense-Strang umfasste, unterstützte ebenfalls keine Spaltung (Tabelle 5). Die Anordnung von 2'-Methoxy-Modifikationen um eine zentrale Region von Oligodesoxynukleotiden verringerte die Anfangsgeschwindigkeit (Tabelle 5). Je kleiner die zentrale Oligodesoxynukleotid-„Lücke" war, desto geringer war die Anfangsgeschwindigkeit. Das kleinste „Gapmer", bei dem die Spaltung gemessen werden konnte, war eine 5-Desoxynukleotid-Lücke. Diese Daten stimmen in hohem Maße mit Beobachtungen überein, die wir früher für E.-coli-RNase-H1 beschrieben haben, mit der Ausnahme, dass die Mindest-Lückengröße für das bakterielle Enzym 4 Desoxynukleotide betrug.
Die Km und die Vmax von menschlicher RNase-H1 für drei Substrate sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Km-Werte für alle drei Substrate waren wesentlich niedriger als diejenigen von E.-coli-RNase-H1 (Tabelle 6). Wie vorher für E.-coli-RNase-H1 angegeben, war die Km bei einem Phosphorothioathaltigen Duplex niedriger als diejenige bei einem Phosphodiester-Duplex. Die Vmax des menschlichen Enzyms war 30-fach geringer als diejenige des E.-coli-Enzyms. Die Vmax bei dem Phosphorothioat-haltigen Substrat war niedriger als bei dem Phosphodiester-Duplex. Dies ist wahrscheinlich durch die Hemmung des Enzyms bei höheren Konzentrationen durch überschüssiges einsträngiges Phosphorothioat-Oligonukleotid bedingt, da die Anfangsgeschwindigkeit der Spaltung bei einem Phosphorothioat-haltigen Duplex in der Tat größer als bei dem Phosphodiester war (Tabelle 4).
Bindungsaffinität und -spezifität
Um die Bindungsaffinität menschlicher RNase-H1 zu beurteilen, wurde ein kompetitiver Spaltungsassay angewendet, bei dem zunehmende Konzentrationen nichtspaltbarer Substrate zugegeben wurden. Bei Benutzung dieses Ansatzes ist die Ki formell gleichwertig der Ki für die kompetierenden Substrate. Lineweaver-Burk-Analysen zeigten, dass von den untersuchten nichtspaltbaren Substraten, alle Hemmstoffe, die in Tabelle 7 gezeigt sind, kompetitiv waren (Daten nicht dargestellt). Ein Duplex, der ein Phosphodiester-Oligodesoxynukleotid enthielt, hybridisierte mit einem Phosphodiester-2'-methoxy-Oligonukleotid, da das nichtspaltbare Substrat als DNA:RNA am ähnlichsten angesehen wird. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchungen und vergleicht sie mit vorher angegebenen Ergebnissen für das E.-coli-Enzym solcher, die unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt wurden. Es ist deutlich, dass die Affinität des menschlichen Enzyms zu seinem DNA:RNA-artigen Substrat (DNA:2'-O-Me) wesentlich größer war als diejenige des E.-coli-Enzyms, was mit den Unterschieden bei Km im Einklang steht (Tabelle 6).
E.-coli-RNase-H1 weist etwa die gleiche Affinität zu RNA:RNA-, RNA:2'-O-Me- und DNA:2'-O-Me-Duplices auf (Tabelle 7). Das menschliche Enzym weist ähnliche Bindungseigenschaften auf, ist jedoch stärker befähigt, zwischen verschiedenen Duplices zu unterscheiden. Beispielsweise war die Kd für RNA:RNA etwa 5-fach niedriger als die Kd für DNA:2'-O-Me. Dies ist ferner durch die Kd für den RNA:2'-F-Duplex gezeigt. Die Kd bei dem DNA:2'-F-Duplex war leicht größer als diejenige bei dem RNA:2'-F-Duplex und dem RNA:RNA-Duplex, aber deutlich niedriger als bei anderen Duplices. Somit können beide Enzyme als doppelsträngige, RNA-bindende Proteine angesehen werden. Menschliche RNase-H1 ist jedoch etwas weniger spezifisch für Duplices im Vergleich zu einsträngigen Oligonukleotiden als das E.-coli-Enzym. Das Enzym band an einsträngige RNA und DNA 20-fach weniger gut als an einen RNA:RNA-Duplex, während das E.-coli-Enzym an einsträngige DNA fast 600-fach weniger als an einen RNA:RNA-Duplex band (Tabelle 7). Die Affinität eines einsträngigen Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotids zu beiden Enzymen stand in signifikantem Verhältnis zu der Affinität zu dem natürlichen Substrat und bedingt die Hemmung der Enzyme durch Angehörige dieser Klasse von Oligonukleotiden. Bemerkenswert ist, dass menschliche RNase-H1 die größte Affinität zu einem einsträngigen Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotid aufwies. Somit ist dieses nichtspaltbare Substrat ein sehr wirkungsvoller Hemmer des Enzyms, und überschüssiger Phosphorothioat-Antisense-Wirkstoff in Zellen könnte stark hemmend wirken.
Orts- und Sequenzbevorzugung bei der Spaltung
2 zeigt das Spaltungsmuster für RNA im Duplex mit seinem Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotid und das Muster für mehrere Gapmere. Bei dem Elternduplex erfolgte die RNA-Spaltung an einem einzelnen Hauptort, wobei Nebenspaltung an mehreren Orten 3' zu diesem Haupt-Spaltort wahrgenommen wurde, der 8 Nukleotide von dem 5'-Terminus der RNA war. Beachte, dass der bevorzugte Ort an einem GU-Dinukleotid war. Die Spaltung mehrerer „Gapmere" erfolgte langsamer, und der Haupt-Spaltort war in einer anderen Position als beim Eltern-Duplex. Im Gegensatz zu den Beobachtungen, die wir für E.-coli-RNase-H1 gemacht haben, trat ferner der Haupt-Spaltort in Gapmeren, die mit menschlicher RNase-H1 behandelt wurden, in dem Nukleotid nicht auf, das dem Nukleotid hinzugefügt war, dass dem ersten 2'-Methoxy-Nukleotid in dem Flügel, der mit dem 3'-Teil der RNA hybridisiert war, benachbart ist.
Um die Orts- und Sequenzspezifitäten menschlicher RNase-H1 zu beurteilen, wurde die Spaltung von Substraten, gezeigt in 3 und 4, untersucht. In 3 ist die Sequenz der RNA unter den Sequenzierungsgelen gezeigt, und die Länge und Position des komplementären Phosphodiester-Oligodesoxynukleotids sind durch die durchgezogene Linie unter der RNA-Sequenz angezeigt. Diese Figur zeigt mehrere wichtige Eigenschaften des Enzyms. Erstens war der Haupt-Spaltort durchweg 8 bis 9 Nukleotide von dem 5'-RNA:3'-DNA-Terminus des Duplexes, ungeachtet ob einsträngige 5'- oder 3'-RNA-Überhänge vorhanden waren. Zweitens war das Enzym wie E.-coli-RNase-H1 in der Lage, einsträngige Regionen von RNA in Nachbarschaft zu dem 3'-Terminus eines RNA:DNA-Duplexes zu spalten. Drittens betrug die Duplex-Mindestlänge, die jede Spaltung unterstützt, etwa 6 Nukleotide. RNase-Schutzassays wurden benutzt, um zu bestätigen, dass die kürzeren Duplices unter den Bedingungen des Assays vollständig hybridisiert wurden, sodass die festgestellten Unterschiede nicht durch das Versagen beim Hybridisieren bedingt waren. Um sicherzustellen, dass der 6-Nukleotid-Duplex vollständig hybridisiert wurde, wurden die Reaktionen bei einem DNA:RNA-Verhältnis von 50:1 durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Viertens zeigt die Figur, dass bei Duplices, die kleiner als die neun Basenpaare sind, je kleiner der Duplex ist, desto kleiner die Spaltungsgeschwindigkeit ist. Fünftens befand sich der bevorzugte Spaltort an einem GU-Dinukleotid.
Die Orts- und Sequenzspezifitäten sind in 4 weiter untersucht. Dass das Enzym geringe Sequenzbevorzugung aufweist, ist durch Vergleichen der Geschwindigkeiten und Orte der Spaltung bei den Duplices A, C und D gezeigt. In allen Fällen war der bevorzugte Ort der Spaltung, ungeachtet der Sequenz, 8 bis 12 Nukleotide von dem 5'-RNA:3'-DNA-Terminus des Duplexes. Der Vergleich des Spaltungsmusters bei den Duplices A und B zeigt, dass die Spaltung an der Nukleotidposition 8 bis 12 erfolgte, selbst wenn RNA-Überhänge vorhanden waren, wie auch in 3 gezeigt. Die Spaltung von Duplex F zeigte, dass der Spaltort beibehalten wurde, selbst wenn 5'- und 3'-DNA-Überhänge vorhanden waren. In einem längeren Substrat, Duplex G, war der Haupt-Spaltort immer noch 8 bis 12 Nukleotide von dem Terminus des Duplexes. Jedoch wurden Neben-Spaltorte in der gesamten RNA festgestellt, was nahelegt, dass dieses Substrat das Binden von mehr als einem Enzymmolekül pro Substrat unterstützen könnte, dass aber der bevorzugte Ort nahe bei dem 5'-RNA:3'-DNA-Terminus war. Abschließend schien optimale Spaltung zu erfolgen, wenn ein GU-Dinukleotid sich 8 bis 12 Nukleotide von dem 5'-RNA:3'-DNA-Terminus des Duplexes befand.
Um sowohl den Mechanismus der Spaltung als auch die Prozessivität der Spaltung anzugehen, wurde die Spaltung von 5'-markierten und 3'-markierten Substraten verglichen (5). Zeile C zeigt, dass die CIP-Behandlung vor und nach der Verdauung mit menschlicher RNase-H1 eine Veränderung der Beweglichkeit der verdauten Fragmente ergab, was nahelegt, dass menschliche RNase-H1 Spaltprodukte mit 5'-Phosphaten erzeugt. Somit ist sie in dieser Hinsicht E.-coli-RNase-H1 ähnlich. Eine zweite verblüffende Beobachtung ist, dass die Anfügung von pC an das 3'-Ende der RNA eine Veränderung der Position des bevorzugten Spaltortes verursachte (A zu B oder C). Die vier Spaltorte in dem Zentrum des Duplexes, die mit einer 5'-Phosphat-markierten RNA festgestellt wurden, wurden in 3'-pC-markierten Substraten festgestellt. Der Haupt-Spaltort verschob sich jedoch vom Basenpaar 8 zum Basenpaar 12. Interessanterweise war die Sequenz an beiden Orten GU. Daher ist es denkbar, dass das Enzym eine Position 8 bis 12 Nukleotide von dem 5'-RNA:3'-DNA-Terminus wählt, dann an einem bevorzugten Dinukleotid wie GU spaltet. Drittens zeigt diese Figur unter Berücksichtung der Spaltungsmuster, die in 3 und 4 gezeigt sind, dass dieses Enzym minimale Prozessivität in entweder der 5'- oder 3'-Richtung aufweist. Zu keinem Zeitpunkt im Verlaufe des Experimentes unter Benutzung eines beliebigen Substrates haben wir ein Muster beobachtet, dass mit Prozessivität im Einklang steht. Die Möglichkeit, dass der Misserfolg, in 3 und 4 Prozessivität festzustellen, durch Prozessivität in der 3'- bis 5'-Richtung bedingt war, ist durch die Ergebnisse in 5 ausgeschlossen. Dies unterscheidet sich wiederum stark von Beobachtungen, die wir vorher für E.-coli-RNase-H1 beschrieben haben.
Allgemeine Eigenschaften der Aktivität menschlicher RNase-H1
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Eigenschaften menschlicher RNase-H1, die gekennzeichnet worden sind. Da das untersuchte Protein ein His-Tag-Fusionsprotein ist und denaturiert und rückgefaltet war, ist es möglich, dass die Aktivität des Enzyms in seinem nativen Zustand größer ist, als wir festgestellt haben. Die Grundeigenschaften werden natürlich voraussichtlich die Grundeigenschaften des nativen Enzyms widerspiegeln. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass ein His-Tag die Proteinfaltung und -kristallisation, die kinetischen und katalytischen Eigenschaften oder die Nukleinsäure-Bindungseigenschaften nicht stört, da es sehr klein ist (einige wenige Aminosäuren) und sein pK-Wert nahezu neutral ist. In der vorliegenden Erfindung ist gezeigt, dass das His-Tag-Fusionsprotein sich wie andere RNasen-H verhält. Es spaltete spezifisch den RNA-Strang in RNA:DNA-Duplices, ergab Spaltprodukte mit 5'-Phosphat-Termini (5) und wurde von zweiwertigen Kationen beeinflusst (1). Die optimalen Bedingungen für menschliche RNase-H1 waren denjenigen für E.-coli-RNase-H1 ähnlich, aber nicht identisch damit. Für das menschliche Enzym betrug das Mg²⁺-Optimum 1 mM, und 5 mM Mg²⁺ wirkten hemmend. In der Gegenwart von Mg²⁺ wurden beide Enzyme von Mn²⁺ gehemmt. Das menschliche Enzym wurde durch n-Ethylmaleimid gehemmt und war ziemlich stabil, leicht zu handhaben und bildete keine multimeren Strukturen (1). Die Leichtigkeit der Handhabung, Denaturierung, Rückfaltung und Stabilität unter verschiedenen Bedingungen legen nahe, dass die menschliche RNase-H1 als ein Monomer aktiv war und eine verhältnismäßig stabile bevorzugte Konformation aufweist.
Untersuchungen der Struktur und der enzymatischen Aktivitäten einer Anzahl von Mutanten von E.-coli-RNase-H1 haben jüngst zu einer Hypothese geführt, um die Auswirkungen zweiwertiger Kationen zu erklären, Aktivierungs/Schwächungs-Modell genannt. Die Auswirkungen zweiwertiger Kationen auf menschliche RNase-H1 sind komplex und stehen im Einklang mit dem vorgeschlagenen Aktivierungs/Schwächungs-Modell. Die Aminosäuren, die vorgeschlagen wurden, in beide Kationenbindungsorte einbezogen zu sein, sind in menschlicher RNase-H1 konserviert.
Positions- und Sequenzbevorzugungen und Prozessivität
Die Orts- und die Sequenzspezifität menschlicher RNase-H1 unterscheiden sich wesentlich von denjenigen von E.-coli-RNase-H1. Obwohl keines der Enzyme bedeutende Sequenzspezifität aufweist (2 bis 5 dieses Manuskripts), weist das menschliche Enzym bemerkenswerte Ortsspezifität auf. Die 2 bis 4 zeigen, dass menschliche RNase-H1 bevorzugt 8 bis 12 Nukleotide 3' von dem 5'-RNA:3'-DNA-Terminus eines DNA:RNA-Duplexes spaltete, ungeachtet ob 5'- oder 3'-RNA- oder -DNA-Überhänge vorhanden waren. Das Verfahren, durch das eine Position ausgewählt wird und dann innerhalb dieser Position an dem Duplex ein bestimmtes Dinukleotid vorzugsweise gespalten wird, muss verhältnismäßig komplex und von der Sequenz beeinflusst sein. Es ist deutlich, dass das Dinukleotid, GU, eine bevorzugte Sequenz ist. In 3 enthielten beispielsweise alle Duplices eine GU-Sequenz in der Nähe der optimalen Position für das Enzym, und in allen Fällen war der bevorzugte Spaltort GU. Außerdem wurde in den Duplices A und B auch ein zweites GU gespalten, obwohl mit einer sehr kleinen Geschwindigkeit. Der dritte gespaltete Ort in den Duplices A und B war ein GG-Dinukleotid, 7 Basenpaare von dem 3'-RNA:5'-DNA-Terminus. Somit legen die Daten nahe, dass das Enzym eine starke Positionsbevorzugung aufweist und innerhalb des geeigneten Ortes, eine leichte Bevorzugung von GU-Dinukleotiden.
Die starke Positionsbevorzugung, die menschliche RNase-H1 aufweist, legt nahe, dass das Enzym seine Position in dem Duplex über den 5'-RNA:3'-DNA-Terminus festlegt. Interessanterweise ist das in-vitro-Spaltungsmuster, dass bei dem Enzym festgestellt wurde, mit seiner vorgeschlagenen Rolle in vivo vereinbar, nämlich dem Entfernen von RNA-Primern während der DNA-Replikation des Folgestranges. Die durchschnittliche Länge des RNA-Primers liegt in dem Bereich von 7 bis 14 Nukleotiden. Infolgedessen ergibt die Synthese des Folgestranges chimäre Sequenzen, die aus 7 bis 14 Ribonukleotiden an dem 5'-Terminus mit angrenzenden Ausdehnungen von DNA, die sich in die 3'-Richtung erstrecken, bestehen. Die Positionsbevorzugung, die bei menschlicher RNase-H1 festgestellt wurde (d.h. 8 bis 12 Reste von dem 5'-Terminus der RNA), würde nahelegen, dass die Spaltung des chimären Folgestranges durch RNase-H1 an der RNA:DNA-Verbindungsstelle oder in deren Nähe erfolgen würde. Es ist gezeigt worden, dass das Entfernen restlicher Ribonukleotide im Anschluss an die RNase-H-Verdauung durch die Endonuklease FEN1 erfolgt.
4 sorgt für zusätzliche Einsicht in die Positions- und Sequenzbevorzugungen des Enzyms. Wenn ein GU-Dinukleotid in der richtigen Position in dem Duplex gegenwärtig war, wurde es vorzugsweise gespalten. Wenn ein GU-Dinukleotid abwesend war, wurden AU ebenso wie andere Dinukleotide gespalten. Bei dem Duplex G waren sowohl ein GU- als auch ein GG-Dinukleotid innerhalb des bevorzugten Ortes gegenwärtig, und in diesem Fall wurde das GG-Dinukleotid etwas weitergehend gespalten als das GU-Nukleotid. Es ist klar, dass weitere Duplices mit verschiedenen Sequenzen untersucht werden müssen, bevor endgültige Schlussfolgerungen bezüglich der Rollen verschiedener Sequenzen innerhalb der bevorzugten Spaltorte gezogen werden können.
In 5 war der 3'-Terminus der RNA mit ³²pC markiert. In diesem Fall wurden dieselben vier Nukleotide gespalten wie bei 5'-Markierung der RNA (5, Tafel B und C). Das GU, das näher bei dem 3'-Terminus der RNA war, wurde jedoch wenigstens genau so schnell gespalten wie das 5'-GU. Interessanterweise wurden in Untersuchungen am teilweise gereinigten Enzym Unterschiede im Spaltungsmuster auch festgestellt, wenn die 5'-markierten Substrate mit 3'-markierten Substraten verglichen wurden. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist, dass die Gegenwart eines 3'-Phosphats an einem Oligonukleotid-Substrat den Abtastmechanismus beeinflusst, den das Enzym benutzt, um bevorzugte Positionen für die Spaltung auszuwählen.
In einem Duplex, der RNA umfasst, die an ein chimäres Oligonukleotid mit einem Oligodesoxynukleotid-Zentrum, das von 2'-modifizierten Nukleotidflügeln flankiert ist, angelagert ist, war die Spaltung durch menschliche RNase-H1 auf den DNA:RNA-Teil des Duplexes gerichtet, so wie es bei E.-coli-RNase-H1 beobachtet wurde. Innerhalb dieser Region sind die bevorzugten Spaltorte des menschlichen Enzyms jedoch verschieden von denjenigen von E.-coli-RNase-H1. E.-coli-RNase-H1 spaltete vorzugsweise an dem Ribonukleotid, das an das erste 2'-modifizierte Nukleotid in dem Flügel des Antisense-Oligonukleotids an dem 3'-Ende der RNA angefügt war. Im Gegensatz dazu spaltete das menschliche Enzym vorzugsweise an mehr im Zentrum befindlichen Orten innerhalb der Lücke, bis die Lücke auf 5 Nukleotide verringert war. Ferner betrug die Lücken-Mindestgröße für das menschliche Enzym 5 Nukleotide, wohingegen diejenige für E.-coli-RNase-H1 4 Nukleotide betrug. Diese Unterschiede im Verhalten legen Unterschiede in den Strukturen der Enzyme und deren Wechselwirkungen mit Substrat nahe, die weiterer Untersuchung bedürfen.
Obwohl E.-coli-RNase-H1 das Heteroduplexsubstrat in einer vorwiegend distributiven Weise abbaut, weist das Enzym mäßige 5'-3'-Prozessivität auf. Im Gegensatz dazu zeigt menschliche RNase-H1 keine 5'-3'- oder 3'-5'-Prozessivität, was nahelegt, dass das menschliche Enzym das Substrat in einer ausschließlich distributiven Weise hydrolysiert. Das Fehlen von Prozessivität, das bei der menschlichen RNase-H1 festgestellt wird, kann eine Wirkung der bedeutend höheren Bindungsaffinität (Tabelle 7) sein, wodurch die Fähigkeit des Enzyms, sich auf dem Substrat zu bewegen, verringert ist. Alternativ scheint menschliche RNase-H1 seine Position auf dem Substrat auf den 5'-RNA:3'-DNA-Terminus bezogen zu fixieren, und diese starke Positionsbevorzugung kann die Spaltung des Substrates in einer prozessiven Weise verhindern (5). Trotz der Tatsache, dass beide Enzyme von Metall abhängige Endonukleasen sind, die Spaltprodukte mit 5'-Phosphaten ergeben (5), und beide einsträngige 3'-RNA-Überhänge spalten können (5), weisen diese Enzyme somit wesentliche Unterschiede auf.
Es ist vorgeschlagen worden, dass E.-coli-RNase-H1 hinsichtlich der RNA des Substrates „Bindungsdirektionalität" aufweisen solle, derart, dass die primäre Bindungsregion des Enzyms mehrere Nukleotide 5' zu dem katalytischen Zentrum angeordnet ist. Dies führt dazu, dass Spaltorte von dem 5'-RNA:3'-DNA-Ende eines Duplexes abgegrenzt sind und dass Spaltorte an dem 3'-RNA:5'-DNA-Ende des Duplexes und in 3'-Einzelstrangüberhängen vorkommen. Das menschliche Enzym verhält sich völlig analog. Daher ziehen wir die Schlussfolgerung, dass menschliche RNase-H1 wahrscheinlich die gleiche Bindungsdirektionalität wie das E.-coli-Enzym aufweist.
Substratbindung
Von RNA:RNA-Duplices ist gezeigt worden, dass sie eine A-Form-Konformation annehmen. Viele 2'-Modifikationen verschieben die Zuckerkonformation in eine 3'-endo-Wellung, die für RNA kennzeichnend ist. Folglich ist bei Hybridisierung mit RNA der sich ergebende Duplex von der „A"-Form, und dies äußert sich in einem stabileren Duplex. 2'-F-Oligonukleotide weisen duplexbildende Eigenschaften auf, die denjenigen von RNA am ähnlichsten sind, wohingegen 2'-Methoxy-Oligonukleotide Duplices mit einer Zwischenkonformation zwischen DNA:RNA- und RNA:RNA-Duplices ergeben.
Die Ergebnisse, die in Tabelle 7 gezeigt sind, zeigen, dass die menschliche RNAse-H1 wie das E.-coli-Enzym ein Protein ist, das doppelsträngige RNA bindet. Zudem weist sie eine gewisse Fähigkeit auf, zwischen verschiedenen A-Form-Duplices zu unterscheiden (Tabelle 7). Die Beobachtung, dass die Kd bei einem RNA:2'-F-Duplex gleich derjenigen bei einem RNA:RNA-Duplex ist, legt nahe, dass die 2'-Hydroxygruppe nicht zum Binden an das Enzym erforderlich ist. Dennoch können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass voluminösere 2'-Modifikationen, z.B. 2'-Methoxy oder 2'-Propyl, das Binden des Enzyms sterisch hemmen sowie die A-F-Eigenschaft des Duplexes verändern könnten. Das menschliche Enzym weist eine wesentlich größere Affinität zu allen Oligonukleotiden auf als das E.-coli-Enzym, und dies ist durch eine niedrigere Km für spaltbare Substrate widergegeben (Tabelle 6 und 7). Außerdem kann die höhere Bindungsaffinität, die bei der menschlichen RNase-H1 festgestellt wird, für die im Vergleich mit dem E.-coli-Enzym 20-fach geringere Vmax verantwortlich sein. In diesem Fall, unter der Annahme, dass das E.-coli- und das menschliche Enzym ähnliche Katalysegeschwindigkeiten (Kcat) aufweisen, würde dann eine Erhöhung der Bindungsaffinität zu einer niedrigeren Umsatzgeschwindigkeit und letztendlich einer niedrigeren Vmax führen.
Es wird angenommen, dass der Haupt-Substratbindungsort in E.-coli-RNase-H1 ein Cluster von Lysinen ist, von denen man glaubt, dass sie an die Phosphate des Substrates binden. Es wird angenommen, dass die Wechselwirkung zwischen der Bindungsoberfläche des Enzyms und dem Substrat innerhalb der kleinen Furche erfolgt. Diese Region ist in dem menschlichen Enzym in hohem Maße konserviert. Außerdem enthalten eukaryotische Enzyme eine extra-N-terminale Region mit variabler Länge, die eine Fülle an basischen Aminosäuren enthält. Diese Region ist homolog zu einem doppelsträngigen RNA-Bindungsmotiv, und tatsächlich ist gezeigt worden, dass S.-cerevasiae-RNase-H an doppelsträngige RNA bindet. Die N-terminale Verlängerung ist bei menschlicher RNase-H1 länger als in dem S.-cerevasiae-Enzym und scheint einem vollständigeren doppelsträngigen RNA-Bindungsmotiv zu entsprechen. Folglich kann das verstärkte Binden menschlicher RNase-H1 an verschiedene Nukleinsäuren durch die Gegenwart dieses zusätzlichen Bindungsortes bedingt sein.
Wie hierin benutzt, umfasst der Ausdruck „Alkyl" – ist aber nicht beschränkt auf – geradkettige, verzweigtkettige und cyclische ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Methyl-, Ethyl- und Isopropylgruppen. Alkylgruppen der vorliegenden Erfindung können substituiert sein. Typische Alkylsubstituenten sind in der US-Patentschrift Nr. 5,212,295 in Spalte 12, Zeile 41 bis 50 offenbart, die durch Bezugnahme hiermit in ihrer Gesamtheit eingebunden ist.
Erfindungsgemäß sind Alkenylgruppen geradkettige, verzweigtkettige und cyclische Kohlenwasserstoffgruppen, die wenigstens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten, und sind Alkinylgruppen geradkettige, verzweigtkettige und cyclische Kohlenwasserstoffgruppen, die wenigstens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthalten. Alkenyl- und Alkinylgruppen der vorliegenden Erfindung können substituiert sein.
Arylgruppen sind substituierte und unsubstituierte aromatische, cyclische Einheiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Phenyl-, Naphthyl-, Anthracyl-, Phenanthryl-, Pyrenyl- und Xylylgruppen. Alkarylgruppen sind diejenigen, in denen eine Aryleinheit eine Alkyleinheit mit einer Kernstruktur verbindet, und Aralkylgruppen sind diejenigen, in denen eine Alkyleinheit eine Aryleinheit mit einer Kernstruktur verbindet.
Allgemein bezeichnet der Ausdruck „hetero" ein Atom, das ein anderes als Kohlenstoff ist, vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, N, O oder S. Demgemäß bezeichnet der Ausdruck „heterocyclischer Ring" ein Ringsystem auf Basis von Kohlenstoff mit einem oder mehreren Heteroatomen (d.h. Nichtkohlenstoffatomen). Zu bevorzugten heterocyclischen Ringen gehören beispielsweise Imidazol-, Pyrrolidin-, 1,3-Dioxan-, Piperazin-, Morpholinringe, sind aber nicht auf diese beschränkt. Wie hierin benutzt, bezeichnet der Ausdruck „heterocyclischer Ring" auch ein Ringsystem mit einer oder mehreren Doppelbindungen und einem oder mehreren Heteroatomen. Zu bevorzugten heterocyclischen Ringen gehört beispielsweise der Pyrrolidinoring; sie sind aber nicht auf diesen beschränkt.
Erfindungsgemäße Oligonukleotide, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisierbar sind, umfassen vorzugsweise etwa 5 bis etwa 50 Nukleoside. Stärker bevorzugt ist, dass solche Verbindungen etwa 8 bis etwa 30 Nukleoside umfassen, wobei 15 bis 25 Nukleoside besonders bevorzugt sind. Wie hierin benutzt, ist eine Ziel-Nukleinsäure eine beliebige Nukleinsäure, die mit einer komplementären nukleinsäureartigen Verbindung hybridisieren kann. Ferner soll im Zusammenhang mit dieser Erfindung „Hybridisierung" Wasserstoffbrückenbindung bedeuten, die eine Watson-Crick-, Hoogsteen-, oder Reverse-Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Nukleobasen sein kann. „Komplementär", wie hierin benutzt, bezieht sich auf die Fähigkeit zur genauen Paarbildung zwischen zwei Nukleobasen. Beispielsweise sind Adenin und Thymin komplementäre Nukleobasen, welche sich durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen paaren. „Komplementär" und „spezifisch hybridisierbar", wie hierin benutzt, beziehen sich auf die genaue Paarbildung oder Sequenzkomplementarität eines ersten mit einem zweiten nukleinsäureartigen Oligomer, die Nukleosid-Untereinheiten enthalten. Wenn beispielsweise eine Nukleobase in einer bestimmten Position der ersten Nukleinsäure in der Lage ist, Wasserstoffbrückenbindung mit einer Nukleobase in derselben Position der zweiten Nukleinsäure einzugehen, dann werden die erste Nukleinsäure und die zweite Nukleinsäure in dieser Position als komplementär zueinander angesehen. Die erste und die zweite Nukleinsäure sind komplementär zueinander, wenn eine ausreichende Anzahl von entsprechenden Positionen in jedem Molekül mit Nukleobasen besetzt ist, die mit einander Wasserstoffbrückenbindung eingehen können. Somit sind „spezifisch hybridisierbar" und „komplementär" Ausdrücke, die benutzt werden, um einen ausreichenden Grad an Komplementarität anzuzeigen, derart, dass stabile und spezifische Bindung zwischen einer Verbindung der Erfindung und einem Ziel-RNA-Molekül erfolgt. Es versteht sich, dass eine oligomere Verbindung der Erfindung nicht zu 100 % komplementär zu ihrer Ziel-RNA-Sequenz zu sein braucht, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Eine oligomere Verbindung ist spezifisch hybridisierbar, wenn das Binden der oligomeren Verbindung an das Ziel-RNA-Molekül unter Verursachung eines Verlustes an Nützlichkeit die normale Wirkungsweise der Ziel-RNA stört und ein ausreichender Grad an Komplementarität vorhanden ist, um unspezifisches Binden der oligomeren Verbindung an Nichtziel-Sequenzen unter Bedingungen, unter denen spezifisches Binden erwünscht ist, d.h. unter physiologischen Bedingungen im Falle von in-vivo-Assays oder therapeutischer Behandlung oder im Falle von in-vitro-Assays, unter Bedingungen, unter denen die Assays durchgeführt werden, zu verhindern.
Wie hierin benutzt, beziehen sich „menschliche Typ-2-RNase-H" und „menschliche RNase-H1" auf dasselbe menschliche RNase-H-Enzym. Demgemäß sollen diese Ausdrücke untereinander austauschbar benutzt werden.
Die Oligonukleotide der Erfindung können in der Diagnose, der Therapeutik und als Forschungsreagenzien und -Kits benutzt werden. Sie können in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Einbeziehen eines geeigneten pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittels oder Trägers benutzt werden. Sie können ferner zum Behandeln von Organismen benutzt werden, die eine Krankheit aufweisen, die durch die unerwünschte Produktion eines Proteins gekennzeichnet ist. Der Organismus sollte mit einem Oligonukleotid mit einer Sequenz kontaktiert werden, das in der Lage ist, spezifisch mit einem Strang von Nukleinsäure zu hybridisieren, die für das unerwünschte Protein codiert. Behandlungen dieses Typs können an einer Vielfalt von Organismen vorgenommen werden, die von einzelligen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen bis zu vielzelligen eukaryotischen Organismen reicht. Jeder Organismus, der DNA-RNA-Transkription oder RNA-Protein-Translation als einen grundlegenden Teil seiner hereditären, metabolischen oder zellulären Steuerung benutzt, ist für die erfindungsgemäße therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung empfänglich. Anscheinend können verschiedenartige Organismen, wie z.B. Bakterien, Hefe, Protozoen, Algen, alle Pflanzen und alle höheren Tierformen einschließlich warmblütiger Tiere, behandelt werden. Ferner kann jede Zelle von vielzelligen Eukaryoten behandelt werden, da in diese sowohl DNA-RNA-Transkription als auch RNA-Protein-Translation als wesentliche Bestandteile ihrer Zellaktivität einbezogen sind. Zudem sind in viele der Organellen (z.B. Mitochondrien und Chloroplasten) eukaryotischer Zellen auch Transkriptions- und Translationsmechanismen einbezogen. Somit können einzelne Zellen, Zellpopulationen oder Organellen ebenfalls in die Definition von Organismen, die mit therapeutischen oder diagnostischen Oligonukleotiden behandelt werden können, einbezogen werden.
Die folgenden nichteinschränkenden Beispiele sind bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
5'-O-DMT-2'-O-(2-methoxyethyl)-5-methyluridin und 5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methyluridin
2',3'-O-Dibutylstannylen-5-methyluridin (345 g) (hergestellt gemäß Wagner et al., J. Org. Chem., 1974, 39, 24) wurde in der Gegenwart von Tetrabutylammoniumiodid (235 g) in DMF (3 l) bei 70 °C mit 2-Methoxyethylbromid (196 g) alkyliert; es wurde ein Gemisch aus 2'-O- und 3'-O-(2-Methoxyethyl)-5-methyluridin (150 g) in einem Isomerenverhältnis von nahezu 1:1 erhalten. Das Gemisch wurde mit DMT-chlorid (110 g, DMT-Cl) in Pyridin (1 l) behandelt und ergab ein Gemisch der 5'-O-DMT-Nukleoside. Nach der normalen Aufarbeitung wurden die Isomere durch Silicagel-Säulenchromatographie getrennt. Das 2'-Isomer eluierte zuerst, gefolgt von dem 3'-Isomer.
BEISPIEL 2
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methyluridin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methyluridin (5 g, 0,008 mol) wurde in CH₂Cl₂ (30 ml) gelöst, und dieser Lösung wurden unter Argon Diisopropylaminotetrazolid (0,415 g) und 2-Cyanoethoxy-N,N-diisopropyl-phosphoramidit (3,9 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösemittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde auf eine Silicasäule gegeben und mit Ethylacetat eluiert und ergab 3,75 g der Titelverbindung.
BEISPIEL 3
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-N⁴-benzoyl-5-methylcytidin
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methyluridin (15 g) wurde unter Argon mit 150 ml wasserfreiem Pyridin und 4,5 ml Essigsäureanhydrid behandelt und über Nacht gerührt. Das Pyridin wurde verdampft, und der Rückstand wurde zwischen 200 ml gesättigter NaHCO₃-Lösung und 200 ml Ethylacetat verteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet (wasserfreies MgSO₄) und eingedampft und ergab 16 g 2'-Acetoxy-5'-O-(DMT)-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methyluridin. Zu einer eiskalten Lösung von Triazol (19,9 g) in Triethylamin (50 ml) und Acetonitril (150 ml) wurden unter mechanischem Rühren tropfenweise 9 ml POCl₃ gegeben. Nach der Zugabe wurde das Eisbad entfernt und das Gemisch 30 min lang gerührt. Das 2'-Acetoxy-5'-O-(DMT)-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methyluridin (16 g in 50 ml CH₃CN) wurde tropfenweise zu der obigen Lösung gegeben, wobei der aufnehmende Kolben bei Eisbadtemperaturen gehalten wurde. Nach 2 h zeigte die TLC ein sich schneller bewegendes Nukleosid, C-4-Triazol-Derivat, an. Der Inhalt des Reaktionskolbens wurde eingedampft und das Nukleosid zwischen Ethylacetat (500 ml) und NaHCO₃ (500 ml) verteilt. Die organische Schicht wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (wasserfreies MgSO₄) und eingedampft und ergab 15 g C-4-Triazol-Nukleosid. Diese Verbindung wurde dann in einem 2:1-Gemisch aus NH₄OH/Dioxan (100 ml:200 ml) gelöst und über Nacht gerührt. TLC zeigte das Verschwinden des Ausgangsmaterials an. Die Lösung wurde eingedampft und in Methanol gelöst; es kristallisierten 9,6 g 5'-O-(DMT)-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methylcytidin aus. 5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methylcytidin (9,6 g, 0,015 mol) wurde in 50 ml DMF gelöst und mit 7,37 g Benzoesäureanhydrid behandelt. Nach 24 h Rühren wurde DMF verdampft, und der Rückstand wurde auf eine Silicasäule geladen und mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert und ergab das gewünschte Nukleosid.
BEISPIEL 4
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-N⁴-benzoyl-5-methylcytidin- 2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-N⁴-benzoyl-5-methylcytidin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit wurde aus dem obigen Nukleosid unter Benutzung der Phosphitylierungsvorschrift, die für das entsprechende 5-Methyluridin-Derivat angegeben ist, erhalten.
BEISPIEL 5
N⁶-Benzoyl-5'-O-(DMT)-3'-O-(2-methoxyethyl)adenosin
Eine Lösung von Adenosin (42,74 g, 0,16 mol) in trockenem Dimethylformamid (800 ml) bei 5 °C wurde mit Natriumhydrid (8,24 g, 60 % in Öl, dreimal vorgewaschen mit Hexanen, 0,21 mol) behandelt. Nach 30 min Rühren wurde während 20 min 2-Methoxyethylbromid (0,16 mol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 8 h lang bei 5 °C gerührt, dann durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, gefolgt vom Co-Verdampfen mit Toluol (2 × 100 ml). Der Rückstand wurde an Silicagel (100 g) adsorbiert und chromatographiert (800 g, Chloroform-Methanol 9:14:1). Ausgewählte Fraktionen wurden unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand war ein Gemisch aus 2'-O-(2-(Methoxyethyl)adenosin und 3'-O-(2-Methoxyethyl)adenosin im Verhältnis von 4:1.
Das obige Gemisch (0,056 mol) in Pyridin (100 ml) wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Pyridin (560 ml) wieder gelöst und in einem Eiswasserbad abgekühlt. Trimethylsilylchlorid (36,4 ml, 0,291 mol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch bei 5 °C 30 min lang gerührt. Benzoylchlorid (33,6 ml, 0,291 mol) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde sich für 2 h auf 25 °C erwärmen lassen und dann auf 5 °C abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde mit kaltem Wasser (112 ml) verdünnt und nach Rühren für 15 min konzentriertes Ammoniumhydroxid (112 ml) zugegeben. Nach 30 min wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt (unterhalb von 30 °C), gefolgt vom Co-Verdampfen mit Toluol (2 × 100 ml). Der Rückstand wurde in Ethylacetat-Methanol (400 ml, 9:1) gelöst, und die unerwünschten Silyl-Nebenprodukte wurden mittels Filtration entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und dann auf Silicagel (800 g, Chloroform-Methanol 9:1) chromatographiert. Ausgewählte Fraktionen wurden zusammengegeben, unter vermindertem Druck eingeengt und bei 25 °C/0,2 mm Hg 2 Stunden lang getrocknet: es wurde reines N⁶-Benzoyl-2'-O-(2-methoxyethyl)adenosin und reines N⁶-Benzoyl-3'-O-(2-methoxyethyl)adenosin erhalten.
Eine Lösung von N⁶-Benzoyl-3'-O-(2-methoxyethyl)adenosin (11,0 g, 0,285 mol) in Pyridin (100 ml) wurde unter vermindertem Druck zu einem Öl eingedampft. Der Rückstand wurde in trockenem Pyridin (300 ml) wieder gelöst und DMT-Cl (10,9 g, 95 %, 0,31 mol) zugegeben. Das Gemisch wurde 16 h lang bei 25 °C gerührt und dann auf eine Lösung von Natriumbicarbonat (20 g) in Eiswasser (500 ml) gegossen. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert (2 × 150 ml).
Die organische Schicht wurde mit Sole (50 ml) gewaschen, über Natriumsulfat (pulverisiert) getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft (unterhalb von 40 °C). Der Rückstand wurde auf Silicagel (400 g, Ethylacetat-Acetonitril-Triethylamin 99:1:195:5:1) chromatographiert. Ausgewählte Fraktionen wurden zusammengegeben, unter vermindertem Druck eingeengt und bei 25 °C/0,2 mm Hg getrocknet und ergaben 16,8 g (73 %) der Titelverbindung als einen Schaum. Die TLC zeigt Homogenität.
BEISPIEL 6
[N⁶-Benzoyl-5'-O-(DMT)-3'-O-(2-methoxyethyl)adenosin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
Die Titelverbindung wurde in derselben Weise wie die 5-Methyl-cytidin- und 5-Methyl-uridin-Analogen von Beispiel 2 und 4 von der Titelverbindung von Beispiel 5 ausgehend hergestellt. Die Reinigung unter Benutzung von Ethylacetat-Hexane-Triethylamin 59:40:1 als dem Chromatographie-Elutionsmittel ergab eine 67%ige Ausbeute an der Titelverbindung als einen festen Schaum. Die TLC zeigte Homogenität. ³¹P-NMR (CDCl₃, H₃PO₄ Std.) δ 147,89; 148,36 (Diastereomere).
BEISPIEL 7
5'-O-(DMT)-N²-isobutyryl-3'-O-(2-methoxyethyl)guanosin
A. 2,6-Diaminopurin-Ribosid
In eine 2-l-Parr-Bombe aus rostfreiem Stahl wurden, Guanosinhydrat (100 g, 0,35 mol, Aldrich), Hexamethyldisilazan (320 ml, 1,52 mol, 4,4 Äq.), Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (8,2 ml) und Toluol (350 ml) gegeben. Die Bombe wurde verschlossen und für 5 Tage teilweise in ein Ölbad eingetaucht (170 °C, Innentemp. 150 °C, 150 psi). Die Bombe wurde in einem Trockeneis/Aceton-Bad abgekühlt und geöffnet. Der Inhalt wurde mit Methanol (300 ml) in einen Kolben überführt und das Lösemittel unter vermindertem Druck verdampft. Wässriges Methanol (50 %, 1,2 l) wurde zugegeben. Die entstehende braune Suspension wurde während 5 h unter Rückfluss erhitzt. Die Suspension wurde unter vermindertem Druck auf das halbe Volumen eingeengt, um den Großteil des Methanols zu entfernen. Wasser (600 ml) wurde zugegeben und die Lösung unter Rückfluss erhitzt, mit künstlicher Kohle (5 g) behandelt und heiß durch Celite filtriert. Die Lösung wurde auf 25 °C abkühlen lassen. Der entstandene Niederschlag wurde aufgefangen, mit Wasser (200 ml) gewaschen und 5 h lang bei 90 °C/0,2 mm Hg getrocknet und ergab gewichtskonstante 87,4 g (89 %) eines hellbraunen kristallinen Feststoffes; Smp. 247 °C (schrumpft), 255 °C (Zers., Lit. (1) Smp. 250 bis 252 °C); TLC-homogen (R_f 0,50, Isopropanol-Ammoniumhydroxid-Wasser 16:3:1); PMR (DMSO), δ 5,73 (d, 2, 2-NH₂), 5,78 (s, 1, H-1), 6,83 (br s, 2,6-NH₂).
B. 2'-O-(2-Methoxyethyl)-2,6-diaminopurin-Ribosid und 3'-O-(2-Methoxyethyl)-2,6-diaminopurin-Ribosid
Zu einer Lösung von 2,6-Diaminopurin-Ribosid (10,0 g, 0,035 mol) in trockenem Dimethylformamid (350 ml) bei 0 °C unter einer Argon-Atmosphäre wurde Natriumhydrid (60 % in Öl, 1,6 g, 0,04 mol) gegeben. Nach 30 min wurde 2-Methoxyethylbromid (0,44 mol) in einer Portion zugegeben und das Reaktionsgemisch 16 h lang bei 25 °C gerührt. Methanol (10 ml) wurde zugegeben und das Gemisch unter vermindertem Druck zu einem Öl (20 g) eingeengt. Das Rohprodukt, das die 2'/3'-Isomere in einem Verhältnis von 4:1 enthielt, wurde auf Silicagel (500 g, Chloroform-Methanol 4:1) chromatographiert. Die geeigneten Fraktionen wurden zusammengegeben und unter vermindertem Druck zu einem halbfesten Stoff (12 g) eingeengt. Dieser wurde mit Methanol (50 ml) zerrieben und ergab einen weißen hygroskopischen Feststoff. Der Feststoff wurde bei 40 °C/0,2 mm Hg 6 h lang getrocknet und ergab ein reines 2'-Produkt und das reine 3'-Isomer, die mittels NMR bestätigt wurden.
C. 3'-O-2-(Methoxyethyl)guanosin
3'-O-(2-Methoxyethyl)-2,6-diaminopurin-Ribosid (0,078 mol) wurde unter schnellem Rühren in einbasigem Natriumphosphatpuffer (0,1 M, 525 ml, pH 7,3 bis 7,4) bei 25 °C gelöst. Adenosindeaminase (Sigma-Typ II, 1 Einheit/mg, 350 mg) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 60 h lang bei 25 °C gerührt. Das Gemisch wurde auf 5 °C abgekühlt und filtriert. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen (2 × 25 ml) und bei 60 °C/0,2 mm Hg 5 h lang getrocknet und ergab 10,7 g einer ersten Materialmenge. Eine zweite Materialmenge wurde durch Einengen der Mutterlaugen unter vermindertem Druck auf 125 ml, Abkühlen auf 5 °C, Sammeln des Feststoffes, Waschen mit kaltem Wasser (2 × 20 ml) und Trocknen wie oben erhalten und ergab 6,7 g weiteren Materials von insgesamt 15,4 g (31 % von Guanosinhydrat) dunkelgelbem Feststoff; TLC-Reinheit 97 %.
D. N²-Isobutyryl-3'-O-2-(methoxyethyl)guanosin
Zu einer Lösung von 3'-O-2-(Methoxyethyl)guanosin (18,1 g, 0,0613 mol) in Pyridin (300 ml) wurde Trimethylsilylchlorid (50,4 ml, 0,46 mol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 16 h lang bei 25 °C gerührt. Isobutyrylchlorid (33,2 ml, 0,316 mol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 4 h lang bei 25 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (25 ml) verdünnt. Nach 30-minütigem Rühren wurde Ammoniumhydroxid (konzentriert, 45 ml) zugegeben, bis ein pH-Wert von 6 erreicht war. Das Gemisch wurde 30 min lang in einem Wasserbad gerührt und dann unter vermindertem Druck zu einem Öl eingedampft. Das Öl wurde in einem Gemisch aus Ethylacetat (600 ml) und Wasser (100 ml) suspendiert, bis sich eine Lösung bildete. Die Lösung wurde 17 h lang bei 25 °C stehen lassen. Der entstandene Niederschlag wurde gesammelt, mit Ethylacetat (2 × 50 ml) gewaschen und 5 h lang bei 60 °C/0,2 mm Hg getrocknet und ergab 16,1 g (85 %) eines hellbraunen Feststoffes; TLC-Reinheit 98 %.
E . 5'-O-(DMT)-N²-isobutyryl-3'-O-(2-methoxyethyl)guanosin
Eine Lösung von N²-Isobutyryl-3'-O-2-(methoxyethyl)guanosin (0,051 mol) in Pyridin (150 ml) wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Pyridin (300 ml) wieder gelöst und auf 10 bis 15 °C abgekühlt. DMT-Cl (27,2 g, 95 %, 0,080 mol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 16 h lang bei 25 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zu einem Öl eingeengt, in einem Minimum an Methylenchlorid gelöst und auf eine Silicagel-Säule (500 g) gegeben. Das Produkt wurde mit einem Gradienten von Methylenchlorid-Triethylamin (99:1) zu Methylenchlorid-Methanol-Triethylamin (99:1:1) eluiert. Ausgewählte Fraktionen wurden zusammengegeben, unter vermindertem Druck eingeengt und bei 40 °C/0,2 mm Hg 2 Stunden lang getrocknet und ergaben 15 g (15,5 % von Guanosinhydrat) hellbraunen Schaum; TLC-Reinheit 98 %.
BEISPIEL 8
[5'-O-(DMT)-N²-isobutyryl-3'-O-(2-methoxyethyl)guanosin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
Das geschützte Nukleosid von Beispiel 7 (0,0486 mol) wurde in einen trockenen 1-l-Rundkolben gegeben, der einen Teflon-Rührstab enthielt. Der Kolben wurde mit Argon gespült. Wasserfreies Methylenchlorid (400 ml) wurde mittels einer Kanüle in den Kolben eingebracht, um das Nukleosid zu lösen. Vorher vakuumgetrocknetes N,N-Diisopropylaminohydrotetrazolid (3,0 g, 0,0174 mol) wurde unter Argon zugegeben. Unter Rühren wurde Bis-N,N-diisopropyl-aminocyano-ethylphosphoramidit (18,8 g, 0,0689 mol) während 1 min mittels einer Spritze zugegeben (keine Wärmeentwicklung festgestellt). Das Reaktionsgemisch wurde unter Argon 16 h lang bei 25 °C gerührt. Nachdem mittels TLC die Vollständigkeit der Reaktion festgestellt wurde, wurde das Reaktionsgemisch in einen Scheidetrichter (1 l) überführt. Der Reaktionskolben wurde mit Methylenchlorid (2 × 50 ml) ausgespült. Die vereinigte organische Schicht wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat (200 ml) und dann mit Sole (200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde während 2 h über Natriumsulfat (50 g, pulverisiert) getrocknet. Die Lösung wurde filtriert und unter vermindertem Druck zu einem viskosen Öl eingeengt. Das entstandene Phosphoramidit wurde mittels Silicagel-Flash-Chromatographie gereinigt (800 g, Ethylacetat-Triethylamin 99:1). Ausgewählte Fraktionen wurden zusammengegeben, unter vermindertem Druck eingeengt und bei 25 °C/0,2 mm Hg 16 h lang getrocknet und ergaben 18,0 g (46 %, 3 % von Guanosinhydrat) TLC-homogenen festen Schaum. ³¹P-NMR (CDCl₃, H₃PO₄ Std.) δ 147,96; 148,20 (Diastereomere).
BEISPIEL 9 5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-5-methyl-uridin-2'-O-succinat
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)thymidin wurde zuerst in der 2'-Position succinyliert. Thymidinnukleosid (4 mmol) wurde mit 10,2 ml Dichlorethan, 615 mg (6,14 mmol) Bernsteinsäureanhydrid, 570 μl (4,09 mmol) Triethylamin und 251 mg (2,05 mmol) 4-Dimethylaminopyridin zur Reaktion gebracht. Die Reaktanden wurden gevortext, bis sie gelöst waren, und für etwa 30 Minuten in einen Heizblock bei 55 °C eingebracht. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) überprüft. Das Reaktionsgemisch wurde dreimal mit kalter 10%iger Zitronensäure gewaschen, gefolgt von drei Wäschen mit Wasser. Die organische Phase wurde entfernt und unter Natriumsulfat getrocknet. Succinyliertes Nukleosid wurde über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet.
BEISPIEL 10
5'-O-DMT-3'-O-methoxyethyl-5-methyl-uridin-2'-O-succinoyl, gebunden an LCA-CPG
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-2'-O-succinyl-thymidin wurde an poröses Glas (controlled pore glass, CPG) gekoppelt. 1,09 g (1,52 mmol) des Succinats wurden über Nacht zusammen mit 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 2,2'-Dithiobis(5-nitropyridin) (dTNP), Triphenylphosphin (TPP) und mit Säure vorgewaschenem CPG (poröses Glas) in einem Vakuumofen getrocknet. Nach etwa 24 Stunden wurden DMAP (1,52 mmol, 186 mg) und Acetonitril (13,7 ml) zu dem Succinat gegeben. Das Gemisch wurde unter einer Argonatmosphäre unter Benutzung eines Magnetrührers gerührt. In einem separaten Kolben wurde dTNP (1,52 mmol, 472 mg) unter Argon in Acetonitril (9,6 ml) und Dichlormethan (4,1 ml) gelöst. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann zu dem Succinat gegeben. In einem anderen separaten Kolben wurde TPP (1,52 mmol, 399 mg) unter Argon in Acetonitril (37 ml) gelöst. Dieses Gemisch wurde dann zu dem Succinat/DMAP/dTNP-Reaktionsgemisch gegeben. Zuletzt wurden zu dem Haupt-Reaktionsgemisch 12,23 g mit Säure vorgewaschenes LCA-CPG (Beladung = 115,2 μmol/g) gegeben, kurz gevortext und für etwa 3 Stunden am Schüttler angebracht. Das Gemisch wurde nach 3 Stunden von dem Schüttler entfernt und die Beladung überprüft. Eine kleine Probe von CPG wurde mit reichlichen Mengen von Acetonitril, Dichlormethan und dann mit Ether gewaschen. Es wurde festgestellt, dass die Anfangsbeladung 63 μmol/g betrug (3,9 mg CPG wurden mit Trichloressigsäure abgespalten, die Absorption von freigesetztem Tritylkation wurde bei 503 nm in einem Spektrophotometer abgelesen, um die Beladung zu bestimmen). Die gesamte CPG-Probe wurde dann gewaschen wie oben beschrieben und über Nacht in einem Vakuumofen unter P₂O₅ getrocknet. Am folgenden Tag wurde das CPG mit 25 ml CAP A (Tetrahydrofuran/Essigsäureanhydrid) und 25 ml CAP B (Tetrahydrofuran/Pyridin/1-Methylimidazol) für etwa 3 Stunden am Schüttler verkappt, filtriert und mit Dichlormethan und Ether gewaschen. Das CPG wurde über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet. Nach dem Trocknen wurden 12,25 g CPG mit einer Endbeladung von 90 μmol/g isoliert.
BEISPIEL 11
3'-O-Methoxyethyl-5-methyl-N-benzoyl-cytidin-2'-O-succinat
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxy)ethyl-N-benzoyl-cytidin wurde zuerst in der 2'-Position succinyliert. Cytidin-Nukleosid (4 mmol) wurde mit 10,2 ml Dichlorethan, 615 mg (6,14 mmol) Bernsteinsäureanhydrid, 570 μl (4,09 mmol) Triethylamin und 251 mg (2,05 mmol) 4-Dimethylaminopyridin zur Reaktion gebracht. Die Reaktanden wurden gevortext, bis sie gelöst waren, und für etwa 30 Minuten in einen Heizblock bei 55 °C eingebracht. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) überprüft. Das Reaktionsgemisch wurde dreimal mit kalter 10%iger Zitronensäure gewaschen, gefolgt von drei Wäschen mit Wasser. Die organische Phase wurde entfernt und unter Natriumsulfat getrocknet. Das succinylierte Nukleosid wurde über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet.
BEISPIEL 12
5'-O-DMT-3'-O-methoxyethyl-5-methyl-N-benzoyl-cytidin-2'-O-succinoyl, gebunden an ZCA-CPG
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-2'-O-succinyl-N⁴-benzoyl-cytidin wurde an poröses Glas (CPG) gekoppelt. 1,05 g (1,30 mmol) des Succinats wurde über Nacht zusammen mit 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 2,2'-Dithiobis(5-nitropyridin) (dTNP), Triphenylphosphin (TPP) und mit Säure vorgewaschenem CPG (poröses Glas) in einem Vakuumofen getrocknet. Am folgenden Tag wurden DMAP (1,30 mmol, 159 mg) und Acetonitril (11,7 ml) zu dem Succinat gegeben. Das Gemisch wurde unter Argon mittels eines Magnetrührers „gemischt". In einem separaten Kolben wurde dTNP (1,30 mmol, 400 mg) unter Argon in Acetonitril (8,2 ml) und Dichlormethan (3,5 ml) gelöst. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann zu dem Succinat gegeben. In einem anderen separaten Kolben wurde TPP (1,30 mmol, 338 mg) unter Argon in Acetonitril (11,7 ml) gelöst. Dieses Gemisch wurde dann zu dem Succinat/DMAP/dTNP-Reaktionsgemisch gegeben. Zuletzt wurden 10,46 g mit Säure vorgewaschenes LCA-CPG (Beladung = 115,2 μmol/g) zu dem Haupt-Reaktionsgemisch gegeben, kurz gevortext und für etwa 2 Stunden an dem Schüttler angebracht. Ein Teil wurde nach 2 Stunden von dem Schüttler entfernt und die Beladung überprüft. Eine kleine Probe von CPG wurde mit reichlichen Mengen von Acetonitril, Dichlormethan und dann mit Ether gewaschen. Es wurde festgestellt, dass die Anfangsbeladung 46 μmol/g betrug (3,4 mg CPG wurden mit Trichloressigsäure abgespalten). Die Absorption von freigesetztem Tritylkation wurde bei 503 nm in einem Spektrophotometer abgelesen, um die Beladung zu bestimmen. Die gesamte CPG-Probe wurde dann gewaschen wie oben beschrieben und über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet. Am folgenden Tag wurde das CPG mit 25 ml CAP A (Tetrahydrofuran/Essigsäureanhydrid) und 25 ml CAP B (Tetrahydrofuran/Pyridin/1-Methylimidazol) für etwa 3 Stunden an einem Schüttler verkappt. Das Material wurde filtriert und mit Dichlormethan und Ether gewaschen. Das CPG wurde über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet. Nach dem Trocknen wurden 10,77 g CPG mit einer Endbeladung von 63 μmol/g isoliert.
BEISPIEL 13
5'-O-DMT-3'-O-methoxyethyl-N⁶-benzoyl-adenosin-2'-O-succinat
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-N⁶-benzoyl-adenosin wurde zuerst in der 2'-Position succinyliert. 3,0 g (4,09 mmol) des Adenosin-Nukleosids wurden mit 10,2 ml Dichlorethan, 615 mg (6,14 mmol) Bernsteinsäureanhydrid, 570 μl (4,09 mmol) Triethylamin und 251 mg (2,05 mmol) 4-Dimethylaminopyridin zur Reaktion gebracht. Die Reaktanden wurden gevortext, bis sie gelöst waren, und für etwa 30 min in einen Heizblock bei 55 °C eingebracht. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) überprüft. Das Reaktionsgemisch wurde dreimal mit kalter 10%iger Zitronensäure gewaschen, gefolgt von drei Wäschen mit Wasser. Die organische Phase wurde entfernt und unter Natriumsulfat getrocknet. Succinyliertes Nukleosid wurde über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet.
BEISPIEL 14
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-N⁶-benzoyl-adenosin-2'-O-succinoyl, gebunden an LCA-CPG
Im Anschluss an die Succinylierung wurde 5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-2'-O-succinyl-N⁶-benzoyl-adenosin an poröses Glas (CPG) gekoppelt. 3,41 g (4,10 mmol) des Succinats wurden über Nacht zusammen mit 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 2,2'-Dithiobis(5-nitro-pyridin) (dTNP), Triphenylphosphin (TPP) und mit Säure vorgewaschenem CPG (poröses Glas) in einem Vakuumofen getrocknet. Am folgenden Tag wurden DMAP (4,10 mmol, 501 mg) und Acetonitril (37 ml) zu dem Succinat gegeben. Das Gemisch wurde unter Argon mittels eines Magnetrührers „gemischt". In einem separaten Kolben wurde dTNP (4,10 mmol, 1,27 g) unter Argon in Acetonitril (26 ml) und Dichlormethan (11 ml) gelöst. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann zu dem Succinat gegeben. In einem anderen separaten Kolben wurde TPP (4,10 mmol, 1,08 g) unter Argon in Acetonitril (37 ml) gelöst. Dieses Gemisch wurde dann zu dem Succinat/DMAP/dTNP-Reaktionsgemisch gegeben. Zuletzt wurden 33 g mit Säure vorgewaschenes LCA-CPG (Beladung = 115,2 μmol/g) zu dem Haupt-Reaktionsgemisch gegeben, kurz gevortext und für etwa 20 Stunden an dem Schüttler angebracht, nach 20 Stunden von dem Schüttler entfernt, und die Beladung wurde überprüft. Eine kleine Probe von CPG wurde mit reichlichen Mengen von Acetonitril, Dichlormethan und dann mit Ether gewaschen. Es wurde festgestellt, dass die Anfangsbeladung 49 μmol/g betrug (2,9 mg CPG wurden mit Trichloressigsäure abgespalten). Die Absorption von freigesetztem Tritylkation wurde bei 503 nm in einem Spektrophotometer abgelesen, um die Beladung zu bestimmen. Die gesamte CPG-Probe wurde dann gewaschen wie oben beschrieben und über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet. Am folgenden Tag wurde das CPG mit 50 ml CAP A (Tetrahydrofuran/Essigsäureanhydrid) und 50 ml CAP B (Tetrahydrofuran/pyridin/1-Methylimidazol) für etwa 1 Stunde am Schüttler verkappt. Das Material wurde filtriert und mit Dichlormethan und Ether gewaschen. Das CPG wurde über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet. Nach dem Trocknen wurden 33,00 g CPG mit einer Endbeladung von 66 μmol/g erhalten.
BEISPIEL 15
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-N²-isobutyryl-guanosin-2'-O-succinat
5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-N²-isobutyryl-guanosin wurde in der 2'-Zuckerposition succinyliert. 3,0 g (4,20 mmol) des Guanosin-Nukleosids wurden mit 10,5 ml Dichlorethan, 631 mg (6,30 mmol) Bernsteinsäureanhydrid, 585 μl 4,20 mmol) Triethylamin und 257 mg (2,10 mmol) 4-Dimethylaminopyridin zur Reaktion gebracht. Die Reaktanden wurden gevortext, bis sie gelöst waren, und für etwa 30 Minuten in einen Heizblock bei 55 °C eingebracht. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) überprüft. Das Reaktionsgemisch wurde dreimal mit kalter 10%iger Zitronensäure gewaschen, gefolgt von drei Wäschen mit Wasser. Die organische Phase wurde entfernt und unter Natriumsulfat getrocknet. Das succinylierte Nukleosid wurde über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet.
BEISPIEL 16
5'-O-DMT-3'-O-methoxyethyl-N²-isobutyryl-guanosin-2'-O-succinoyl, gebunden an LCA-CPG
Im Anschluss an die Succinylierung wurde 5'-O-DMT-3'-O-(2-methoxyethyl)-2'-O-succinyl-N²-benzoyl-guanosin an poröses Glas (CPG) gekoppelt. 3,42 g (4,20 mmol) des Succinats wurden über Nacht zusammen mit 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 2,2'-Dithiobis(5-nitro-pyridin) (dTNP), Triphenylphosphin (TPP) und mit Säure vorgewaschenem CPG (poröses Glas) in einem Vakuumofen getrocknet. Am folgenden Tag wurden DMAP (4,20 mmol, 513 mg) und Acetonitril (37,5 ml) zu dem Succinat gegeben. Das Gemisch wurde unter Argon mittels eines Magnetrührers „gemischt". In einem separaten Kolben wurde dTNP (4,20 mmol, 1,43 mg) unter Argon in Acetonitril (26 ml) und Dichlormethan (11 ml) gelöst. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann zu dem Succinat gegeben. In einem anderen separaten Kolben wurde TPP (4,20 mmol, 1,10 g) unter Argon in Acetonitril (37,5 ml) gelöst. Dieses Gemisch wurde dann zu dem Succinat/DMAP/dTNP-Reaktionsgemisch gegeben. Zuletzt wurden 33,75 g mit Säure vorgewaschenes LCR-CPG (Beladung = 115,2 μmol/g) zu dem Haupt-Reaktionsgemisch gegeben, kurz gevortext und für etwa 20 Stunden an dem Schüttler angebracht, nach 20 Stunden von dem Schüttler entfernt, und die Beladung wurde überprüft. Eine kleine Probe von CPG wurde mit reichlichen Mengen von Acetonitril, Dichlormethan und dann mit Ether gewaschen. Es wurde festgestellt, dass die Anfangsbeladung 64 μmol/g betrug (3,4 mg CPG wurden mit Trichloressigsäure abgespalten). Die Absorption von freigesetztem Tritylkation wurde bei 503 nm in einem Spektrophotometer abgelesen, um die Beladung zu bestimmen. Die gesamte CPG-Probe wurde dann gewaschen wie oben beschrieben und über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet. Am folgenden Tag wurde das CPG mit 50 ml CAP A (Tetrahydrofuran/Essigsäureanhydrid) und 50 ml CAP B (Tetrahydrofuran/Pyridin/1-Methylimidazol) für etwa 1 Stunde am Schüttler verkappt. Das Material wurde filtriert und mit Dichlormethan und Ether gewaschen. Das CPG wurde über Nacht unter P₂O₅ in einem Vakuumofen getrocknet. Nach dem Trocknen wurden 33,75 g CPG mit einer Endbeladung von 72 μmol/g isoliert.
BEISPIEL 17
5'-O-DMT-3'-O-[hexyl-(6-phthalimido)]uridin
2',3'-O-Dibutyl-stannylen-uridin wurde gemäß der Arbeitsweise von Wagner et. al., J. Org. Chem., 1974, 39, 24 synthetisiert. Diese Verbindung wurde 12 Stunden lang unter Vakuum über P₂O₅ getrocknet. Zu einer Lösung dieser Verbindung (29 g, 42,1 mmol) in 200 ml trockenem DMF wurden (16,8 g, 55 mmol) 6-Bromhexyl-phthalimid und 4,5 g Natriumiodid gegeben, und das Gemisch wurde 16 Stunden lang auf 130 °C unter Argon erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft, einmal mit Toluol co-verdampft, und der gummiartige Teerrückstand wurde auf eine Silicasäule (500 g) aufgegeben. Die Säule wurde mit 2 l EtOAc gewaschen, gefolgt vom Eluieren mit 10 % Methanol (MeOH):90 % EtOAc. Das Produkt, 2'- und 3'-Isomere von O-Hexyl-6-N-phthalimidouridin, eluierte als ein untrennbares Gemisch (R_f = 0,64 in 10 % MeOH in EtOAc). Das Isomerenverhältnis gemäß ¹³C-NMR war etwa 55 % 2'-Isomer und etwa 45 % 3'-Isomer. Die vereinigte Ausbeute betrug 9,2 g (46,2 %). Dieses Gemisch wurde unter Vakuum getrocknet und zweimal mit Pyridin wieder eingedampft. Es wurde in 150 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 7,5 g DMT-Cl (22,13 mmol) und 500 mg Dimethylaminopyridin (DMAP) behandelt. Nach 2 Stunden zeigte die Dünnschichtchromatographie (TLC, 6:4 EtOAc:Hexan) das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials und eine gute Trennung zwischen den 2'- und 3'-Isomeren an (R_f = 0,29 für das 2'-Isomer und 0,12 für das 3'-Isomer). Das Reaktionsgemisch wurde durch die Zugabe von 5 ml CH₃OH abgeschreckt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 300 ml CH₂Cl₂ gelöst, nacheinander mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung, gewaschen. Er wurde über Mg₂SO₄ getrocknet und eingedampft und ergab 15 g eines braunen Schaums, der auf Silicagel (500 g) gereinigt wurde und 6,5 g des 2'-Isomers und 3,5 g des 3'-Isomers ergab.
BEISPIEL 18
5'-O-DMT-3'-O-[hexyl-(6-phthalimido)]uridin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
5'-DMT-3'-O-[hexyl-(6-phthalimido)]uridin (2 g, 2, 6 mmol) wurde in 20 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ gelöst. Zu dieser Lösung wurden Diisopropylaminotetrazolid (0,2 g, 1,16 mmol) und 2,0 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit (6,3 mmol) gegeben, und sie wurde über Nacht gerührt. TLC (1:1 EtOAc/Hexan) zeigte das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials an. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂Cl₂ überführt und mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (100 ml), gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung, gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft und ergab 3,8 g eines Rohproduktes, das in einer Silicasäule (200 g) unter Benutzung von 1:1 Hexan/EtOAc gereinigt wurde und 1,9 g (1,95 mmol, 74 % Ausbeute) des gewünschten Phosphoramidits ergab.
BEISPIEL 19
Herstellung von 5'-O-DMT-3'-O-[hexyl-(6-phthalimido)]uridin-2'-O-succinoyl-aminopropyl-CPG
Succinyliertes und verkapptes Aminopropyl-poröses Glas (CPG, Porendurchmesser 500 A, Aminopropyl-CPG, 1,0 Gramm, hergestellt gemäß Damha et. al., Nucl. Acids Res. 1990, 18, 3.813) wurden zu 12 ml wasserfreiem Pyridin in einem 100-ml-Rundkolben gegeben. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (DEC, 0,38 Gramm, 2,0 mmol), Triethylamin (TEA, 100 μl, destilliert über CaH₂), Dimethylaminopyridin (DMAP, 0,012 Gramm, 0,1 mmol) und Nukleosid 5'-O-DMT-3'-O-[hexyl-(6-phthalimido)]uridin (0,6 Gramm, 0,77 mmol) wurden unter Argon zugegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang mechanisch geschüttelt. Weiteres Nukleosid (0,20 Gramm) wurde zugegeben und das Gemisch 24 Stunden lang geschüttelt. Das CPG wurde abfiltriert und nacheinander mit Dichlormethan, Triethylamin und Dichlormethan gewaschen. Das CPG wurde dann unter Vakuum getrocknet, in 10 ml Piperidin suspendiert und 15 Minuten geschüttelt. Das CPG wurde abfiltriert, gründlich mit Dichlormethan gewaschen und erneut unter Vakuum getrocknet. Das Maß der Beladung (bestimmt mittels spektrophotometrischen Assays des DMT-Kations in 0,3 M p-Toluolsulfonsäure bei 498 nm) betrug etwa 28 μmol/g. Das 5'-O-(DMT)-3'-O-[hexyl-(6-phthalimido]uridin-2'-O-succinyl-aminopropyl-poröse Glas wurde benutzt, um die Oligomere unter Benutzung der Standardbedingungen der Phosphoramiditchemie in einem DNA-Syntheseautomaten ABI 380B zu synthetisieren. Ein Vier-Basen-Oligomer, 5'-GACU*-3', wurde benutzt, um die Struktur des 3'-O-Hexylamin-Anhefters, eingeführt in das Oligonukleotid, mittels NMR zu bestätigen. Wie erwartet, wurde bei der ¹H-NMR ein Multiplett-Signal zwischen 1,0 und 1,8 ppm festgestellt.
BEISPIEL 20
5'-O-DMT-3'-O-[hexylamino]-uridin
5'-O-(DMT)-3'-O-[hexyl-(6-phthalimido)]uridin (4,5 Gramm, 5,8 mmol) wird in 200 ml Methanol in einem 500-ml-Kolben gelöst. Hydrazin (1 ml, 31 mmol) wird unter Rühren zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Gemisch wird in einem Ölbad auf 60 bis 65 °C erwärmt und 14 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wird unter Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichlormethan (250 ml) gelöst und zweimal mit einem gleichen Volumen an NH₄OH extrahiert. Die organische Schicht wird eingedampft, um das Rohprodukt zu erhalten, dessen NMR anzeigt, dass es nicht völlig rein ist. R_f = 0 in 100%igem Ethylacetat. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung in nachfolgenden Reaktionen benutzt.
BEISPIEL 21
3'-O-[Propyl-(3-phthalimido)]-adenosin
Zu einer Lösung von Adenosin (20,0 g, 75 mmol) in trockenem Dimethylformamid (550 ml) bei 5 °C wurde Natriumhydrid (60 % Öl, 4,5 g, 112 mmol) gegeben. Nach einer Stunde wurde N-(3-Brompropyl)phthalimid (23,6 g, 86 mmol) zugegeben und die Temperatur auf 30 °C erhöht und für 16 Stunden beibehalten. Eis wird zugegeben und die Lösung unter Vakuum zu einem Gummi eingedampft. Das Gummi wurde zwischen Wasser und Ethylacetat (4 × 300 ml) verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet und unter Vakuum eingedampft, und das entstandene Gummi wurde auf Silicagel (95/5 CH₂Cl₂/MeOH) chromatographiert und ergab einen weißen Feststoff (5,7 g) des 2'-O-(Propylphthalimid)adenosins. Die Fraktionen, die das 3'-O-(Propylphthalimid)adenosin enthielten, wurde ein zweites Mal unter Benutzung desselben Lösemittelsystems auf Silicagel chromatographiert.
Das Kristallisieren der 2'-O-(Propylphthalimid)adenosin-Fraktionen aus Methanol ergab einen kristallinen Feststoff, Smp. 123 bis 124 °C. ¹H-NMR (400 MHz: DMSO-d₆) δ 1,70 (m, 2H, CH₂), 3,4–3,7 (m, 6H, C_5', CH₂, OCH₂, Phth CH₂), 3,95 (q, 1H, C_4'H), 4,30 (q, 1H, C_5'H), 4,46 (t, 1H, C_2'H), 5,15 (d, 1H, C_3'OH), 5,41 (t, 1H, C_5'OH), 5,95 (d, 1H, C_1'H) 7,35 (s, 2H, NH₂), 7,8 (brs, 4H, Ar), 8,08 (s, 1H, C₂H) und 8,37 (s, 1H, C₈H). Anal. berechnet C₂₁H₂₂N₆O₆: C, 55,03; H, 4,88; N, 18,49. Gefunden: C, 55,38; H, 4,85; N, 18,46.
Das Kristallisieren der 3'-O-(Propylphthalimid)adenosin-Fraktionen aus H₂O ergab eine Analysenprobe, Smp. 178 bis 179 °C. ¹H-NMR (400 MHz: DMSO-d₆) δ 5,86 (d, 1H, H-1').
BEISPIEL 22
3'-O-[Propyl-(3-phthalimido)]-N⁶-benzoyl-adenosin
3'-O-(3-Propylphthalimid)adenosin wird mit Benzoylchlorid in einer Weise behandelt, die der Arbeitsweise von Gaffney et al., Tetrahedron Lett. 1982, 23, 2.257 ähnlich ist. Die Reinigung des Rohmaterials mittels Chromatographie auf Silicagel (Ethylacetat-Methanol) ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 23
3'-O-[Propyl-(3-phthalimido)]-5'-O-DMT-N⁶-benzoyl-adenosin
Zu einer Lösung von 3'-O-(Propyl-3-phthalimid)-N⁶-benzoyladenosin (4,0 g) in Pyridin (250 ml) wird DMT-Cl (3,3 g) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 16 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zu Eis/Wasser/Ethylacetat gegeben, die organische Schicht wird abgetrennt, getrocknet und unter Vakuum eingeengt, das entstehende Gummi wird auf Silicagel (Ethylacetat-Methanol-Triethylamin) chromatographiert und ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 24
3'-O-[Propyl-(3-phthalimido)]-5'-O-DMT-N⁶-benzoyl-adenosin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
3'-O-(Propyl-3-phthalimid)-5'-O-DMT-N⁶-benzoyladenosin wird mit (β-Cyanoethoxy)chlor-N,N-diisopropyl)aminophosphan in einer Weise behandelt, die der Arbeitsweise von Seela, et al., Biochemistry 1987, 26, 2.233 ähnlich ist. Chromatographie auf Silicagel (EtOAc/Hexan) ergibt die Titelverbindung als einen weißen Schaum.
BEISPIEL 25
3'-O-(Aminopropyl)-adenosin
Eine Lösung von 3'-O-(Propyl-3-phthalimid)adenosin (8,8 g, 19 mmol), 95%igem Ethanol (400 ml) und Hydrazin (10 ml, 32 mmol) wird 16 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat unter Vakuum eingeengt. Es wird Wasser (150 ml) zugegeben und mit Essigsäure auf pH 5,0 angesäuert. Die wässrige Lösung wird mit EtOAc (2 × 30 ml) extrahiert, und die wässrige Phase wird unter Vakuum eingeengt und ergibt die Titelverbindung als ein HOAc-Salz.
BEISPIEL 26
3'-O-[3-(N-Trifluoracetamido)propyl]-adenosin
Eine Lösung von 3'-O-(Propylamino)adenosin in Methanol (50 ml) und Triethylamin (15 ml, 108 mmol) wird mit Ethyltrifluoracetat (18 ml, 151 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wird 16 h lang gerührt und dann unter Vakuum eingeengt, und das entstandene Gummi wird auf Silicagel (9/1, EtOAc-MeOH) chromatographiert und ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 27
N⁶-Dibenzoyl-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]-adenosin
3'-O-[3-(N-Trifluoracetamido)propyl]adenosin wird gemäß Beispiel 22 unter Benutzung einer Jones-Modifikation behandelt, wobei bei der Aufarbeitung Tetrabutylammoniumfluorid anstelle von Ammoniumhydroxid benutzt wird. Das Rohprodukt wird unter Benutzung von Silicagel-Chromatographie (EtOAc/MeOH 1/1) gereinigt und ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 28
N⁶-Dibenzoyl-5'-O-DMT-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]-adenosin
DMT-Cl (3,6 g, 10,0 mmol) wird zu einer Lösung von N⁶-(Dibenzoyl)-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl)adenosin in Pyridin (100 ml) bei Raumtemperatur gegeben und 16 h lang gerührt. Die Lösung wird unter Vakuum eingeengt und auf Silicagel (EtOAc/TEA 99/1) chromatographiert und ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 29
N⁶-Dibenzoyl-5'-O-DMT-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]-adenosin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
Eine Lösung von N⁶-(Dibenzoyl)-5'-O-(DMT)-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]adenosin in trockenem CH₂Cl₂ wird mit Bis-N,N-diisopropylamino-cyanoethylphosphit (1,1 Äq.) und N,N-Diisopropylaminotetrazolid (katalytische Menge) bei Raumtemperatur 16 h lang behandelt. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum eingeengt und auf Silicagel (EtOAc/Hexan/TEA 6/4/1) chromatographiert und ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 30
3'-O-(Butylphthalimido)-adenosin
Die Titelverbindung wird gemäß Beispiel 21 unter Benutzung von N-(4-Brombutyl)phthalimid anstelle von 1-Brompropan hergestellt. Chromatographie auf Silicagel (EtOAc/MeOH) ergibt die Titelverbindung; ¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,88 (d, 1H, C_1'H).
BEISPIEL 31
N⁶-Benzoyl-3'-O-(butylphthalimido)-adenosin
Die Benzoylierung von 3'-O-(Butylphthalimid)adenosin gemäß Beispiel 22 ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 32
N⁶-Benzoyl-5'-O-DMT-3'-O-(butylphthalimido)-adenosin
Die Titelverbindung wird aus 3'-O-(Butylphthalimid)-N⁶-benzoyladenosin gemäß Beispiel 22 hergestellt.
BEISPIEL 33
N⁶-Benzoyl-5'-o-DMT-3'-O-(butylphthalimido)-adenosin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
Die Titelverbindung wird aus 3'-O-(Butylphthalimid)-5'-O-DMT-N⁶-benzoyladenosin gemäß Beispiel 24 hergestellt.
BEISPIEL 34
3'-O-(Pentylphthalimido)-adenosin
Die Titelverbindung wird gemäß Beispiel 21 unter Benutzung von N-(5-Brompentyl)phthalimid hergestellt. Das Rohmaterial aus der Extraktion wird unter Benutzung von CHCl₃/MeOH (95/5) auf Silicagel chromatographiert und ergibt ein Gemisch der 2'- und 3'-Isomeren. Das 2'-Isomer wird aus EtOH/MeOH 8/2 umkristallisiert. Die Mutterlauge wird erneut auf Silicagel chromatographiert und ergibt das 3'-Isomer. 2'-O-(Pentylphthalimido)adenosin: Smp. 159 bis 160 °C. Anal. berechnet für C₂₃H₂₄N₆O₅: C, 57,26; H, 5,43; N, 17,42. Gefunden: C, 57,03; H, 5,46; N, 17,33. 3'-O- (Pentylphthalimido)adenosin: ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 5,87 (d, 1H, H-1').
BEISPIEL 35
N⁶-Benzoyl-3'-O-(pentylphthalimido)-adenosin
Die Benzoylierung von 3'-O-(Pentylphthalimido)adenosin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 22 erzielt und ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 36
N⁶-Benzoyl-5'-O-DMT-3'-O-(pentylphthalimido)-adenosin
Die Titelverbindung wird aus 3'-O-(Pentylphthalimid)-N⁶-benzoyladenosin gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 23 hergestellt. Chromatographie auf Silicagel (Ethylacetat, Hexan, Triethylamin) ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 37
N⁶-Benzoyl-5'-O-DMT-3'-O-(pentylphthalimido)-adenosin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
Die Titelverbindung wird aus 3'-O-(Pentylphthalimid)-5'-O-(DMT)-N⁶-benzoyladenosin gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 24 hergestellt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 38
3'-O-(Propylphthalimido)uridin
Eine Lösung des Uridin-Zinn-Komplexes (48,2 g, 115 mmol) in trockenem DMF (150 ml) und N-(3-Brompropyl)phthalimid (46 g, 172 mmol) wurden 6 h lang auf 130 °C erwärmt. Das Rohprodukt wurde direkt auf Silicagel (CHCl₃/MeOH 95/5) chromatographiert. Das Isomerenverhältnis von 2' zu 3' des gereinigten Gemisches betrug 81/19. Das 2'-Isomer wurde durch Kristallisation aus MeOH gewonnen. Das Filtrat wurde unter Benutzung von CHCl₃/MeOH (95/5) auf Silicagel wieder chromatographiert und ergab das 3'-Isomer als einen Schaum. 2'-O-(Propylphthalimid)uridin: Analysenprobe umkristallisiert aus MeOH, Smp. 165,5 bis 166,5 °C, ¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 1,87 (m, 2H, CH₂), 3,49–3,65 (m, 4H, C_2'H), 3,80–3,90 (m, 2H, C_3'H₁C_4'H), 4,09 (m, 1H, C_2'H), 5,07 (d, 1h, C_3'OH), 5,16 (m, 1H, C_5'OH), 5,64 (d, 1H, CH=), 7,84 (d, 1H, C_1'H), 7,92 (bs, 4H, Ar), 7,95 (d, 1H, CH=) und 11,33 (s, 1H, ArNH). Anal. berechnet C₂₀H₂₁N₃H₈, C, 55,69; H, 4,91; N, 9,74. Gefunden: C, 55,75; H, 5,12; N, 10,01. 3'-O-(Propylphthalimid)uridin: ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 5,74 (d, 1H, H-1').
BEISPIEL 39
3'-O-(Aminopropyl)-uridin
Die Titelverbindung wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 25 hergestellt.
BEISPIEL 40
3'-O-[3-(N-Trifluoracetamido)propyl]-uridin
3'-O-(Propylamino)uridin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 26 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 41
5'-O-DMT-3'-O-[3-(N-Trifluoracetamido)propyl]-uridin
3'-O-[3-(N-Trifluoracetamido)propyl]uridin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 28 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 42
5'-O-DMT-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]-uridin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
5'-O-(DMT)-3'-O-[3-(N-Trifluoracetamido)propyl]uridin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 29 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 43
3'-O-(Propylphthalimido)-cytidin
Die Titelverbindungen wurden gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 21 hergestellt.
2'-O-(Propylphthalimid)cytidin: ¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,82 (d, 1H, C_1'H).
3'-O-(Propylphthalimid)cytidin: ¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ 5,72 (d, 1H, C_1'H).
BEISPIEL 44
3'-O-(Aminopropyl)-cytidin
3'-O-(Propylphthalimid)cytidin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 25 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 45
3'-O-[3-(N-Trifluoracetamido)propyl]-cytidin
3'-O-(Propylamino)cytidin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 26 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 46
N⁴-Benzoyl-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]-cytidin
3'-O-[3-(N-Trifluoracetamido)propyl]cytidin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 27 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 47
N⁴-Benzoyl-5'-O-DMT-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]-cytidin
N⁴-(Benzoyl)-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]-cytidin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 28 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 48
N⁴-Benzoyl-5'-O-DMT-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]-cytidin-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
N⁴-(Benzoyl)-5'-O-(DMT)-3'-O-[3-(N-trifluoracetamido)propyl]cytidin wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 29 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 49
Allgemeine Arbeitsweisen für die Oligonukleotid-Synthese
Oligonukleotide wurden in einem Nukleinsäuresynthesesystem Perseptive Biosystems Expedite 8901 synthetisiert. Mehrere 1-μmol-Synthesen wurden für jedes Oligonukleotid durchgeführt. Tritylgruppen wurden mit Trichloressigsäure entfernt (975 μl während einer Minute), gefolgt von einer Acetonitril-Wäsche. Alle Standard-Amidite (0,1 M) wurden zweimal pro Zyklus gekoppelt (die gesamte Kopplungsdauer betrug etwa 4 Minuten). Alle neuen Amidite wurden in trockenem Acetonitril (100 mg Amidit/1 ml Acetonitril) gelöst, um etwa 0,08 bis 0,1 M Lösungen zu ergeben. Die gesamte Kopplungsdauer betrug etwa 6 Minuten (105 μl zugeführtes Amidit). 1-H-Tetrazol in Acetonitril wurde als das Aktivierungsagens benutzt. Überschüssiges Amidit wurde mit Acetonitril weggewaschen. (1S)-(+)-(10-Camphersulfonyl)oxaziridin (CSO, 1,0 g CSO/8,72 ml trockenes Acetonitril) wurde benutzt, um Phosphodiester-Bindungen zu oxidieren (4-minütiger Warteschritt), wohingegen 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid (Beaucage-Reagens, 3,4 g Beaucage-Reagens/200 ml Acetonitril) benutzt wurde, um Phosphorothioat-Bindungen zu oxidieren (1- minütiger Warteschritt). Nichtumgesetzte Funktionalitäten wurden mit einem 50:50-Gemisch aus Tetrahydrofuran/Essigsäureanhydrid und Tetrahydrofuran/Pyridin/1-Methylimidazol verkappt. Die Tritylausbeuten wurden während der Dauer der Synthese mittels des Tritylmonitors überwacht. Die abschließende DMT-Gruppe wurde intakt belassen. Die Oligonukleotide wurden in 1 ml 28,0- bis 30%igem Ammoniumhydroxid (NH₄OH) während etwa 16 Stunden bei 55 °C entschützt. Oligonukleotide wurden auch in einem größeren Maßstab hergestellt (20 μmol/Synthese). Tritylgruppen wurden mit etwas mehr als 8 ml Trichloressigsäure entfernt. Alle Standard-Amidite (0,1 M) wurden zweimal pro Zyklus gekoppelt (13-minütiger Kopplungsschritt). Alle neuen Amidite wurden ebenfalls viermal pro Zyklus gekoppelt, jedoch wurde die Kopplungsdauer auf etwa 20 Minuten erhöht (480 μl Amidit zuführend). Die Oxidationsdauern blieben die gleichen, jedoch erhöhte sich die Zufuhr an Oxidationsmittel auf etwa 1,88 ml je Zyklus. Oligonukleotide wurden in 5 ml 28,0- bis 30%igem NH₄OH während etwa 16 Stunden bei 55 °C entschützt.
Tabelle I 3'-O-(2-Methoxyethyl)-haltige, 2'-5'-verknüpfte Oligonukleotide

¹Alle mit einem Stern versehenen Nukleoside enthalten 3'-O-(2-Methoxyethyl).

BEISPIEL 50
Allgemeine Arbeitsweise zur Reinigung von Oligonukleotiden
Im Anschluss an den Spaltungs- und den Entschützungsschritt wurden die Roholigonukleotide (wie z.B. diejenigen, die in Beispiel 49 synthetisiert wurden) unter Benutzung von 0,45-μm-Nylon-Acrodisc-Spritzenfiltern von Gelman vom CPG abfiltriert. Überschüssiges NH₄OH wurde in einem Savant AS160 Automatic Speedvac abgedampft. Die Rohausbeute wurde in einem Diodenarray-Spektrophotometer 8452A von Hewlett Packard bei 260 nm gemessen. Rohproben wurden dann in einem Elektrospray-Massenspektrometer von Hewlett Packard massenspektrometrisch (MS) und in einem Beckmann-P/ACE-System 5000 mittels Kapillar-Gelelektrophorese (CGE) analysiert. Trityl-On-Oligonukleotide wurden mittels präparativer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatograpie (HPLC) gereinigt. Die HPLC-Bedingungen waren wie folgt: Waters 600E mit Detektor 991; Säule Waters Delta Pak C4 (7,8 × 300 mm); Lösemittel A: 50 mM Triethylammoniumacetat (TEA-Ac), pH 7,0; B: 100 % Acetonitril; Durchflussgeschwindigkeit 2,5 ml/min; Gradient: 5 % B während der ersten fünf Minuten mit linearem Anstieg von B auf 60 % während der nächsten 55 Minuten. Größere Oligo-Ausbeuten aus den größeren 20-μmol-Synthesen wurden auf größeren HPLC-Säulen (Waters Bondapak HC18HA) gereinigt, und die Durchflussgeschwindigkeit wurde auf 5,0 ml/min erhöht. Geeignete Fraktionen wurden aufgefangen und Lösemittel im Speedvac weggetrocknet. Die Oligonukleotide wurden während etwa 45 Minuten in 80%iger Essigsäure detrityliert und wieder lyophilisiert. Freies Trityl und überschüssiges Salz wurden entfernt, indem die detritylierten Oligonukleotide durch Sephadex G-25 (Größenausschlusschromatographie) gegeben und geeignete Proben mittels eines Pharmacia-Fraktionensammlers aufgefangen wurden. Das Lösemittel wurde wieder in einem Speedvac abgedampft. Die gereinigten Oligonukleotide wurden dann mittels CGE, HPLC (Durchflussgeschwindigkeit 1,5 ml/min, Säule Waters Delta Pak C4, 3,9 × 300 mm) und MS auf Reinheit analysiert. Die Endausbeute wurde mittels eines Spektrophotometers bei 260 nm bestimmt.
Tabelle II Physikalische Kennzeichen von 3'-O-(2-Methoxyethyl)-haltigen 2'-5'-verknüpften Oligonukleotiden

²Bedingungen: Waters 600E mit Detektor 991; Säule Waters C4 (3,9 × 300 mm); Lösemittel A: 50 mM TEA-Ac, pH 7,0; B: 100 % Acetonitril; Durchflussgeschwindigkeit 1,5 ml/min; Gradient: 5 % B während der ersten fünf Minuten mit linearem Anstieg von B auf 60 % während der nächsten 55 Minuten.

BEISPIEL 51
Untersuchungen von T_m modifizierter Oligonukleotide
Oligonukleotide, die in den Beispielen 49 und 50 synthetisiert wurden, wurden durch Messung ihrer Schmelztemperatur (T_m) hinsichtlich ihrer relativen Fähigkeit beurteilt, an ihre komplementären Nukleinsäuren zu binden. Die Schmelztemperatur (T_m), eine kennzeichnende physikalische Eigenschaft von Doppelhelices, bezeichnet die Temperatur (in Grad Celsius), bei der 50 % helikale (hybridisiert) gegenüber Knäuel-Formen (unhybridisiert) vorliegen. T_m wird unter Benutzung des UV-Spektrums gemessen, um die Bildung und den Zerfall (Schmelzen) des Hybridisierungskomplexes zu bestimmen. Die Basenstapelung, die während der Hybridisierung erfolgt, ist von einer Verringerung der UV-Absorption (Hypochromizität) begleitet. Folglich zeigt eine Verringerung der UV-Absorption eine höhere T_m an. Je höher die T_m ist, desto größer ist die Festigkeit der Bindungen zwischen den Strängen.
Ausgewählte Prüf-Oligonukleotide und ihre komplementären Nukleinsäuren wurden mit einer Standardkonzentration von 4 μM für jedes Oligonukleotid in Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 0,1 mM EDTA) inkubiert. Die Proben wurden auf 90 °C erhitzt, und die Anfangsextinktion wurde unter Benutzung eines Guilford-Response-II-Spektrophotometers (Corning) erfasst. Die Proben wurden dann langsam auf 15 °C abkühlt, und dann wurde die Änderung der Extinktion bei 260 nm unter Erwärmen während des Wärmedenaturierungsvorganges überwacht. Die Temperatur wurde um 1 °C/Extinktionsablesung erhöht und das Denaturierungsprofil analysiert, indem die erste Ableitung der Schmelzkurve gebildet wurde. Die Daten wurden auch unter Benutzung einer linearen Zwei-Zustände-Regressionsanalyse analysiert, um die T_m = s zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Prüfungen für einige der Oligonukleotide von Beispiel 49 und 50 sind in Tabelle III unten gezeigt.
Tabelle III T_m Analyse von Oligonukleotiden

¹Alle mit einem Stern versehenen Nukleoside enthalten 3'-O-(2-Methoxyethyl).

BEISPIEL 52
NMR-Experimente an modifizierten Oligonukleotiden, Vergleich von 3',5'- mit 2',5'-Internukleotidbindungen und 2'-Substituenten mit 3'-Substituenten mittels NMR
Das 400-MHz-¹H-Spektrum des Oligomers d(GAU₂*CT), wobei U₂* = 2'-O-Aminohexyluridin, zeigte 8 Signale zwischen 7,5 und 9,0 ppm, die den 8 aromatischen Protonen entsprechen. Außerdem erscheint das anomere Proton von U* als ein Duplett bei 5,9 ppm mit J_1',2' = 7,5 Hz, was C2'-endo-Zuckerwellung anzeigt. Das entsprechende 2'-5'-gebundene Isomer zeigt eine ähnliche Struktur mit J_1',2' = 3,85 Hz bei 5,75 ppm, was eine RNA-Typ-Zuckerwellung am neuen Modifizierungsort anzeigt, die für die Hybridisierung mit einem mRNA-Ziel günstig ist. Das Protonenspektrum des Oligomers d(GACU₃*), wobei U₃* = 3'-O-Hexylamin, zeigte die erwarteten 7 aromatischen Protonensignale zwischen 7,5 und 9,0 ppm und das anomere Protonenduplett bei 5,9 ppm mit J_1',2' = 4,4 Hz. Dies weist auf eine C3'-endo-Wellung der 3'-O-Alkylamino-Verbindungen im höheren Maße im Vergleich zu ihren 2'-Analogen hin. Die ³¹P-NMR dieser Oligonukleotide zeigte die erwarteten 4 und 3 Signale von den Internukleotid-Phosphat-Bindungen für d(GAU*CT) bzw. d(GACU*). 3'-5'-gebundene gegenüber 2'-5'-gebundenen weisen bei der RP-HPLC unterschiedliche Retentionszeiten und folglich unterschiedliche Lipophilie auf, was ein möglicherweise unterschiedliches Ausmaß an Wechselwirkungen mit Zellmembranen andeutet.
BEISPIEL 53
T_m-Analyse von 2',5'-verbundenen Oligonukleotiden im Vergleich zu 3',5'-verbundenen Oligonukleotiden
Thermische Schmelzungen wurden gemäß standardisierter Arbeitsweisen in der Literatur durchgeführt. Die Oligonukleotid-Identität ist wie folgt: Oligonukleotid A ist ein normales 3'-5'-gebundenes Phosphodiester-Oligodesoxyribonukleotid mit der Sequenz d(GGC TGU* CTG CG) (SEQ ID NO: 16), wobei der * den Befestigungsort eines 2'- Aminoverbinders kennzeichnet. Oligonukleotid B ist ein normales 3'-5'-gebundenes Phosphodiester-Oligoribonukleotid mit der Sequenz d(GGC TGU* CTG CG), wobei der * den Befestigungsort eines 2'-Aminoverbinders kennzeichnet. Alle Ribonukleotide der Oligonukleotide mit Ausnahme desjenigen, das den *-Substituenten trägt, sind 2'-O-Methyl-Ribonukleotide. Das Oligonukleotid C weist 2'-5'-Bindung in der *-Position zusätzlich zu einem 3'-Aminoverbinder an diesem Ort auf. Der Rest des Oligonukleotids ist ein Phosphodiester-Oligodesoxyribonukleotid mit der Sequenz d(GGC TGU* CTG CG). Das zugrundeliegende Oligonukleotid (kein 2'-Aminoverbinder) war in die Untersuchung nicht einbezogen.
Tabelle IIIa
Die 2'-5'-Bindungen zeigten eine höhere Schmelztemperatur gegenüber einem RNA-Ziel im Vergleich zu einem DNA-Ziel.
BEISPIEL 54
Schlangengift-Phosphodiesterase- und Leber-Homogenat-Experimente zur Oligonukleotid-Stabilität
Die folgenden Oligonukleotide wurden gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 49 synthetisiert.
Tabelle IV Zur Beurteilung der Stabilität synthetisierte modifizierte Oligonukleotide

¹Alle einem Stern versehenen Nukleoside enthalten 3'-O-(2-Methoxyethyl). Alle Nukleoside mit einem # enthalten 2'-O-(2-Methoxyethyl).

Die Oligonukleotide wurden gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 50 gereinigt und hinsichtlich ihrer Struktur analysiert.
Tabelle V Eigenschaften modifizierter Oligonukleotide

¹Alle mit einem Stern versehenen Nukleoside enthalten 3'-O-(2-Methoxyethyl). Alle Nukleoside mit einem # enthalten 2'-O-(2-Methoxyethyl).
²Bedingungen: Waters 600E mit Detektor 991; Säule Waters C4 (3,9 × 300 mm); Lösemittel A: 50 mM TEA-Ac, pH 7,0; B: 100 % Acetonitril; Durchflussgeschwindigkeit 1,5 ml/min; Gradient: 5 % B während der ersten fünf Minuten mit linearem Anstieg von B auf 60 % während der nächsten 55 Minuten.

BEISPIEL 55
3'-O-Aminopropyl-modifizierte Oligonukleotide
Unter Befolgung der oben veranschaulichten Arbeitsweisen zur Synthese von Oligonukleotiden wurden außer den herkömmlichen Amiditen modifizierte 3'-Amidite benutzt, um die Oligonukleotide herzustellen, die in Tabelle VI und VII aufgeführt sind. Zu benutzten Nukleosiden gehören N⁶-Benzoyl-3'-O-propylphthalimido-A-2'-amidit, 2'-O-Propylphthaloyl-A-3'-amidit, 2'-O-Methoxyethyl-thymidin-3'-amidit (RIC, Inc.), 2'-O-MOE-G-3'-amidit (RI Chemical), 2'-O-Methoxyethyl-5-methylcytidin-3'-amidit, 2'-O-Methoxyethyl-adenosin-3'-amidit (RI Chemical) und 5-Methylcytidin-3'-amidit. 3'-Propylphthalimido-A und 2'-Propylphthalimido-A wurden als der feste LCA-CPG-Träger benutzt. Die erforderlichen Mengen der Amidite wurden in getrocknete Fläschchen gegeben, in Acetonitril gelöst (unmodifizierte Nukleoside wurden zu 1 M Lösungen hergestellt und modifizierte Nukleoside zu 100 mg/ml) und in einem Millipore-Expedite^TM-Nukleinsäuresynthesesystem mit den geeigneten Pforten verbunden. Festes Trägerharz (60 mg) wurde in jeder Säule für die Synthese im 2-x-1-μmol-Maßstab benutzt (für jedes Oligo wurden 2 Säulen benutzt). Die Synthese wurde unter Benutzung der Kopplungsvorschrift IBP-PS (1 μmol) für Phosphorothioat-Rückgrate und CSO-8 für Phosphodiester durchgeführt. Die Trityl-Berichte zeigten normale Kopplungsergebnisse an.
Nach der Synthese wurden die Oligonukleotide während etwa 16 h bei 55 °C mit konz. Ammoniumhydroxid (aq), das 10 einer Lösung von 40%igem Methylamin (aq) enthielt, entschützt. Dann wurden sie unter Benutzung eines Savant AS160 Automatic SpeedVac eingedampft (um Ammoniak zu entfernen) und filtriert, um das CPG-Harz zu entfernen. Die Rohproben wurden mittels MS, HPLC und CE analysiert. Dann wurden sie in einem HPLC-System Waters 600E mit einem Detektor 991 unter Benutzung einer präparativen Säule Waters C4 (Alice C4 Prep.) und den folgenden Lösemitteln A: 50 mM TEA-Ac, pH 7,0, und B: Acetonitril unter Benutzung des AMPREP2@-Verfahrens gereinigt. Nach der Reinigung wurden die Oligonukleotide zur Trockne eingedampft und dann während etwa 30 min mit 80%iger Essigsäure bei Raumtemperatur detrityliert. Dann wurden sie eingedampft. Die Oligonukleotide wurden in konz. Ammoniumhydroxid gelöst und dann durch eine Säule gegeben, die Sephadex G-25 enthielt, wobei Wasser als das Lösemittel und ein Fraktionensammler Pharmacia LKB SuperFrac benutzt wurden. Die resultierenden gereinigten Oligonukleotide wurden eingedampft und mittels MS, CE und HPLC analysiert.
Tabelle VI Oligonukleotide, die Aminopropyl-Substituenten tragen

¹Alle unterstrichenen Nukleoside tragen einen 2'-O-Methoxyethyl-Substituenten; Internukleotidbindungen in PS/PO-Oligonukleotiden sind durch die tiefgestellten Darstellungen > s = bzw. > o = gekennzeichnet; A* = 3'-Aminopropyl-A; A* = 2'-Aminopropyl-A; C = 5-Methyl-C

Tabelle VII Aminopropyl-modifizierte Oligonukleotide
BEISPIEL 56
In-vivo-Stabilität modifizierter Oligonukleotide
Die in-vivo-Stabilität ausgewählter modifizierter Oligonukleotide, die in den Beispielen 49 und 55 synthetisiert wurden, wurde in BALB/c-Mäusen bestimmt. Im Anschluss an eine einzelne intravenöse Verabreichung von 5 mg/kg Oligonukleotid wurden in verschiedenen Zeitabständen Blutproben gezogen und mittels CGE analysiert. Für jedes geprüfte Oligonukleotid wurden 9 männliche BALB/c-Mäuse (Charles River, Wilmington, MA), die etwa 25 g wogen, benutzt. Im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierung erhielten die Mäuse eine einzelne Schwanzveneninjektion von Oligonukleotid (5 mg/kg), verabreicht in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,0. An jeder Gruppe wurden eine retrobulbäre (entweder nach 0,25, 0,5, 2 oder 4 h nach Gabe) und eine terminale Blutentnahme (entweder 1, 3, 8 oder 24 h nach Gabe) vorgenommen. Die terminale Blutentnahme (etwa 0,6 bis 0,8 ml) erfolgte mittels Herzpunktion im Anschluss an Ketamin/Xylazin-Anästhesie. Das Blut wurde in ein mit EDTA beschichtetes Sammelröhrchen überführt und zentrifugiert, um Plasma zu erhalten. Zum Abschluss wurden jeder Maus die Leber und die Nieren entnommen. Plasma und Gewebehomogenate wurden zur Analyse benutzt, um den intakten Oligonukleotid-Gehalt mittels CGE zu bestimmen. Alle Proben wurden nach der Gewinnung unverzüglich auf Trockeneis eingefroren und bis zur Analyse bei –80 °C aufbewahrt.
Die CGE-Analyse zeigte die relative Nukleasebeständigkeit 2',5'-gebundener Oligomere im Vergleich zu ISIS 11061 (Tabelle III, Beispiel 51) (einheitliches 2'-Desoxyphosphorothioat-Oligonukleotid, gezielt auf Maus-c-Raf). Aufgrund der Nukleasebeständigkeit der 2',5'-Bindung in Verbindung mit der Tatsache, dass 3'-Methoxyethoxy-Substituenten gegenwärtig sind und für weiteren Nukleaseschutz sorgen, wurde festgestellt, dass die Oligonukleotide ISIS 17176, ISIS 17177, ISIS 17178, ISIS 17180, ISIS 17181 und ISIS 21415 in Plasma stabiler waren, ISIS 11061 (Tabelle III) jedoch nicht. Ähnliche Beobachtungen wurden an Nieren- und Lebergewebe gemacht.
Dies deutet an, dass 2',5'-Bindungen mit 3'-Methoxyethoxy-Substituenten in Plasma, Niere und Leber gegenüber 5'-Exonukleasen und 3'-Exonukleasen ausgezeichnete Nukleasebeständigkeit bieten. Somit können Oligonukleotide mit längeren Wirkdauern durch Einbinden sowohl der 2',5'-Bindung als auch der 3'-Methoxyethoxy-Motive in ihre Struktur aufgebaut werden. Es wurde auch festgestellt, dass die 2',5'-Phosphorothioat-Bindungen stabiler sind als 2',5'-Phosphodiester-Bindungen. In 4 ist eine Aufzeichnung des Prozentsatzes von Oligonukleotid mit voller Länge dargestellt, das in Plasma eine Stunde nach der Verabreichung eines intravenösen Bolus von 5 mg/kg Oligonukleotid intakt bleibt.
In 5 ist eine Aufzeichnung des Prozentsatzes von Oligonukleotid mit voller Länge dargestellt, das in Gewebe 24 Stunden nach der Verabreichung eines intravenösen Bolus von 5 mg/kg Oligonukleotid intakt bleibt.
In 6 sind CGE-Spuren von Prüf-Oligonukleotiden und einem Standard-Phosphorothioat-Oligonukleotid in sowohl Mausleberproben als auch Mausniereproben nach 24 Stunden dargestellt. Wie durch diese Spuren offensichtlich ist, ist bei den Oligonukleotiden der Erfindung im Vergleich zu dem Standard, der in Tafel A gezeigt ist, eine größere Menge an intaktem Oligonukleotid vorhanden. Das Oligonukleotid, das in Tafel B gezeigt ist, wies einen Substituenten der Erfindung an jedem der 5'- und 3'-Enden eines Phosphorothioat-Oligonukleotids auf, wohingegen das Phosphorothioat-Oligonukleotid, das in Tafel C gezeigt ist, einen Substituenten an dem 5'-Ende und zwei an dem 3'-Ende aufwies. Das Oligonukleotid von Tafel D weist einen Substituenten der Erfindung auf, der in eine 2',5'-Phosphodiester-Bindung sowohl an seinem 5'- als auch 3'-Ende eingebunden ist. Obwohl es weniger stabil als das Oligonukleotid ist, das in Tafel B und C gezeigt ist, ist es stabiler als das vollständige Standard-Phosphorothioat-Oligonukleotid von Tafel A.
BEISPIEL 57
Kontrolle der c-Raf-Botschaft in bEND-Zellen unter Benutzung modifizierter Oligonukleotide
Um die Aktivität einiger der Oligonukleotide festzustellen, wurde ein in-vitro-Zellkulturassay benutzt, mit dem das zelluläre Ausmaß an c-Raf-Expression in bEND-Zellen gemessen wird.
Zellen und Reagenzien
Die bEnd.3-Zelllinie, ein Gehirn-Endothelioma, wurde von Dr. Werner Risau (Max-Planck-Institut) erhalten. Opti-MEM, Trypsin-EDTA und DMEM mit hohem Glucosegehalt wurden von Gibco-BRL (Grand Island, NY) bezogen. Dulbeccos PBS wurde von Irvine Scientific (Irvine, CA) bezogen. Sterile Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen und Facsflow-Lösung wurden von Becton Dickinson (Mansfield, MA) bezogen. Ultrareiner Formaldehyd wurde von Polysciences (Warrington, PA) bezogen. NAP-5-Säulen wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) bezogen.
Oligonukleotid-Behandlung
Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen mit DMEM, das 4,5 g/l Glucose und 10 % FBS enthielt, auf etwa 75 Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden dreimal mit Opti-MEM, vorgewärmt auf 37 °C, gewaschen. Das Oligonukleotid wurde mit einem kationischen Lipid (Lipofectin-Reagens, GIBCO/BRL) vorgemischt und in einer Reihe auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und für eine 4-stündige Inkubation bei 37 °C auf die gewaschenen Zellen überführt. Die Medien wurden dann entfernt und für die Northern-Blot-Analyse von mRNA für 24 Stunden mit normalen Wachstumsmedien ersetzt.
Northern-Blot-Analyse
Zur Bestimmung von mRNA-Gehalten mittels der Northern-Blot-Analyse wurde die gesamte RNA 24 h nach dem Beginn der Oligonukleotidbehandlung mittels der Guanidiniumisothiocyanat-Arbeitsweise (Monia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 15.481 bis 15.484) aus Zellen präpariert. Die gesamte RNA wurde mittels Zentrifugieren der Zelllysate auf einem CsCl-Kissen isoliert. Die Northern-Blot-Analyse, die RNA-Quantifizierung und -Normalisierung auf G#PDH-mRNA-Gehalte wurden gemäß einer beschriebenen Arbeitsweise (Dean und McKay, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11.762 bis 11.766) durchgeführt. In bEND-Zellen zeigten die 2-,5-gebundenen 3'-O-Methoxyethyl-Oligonukleotide eine Verringerung der c-Raf-Botschaftsaktivität als eine Funktion der Konzentration. Die Tatsache, dass diese modifizierten Oligonukleotide die Aktivität beibehielten, verspricht verringerte Dosierungsfrequenz bei diesen Oligonukleotiden, die auch erhöhte in-vivo-Nukleasebeständigkeit zeigen. Alle 2',5'-gebundenen Oligonukleotide behielten die Aktivität des Eltern-11061-Oligonukleotids (Tabelle III) und verbesserten die Aktivität noch weiter. Ein Schaubild der Wirkung der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung auf die c-Raf-Expression (im Vergleich zur Kontrollprobe) in bEND-Zellen ist in 7 gezeigt.
BEISPIEL 58
Synthese von MMI-haltigen Oligonukleotiden
a. Bis-2'-O-methyl-MMI-Bausteine
Die Synthese dimerer MMI-Bausteine (d.h. R = CH₃) ist früher beschrieben worden (siehe z.B. Swayze et al., Synlett 1997, 859; Sanghvi et al., Nucleosides & Nucleotides 1997, 16, 907; Swayze et al., Nucleosides & Nucleotides 1997, 16, 971; Dimock et al., Nucleosides & Nucleotides 1997, 16, 1. 629). Allgemein wurden 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-methyl-3'-C-formyl-Nukleoside mit 5'-O-(N-Methylhydroxylamino)-2'-O-methyl-3'-O-TBDPS-Nukleosiden unter Benutzung von 1 Äquivalent BH₃-Pyridin/1 Äquivalent Pyridinium-para-toluolsulfonat (PPTS) in 3:1 MeOH/THF kondensiert. Die entstandenen dimeren MMI-Blöcke wurden dann in dem unteren Teil des Zuckers mit 15 Äquivalenten Et₃N-2HF in THF entschützt. So wurde die T*G^iBu-Dimereinheit synthetisiert und phosphityliert, um T*G(MMI)-Phosphoramidit zu ergeben. In einer ähnlichen Weise wurde A^BZ*T(MMI)-Dimer synthetisiert, succinyliert und an poröses Glas angehängt.
b. Oligonukleotid-Synthese
Oligonukleotide wurden in einem Nukleinsäuresynthesesystem Perseptive Biosystems Expedite 8901 synthetisiert. Mehrere 1-μmol-Synthesen wurden für jedes Oligonukleotid durchgeführt. Fester A*_MMIT-Träger wurde in die Säule gegeben. Tritylgruppen wurden mit Trichloressigsäure entfernt (975 μl während einer Minute), gefolgt von einer Acetonitril-Wäsche. Das Oligonukleotid wurde unter Benutzung einer modifizierten Thioat-Vorschrift aufgebaut. Standard-Amidite wurden in dieser Vorschrift über einen Zeitraum von 3 Minuten zugeführt (210 μl). Das T*_MMIG-Amidit wurde unter Benutzung von 210 μl während insgesamt 20 Minuten doppelt gekoppelt. Die Menge an Oxidationsmittel, 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid (Beaucage-Reagens, 3,4 g Beaucage-Reagens/200 ml Acetonitril), betrug 225 μl (einminütiger Warteschritt). Die nichtumgesetzten Nukleoside wurden mit einem 50:50-Gemisch aus Tetrahydrofuran/Essigsäureanhydrid und Tetrahydrofuran/Pyridin/1-Methylimidazol verkappt. Die Tritylausbeuten wurden während der Dauer der Synthese mittels des Tritylmonitors verfolgt. Die abschließende DMT-Gruppe wurde intakt belassen. Nach der Synthese wurde der Inhalt der Synthesepatrone (1 μmol) in ein Pyrex-Fläschchen überführt und das Oligonukleotid unter Benutzung von 5 ml 30%igem Ammoniumhydroxid (NH₄OH) während etwa 16 Stunden bei 55 °C von dem porösen Glas (CPG) abgespalten.
c. Oligonukleotid-Reinigung
Nach dem Entschützungsschritt wurden die Proben unter Benutzung von 0,45-μm-Nylon-Aerodisc-Spritzenfiltern vom CPG abfiltriert. Überschüssiges NH₄OH wurde in einem Savant AS160 Automatic SpeedVac abgedampft. Die Rohausbeute wurde in einem Diodenarray-Spektrophotometer 8452A von Hewlett Packard bei 260 nm gemessen. Die Rohproben wurden dann in einem Elektrospray-Massenspektrometer von Hewlett Packard massenspektrometrisch (MS) analysiert. Die Trityl-On-Oligonukleotide wurden mittels präparativer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatograpie (HPLC) gereinigt. Die HPLC-Bedingungen waren wie folgt: Waters 600E mit Detektor 991; Säule Waters Delta Pak C4 (7,8 × 300 mm); Lösemittel A: 50 mM Triethylammoniumacetat (TEA-Ac), pH 7,0; B: 100 % Acetonitril; Durchflussgeschwindigkeit 2,5 ml/min; Gradient: 5 % B während der ersten fünf Minuten mit linearem Anstieg von B auf 60 % während der nächsten 55 Minuten. Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten (Retentionszeit = 41 min für DMT-ON-16314; Retentionszeit = 42,5 min für DMT-ON-16315), wurden aufgefangen, und das Lösemittel wurde in dem SpeedVac weggetrocknet. Die Oligonukleotide wurden während etwa 60 Minuten in 80%iger Essigsäure detrityliert und wieder lyophilisiert. Freies Trityl und überschüssiges Salz wurden entfernt, indem die detritylierten Oligonukleotide durch Sephadex G-25 (Größenausschlusschromatographie) gegeben und geeignete Proben mittels eines Pharmacia-Fraktionensammlers aufgefangen wurden. Das Lösemittel wurde wieder in einem Speedvac abgedampft. Die gereinigten Oligonukleotide wurden dann mittels CGE, HPLC (Durchflussgeschwindigkeit 1,5 ml/min; Säule Waters Delta Pak C4, 3,9 × 300 mm) und MS auf Reinheit analysiert. Die Endausbeute wurde mittels eines Spektrophotometers bei 260 nm bestimmt.
Die synthetisierten Oligonukleotide und ihre physikalischen Kennzeichen sind in Tabelle VIII bzw. IX gezeigt. Alle mit einem Stern versehenen Nukleoside enthalten MMI-Bindung.
Tabelle VIII ICAM-1-Oligonukleotide, die MMI-Dimere enthalten und für in-vivo-Nuklease- und pharmakologische Untersuchungen synthetisiert wurden
Tabelle IX Physikalische Kennzeichen von MMI-Oligomeren, die für pharmakologische und in-vivo-Nuklease-Untersuchungen synthetisiert wurden
HPLC-Bedingungen: Waters 600E mit Detektor 991; Säule Waters C4 (3,9 × 300 mm); Lösemittel A: 50 mM TEA-Ac, pH 7,0; B: 100 % Acetonitril; Durchflussgeschwindigkeit 1,5 ml/min; Gradient: 5 % B während der ersten fünf Minuten mit linearem Anstieg von B auf 60 % während der nächsten 55 Minuten.
BEISPIEL 59
Synthese von Sp-terminalem Oligonukleotid
a. 3'-O-t-Butyldiphenylsilyl-thymidin (1)
5'-O-Dimethoxytritylthymidin wird mit 1 Äquivalent t-Butyldiphenylsilylchlorid (TBDPSCl) und 2 Äquivalenten Imidazol in Lösemittel DMF bei Raumtemperatur silyliert. Die 5'-Schutzgruppe wird durch Behandeln mit 3 Dichloressigsäure in CH₂Cl₂ entfernt.
b. 5'-O-Dimethoxytrityl-thymidin-3'-O-yl-N,N-diisopropylamino(S-pivaloyl-2-mercaptoethoxy)phosphoramidit (2)
5'-O-Dimethoxytrityl-thymidin wird mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-S-pivaloyl-2-mercaptoethoxyphosphoramidit und Tetrazol in CH₂Cl₂/CH₃CN, wie beschrieben von Guzaev et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1998, 8, 1.123, behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.
c. 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-desoxy-adenosin-3'-O-yl-N,N-diisopropylamino(5-pivaloyl-2-mercaptoethoxy)phosphoramidit (3)
5'-O-Dimethoxytrityl-N-6-benzoyl-2'-desoxy-adenosin wird wie in dem vorhergehenden Beispiel phosphityliert, um das gewünschte Amidit zu erhalten.
d. 3'-O-t-Butyldiphenylsilyl-2'-desoxy-N₂-isobutyryl-guanosin (4)
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-desoxy-N₂-isobutyryl-guanisin wird mit TBDPSC1 und Imidazol in DMF silyliert. Das 5'-DMT wird dann mit 3 % DCA in CH₂Cl₂ entfernt.
e. T_(Sp)G-Dimere und T_(S)-Phosphoramidit
Verbindung 4 und 2 werden unter Benutzung von 1H-Tetrazol in Lösemittel CH₃CN kondensiert (1:1 Äquivalent), gefolgt von Sulfurierung unter Einsatz von Beaucage-Reagens (siehe z.B. Iyer et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 4.693). Die Dimere (TG) werden mittels Säulenchromatographie getrennt und die Silylgruppe unter Benutzung von t-Butylammoniumfluorid/THF entschützt, um Rp- und Sp-Dimere von TSG zu ergeben. Kleine Mengen dieser Dimere werden vollständig entschützt und entweder mit P1-Nuklease oder mit Schlangengift-Phosphodiesterase behandelt. Das R-Isomer ist gegenüber P1-Nuklease beständig und wird von SVPD hydrolysiert. Das S-Isomer ist gegenüber SVPD beständig und wird von P1-Nuklease hydrolysiert. Das Sp-Isomer des vollständig geschützten T_SG-Dimers wird phosphityliert, um DMT-T-Sp-G-Phosphoramidit zu ergeben.
f . A_ST-Dimere und fester Träger, der A_SPT-Dimer enthält
Verbindung 3 und 1 werden unter Benutzung von 1H-Tetrazol in Lösemittel CH₃CN kondensiert, gefolgt von Sulfurierung, um AT-Dimere zu ergeben. Die Dimere werden mittels Säulenchromatographie getrennt und die Silylgruppe mit TBAF/THF entschützt. Die Konfigurationszuweisungen werden allgemein wie in dem vorherigen Beispiel durchgeführt. Das Sp-Isomer wird dann gemäß Standard-Arbeitsweisen an poröses Glas angehängt, um DMT-A_SP-T-CPG-Oligomerisierung mit chiral reinen Sp-Dimereinheiten an den Termini zu ergeben.
g. Oligonukleotid-Synthese
Das Oligonukleotid mit der Sequenz T*GC ATC CCC CAG GCC ACC A*T wird synthetisiert, wobei T*G und A*T oben beschriebene chirale Sp-Dimerblöcke darstellen. DMT-A_SP-T-CPG wird in die Synthesesäule eingebracht, und die nächsten 16b-Reste werden unter Benutzung von Standard-Phosphorothioat-Vorschriften und 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid als dem Sulfurierungsagens aufgebaut. Nach dem Aufbauen dieser 18-mer-Einheit, gefolgt von der abschließenden Detritylierung, wird das chirale Sp-Dimer-Phosphoramidit von 5'-DMT-T_SP-G-amidit gekoppelt, um das gewünschte Antisense-Oligonukleotid zu ergeben. Diese Verbindung wird dann in 30%iger NH₄OH während 16 Stunden entschützt und das Oligomer in einer HPLC-Säule gereinigt und in einer Sephadex-G-25-Säule entsalzt. Das fertige Oligomer weist an dem 5'-Terminus und dem 3'-Terminus Sp-Konfiguration und der Innenteil eine diastereomere Mischung aus Rp- und Sp-Konfiguration auf.
BEISPIEL 60
Beurteilung der in-vivo-Stabilität von MMI-verkappten Oligonukleotiden, Maus-Experiment-Arbeitsweise
Für jedes geprüfte Oligonukleotid wurden 9 männliche BALB/c-Mäuse (Charles River, Wilmington, MA), die etwa 25 g wogen, benutzt (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923). Im Anschluss an eine 1-wöchige Akklimatisierung erhielten Mäuse eine einzelne Schwanzveneninjektion von Oligonukleotid (5 mg/kg), das in phosphatgepufferter Salzlösung (SBS), pH 7,0, verabreicht wurde. An jeder Gruppe wurden eine retrobulbäre (entweder nach 0,25, 0,5, 2 oder 4 h nach Gabe) und eine terminale Blutentnahme (entweder 1, 3, 8 oder 24 h nach Gabe) vorgenommen. Die terminale Blutentnahme (etwa 0,6 bis 0,8 ml) erfolgte mittels Herzpunktion im Anschluss an Ketamin/Xylazin-Anästhesie. Das Blut wurde in ein mit EDTA beschichtetes Sammelröhrchen überführt und zentrifugiert, um Plasma zu erhalten. Zum Abschluss wurden jeder Maus die Leber und die Nieren entnommen. Plasma und Gewebehomogenate wurden zur Analyse benutzt, um den intakten Oligonukleotid-Gehalt mittels CGE zu bestimmen. Alle Proben wurden nach der Gewinnung unverzüglich auf Trockeneis eingefroren und bis zur Analyse bei –80 °C aufbewahrt.
Die kapillar-gelelektrophoretische Analyse zeigte die relative Nukleasebeständigkeit MMI-verkappter Oligomere im Vergleich zu ISIS 3082 an (einheitliches 2'-Desoxyphosphorothioat). Aufgrund der Beständigkeit der MMI-Bindung gegenüber Nukleasen wurde festgestellt, dass die Verbindung 16314 in Plasma stabil war, 3082 dagegen nicht. Jedoch zeigte die Verbindung 16314 in Niere und Leber auch ein gewisses Ausmaß an Abbau. Dies deutet an, dass, während 3'-Exonuklease in Plasma wichtig ist, 5'-Exonukleasen oder -Endonukleasen in Geweben aktiv sein können. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden die Daten von 16315 analysiert. In Plasma sowie in Geweben (Leber und Niere) war die Verbindung zu mehreren Zeitpunkten stabil (1, 3 und 24 h). Die Tatsache, dass kein Abbau nachgewiesen wurde, bewies, dass 5'-Exonukleasen und 3'-Exonukleasen in Geweben vorherrschend sind und Endonukleasen nicht aktiv sind. Zudem ist eine einzelne Bindung (MMI- oder Sp-Thioat-Bindung) als ein Pförtner gegen Nukleasen ausreichend.
Kontrolle von ICAM-1-Expressionszellen und Reagenzien
Die bEnd.3-Zelllinie, ein Gehirn-Endothelioma, war die freundliche Gabe von Dr. Werner Risau (Max-Planck-Institut). Opti-MEM, Trypsin-EDTA und DMEM mit hohem Glucosegehalt wurden von Gibco-BRL (Grand Island, NY) bezogen. Dulbeccos PBS wurde von Irvine Scientific (Irvine, CA) bezogen. Sterile Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen und Facsflow-Lösung wurden von Becton Dickinson (Mansfield, MA) bezogen. Ultrareiner Formaldehyd wurde von Polysciences (Warrington, PA) bezogen. Rekombinantes menschliches TNF-a wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) bezogen. Maus-Interferon-γ wurde von Genzyme (Cambridge, MA) bezogen. Fraktion V, BSA wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Die Maus-ICAM-1-PE-, VCAM-1-FITC-, Hamster-IgG-FITC- und Ratte-IgG_2a-PE-Antikörper wurden von Pharmingen (San Diego, CA) bezogen. Zeta-Probe-Nylon-Blotting-Membran wurde von Bio-Rad (Richmond, CA) bezogen. QuickHyb-Lösung wurde von Stratagene (La Jolla, CA) bezogen. Ein cDNA-Markierungskit, Prime-a-Gene, wurde von ProMega (Madison, WI) bezogen. NAP-5-Säulen wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) bezogen.
Oligonukleotid-Behandlung
Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen mit DMEM, das 4,5 g/l Glucose und 10 % FBS enthielt, auf 75 % Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden dreimal mit Opti-MEM, vorgewärmt auf 37 °C, gewaschen. Oligonukleotid wurde mit Opti-MEM vorgemischt und in einer Reihe auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und für eine 4-stündige Inkubation bei 37 °C auf gewaschene Zellen überführt. Medien wurden entfernt und durch normale Wachstumsmedien mit oder ohne 5 ng/ml TNF-α und 200 E/ml Interferon-γ ersetzt, zur Northern-Blot-Analyse von mRNA für 2 Stunden oder zur durchflusszytometrischen Analyse der Zelloberflächen-Proteinexpression über Nacht inkubiert.
Durchflusszytometrie
Nach der Oligonukleotidbehandlung wurden die Zellen mittels einer kurzen Behandlung mit Trypsin-EDTA (1 bis 2 min) von den Platten abgelöst. Die Zellen wurden in Polystyrolröhrchen von 12 × 75 mm überführt und mit 2 BSA, 0,2 % Natriumazid in DPBS bei 4 °C gewaschen. Die Zellen wurden mit 1.000 U/min in einer Beckman-GPR-Zentrifuge zentrifugiert, und der Überstand wurde dann abdekantiert. ICAM-1-, VCAM-1- und die Kontroll-Antikörper wurden mit 1 μg/ml zu 0,3 ml des obigen Puffers gegeben. Die Antikörper wurden mit den Zellen während 30 Minuten bei 4 °C im Dunkeln unter behutsamem Rühren inkubiert. Die Zellen wurden wieder wie oben gewaschen und dann in 0,3 ml FacsFlow-Puffer mit 0,5 % extrem reinem Formaldehyd wieder suspendiert. Die Zellen wurden in einem Becton-Dickinson-FACScan analysiert. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Kontrollexpression angegeben, der wie folgt berechnet wurde: [((CAM-Expression für Oligonukleotid-behandelte, Cytokin-induzierte Zellen) – (basale CAM-Expression))/((Cytokin-induzierte CAM-Expression)-(basale CAM-Expression))] × 100. Bei den Experimenten, in die kationische Lipide einbezogen waren, wurden sowohl basale als auch Cytokin-behandelte Kontrollzellen 4 Stunden lang mit Lipofection in Abwesenheit von Oligonukleotiden behandelt.
Die Ergebnisse zeigen Folgendes: 1) Isis 3082 zeigte eine erwartete Dosisreaktion (25 bis 200 nM); 2) Isis 13001 verlor seine Fähigkeit, ICAM-1-Expression zu hemmen, wie erwartet von einer Fehlpaarungsverbindung, was somit einen Antisense-Mechanismus beweist; 3) 3'-MMI-verkapptes Oligomer 16314 verbesserte die Aktivität von 3082 und war bei einer Konzentration von 200 nM fast doppelt so aktiv wie 3082; 4) 5'- und 3'-MMI-verkapptes Oligomer ist die potenteste Verbindung und ist bei Konzentrationen von 100 und 200 nM fast 4- bis 5-mal wirksamer als die Elternverbindung.
Somit erhöhte verbesserte Nukleasebeständigkeit die Potenz von Antisense-Oligonukleotiden.
BEISPIEL 61
Kontrolle der H-Ras-Expression
Antisense-Oligonukleotide, die auf die H-Ras-Botschaft zielen, wurden auf ihre Fähigkeit hin geprüft, die Produktion von H-Ras-mRNA in T-24-Zellen zu hemmen. Für diese Prüfungen wurden T-24-Zellen auf Platten mit 6 Vertiefungen gegeben und dann mit verschiedenen steigenden Konzentrationen an Oligonukleotid in der Gegenwart von kationischem Lipid (Lipofectin, GIBCO) im Verhältnis von 2,5 μg/ml Lipofectin pro 100 nM Oligonukleotid behandelt. Die Oligonukleotid-Behandlung wurde 4 Stunden lang in serumfreien Medien durchgeführt. Achtzehn Stunden nach der Behandlung wurde die gesamte RNA gewonnen und mittels Northern-Blot auf H-Ras-mRNA und Kontrollgen G3PDH analysiert. Die Daten sind in 8 und 9 in Balkendiagrammen als Prozentsatz der Kontrolle, normalisiert für das G3PDH-Signal, dargestellt. Wie erkannt werden kann, zeigte das Oligonukleotid mit einer einzelnen MMI-Bindung in jeder der Flankenregionen bedeutende Verringerung an H-Ras-mRNA.
BEISPIEL 62
5-Lipoxygenase-Analyse und -Assays
A. Therapeutika
Zur therapeutischen Anwendung wird ein Tier, von dem vermutet wurde, dass es eine Krankheit aufwies, die durch ein übermäßiges oder anormales Angebot an 5-Lipoxygenase gekennzeichnet ist, durch Verabreichen einer Verbindung der Erfindung behandelt. Der Durchschnittsfachmann kann die optimalen Dosierungen, Dosiermethoden und Wiederholungsraten leicht bestimmen. Solch eine Behandlung wird im Allgemeinen fortgesetzt, bis entweder eine Heilung bewirkt ist oder eine Verminderung des Krankheitszustandes erzielt ist. Bei einigen Krankheiten ist eine Langzeitbehandlung wahrscheinlich.
B. Forschungsreagenzien
Die Oligonukleotide der Erfindung werden auch als Forschungsreagenzien nützlich sein, wenn sie benutzt werden, um 5-Lipoxygenase-mRNA in rohen Zelllysaten oder in teilweise gereinigten oder vollständig gereinigten RNA-Zubereitungen zu spalten oder in einer anderen Weise abzuändern. Diese Anwendung der Erfindung wird beispielsweise durch Lysieren von Zellen mittels Standardverfahren, optimales Extrahieren der RNA und anschließendes Behandeln derselben mit einer Zusammensetzung in Konzentrationen im Bereich von z.B. etwa 100 bis etwa 500 ng pro 10 mg Gesamt-RNA in einem Puffer, der beispielsweise aus 50 mm Phosphat besteht, pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 10, bei einer Temperatur von etwa 30 bis etwa 50 °C durchgeführt. Die gespaltene 5-Lipoxygenase-RNA kann mittels Agarosegel-Elektrophorese und Hybridisierung mit radioaktiv markierten DNA-Sonden oder mittels anderer Standardverfahren analysiert werden.
C. Diagnostika
Die Oligonukleotide der Erfindung werden auch in diagnostischen Anwendungen nützlich sein, insbesondere zur Bestimmung der Expression spezifischer mRNA-Spezies in verschiedenen Geweben oder der Expression von anormalen oder Mutanten-RNA-Spezies. In diesem Beispiel würden die Makromoleküle, während sie auf eine anormale mRNA zielen, da sie zu der anormalen Sequenz komplementär gestaltet sind, nicht mit normaler mRNA hybridisieren. Gewebeproben können homogenisiert und RNA mittels Standardverfahren extrahiert werden. Das Rohhomogenat oder der Extrakt kann beispielsweise behandelt werden, um die Spaltung der Ziel-RNA zu bewirken. Das Produkt kann dann mit einem festen Träger hybridisiert werden, der ein gebundenes Oligonukleotid enthält, das komplementär zu einer Region auf der 5'-Seite des Spaltortes ist. Sowohl die normale als auch die anormale 5'-Region der mRNA würden an den festen Träger binden. Die 3'-Region der anormalen RNA, die gespalten wird, würde nicht an den Träger gebunden und daher von der normalen mRNa abgetrennt werden.
Zur Abänderung anvisierte mRNA-Spezies beziehen sich auf 5-Lipoxygenase; der Durchschnittsfachmann wird jedoch verstehen, dass die vorliegende Erfindung nicht so eingeschränkt ist und allgemein anwendbar ist. Es wird erwartet, dass die Hemmung oder Abänderung der Produktion des Enzyms 5-Lipoxygenase bedeutenden therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von Krankheit aufweist. Um die Wirksamkeit der Zusammensetzungen zu bestimmen, ist ein Assay oder eine Reihe von Assays erforderlich.
D. In-vitro-Assays
Bei den Zellassays für 5-Lipoxygenase wird vorzugsweise die menschliche promyelozytische Leukämie-Zelllinie HL-60 benutzt. Diese Zellen können durch verschiedene bekannte Agenzien veranlasst werden, in entweder eine monozytartige oder eine neutrophile Zelle zu differenzieren. Es ist bekannt, dass die Behandlung der Zellen mit 1,3%igem Dimethylsulfoxid, DMSO, die Differenzierung der Zellen in neutrophile begünstigt. Es ist jetzt festgestellt worden, dass basale HL-60-Zellen keine nachweisbaren Gehalte an 5-Lipoxygenase-Protein synthetisieren oder Leukotriene (ein Nachfolgeprodukt von 5-Lipoxygenase) sekretieren. Die Differenzierung der Zellen mit DMSO verursacht ein Auftreten des 5-Lipoxygenase-Proteins und der Leukotrien-Biosynthese 48 Stunden nach der Zugabe von DMSO. Daher kann die Induktion der 5-Lipoxygenase-Proteinsynthese als ein Prüfsystem zur Analyse von Oligonukleotiden benutzt werden, die in die 5-Lipoxygenase-Synthese in diesen Zellen eingreifen.
Bei einem zweiten Prüfsystem für Oligonukleotide bedient man sich der Tatsache, dass 5-Lipoxygenase deswegen ein „Selbstmord"-Enzym ist, weil es sich beim Reagieren mit Substrat selbst inaktiviert. Die Behandlung differenzierter HL-60- oder anderer Zellen, die 5-Lipoxygenase exprimieren, mit 10 μM A23187, einem Calciumionophoren, begünstigt die Translokation von 5-Lipoxygenase von dem Zytosol zu der Membran mit nachfolgender Aktivierung des Enzyms. Im Anschluss an die Aktivierung und mehrere Katalysedurchgänge wird das Enzym katalytisch inaktiv. Somit inaktiviert die Behandlung der Zellen mit Calciumionophor endogene 5-Lipoxygenase. Die Zellen benötigen etwa 24 Stunden, um sich von der A23187-Behandlung zu erholen, wie durch ihre Fähigkeit, Leukotrien B₄ zu synthetisieren, gemessen wird. Makromoleküle, die gegen 5-Lipoxygenase gerichtet sind, können unter Benutzung der folgenden quantitativen Assays auf Aktivität in zwei HL-60-Modellsystemen geprüft werden. Die Assays sind von der direktesten Messung der Hemmung der 5-Lipoxygenase-Proteinsynthese in intakten Zellen zu weiter nachfolgenden Ereignissen, wie z.B. die Messung der 5-Lipoxygenase-Aktivität in intakten Zellen, beschrieben. Eine direkte Wirkung, die Oligonukleotide auf intakte Zellen ausüben können und die leicht quantifiziert werden kann, ist die spezifische Hemmung der 5-Lipoxygenase-Proteinsynthese. Zur Ausführung dieser Technik können Zellen mit ³⁵S-Methionin (50 μCi/ml) für 2 Stunden bei 37 °C markiert werden, um neu synthetisiertes Protein zu markieren. Die Zellen werden extrahiert, um die gesamten Zellproteine zu solubilisieren, und die 5-Lipoxygenase wird mit 5-Lipoxygenase-Antikörper immunpräzipitiert, gefolgt von Eluierung von Protein-A-Sepharose-Kügelchen. Die immunpräzipitierten Proteine werden mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt und der Autoradiographie unterworfen. Die Menge an immunpräzipitierter 5-Lipoxygenase wird mittels rasternder Densitometrie quantifiziert.
Ein aus diesen Experimenten vorausgesagtes Ergebnis wäre wie folgt. Die Menge an 5-Lipoxygenase-Protein, das aus Kontrollzellen immunpräzipitiert wird, würde auf 100 normalisiert. Die Behandlung der Zellen mit 1 μM, 10 μM und 30 μM der Makromoleküle der Erfindung während 48 Stunden würde die immunpräzipitierte 5-Lipoxygenase um 5 %, 25 bzw. 75 % der Kontrollprobe verringern.
Die Messung der 5-Lipoxygenase-Enzymaktivität in Zellhomogenaten könnte auch benutzt werden, um die Menge an vorhandenem Enzym zu quantifizieren, das in der Lage ist, Leukotriene zu synthetisieren. Ein radiometrischer Assay zur Quantifizierung der 5-Lipoxygenase-Enzymaktivität in Zellhomogenaten unter Benutzung von Umkehrphasen-HPLC ist jetzt entwickelt worden. Die Zellen werden durch Ultraschallbehandlung in einem Puffer, der Proteasehemmer und EDTA enthält, aufgebrochen. Das Zellhomogenat wird bei 10.000 g 30 min lang zentrifugiert und die Überstände auf 5-Lipoxygenase-Aktivität analysiert. Zytosolische Proteine werden mit 10 μM ¹⁴C-Arachidonsäure, 2 mM ATP, 50 μM freiem Calcium, 100 μg/ml Phosphatidylcholin und 50 mM Bis-Trispuffer, pH 7,0, 5 min lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen werden durch die Zugabe eines gleichen Volumens Aceton gelöscht und die Fettsäuren mit Ethylacetat extrahiert. Das Substrat und die Reaktionsprodukte werden mittels Umkehrphasen-HPLC in einer Novapak-Cl8-Säule (Waters Inc., Millford, MA) getrennt. Radioaktive Peaks werden mit einem radiochromatographischen Detektor, Modell 171 von Beckman, erfasst. Die Menge an Arachidonsäure, die in Di-HETEs und Mono-HETEs umgewandelt ist, wird als ein Maß für die 5-Lipoxygenase-Aktivität benutzt.
Ein vorausgesagtes Ergebnis für die 72-stündige Behandlung DMSO-differenzierter HL-60-Zellen mit wirksamen Makromolekülen der Erfindung bei 1 μM, 10 μM und 30 μM wäre wie folgt. Kontrollzellen oxidieren 200 pmol Arachidonsäure/5 min/10⁶ Zellen. Zellen, die mit 1 μM, 10 μM und 30 μM eines wirksamen Oligonukleotids behandelt wurden, würden 195 pmol, 140 pmol bzw. 60 pmol Arachidonsäure/5 min/10⁶ Zellen oxidieren.
Ein quantitativer, kompetitiver, enzymgekoppelter Immunabsorptionsassay (ELISA) zur Messung des gesamten 5-Lipoxygenase-Proteins in Zellen ist entwickelt worden. Menschliche 5-Lipoxygenase, exprimiert in E. coli und mittels Extraktion, Q-Sepharose, Hydroxyapatit und Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wird als ein Standard und als das primäre Antigen benutzt, um Mikrotiterplatten zu beschichten. Gereinigte 5-Lipoxygenase (25 ng) wird über Nacht bei 4 °C an die Mikrotiterplatten gebunden. Die Vertiefungen werden 90 min lang mit 5 % Ziegenserum, verdünnt in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, in der Gegenwart von 150 mM NaCl (TBS) blockiert. Zellextrakte (0,2%iges Triton X-100, 12.000 g während 30 min) oder gereinigte 5-Lipoxygenase wurden mit einer 1:4.000-Verdünnung von polyklonalem 5-Lipoxygenase-Antikörper in einem Gesamtvolumen von 100 μl in den Mikrotiter-Vertiefungen für 90 min inkubiert. Die Antikörper werden durch Immunisieren von Kaninchen mit gereinigter menschlicher rekombinanter 5-Lipoxygenase hergestellt. Die Vertiefungen werden mit TBS, das 0,05 % Tween 20 enthält (TBST), gewaschen, dann mit 100 μl einer 1:1.000-Verdünnung von Peroxidase-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Cappel Laboratories, Malvern, PA) für 60 min bei 25 °C inkubiert. Die Vertiefungen werden mit TBST gewaschen und die Menge an mit Peroxidase markiertem zweitem Antikörper durch Entwicklung mit Tetramethylbenzidin bestimmt.
Vorausgesagte Ergebnisse eines solchen Assays unter Benutzung eines 30-meren Oligonukleotids mit 1 μM, 10 μM und 30 μM wären 30 ng, 18 ng bzw. 5 ng 5-Lipoxygenase pro 10⁶ Zellen, wobei unbehandelte Zellen etwa 34 ng 5-Lipoxygenase enthalten.
Eine Netto-Hemmwirkung der 5-Lipoxygenase-Biosynthese ist eine Verringerung der Mengen an Leukotrienen, die aus stimulierten Zellen freigesetzt werden. DMSO-differenzierte HL-60-Zellen setzen bei Stimulierung mit Calciumionophor A23187 Leukotrien B4 frei. Leukotrien B4, das in das Zellmedium freigesetzt wird, kann mittels Radioimmunoassay unter Benutzung handelsüblicher Diagnose-Kits (New England Nuclear, Boston, MA) quantifiziert werden. Die Leukotrien-B4-Produktion kann in HL-60-Zellen 48 Stunden nach der Zugabe von DMSO, um die Zellen in eine neutrophile Zelle zu differenzieren, nachgewiesen werden. Zellen (2 × 10⁵ Zellen/ml) werden mit steigenden Konzentrationen des Makromoleküls während 48 bis 72 Stunden in der Gegenwart von 1,3%igem DMSO behandelt werden. Die Zellen werden gewaschen und auf eine Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung, die 1 % delipidiertes Rinderserumalbumin enthält, wieder suspendiert. Die Zellen werden mit 10 μM Calciumionophor A23187 für 15 min stimuliert und die Menge an LTB4, das von 5 × 10⁵ Zellen produziert wird, mittels Radioimmunoassay wie vom Hersteller beschrieben bestimmt.
Unter Benutzung dieses Assays würden mit einem Oligonukleotid, das auf die S-LO-mRNA gerichtet ist, wahrscheinlich die folgenden Ergebnisse erhalten. Die Zellen werden in der Gegenwart von 1,3%igem DMSO während 72 Stunden mit entweder 1 μM, 10 μM oder 30 μM des Makromoleküls behandelt werden. Es würde erwartet, dass die Menge an LTB₄, die von 5 × 10⁵ Zellen produziert wird, etwa 75 pg, 50 pg bzw. 35 pg beträgt, wobei unbehandelte differenzierte Zellen 75 pg LTB₄ produzieren.
E. In-vivo-Assay
Die Hemmung der Produktion von 5-Lipoxygenase in der Maus kann gemäß der folgenden Vorschrift gezeigt werden. Die topische Anwendung von Arachidonsäure führt zur raschen Produktion von Leukotrien B₄, Leukotrien C₄ und Prostaglandin E₂ in der Haut, gefolgt von Ödem und Zellinfiltration. Von bestimmten Hemmern von 5-Lipoxygenase ist bekannt gewesen, dass sie in diesem Assay Aktivität aufweisen. In dem Assay werden 2 mg Arachidonsäure auf ein Mausohr aufgetragen, wobei das kontralaterale Ohr als eine Kontrolle dient. Das polymorphonukleare Zellinfiltrat wird mittels der Myeloperoxidase-Aktivität in Homogenaten analysiert, die von einer Biopsie 1 Stunde nach der Verabreichung der Arachidonsäure genommen wurden. Die ödematöse Reaktion wird mittels Messung der Ohrdicke und des Feuchtgewichtes einer Stanzbiopsie quantitativ erfasst. Die Messung von Leukotrien B₄, das in Biopsieproben produziert wird, wird als eine direkte Messung der 5-Lipoxygenase-Aktivität in dem Gewebe durchgeführt. Oligonukleotide werden 12 bis 24 Stunden vor der Verabreichung von Arachidonsäure topisch auf beide Ohren aufgetragen, um eine optimale Aktivität der Verbindungen zu ermöglichen. Beide Ohren werden vor der Belastung mit Arachidonsäure 24 Stunden lang mit entweder 0,1 μmol, 0,3 μmol oder 1,0 μmol des Makromoleküls vorbehandelt. Die Werte sind als der Mittelwert für drei Tiere je Konzentration ausgedrückt. Es wird erwartet, dass die Hemmung der polymorphonuklearen Zellinfiltration für 0,1 μmol, 0,3 μmol und 1 μmol etwa 10 %, 75 % bzw. 92 % der Kontrollaktivität beträgt. Es wird erwartet, dass die Hemmung von Ödem etwa 3 %, 58 % bzw. 90 % beträgt, während erwartet werden würde, dass die Hemmung der Leukotrien-B₄-Produktion etwa 15 %, 79 % bzw. 99 % betrüge.
BEISPIEL 63
5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-methylen-5-methyl-uridin-3'-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
2'-Desoxy-2'-methylen-3',5'-O-(tetraisopropyl-disiloxan-1,3-diyl)-5-methyluridin wird den Arbeitsweisen folgend durchgeführt, die für die entsprechenden Uridinderivate beschrieben sind (Hansske, F.; Madej, D.; Robins, M. J. Tetrahedron (1984) 40, 125; Matsuda, A.; Takenusi, K.; Tanaka, S.; Sasaki, T.; Ueda, T., J. Med. Chem. (1991) 34, 812; siehe auch Cory, A. H.; Samano, V.; Robins, M. J.; Cory, J. G., 2'-Deoxy-2'-methylene derivatives of adenosine, guanosine, tubercidin, cytidine and uridine as inhibitors of L1210 cell growth in culture. Biochem. Pharmacol. (1994), 47(2), 365 bis 71).
Es wird mit 1 M TBAF in THF behandelt, um 2'-Desoxy-2'-methylen-5-methyluridin zu ergeben. Es wird in Pyridin gelöst und mit DMT-Cl behandelt und gerührt, um das 5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-methylen-5-methyluridin zu ergeben. Diese Verbindung wird mit 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit und Diisopropylaminotetrazolid behandelt. In einer ähnlichen Weise werden die entsprechenden N-6-Benzoyladenosin-, N-4-Benzoylcytosin-, N-2-Isobutyrylguanosin-Phosphoramiditderivate synthetisiert.
BEISPIEL 63
Synthese von 3'-O-4'-C-Methylenribonukleosid
5'-O-DMT-3'-O-4'-C-methylen-uridin und 5-Methyluridin werden gemäß der Arbeitsweise von Obika et al. (Obika et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9, 515 bis 518) durchgeführt. Die Amidite werden unter Benutzung der oben beschriebenen Vorschriften in Oligonukleotide eingebunden.
BEISPIEL 64
Synthese von 2'-Methylen-Phosphoramiditen
5'-O-DMT-2'-(methyl)-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamin)-5-methyluridin-phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-(methyl)-N-6-benzoyladenosin-(3'-O-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-(methyl)-N2-isobutyrylguanosin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit und 5'-O-DMT-2'-(methyl)-N-4-benzoyl-cytidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit wurden durch die Phosphitylierung der entsprechenden Nukleoside erhalten. Die Nukleoside wurden gemäß der Arbeitsweise synthetisiert, die von Iribarren, Adolfo M.; Cicero, Daniel O.; Neuner, Philippe J., Resistance to degradation by nucleases of (2'S)-2'-deoxy-2'-C-methyloligonucleotides, novel potential antisense probes. Antisense Res. Dev., (1994), 4(2), 95 bis 98; Schmit, Chantal; Bevierre, Marc-Olivier; De Mesmaeker, Alain; Altmann, Karl-Heinz, „The effects of 2'- and 3'-alkyl substituents on oligonucleotide hybridization and stability", Bioorg. Med. Chem. Lett. (1994), 4(16), 1.969 bis 1.974, beschrieben ist.
Die Phosphitylierung wird unter Benutzung der Bisamidit-Arbeitsweise durchgeführt.
BEISPIEL 65
Synthese von 2'-S-Methyl-Phosphoramiditen
5'-O-DMT-2'-S-(methyl)-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamin)-5-methyl-uridin-phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-S(methyl)-N-6-benzoyl-adenosin-(3'-O-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-S-(methyl)-N2-isobutyryl-guanosin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit und 5'-O-DMT-2'-5-(methyl)-N-4-benzoyl-cytidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit wurden mittels Phosphitylierung der entsprechenden Nukleoside erhalten. Die Nukleoside wurden gemäß der Arbeitsweise synthetisiert, die von Fraser et al. beschrieben ist (Fraser, A.; Wheeler, P.; Cook, P. D.; Sanghvi, Y. S., J. Heterocycl. Chem. (1993) 31, 1.277 bis 1.287). Die Phosphitylierung wird unter Benutzung der Bisamidit-Arbeitsweise durchgeführt.
BEISPIEL 66
Synthese von 2'-O-Methyl-β-D-arabinofuranosyl-Verbindungen
2'-O-Methyl-β-D-arabinofuranosyl-thymidin-haltige Oligonukleotide wurden den Arbeitsweisen von Gotfredson et. al. folgend durchgeführt (Gotfredson, C. H. et. al. Tetrahedron Lett. (1994) 35, 6.941 bis 6.944; Gotfredson, C. H. et. al., Bioorg. Med. Chem. (1996) 4, 1.217 bis 1225). 5'-O-DMT-2'-ara-(O-methyl)-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamin)-5-methyluridin-phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-ara-(O-methyl)-N-6-benzoyladenosin-(3'-O-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-ara-(O-methyl)-N2-isobutyryl-guanosin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit und 5'-O-DMT-2'-ara-(O-methyl)-N-4-benzoyl-cytidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidite werden durch die Phosphitylierung der entsprechenden Nukleoside erhalten. Die Nukleoside werden gemäß der Arbeitsweise erhalten, die von Gotfredson, C. H. et. al. beschrieben ist, Tetrahedron Lett. (1994) 35, 6.941 bis 6.944; Gotfredson, C. H. et. al., Bioorg. Med. Chem. (1996) 4, 1.217 bis 1.225. Die Phosphitylierung wird unter Benutzung der Bisamidit-Arbeitsweise durchgeführt.
BEISPIEL 67
Synthese von 2'-Fluor-β-D-arabinofuranosyl-Verbindungen
2'-Fluor-β-D-arabinofuranosyl-Oligonukleotide werden den Arbeitsweisen von Kois, P. et al., Nucleosides Nucleotides 12, 1.093, 1993 und Damha et al., J. Am. Chem. Soc., 120, 12.976, 1998 und darin angeführten Literaturhinweisen folgend durchgeführt. 5'-O-DMT-2'-ara-(fluor)-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamin)-5-methyluridinphosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-ara-(fluor)-N-6-benzoyladenosin-(3'-O-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-ara-(fluor)-N2-isobutyryl-guanosin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit und 5'-O-DMT-2'-ara-(fluor)-N-4-benzoylcytidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidite werden durch die Phosphitylierung der entsprechenden Nukleoside erhalten. Die Nukleoside werden gemäß der Arbeitsweise synthetisiert, die von Kois, P. et al., Nucleosides Nucleotides 12, 1.093, 1993 und Damha et al., J. Am. Chem. Soc., 120, 12.976, 1998 beschrieben ist. Die Phosphitylierung wird unter Benutzung der Bisamidit-Arbeitsweise durchgeführt.
BEISPIEL 68
Synthese von 2'-Hydroxyl-β-D-arabinofuranosyl-Verbindungen
2'-Hydroxyl-β-D-arabinofuranosyl-Oligonukleotide werden den Arbeitsweisen von Resmini und Pfleiderer, Helv. Chim. Acta, 76, 158, 1993; Schmit et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 1.969, 1994 Resmini, M.; Pfleiderer, W. Synthesis of arabinonucleic acid (tANA). Bioorg. Med. Chem. Lett. (1994), 16, 1.910.; Resmini, Matthias; Pfleiderer, W. Nucleosides, Part LV, Efficient synthesis of arabinoguanosine building blocks (Helv. Chim. Acta, (1994), 77, 429 bis 434; und Damha et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 12.976, und darin angeführten Literaturhinweisen folgend durchgeführt.
5'-O-DMT-2'-ara-(hydroxy)-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamin)-5-methyluridin-phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-ara-(hydroxy)-N-6-benzoyl-adenosin-(3'-O-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit, 5'-O-DMT-2'-ara-(hydroxy)-N2-isobutyryl-guanosin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit und 5'-O-DMT-2'-ara-(hydroxy)-N-4-benzoylcytidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidite werden mittels der Phosphitylierung der entsprechenden Nukleoside erhalten. Die Nukleoside werden gemäß der Arbeitsweise synthetisiert, die von Kois, P. et al., Nucleosides Nucleotides 12, 1.093, 1993 und Damha et al., J. Am. Chem. Soc., 120, 12.976, 1998 beschrieben ist. Die Phosphitylierung wird unter Benutzung der Bisamidit-Arbeitsweise durchgeführt.
BEISPIEL 69
Synthese von Difluormethylen-Verbindungen
5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-difluormethylen-5-methyluridin-3'-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidit), 5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-difluormethylen-N-4-benzoyl-cytidin, 5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-difluormethylen-N-6-benzoyl-adenosin und 5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-difluorethylen-N₂-isobutyrylguanosin werden den Vorschriften folgend synthetisiert, die von Usman et al. (US-Pat. Nr. 5,639,649, 17. Juni 1997) beschrieben sind.
BEISPIEL 70
Synthese von 5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-β-(O-acetyl)-2'-α-methyl-N6-benzoyl-adenosin-3'-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-Phosphoramidit
5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-β-(OH)-2'-α-methyl-adenosin wird aus der Verbindung 5'-3'-geschütztes 2'-Ketoadenosin (Rosenthal, Sprinzl und Baker, Tetrahedron Lett. 4.233, 1970; siehe auch mit Nukleinsäure verwandte Verbindungen. Eine bequeme Arbeitsweise zur Synthese von 2'- und 3'-Ketonukleosiden ist von Hansske et al., Dep. Chem., Univ. Alberta, Edmonton, Can., Tetrahedron Lett. (1983), 24(15), 1.589 bis 1.592 gezeigt.) mittels Grigand-Addition von McMgI im Lösemittel THF synthetisiert, gefolgt von der Trennung der Isomere. Das 2-β-(OH) ist als Acetat geschützt. Die 5'-3'-Acetalgruppe wird entfernt, die 5'-Position dimethoxytrityliert, die N-6-Position wird benzoyliert und dann die 3'-Position phosphityliert, um 5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-β-(O-acetyl)-2'-α-methyl-N6-benzoyladenosin-3'-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit zu ergeben.
BEISPIEL 71
Synthese von 5'-O-DMT-2'-α-ethinyl-N6-benzoyl-adenosin-3'- (2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidit
5'-O-DMT-2'-desoxy-2'-β-(OH)-2'-α-ethinyl-adenosin wird aus der Verbindung 5'-3'-geschütztes 2'-Ketoadenosin (Rosenthal, Sprinzl und Baker, Tetrahedron Lett. 4.233, 1970) mittels Grigand-Addition von Ethinyl-MgI im Lösemittel THF synthetisiert, gefolgt von der Trennung der Isomere. Das 2'-β-(OH) wird mittels der Robinsschen Desoxygenierungs-Arbeitsweise (Robins et al., J. Am. Chem. Soc. (1983), 105, 4.059 bis 4.065) entfernt. Die 5'-3'-Acetalgruppe wird entfernt, die 5'-Position dimethoxytrityliert, die N-6-Position wird benzoyliert und dann die 3'-Position phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 72
2'-O-(Guajacolyl)-5-methyluridin
2-Methoxyphenol (6,2 g, 50 mmol) wurde unter Rühren langsam zu einer Lösung von Boran in Tetrahydrofuran (1 M, 10 ml, 10 mmol) in einer 100-ml-Bombe gegeben. Beim Lösen des Feststoffes entwickelte sich Wasserstoffgas. O-2,2'-Anhydro-5-methyluridin (1,2 g, 5 mmol) und Natriumbicarbonat (2,5 mg) wurden zugegeben, und die Bombe wurde verschlossen, in ein Ölbad eingebracht und für 36 Stunden auf 155 °C erwärmt. Die Bombe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und geöffnet. Die Rohlösung wurde eingeengt und der Rückstand zwischen Wasser (200 ml) und Hexanen (200 ml) verteilt. Das überschüssige Phenol wurde in Hexane extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert und die vereinigte organische Schicht einmal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Flash-Säulenchromatographie unter Benutzung von Methanol:Methylenchlorid (1/10, V/V) als dem Elutionsmittel gereinigt. Die Fraktionen wurden aufgefangen, die Zielfraktionen wurden eingeengt und ergaben 490 mg reines Produkt als einen weißen Feststoff. R_f = 0,545 in CH₂Cl₂/CH₃OH (10:1). MS/ES für C₁₇H₂₀N₂O₇, 364,4; gefunden 364,9.
BEISPIEL 73
5'-Dimethoxytrityl-2'-O-(2-methoxyphenyl)-5-methyluridin- 3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit
2'-O-(Guajacolyl)-5-methyl-uridin wird mit 1,2 Äquivalent Dimethoxytritylchlorid (DMT-Cl) in Pyridin behandelt, um das 5'-O-dimethoxytritylierte Nukleosid zu erhalten. Nach dem Verdampfen des Pyridins und der Aufarbeitung (CH₂Cl₂/gesättigte NaHCO₃-Lösung) wird die Verbindung in einer Silicagel-Säule gereinigt. Das 5'-geschützte Nukleosid wird in wasserfreiem Methylenchlorid und unter Argonatmosphäre gelöst, N,N-Diisopropylaminohydrotetrazolid (0,5 Äquivalent) und Bis-N,N-diisopropylamino-2-cyanoethylphosphoramidit (2 Äquivalente) werden mittels einer Spritze während einer 1 min zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur während 16 Stunden unter Argon gerührt und dann auf eine Silica-Säule gegeben. Die Eluierung mit Hexan:Ethylacetat (25:75) ergibt die Titelverbindung.
BEISPIEL 74
5'-Diatethoxytrityl-2'-O-(2-methoxyphenyl)-5-methyluridin-3'-O-succinct
Das 5'-geschützte Nukleosid von Beispiel 73 wird mit 2 Äquivalenten Bernsteinsäureanhydrid und 0,2 Äquivalent 4-N,N-Dimethylaminopyridin in Pyridin behandelt. Nach 2 Stunden wird das Pyridin abgedampft, der Rückstand wird in CH₂Cl₂ gelöst und dreimal mit 100 ml 10%iger Zitronensäurelösung gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, um das gewünschte Succinat zu ergeben. Das Succinat wird dann unter Benutzung bewährter Arbeitsweisen an poröses Glas (CPG) angehängt (Pon, R. T., Solid phase supports for oligonucleotide synthesis, in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, S. Agrawal (Ed.), Humana Press: Totawa, NJ, 1993, 465 bis 496).
BEISPIEL 75
5'-Dimethoxytrityl-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)-5-methyluridin
2'-3'-O-Dibutylstannyl-5-methyluridin (Wagner et al., J. Org. Chem., 1974, 39, 24) wird bei 70 °C in DMF mit trans-2-Methoxycyclohexyl-tosylat alkyliert. Bei dieser Reaktion wird ein 1:1-Gemisch von 2'-O- und 3'-O-(trans-2-Methoxycyclohexyl)-5-methyluridin erhalten. Nach dem Verdampfen des Lösemittels DMF wird das Rohgemisch in Pyridin gelöst und mit Dimethoxytritylchlorid (DMT-Cl) (1,5 Äquivalent) behandelt. Das entstandene Gemisch wird mittels Silicagel-Flash-Säulenchromatographie gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 76
5'-Dimethoxytrityl-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)-5-methyluridin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylamino)phosphoramidit
5'-Dimethoxytrityl-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)-5-methyluridin wird gemäß der oben beschriebenen Arbeitsweise phosphityliert, um das erforderliche Phosphoramidit zu ergeben.
BEISPIEL 77
5'-Dimethoxytrityl-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)-5-methyluridin-3'-O-(succinyl-amino)-CPG
5'-Dimethoxytrityl-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)-5-methyluridin wird succinyliert und an poröses Glas angehängt, um das an festen Träger gebundene Nukleosid zu ergeben.
BEISPIEL 78
Trans-2-Ureido-cyclohexanol
Trans-2-Amino-cyclohexanol (Aldrich) wird mit Triphosgen in Methylenchlorid (1/3 Äquivalent) behandelt. Zu der entstehenden Lösung wird Ammoniumhydroxid im Überschuss gegeben, um nach Aufarbeitung die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 79
2'-O-(trans-2-Uriedo-cyclohexyl)-5-methyluridin
Trans-2-Uriedo-cyclohexanol (50 mmol) wird unter Rühren zu einer Lösung von Boran in Tetrahydrofuran (1 M, 10 ml, 10 mmol) in einer 10-ml-Bombe gegeben. Beim Lösen des Reaktanden entwickelt sich Wasserstoffgas. Der Bombe werden 02,2'-Anhydro-5-methyluridin (5 mmol) und Natriumbicarbonat (2,5 mg) zugegeben, und sie wird verschlossen. Dann wird sie für 72 h auf 140 °C erwärmt. Die Bombe wird auf Raumtemperatur abgekühlt und geöffnet. Das Rohmaterial wurde wie oben veranschaulicht aufgearbeitet, gefolgt vom Reinigen mittels Silicagel-Flash-Säulenchromatographie, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 80
5'-O-(Dimethoxytrityl)-2'-O-(trans-2-uriedo-cyclohexyl)-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N,-diisopropyl)uridin-phosphoramidit
2'-O-(trans-2-Uriedo-cyclohexyl)-5-methyluridin wird den Arbeitsweisen folgend, die in Beispiel 2 veranschaulicht sind, an dem 5'-OH trityliert und an dem 3'-OH phosphityliert, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 81
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(trans-2-uriedo-cyclohexyl)-5-methyl-3'-O-(succinyl)-amino-CPG-Uridin
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(trans-2-uriedo-cyclohexyl)-5- methyluridin wird succinyliert und wie oben veranschaulicht an CPG angehängt.
BEISPIEL 82
2'-O-(trans-2-Methoxy-cyclohexyl)adenosin
Trans-2-Methoxycyclopentanol, trans-2-Methoxy-cylcohexanol, trans-2-Methoxy-cyclopentyltosylat und trans-2-Methoxycyclohexyltosylat werden gemäß den angegebenen Arbeitsweisen hergestellt (Roberts, D. D., Hendrickson, W., J. Org. Chem., 1967, 34, 2.415 bis 2.417; J. Org. Chem., 1997, 62, 1.857 bis 1.859). Eine Lösung von Adenosin (42,74 g, 0,16 mol) in trockenem Dimethylformamid (800 ml) bei 5 °C wird mit Natriumhydrid (8,24 g, 60 % in Öl, dreimal mit Hexanen vorgewaschen, 0,21 mol) behandelt. Nach 30-minütigem Rühren wird trans-2-Methoxycyclohexyltosylat (0,16 mol) während 20 Minuten bei 5 °C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 lang gerührt und dann durch Celite filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt, gefolgt von Co-Verdampfung mit Toluol (2 × 100 ml), um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 83
N⁶-Benzoyl-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)adenosin
Eine Lösung von 2'-O-(trans-2-Methoxy-cyclohexyl)adenosin (0,056 mol) in Pyridin (100 ml) wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Pyridin (560 ml) wieder gelöst und in einem Eiswasserbad abgekühlt. Trimethylsilylchlorid (36,4 ml, 0,291 mol) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei 5 °C gerührt. Benzoylchlorid (33,6 ml, 0,291 mol) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch sich für 2 Stunden auf 25 °C erwärmen lassen und dann auf 5 °C abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wird mit kaltem Wasser (112 ml) und nach 15-minütigem Rühren mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (112 ml) verdünnt. Nach 30 min wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck (unterhalb von 30 °C) eingeengt, gefolgt von Co-Verdampfung mit Toluol (2 × 100 ml). Der Rückstand wird in Ethylacetat-Methanol (400 ml, 9:1) gelöst, und die unerwünschten Silyl-Nebenprodukte werden mittels Filtration entfernt. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt und mittels Silicagel-Flash-Säulenchromatographie (800 g, Chloroform/Methanol 9:1) gereinigt. Ausgewählte Fraktionen werden zusammengegeben, unter vermindertem Druck eingeengt und bei 25 °C/0,2 mm Hg während 2 h getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 84
N⁶-Benzoyl-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)adenosin
Eine Lösung von N⁶-Benzoyl-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)adenosin (0,285 mol) in Pyridin (100 ml) wird unter vermindertem Druck zu einem Öl eingedampft. Der Rückstand wird in trockenem Pyridin (300 ml) wieder gelöst und 4,4'-Dimethoxy-triphenylmethylchlorid (DMT-Cl, 10,9 g, 95 %, 0,31 mol) zugegeben. Das Gemisch wird 16 h lang bei 25 °C gerührt und dann auf eine Lösung von Natriumbicarbonat (20 g) in Eiswasser (500 ml) gegossen. Das Produkt wird mit Ethylacetat (2 × 150 ml) extrahiert. Die organische Schicht wird mit Sole (50 ml) gewaschen, über Natriumsulfat (pulverisiert) getrocknet und unter vermindertem Druck (unterhalb von 40 °C) eingedampft. Der Rückstand wird auf Silicagel (400 g, Ethylacetat-Hexan 1:1) chromatographiert. Ausgewählte Fraktionen wurden zusammengegeben, unter vermindertem Druck eingeengt und bei 25 °C/0,2 mm Hg getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 85
[N⁶-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)adenosin-3'-O-yl]-N,N-diisopropylaminocyanoethoxyphosphoramidit
Die Phosphitylierung von N⁶-Benzoyl-5'-O-(dimethoxytrityl)-2'-O-(trans-2-methoxycyclohexyl)adenosin wurde wie oben veranschaulicht durchgeführt, um die Titelverbindung zu ergeben.
BEISPIEL 86
Allgemeine Arbeitsweisen zur, Synthese chimärer C3'-endo- und C2'-endo-modifizierter Oligonukleotide
Oligonukleotide werden in einem Nukleinsäuresynthesesystem PerSeptive Biosystems Expedite 8901 synthetisiert. Für jedes Oligonukleotid werden mehrere 1-mmol-Synthesen durchgeführt. Der 3'-Ende-Nukleosid-haltige feste Träger wird in die Säule eingebracht. Tritylgruppen werden mit Trichloressigsäure entfernt (975 ml während einer Minute), gefolgt von einer Acetonitril-Wäsche. Das Oligonukleotid wird unter Benutzung einer modifizierten Diester-(P=O)- oder Thioat-(P=S)-Vorschrift aufgebaut.
Phosphodiester-Vorschrift
Alle Standard-Amidite (0,1 M) werden während eines 1,5-minütigen Zeitrahmens gekoppelt und ergeben 105 μl Material. Alle neuen Amidite werden in trockenem Acetonitril (100 mg Amidit/1 ml Acetonitril) gelöst, um etwa 0,08 bis 0,1 M Lösungen zu ergeben. Die 2'-modifizierten Amidite (sowohl Ribo- als auch Arabino-Monomere) werden unter Benutzung von 210 μl während insgesamt 5 Minuten doppelt gekoppelt. Die gesamte Kopplungsdauer beträgt etwa 5 Minuten (210 ml zugeführtes Amidit). 1-H-Tetrazol in Acetonitril wird als das Aktivierungsagens benutzt. Überschüssiges Amidit wird mit Acetonitril weggewaschen. (1S)-(+)-(10-Camphersulfonyl)oxaziridin (CSO, 1,0 g CSO/8,72 ml trockenes Acetonitril) wird zum Oxidieren benutzt (3-minütiger Wartschritt), was etwa 375 μl Oxidationsmittel zuführt. Standard-Amidite werden über einen Zeitraum von 3 Minuten zugeführt (210 μl).
Phosphorothioat-Vorschrift
Das 2'-modifizierte Amidit wird unter Benutzung von 210 μl während insgesamt 5 Minuten doppelt gekoppelt. Die Menge an Oxidationsmittel, 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid (Beaucage-Reagens, 3,4 g Beaucage-Reagens/200 ml Acetonitril) beträgt 225 μl (einminütiger Warteschritt). Das nichtumgesetzte Nukleosid wird mit einem 50:50-Gemisch aus Tetrahydrofuran/Essigsäureanhydrid und Tetrahydrofuran/Pyridin/1-Methylimidazol verkappt. Die Tritylausbeuten wurden während der Dauer der Synthese mittels des Tritylmonitors überwacht. Die abschließende DMT-Gruppe wurde intakt belassen. Nach der Synthese wird der Inhalt der Synthesepatrone (1 mmol) in ein Pyrex-Fläschchen überführt und das Oligonukleotid unter Benutzung von 30%igem Ammoniumhydroxid (NH₄OH, 5 ml) während etwa 16 Stunden bei 55 °C von dem porösen Glas (CPG) abgespalten.
Oligonukleotid-Reinigung
Nach dem Entschützungsschritt werden die Proben unter Benutzung von 0,45-μm-Nylon-Acrodisc-Spritzenfiltern von Gelman vom CPG abfiltriert. Überschüssiges NH₄OH wird in einem Savant AS160 Automatic Speedvac abgedampft. Die Rohausbeute wird in einem Diodenarray-Spektrophotometer 8452A von Hewlett Packard bei 260 nm gemessen. Die Rohproben werden dann in einem Elektrospray-Massenspektrometer von Hewlett Packard massenspektrometrisch (MS) analysiert. Trityl-On-Oligonukleotide werden mittels präparativer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatograpie (HPLC) gereinigt. Die HPLC-Bedingungen sind wie folgt: Waters 600E mit Detektor 991; Säule Waters Delta Pak C4 (7,8 × 300 mm); Lösemittel A: 50 mM Triethylammoniumacetat (TEA-Ac), pH 7,0; Lösemittel B: 100 % Acetonitril; Durchflussgeschwindigkeit 2,5 ml/min; Gradient: 5 % B während der ersten fünf Minuten mit linearem Anstieg von B auf 60 % während der nächsten 55 Minuten. Fraktionen, die das gewünschte Produkt/e (Retentionszeit = 41 Minuten für DMT-ON-16314; Retentionszeit = 42,5 Minuten für DMT-ON-16315) enthalten, werden aufgefangen, und das Lösemittel wird in dem SpeedVac weggetrocknet. Die Oligonukleotide werden während etwa 60 Minuten in 80%iger Essigsäure detrityliert und wieder lyophilisiert. Freies Trityl und überschüssiges Salz werden entfernt, indem die detritylierten Oligonukleotide durch Sephadex G-25 (Größenausschlusschromatographie) gegeben und geeignete Proben mittels eines Pharmacia-Fraktionensammlers aufgefangen werden. Das Lösemittel wird wiederum in einem Speedvac abgedampft. Die gereinigten Oligonukleotide werden dann mittels CGE, HPLC (Durchflussgeschwindigkeit 1,5 ml/min; Säule Waters Delta Pak C4, 3,9 × 300 mm) und MS auf Reinheit analysiert. Die Endausbeute wird mittels eines Spektrophotometers bei 260 nm bestimmt.
BEISPIEL 87
Schnelle Amplifikation von 5'-cDNA-Ende (5'-RACE) und 3'-cDNA-Ende (3'-RACE)
Eine Internetsuche in der XREF-Datenbank im National Center of Biotechnology Information (NCBI) ergab ein menschliches exprimiertes sequenziertes Tag von 361 Basenpaaren (bp) (EST, GenBank-Zugangs-Nr. H28861), das zu Hefe-RNase-H-(RNH1)-Protein sequenziertem Tag (EST, GenBank-Zugangs-Nr. Q04740) und seinem Huhn-Homologen (Zugangs-Nr. D26340) homolog war. Drei Sätze von Oligonukleotid-Primern, welche die menschliche RNase-H-EST-Sequenz codieren, wurden synthetisiert. Die Sense-Primer waren ACGCTGGCCGGGAGTCGAAATGCTTC (H1: SEQ ID NO: 6), CTGTTCCTGGCCCACAGAGTCGCCTTGG (H3: SEQ ID NO: 7) und GGTCTTTCTGACCTGGAATGRGTGCAGAG (H5: SEQ ID NO: 8). Die Antisense-Primer waren CTTGCCTGGTTTCGCCCTCCGATTCTTGT (H2: SEQ ID NO: 9), TTGATTTTCATGCCCTTCTGAAACTTCCG (H4; SEQ ID NO: 10) und CCTCATCCTCTATGGCAAACTTCTTAAATCTGGC (H6; SEQ ID NO: 11). Die menschlichen RNase-H-3'- und 5'-cDNAs, die von der EST-Sequenz abgeleitet sind, wurden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert, unter Benutzung von menschlicher Leber- oder Leukämie-Zelllinie (lymphoblastischer, Molt-4) Marathon-Ready-cDNA als Matrizen, H1 oder H3/AP1 sowie H4 oder H6/AP2 als Primer (Clontech, Palo Alto, CA). Die Fragmente wurden der Agarosegel-Elektrophorese unterzogen und auf Nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules CA) überführt zur Bestätigung mittels Southern-Blot unter Benutzung ³²P-markierter H2- und H1-Sonden (für 3'- bzw. 5'-RACE-Produkte) gemäß Arbeitsweisen, die von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, NY, 1988 beschrieben sind. Die bestätigten Fragmente wurden aus dem Agarosegel exzisiert und mittels Gelextraktion (Qiagen, Deutschland) gereinigt, dann in Zero-Blunt-Vektor subkloniert (Invitrogen, Carlsbad, CA) und DNA-sequenziert.
BEISPIEL 88
Durchsuchen der cDNA-Bibliothek, DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse
Eine Lambda-Phagen-Uni-ZAP-Bibliothek der menschlichen Leber-cDNA (Stratagene, La Jolla, CA) wurde unter Benutzung der RACE-Produkte als spezifische Sonden durchsucht. Die positiven cDNA-Klone wurden in das pBluescript-Phagemid (Stragene, La Jolla, CA) von Lambda-Phage exzisiert und der DNA-Sequenzierung mit einer automatischen DNA-Sequenziervorrichtung (Applied Biosystems, Foster City, CA) von Retrogen Inc. (San Diego, CA) unterworfen. Die überlappenden Sequenzen wurden mittels der Assembler-Programme von MacDNASIS v3.0 (Hitachi Software Engineering America, South San Francisco, CA) ausgerichtet und kombiniert. Die Proteinstruktur- und Untersequenzanalyse wurden mittels des Programms von MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group Inc., Campbell, CA) durchgeführt. Eine Homologiesuche wurde per Internet-E-Mail in der NCBI-Datenbank durchgeführt.
BEISPIEL 89
Northern-Blot- und Southern-Blot-Analyse
Die gesamte RNA von verschiedenen menschlichen Zelllinien (ATCC, Rockville, MD) wurde gemäß Arbeitsweisen, die von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, NY, 1988 beschrieben sind, präpariert und der Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese unterworfen und auf Nitrocellulose-Membranen (Bio-Rad, Hercules, CA) überführt. Northern-Blot-Hybridisierung wurde in QuickHyb-Puffer (Stratagene, La Jolla, CA) mit ³²P-markierter Sonde von RNase-H-cDNA-Klon voller Länge oder Primer-H1/H2-PCR-erzeugtem, N-terminalem 322-Basen-RNase-H-cDNA-Fragment bei 68 °C während 2 Stunden durchgeführt. Die Membranen wurden zweimal mit 0,1 % SSC/0,1 % SDS 30 Minuten lang gewaschen und der Autoradiographie unterworfen. Die Southern-Blot-Analyse wurde in 1×-Prä-Hybridisierung/Hybridisierungs-Puffer (BRL, Gaithersburg, MD) mit einem ³²P-markierten C-terminalen Restriktionsenzym-PstI/PvuII-Fragment mit 430 bp oder einer 1,7-kb-cDNA-Sonde voller Länge bei 60 °C während 18 Stunden durchgeführt. Die Membranen wurden zweimal mit 0,1 SSC/0,1 % SDS 30 Minuten lang bei 60 °C gewaschen und der Autoradiographie unterworfen.
BEISPIEL 90
Expression und Reinigung des klonierten RNase-Proteins
Das cDNA-Fragment, das die volle RNase-H-Proteinsequenz codiert, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei 2 Primer benutzt wurden, von denen einer Restriktionsenzym-NdeI-Stellenadapter und sechs Histidin-(His-Tag)-Codons und N-terminale 22-bp-Proteincodiersequenz enthält. Das Fragment wurde in Expressionsvektor pET17b (Novagen, Madison, WI) kloniert und mittels DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid wurde in E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI) transfektiert. Die Bakterien wurden in M9ZB-Medium bei 32 °C gezüchtet und geerntet, wenn die OD₆₀₀ der Kultur 0,8 erreichte, gemäß Arbeitsweisen, die von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, NY, 1988 beschrieben sind. Zellen wurden in 8 M Harnstofflösung lysiert, und rekombinantes Protein wurde mit Ni-NTA-Agarose (Qiagen, Deutschland) teilweise gereinigt. Die weitere Reinigung wurde mittels C4-Umkehrphasen-Chromatographie (Beckman, System Gold, Fullerton, CA) mit 0,1 % TFA/Wasser und 0,1 TFA/Acetonitril mit einem Gradienten von 0 % bis 80 % in 40 Minuten, wie beschrieben von Deutscher, M. P., Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology 182, Academic Press, New York, NY, 1990, durchgeführt. Die rekombinanten Proteine und Kontrollproben wurden gesammelt, lyophilisiert und 12-%-SDS-PAGE unterworfen, wie von Ausubel et al (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, NY beschrieben. Das gereinigte Protein und die Kontrollproben wurden in 6 M Harnstofflösung wieder suspendiert, die 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 20 Glycerin, 0,2 mM PMSF, 5 mM DTT, 10 μg/ml Aprotinin und Leupeptin enthielt, und mittels Dialyse mit abnehmender Harnstoffkonzentration von 6 M auf 0,5 M sowie DTT-Konzentration von 5 mM auf 0,5 mM rückgefaltet, wie von Deutscher, M. P., Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology 182, Academic Press, New York, NY, 1990, beschrieben. Die rückgefalteten Proteine wurden mittels Centricon (Amicon, Danvers, MA) konzentriert (10-fach) und dem RNase-H-Aktivitätsassay unterworfen.
BEISPIEL 91
RNase-H-Aktivitätsassay
³²P-Ende-markierte 17-mer-RNA, GGGCGCCGTCGGTGTGG (SEQ ID NO: 12), beschrieben von Lima, W. F. und Crooke, S. T., Biochemistry, 1997, 36, 390 bis 398, wurde gelgereinigt, wie beschrieben von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York; NY, 1988, und an sein komplementäres 17-mer-Oligodesoxynukleotid in einem zehnfachen Überschuss oder ein 5-Basen-DNA-Gapmer, d.h. einem 17-meren Oligonukleotid, das einen Zentralteil von 5 Desoxynukleotiden (die „Lücke") aufweist, der auf beiden Seiten von 6 2'-Methoxynukleotiden flankiert ist, angelagert. Die Anlagerung wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 50 mM KCl und 0,1 mM DTT durchgeführt, um eines von drei verschiedenen Substraten zu bilden: (a) einsträngige (ss) RNA-Sonde, (b) vollständiger RNA/DNA-Duplex und (c) RNA/DNA-Gapmer-Duplex. Jedes dieser Substrate wurde mit Proteinproben bei 37 °C während 5 Minuten bis 2 Stunden unter denselben Bedingungen inkubiert, die bei dem Ringbildungsvorgang benutzt wurden, und die Reaktionen wurden durch Zugeben von EDTA beendet, gemäß den Arbeitsweisen, die von Lima, W. F. und Crooke, S. T., Biochemistry, 1997, 36, 390 bis 398 beschrieben sind.
Die Reaktionsgemische wurden mittels TCA-Zentrifugierens abgeschieden, und der Überstand wurde mittels Flüssigkeitsszintillationszählung (Beckman LS6000IC, Fullerton, CA) gemessen. Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde auch denaturierender (8 M Harnstoff) Acrylamidgel-Elektrophorese gemäß Arbeitsweisen unterzogen, die von Lima, W. F. und Crooke, S. T., Biochemistry, 1997, 36, 390 bis 398 und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, NY, 1988 beschrieben sind.
BEISPIEL 92
Auswirkungen der Phosphorothioat-Substitution und der Substratlänge auf die Verdauung durch menschliche RNase-H1 (siehe Tabelle 4)
An Oligoribonukleotide wurden komplementäre Antisense-Oligodesoxynukleotid mit 10 nM bzw. 20 nM prä-angelagert, und sie wurden der Verdauung durch menschliche RNase-H1 unterworfen. Die 17-meren (RNA Nr.1) und 25-meren (RNA Nr.3) RNA-Sequenzen sind von Harvy-RAS-Onkogen 51 abgeleitet, und die 25-mere RNA enthält die 17-mer-Sequenz. Die 20-mer-Sequenz (RNA Nr.2) ist von Kernprotein codierender Sequenz des menschlichen Hepatitis-C-Virus (52) abgeleitet. Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden bestimmt, wie beschrieben in „Materialien und Verfahren", 1A: Vergleich der Anfangsgeschwindigkeiten der Spaltung eines RNA:Phosphodiester-(P=O)- und eines RNA:Phosphorothioat(P=S)-Duplexes, und 1B: Vergleich von Duplices unterschiedlicher Sequenzen und Längen.
BEISPIEL 93
Auswirkungen der 2'-Substitution und der Desoxy-Lückengröße auf die Geschwindigkeiten der Verdauung durch menschliche RNase-H1 (siehe Tabelle 5)
Substratduplices wurden hybridisiert und die Anfangsgeschwindigkeiten bestimmt, wie in Tabelle 4 gezeigt und in „Material und Verfahren" beschrieben. Die 17-mere RNA ist dieselbe, die in Tabelle 4 benutzt wird, und die 20-mere RNA (UGGUGGGCAAUGGGCGUGUU (SEQ ID NO: 20), RNA Nr.4, ist von der Sequenz der Proteinkinase C-zeta (53) abgeleitet. Die 17-meren und 20-meren P-S-Oligonukleotide waren vollständiges Desoxyphosphorothioat, das keine 2'-Modifikationen enthielt. Die 9-, 7-, 5-, 4- und 3-Desoxy-Lücken-Oligonukleotide waren 17-mere Oligonukleotide mit einem zentralen Teil, der aus neun, sieben, fünf und vier Desoxynukleotiden besteht, die auf beiden Seiten von 2'-Methoxynukleotiden flankiert sind (siehe auch 2). Sequenzen in Kästchen zeigen die Position der 2'-Methoxymodifizierten Reste an. Sequenz in gestrichelten Kästchen zeigt die Position der 2'-Propoxy-modifizierten Reste an.
BEISPIEL 94
Kinetische Konstanten der RNase-H1-Spaltung von RNA:DNA-Duplices (siehe Tabelle 6)
Die RNA:DNA-Duplices in Tabelle 4 wurden benutzt, um Km und Vmax von menschlicher und E.-coli-RNase-H1 zu bestimmen, wie beschrieben in dem Abschnitt „Materialien und Verfahren".
BEISPIEL 95
Bindungskonstanten und Spezifität von RNasen-H (siehe Tabelle 7)
Die K_d wurden bestimmt, wie in „Materialien und Verfahren" beschrieben. Die K_d für E.-coli-RNase-H1 wurden von vorher angegebenen Daten abgeleitet (21). Die kompetierenden Substrate (kompetierende Hemmer), die in der Bindungsuntersuchung benutzt wurden, sind in zwei Kategorien eingeteilt: einsträngige (ss) Oligonukleotide und Oligonukleotid-Duplices, alle mit der 17-mer-Sequenz wie in Tabelle 4 (RNA Nr. 1). Die einsträngigen Oligonukleotide umfassen: ssRNA, ssDNA, ss vollständig modifiziertes 2'-Methoxyphosphodiester-Oligonukleotid (ss 2'-O-Me) und ss vollständiges Phosphorothioat-Desoxyoligonukleotid (ssDNA, P=S). Die Duplexsubstrate umfassen: DNA:DNA-Duplex, RNA:RNA-Duplex, DNA:vollständig modifiziertes 2'-Fluor- oder vollständig modifiziertes 2'-Methoxy-Oligonukleotid (DNA:2'-F oder 2'-O-Me), RNA:2'-F-oder -2'-O-Me-Duplex. Die Dissoziationskonstanten sind von ≥ 3 Steigungen der Lineweaver-Burk- und/oder Augustisson-Analyse abgeleitet. Geschätzte Fehler für die Dissoziationskonstanten sind 2-fach. Spezifität ist definiert durch Dividieren der Kd für einen Duplex durch die K_d für einen RNA:RNA-Duplex.
Tabelle 4 A
B
Tabelle 5

* Tabellenlegende für Sequenz

Tabelle 6
Tabelle 7
ARBEITSWEISEN
ARBEITSWEISE 1
ICAM-1-Expression
Oligonukleotid-Behandlung von HUVECs
Zellen wurden dreimal mit Opti-MEM (Life Technologies, Inc., vorgewärmt auf 37 °C, gewaschen. Oligonukleotide wurden mit 10 g/ml Lipofectin (Life Technologies, Inc.) in Opti-MEM vorgemischt, in einer Reihe zu den gewünschten Konzentrationen verdünnt und auf die gewaschenen Zellen aufgetragen. Basale und unbehandelte (keine Oligonukleotide) Kontrollzellen wurden ebenfalls mit Lipofectin behandelt. Die Zellen wurden 4 h lang bei 37 °C inkubiert, wonach das Medium entfernt und durch Standard-Wachstumsmedium mit oder ohne 5 mg/ml TNF-α (R & D Systems) ersetzt wurde. Die Inkubation bei 37 °C wurde bis zu den angegebenen Dauern fortgesetzt.
Quantifizierung der ICAM-1-Protein-Expression mittels fluoreszenzaktiviertem Zellsortierer
Zellen wurden durch kurze Trypsinierung mit 0,25 % Trypsin in PBS von den Plattenoberflächen entfernt. Die Trypsin-Aktivität wurde mit einer Lösung von 2 % Rinderserumalbumin und 0,2 % Natriumazid in PBS (+Mg/Ca) gelöscht. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (1000 U/min, Zentrifuge Beckman GPR) pelletiert, in PBS wieder suspendiert und mit 3 l/10⁵ Zellen des ICAM-1-spezifischen Antikörpers, CD54-PE (Pharmingin), angefärbt. Die Antikörper wurden mit den Zellen während 30 Minuten bei 4 °C im Dunkeln unter behutsamem Rühren inkubiert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugiervorgängen gewaschen und dann in 0,3 ml FacsFlow-Puffer (Becton Dickinson) mit 0,5%igem Formaldehyd (Polysciences) wieder suspendiert. Die Expression des ICAM-1 auf der Zellenoberfläche wurde dann mittels Durchflusszytometrie unter Benutzung eines Becton Dickinson FACScan bestimmt. Der Prozentsatz der Kontroll-ICAM-1-Expression wurde wie folgt berechnet: [(Wert für Oligonukleotid-behandeltes ICAM-1)-(Wert für basales ICAM-1)/(Wert für unbehandeltes ICAM-1)-(Wert für basales ICAM-1)] (Baker, Brenda, et al. 2'-O-(2-Methoxy)ethyl-modified Anti-intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Oligonucleotides Selectively Increase the ICAM-1 mRNA Level and Inhibit Formation of the ICAM-1 Translation Initiation Complex in Human Umbilical Vein Endothelial Cells, The Journal of Biological Chemistry, 272, 11.994 bis 12.000, 1997).
Die ICAM-1-Expression chimärer C3'-endo- und C2'-endomodifizierter Oligonukleotide der Erfindung wird mittels der Verringerung der ICAM-1-Gehalte in behandelten HUVEC-Zellen gemessen. Es wird angenommen, dass die Oligonukleotide mittels des RNase-H-Spaltungsmechanismus wirken. Geeignete Kontroll-Oligonukleotide mit durchmischter Sequenz werden als Kontrollen benutzt. Sie weisen dieselbe Basenzusammensetzung wie die Prüfsequenz auf.
Sequenzen, welche die chimären C3'-endo-(2'-MOE) und C2'-endo-Modifikationen (eine der folgenden Modifikationen: 2'-S-Me, 2'-Me, 2'-ara-F, 2'-ara-OH, 2'-ara-O-Me) enthalten, wie in Tabelle X unten aufgeführt, werden hergestellt und in dem obigen Assay geprüft. SEQ ID NO: 14, ein auf c-Raf zielendes Oligonukleotid, wird als eine Kontrolle benutzt.
Tabelle X Oligonukleotide, die chimäre 2'-O-(2-Methoxyethyl)- und 2-S-(Methyl)-Modifikationen enthalten
Alle Nukleoside in Fettschrift sind 2'-O-(2-Methoxyethyl); tiefgestelltes s zeigt eine Phosphorothioat-Bindung an; unterstrichene Nukleoside zeigen 2'-S-Me-Modifikation an; hochgestelltes m an C (C^m) zeigt ein 5-Methyl-C an.
Tabelle XI Oligonukleotide, die chimäre 2'-O-(2-Methoxyethyl)- und 2'-O-(Methyl)-Modifikationen enthalten
Alle Nukleoside in Fettschrift sind 2'-O-(2-Methoxyethyl); tiefgestelltes s zeigt eine Phosphorothioat-Bindung an; unterstrichene Nukleoside zeigen 2'-Methyl-Modifikation an; hochgestelltes m an C (C^m) zeigt ein 5-Methyl-C an.
Tabelle XII Oligonukleotide, die chimäre 2'-O-(2-Methoxyethyl)- und 2'-ara-(fluor)-Modifikationen enthalten
Alle Nukleoside in Fettschrift sind 2'-O-(2-Methoxyethyl); tiefgestelltes s zeigt eine Phosphorothioat-Bindung an; unterstrichene Nukleoside zeigen 2'-ara-(fluor)-Modifikation an; hochgestelltes m an C (C^m) zeigt ein 5-Methyl-C an.
Tabelle XIII Oligonukleotide, die chimäre 2'-O-(2-Methoxyethyl)- und 2'-ara-(OH)-Modifikationen enthalten
Alle Nukleoside in Fettschrift sind 2-O-(Methoxyethyl); tiefgestelltes s zeigt eine Phosphorothioat-Bindung an; unterstrichene Nukleoside zeigen 2'-ara-(OH)-Modifikation an; hochgestelltes m an C (C^m) zeigt ein 5-Methyl-C an.
Tabelle XIV Oligonukleotide, die chimäre 2'-O-(2-Methoxyethyl)- und 2'-ara-(OMe)-Modifikationen enthalten
Alle Nukleoside in Fettschrift sind 2-O-(Methoxyethyl); tiefgestelltes s zeigt eine Phosphorothioat-Bindung an; unterstrichene Nukleoside zeigen 2'-ara-(OMe)-Modifikation an; hochgestelltes m an C (C^m) zeigt ein 5-Methyl-C an.
ARBEITSWEISE 2
Enzymatischer Abbau von 2'-O-modifizierten Oligonukleotiden
Drei Oligonukleotide, in welche die Modifikationen an dem 3'-Ende eingebunden werden, die in Tabelle 2 unten gezeigt sind, werden synthetisiert. Diese modifizierten Oligonukleotide werden der Wirkung von Schlangengift-Phosphodiesterase ausgesetzt.
Oligonukleotide (30 Nanomol) werden in 20 ml Puffer gelöst, der 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 14 mM MgCl₂ und 72 mM NaCl enthält. Zu dieser Lösung werden 0,1 Einheit Schlangengift-Phosphodiesterase (Pharmacia, Piscataway, NJ), 23 Einheiten Nuklease P1 (Gibco LBRL, Gaithersberg, MD) und 24 Einheiten Kalbsdarm-Phosphatase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) gegeben, und das Reaktionsgemisch wird bei 37 °C 100 Stunden lang inkubiert. Die HPLC-Analyse wird unter Benutzung eines automatischen Injektors Waters Modell 715, einer Pumpe Modell 600E, eines Detektors Modell 991 und einer Nukleosid/Nukleotid-Säule (4,6 × 250 mm) von Alltech (Alltech Associates, Inc., Deerfield, IL) durchgeführt. Alle Analysen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die benutzten Lösemittel sind A: Wasser und B: Acetonitril. Die Analyse der Nukleosidzusammensetzung wird mit dem folgenden Gradienten durchgeführt: 0 bis 5 min, 2 % B (isokratisch); 5 bis 20 min, 2 % B bis 10 % B (linear); 20 bis 40 min, 10 % B bis 50 % B. Die integrierte Fläche pro Nanomol wird unter Benutzung von Nukleosid-Standards bestimmt. Relative Nukleosid-Verhältnisse werden berechnet, indem integrierte Flächen in molare Werte umgewandelt und alle Werte mit Thymidin verglichen werden, das für jedes Oligomer auf seinen erwarteten Wert eingestellt wird.
Tabelle XV Relative Nukleasebeständigkeit 2'-modifizierter chimärer Oligonukleotide
ARBEITSWEISE 3
Allgemeine Arbeitsweise zur Beurteilung chimärer C3'-endo- und C2'-endo-modifizierter Oligonukleotide, die auf Ha-Ras zielen
Verschiedene Typen menschlicher Tumoren, einschließlich Sarkome, Neuroblastome, Leukämien und Lymphome, enthalten aktive Onkogene der Ras-Genfamilie. Ha-Ras ist eine Familie von GTPasen mit kleinem Molekulargewicht, deren Funktion es ist, durch Übertragen von Signalen die Zellproliferation und -differenzierung zu regulieren, was zu einer konstitutiven Aktivierung von Ras führt, und sind mit einem hohen Prozentsatz verschiedener Krebsarten beim Menschen assoziiert. Daher stellt Ras ein attraktives Ziel für therapeutische Anti-Krebs-Strategien dar.
Die Elternsequenz (SEQ ID NO: 27) in der Tabelle XV ist ein 20-Basen-Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotid, das auf die Initiierung der Translationsregion menschlicher Ha-Ras zielt, und – basierend auf Durchmusterungsassays – ein potenter isotypspezifischer Hemmer von Ha-Ras in Zellkultur (IC50 = 45 nm). Die Behandlung von Zellen in vitro mit dieser Sequenz ergibt eine rasche Verminderung der Ha-RasmRNA- und Proteinsynthese und Hemmung der Proliferation von Zellen, die eine aktivierende Ha-Ras-Mutation enthalten. Wenn diese Sequenz in Dosen von 25 mg/kg oder kleiner durch tägliche intraperitoneale Injektion (IP) verabreicht wird, weist sie eine potente Antitumor-Aktivität in einer Vielfalt von Tumor-Xenograft-Modellen auf, wohingegen Fehlpaarungskontrollen keine Antitumor-Aktivität aufweisen. Es ist gezeigt worden, dass diese Sequenz gegen eine Vielfalt von Tumorentypen, einschließlich Lunge, Brust, Blase und Bauchspeicheldrüse, in Maus-Xenograft-Untersuchungen aktiv ist (Cowsert, L. M. Anti-cancer drug design, 1997, 12, 359 bis 371). Ein Analog der zweiten Generation mit der SEQ ID NO: 27, in dem der 5'- und 3'-Terminus („Flügel") der Sequenz mit 2'-Methoxyethyl-(MOE)-Modifikation modifiziert sind und das Rückgrat als Phosphorothioat beibehalten ist (Tabelle XV, Kontroll-Gapmer mit MOE-Kontrolle), weist in Zellkultur-Assays ein IC₅₀ von 15 nm auf. Somit ist bei diesem chimären Analog eine 3-fache Verbesserung der Wirksamkeit festgestellt. Aufgrund der verbesserten Nukleasebeständigkeit des 2'-MOE-Phosphorothioats erhöht diese Sequenz die Dauer des Antisense-Effekts in vitro. Dies wird mit der Frequenz der Verabreichung dieses Wirkstoffes an Krebspatienten in Beziehung stehen. Ferner wird diese Sequenz gegenwärtig in Ras-abhängigen Tumormodellen beurteilt (Cowsert, L. M. Anti-cancer drug design, 1997, 12, 359 bis 371). Die Elternverbindung, SEQ ID NO: 27, befindet sich in Phase I der klinischen Versuche gegen solide Tumoren durch systemische Infusion.
Antisense-Oligonukleotide mit der 2'-Me-Modifikation werden in der beschriebenen Weise hergestellt und in den oben erwähnten Assays geprüft, um die Aktivität zu bestimmen.
Ha-Ras-Antisense-Oligonukleotide mit chimären C3'-endo- und C2'-endo-Modifikationen und ihre Kontrollen
Tabelle XV Ha-Ras-Antisense-Oligonukleotide mit chimären C3'-endo- und C2'-endo-Modifikationen und ihre Kontrollen
Alle unterstrichenen Sequenzteile sind 2'-Me.
ARBEITSWEISE 7
In-vivo-Nukleasebeständigkeit
Die in-vivo-Nukleasebeständigkeit chimärer C3'-endo- und C2'-endo-modifizierter Oligonukleotide wird in Mausplasma und -geweben (Niere und Leber) untersucht. Zu diesem Zweck wird die c-Raf-Oligonukleotid-Reihe SEQ ID NO: 32 benutzt, und die folgenden fünf Oligonukleotide, die in der untenstehenden Tabelle aufgeführt sind, werden hinsichtlich ihrer relativen Nukleasebeständigkeit beurteilt.
Tabelle XVI Untersuchung der in-vivo-Nukleasebeständigkeit chimärer C3'-endo-(2'-O-MOE)- und C2'-endo-(2'-S-Me)-modifizierter Oligonukleotide mit und ohne nukleasebeständige Kappen (2'-5'-Phosphat- oder -Phosphorothioat-Bindung mit 3'-O-MOE an Kappenenden)
Tabelle XVII Untersuchung der in-vivo-Nukleasebeständigkeit chimärer C3'-endo-(2'-O-MOE)- und C2'-endo-(2'-Me)-modifizierter Oligonukleotide mit und ohne nukleasebeständige Kappen (2'-5'-Phosphat- oder -Phosphorothioat-Bindung mit 3'-O-MOE an Kappenenden)
Tabelle XVIII Untersuchung der in-vivo-Nukleasebeständigkeit chimärer C3'-endo-(2'-O-MOE)- und C2'-endo-(2'-ara-F)-modifizierter Oligonukleotide mit und ohne nukleasebeständige Kappen (2'-5'-Phosphat- oder -Phosphorothioat-Bindung mit 3'-O-MOE an Kappenenden)
Tabelle XIX Untersuchung der in-vivo-Nukleasebeständigkeit chimärer C3'-endo-(2'-O-MOE)- und C2'-endo-(2'-ara-OH)-modifizierter Oligonukleotide mit und ohne nukleasebeständige Kappen (2'-5'-Phosphat- oder -Phosphorothioat-Bindung mit 3'-O-MOE an Kappenenden)
Tabelle XX Untersuchung der in-vivo-Nukleasebeständigkeit chimärer C3'-endo-(2'-O-MOE)- und C2'-endo-(2'-ara-OMe)-modifizierter Oligonukleotide mit und ohne nukleasebeständige Kappen (2'-5'-Phosphat- oder -Phosphorothioat-Bindung mit 3'-O-MOE an Kappenenden)
ARBEITSWEISE 8
Tieruntersuchungen auf in-vivo-Nukleasebeständigkeit
Für jedes zu untersuchende Oligonukleotid werden 9 männliche BALB/c-Mäuse (Charles River, Wilmington, MA), die etwa 25 g wiegen, benutzt (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923). Im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierung erhalten die Mäuse eine einzelne Schwanzveneninjektion von Oligonukleotid (5 mg/kg), verabreicht in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,0. Die Endkonzentration an Oligonukleotid in der Dosierungslösung beträgt für die PBS-Formulierungen (5 mg/kg). Von jeder Gruppe wird eine retrobulbäre Blutprobe (entweder nach 0,25, 0,5, 2 oder 4 h nach Gabe) und eine terminale Blutprobe (entweder 1, 3, 8 oder 24 h nach Gabe) genommen. Die terminale Blutprobe (etwa 0,6 bis 0,8 ml) wird mittels Herzpunktion im Anschluss an Ketamin/Xylazin-Anästhesie genommen. Das Blut wird in ein mit EDTA beschichtetes Sammelröhrchen überführt und zentrifugiert, um Plasma zu erhalten. Zum Abschluss werden jeder Maus die Leber und die Nieren entnommen werden. Plasma und Gewebehomogenate werden zur Analyse benutzt werden, um den intakten Oligonukleotid-Gehalt mittels CGE zu bestimmen. Alle Proben werden nach der Gewinnung unverzüglich auf Trockeneis eingefroren und bis zur Analyse bei –80 °C aufbewahrt.
ARBEITSWEISE 9
RNase-H-Untersuchungen mit chimären C3'-endo- und C2'-endo-modifizierten Oligonukleotiden mit und ohne nukleasebeständige Kappen
Markieren von Oligonukleotiden mit ³²P
Das Oligoribonukleotid (Sense-Strang) wurde unter Benutzung von [³²P]ATP, T4-Polynukleotidkinase und Standard-Arbeitsweisen am 5'-Ende mit ³²P markiert (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. und Struhl, K., in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, New York (1989)). Die markierte RNA wurde mittels Elektrophorese auf 12 denaturierendem PAGE (Sambrook, J., Frisch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview (1989)) gereinigt. Die spezifische Aktivität des markierten Oligonukleotids betrug etwa 6.000 cpm/fmol.
Bestimmung von RNase-H-Spaltungsmustern
Hybridisierungsreaktionsgemische, die 750 nM Antisense-Oligonukleotid, 500 nM Sense-Oligoribonukleotid und 100,000 cpm ³²P-markiertes Sense-Oligoribonukleotid enthielten, wurden in 120 μl Reaktionspuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM DTT] hergestellt. Die Reaktionsgemische wurden für 5 min auf 90 °C erwärmt, und 1 Einheit Inhibit-ACE wurde zugegeben. Die Proben wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Hybridisierungsreaktionsgemische wurden bei 37 °C mit 1,5 × 10,8^–8 mg E.-coli-RNase-H-Enzym für Bestimmungen der Anfangsgeschwindigkeit inkubiert und dann zu spezifischen Zeitpunkten gelöscht. Proben wurden mittels Trichloressigsäure-(TCA)-Assays oder mittels denaturierender Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert, wie oben beschrieben [Crooke, S. T., Lemonidis, K. M., Neilson, L., Griffey, R., Lesnik, E. A., und Monia, B. P., Kinetic characteristics of Escherichia coli RNase H1: cleavage of various antisense oligonucleotide-RNA duplexes, Biochem J, 312, 599 (1995); Lima, W. F. und Crooke, S. T., Biochemistry, 36, 390 bis 398, 1997.
Der Fachmann wird verstehen, dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen an den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung vorgenommen werden können und dass solche Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne sich vom Gedanken der Erfindung zu entfernen. Daher ist beabsichtigt, dass die beigefügten Ansprüche alle solche äquivalenten Variationen umfassen, die im wahren Gedanken und Umfang der Erfindung liegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonukleotid mit gemischter Sequenz, umfassend wenigstens 12 Nukleotide und mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende und unterteilt in einen ersten Teil und einen weiteren Teil, wobei der erste Teil in der Lage ist, die Spaltung einer komplementären Ziel-RNA durch menschliche RNase-H1-Polypeptid zu unterstützen; wobei der weitere Teil nicht in der Lage ist, die Spaltung durch die RNase-H1 zu unterstützen; wobei der erste Teil wenigstens 6 Nukleotide umfasst und in dem Oligonukleotid so angeordnet ist, dass wenigstens eines der 6 Nukleotide 8 bis 12 Nukleotide vom 3'-Ende des Oligonukleotids liegt; und der erste Teil wenigstens eine 5'-CA-3'-Nukleotidsequenz umfasst, die 8 bis 12 Nukleotide vom 3'-Ende des Oligonukleotids angeordnet ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, umfassend etwa 12 bis etwa 50 Nukleotide.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, umfassend etwa 12 bis etwa 25 Nukleotide.
Oligonukleotid mit gemischter Sequenz, umfassend wenigstens 12 Nukleotide und mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende und unterteilt in einen ersten Teil und einen weiteren Teil, wobei der erste Teil in der Lage ist, die Spaltung einer komplementären Ziel-RNA durch menschliche RNase-H1-Polypeptid zu unterstützen wobei der weitere Teil nicht in der Lage ist, die Spaltung durch die RNase-H1 zu unterstützen; wobei: der erste Teil wenigstens 6 Nukleotide umfasst und in dem Oligonukleotid so angeordnet ist, dass wenigstens eines der 6 Nukleotide 8 bis 12 Nukleotide vom 3'-Ende des Oligonukleotids liegt; der erste Teil wenigstens eine 5'-CA-3'-Nukleotidsequenz umfasst, die 8 bis 12 Nukleotide vom 3'-Ende des Oligonukleotids angeordnet ist; und jedes der Nukleotide des ersten Teils eine B-Form-Konformationsgeometrie hat und sie zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind.
Oligonukleotid mit gemischter Sequenz, umfassend wenigstens 12 Nukleotide und mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende und unterteilt in einen ersten Teil und einen weiteren Teil, wobei der erste Teil in der Lage ist, die Spaltung einer komplementären Ziel-RNA durch menschliche RNase-H1-Polypeptid zu unterstützen wobei der weitere Teil nicht in der Lage ist, die Spaltung durch menschliche RNase-H1 zu unterstützen; wobei: der erste Teil wenigstens 6 Nukleotide umfasst und in dem Oligonukleotid so angeordnet ist, dass wenigstens eines der 6 Nukleotide 8 bis 12 Nukleotide vom 3'-Ende des Oligonukleotids entfernt ist; der erste Teil wenigstens eine 5'-CA-3'-Nukleotidsequenz umfasst, die 8 bis 12 Nukleotide vom 3'-Ende des Oligonukleotids angeordnet ist; und jedes der Nukleotide des ersten Teils unabhängig ein 2'-Desoxyribonukleotid, 2'-SCH₃-Ribonukleotid, ein 2'-NH₂-Ribonukleotid, ein 2'-NH(C₁-C₂-Alkyl)-Ribonukleotid, ein 2'-N(C₁-C₂-Alkyl)₂-Ribonukleotid, ein 2'-CF₃-Ribonukleotid, ein 2'=CH₂-Ribonukleotid, ein 2'=CHF-Ribonukleotid, ein 2'=CF₂-Ribonukleotid, ein 2'-CH₃-Ribonukleotid, ein 2'-C₂H₅-Ribonukleotid, ein 2'-CH-CH₂-Ribonukleotid oder ein 2'-C-CH-Ribonukleotid ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin jedes der Nukleotide des ersten Teils ein 2'-Desoxyribonukleotid ist.
Oligonukleotid mit gemischter Sequenz, umfassend wenigstens 12 Nukleotide und mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende und unterteilt in einen ersten Teil und einen weiteren Teil, wobei der erste Teil in der Lage ist, die Spaltung einer komplementären Ziel-RNA durch menschliche RNase-H1-Polypeptid zu unterstützen, wobei der weitere Teil nicht in der Lage ist, die Spaltung durch die RNase-H1 zu unterstützen; wobei: der erste Teil wenigstens 6 Nukleotide umfasst und in dem Oligonukleotid so angeordnet ist, dass wenigstens eines der 6 Nukleotide 8 bis 12 Nukleotide vom 3'-Ende des Oligonukleotids liegt; der erste Teil wenigstens eine 5'-CA-3'-Nukleotidsequenz umfasst, die 8 bis 12 Nukleotide vom 3'-Ende des Oligonukleotids angeordnet ist; und jedes der Nukleotide des ersten Teils unabhängig ein 2'-CN-Arabinonukleotid, ein 2'-Cl-Arabinonukleotid, ein 2'-Br-Arabinonukleotid, ein 2'-N₃-Arabinonukleotid, ein 2'-OH-Arabinonukleotid, ein 2'-O-CH₃-Arabinonukleotid oder ein 2'-Dehydro-2'-CH₃-Arabinonukleotid ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 7, worin jedes der Nukleotide des ersten Teils unabhängig ein 2'-F-Arabinonukleotid, ein 2'-OH-Arabinonukleotid oder ein 2'-O-CH₃-Arabinonukleotid ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 7, worin jedes der Nukleotide des ersten Teils unabhängig ein 2'-F-Arabinonukleotid oder ein 2'-ON-Arabinonukleotid ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin die Nukleotide des ersten Teils zusammen in der kontinuierlichen Sequenz verknüpft sind durch Phosphat-, Phosphorthioat-, Phosphordithioat- oder Boranphosphat-Bindungen.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin der weitere Teil eine Vielzahl von Nukleotiden einschließt, wobei wenigstens einige von den Nukleotiden eine 2'-Substituentengruppe umfassen, worin jede Substituentengruppe unabhängig Hydroxyl, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₂₀-Alkenyl, C₂-C₂₀-Alkynyl, Halogen, Amino, Thiol, Keto, Carboxyl, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, O-Alkyl, O-Alkenyl, O-Alkynyl, S-Alkyl, S-Alkenyl, S-Alkynyl, NH-Alkyl, NH-Alkenyl, NH-Alkynyl, N-Dialkyl, O-Aryl, S-Aryl, NH-Aryl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, N-Phthalimido, Imidazol, Azid, Hydrazin, Hydroxylamin, Isocyanat, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Disulfid, Silyl, Aryl, Heterozyklus, carbozyklischen Ring, Interkalator, Reportermolekül, Konjugat, Polyamin, Polyamid, Polyalkylenglycol, oder Polyether ist; oder jede Substituentengruppe eine Formel I oder II hat:
worin Z₀ O, S oder NH ist; J eine Einfachbindung, O oder C(=O) ist; E ein C₁-C₁₀-Alkyl, N(R₁)(R₂), N=C(R₁)(R₂) ist oder eine Formel III oder IV hat;
jedes R₆, R₇, R₈, R₉ und R₁₀ unabhängig, Wasserstoff, C(O)R₁₁, substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes C₂-C₁₀-Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes C₂-C₁₀-Alkynyl, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, eine chemische funktionelle Gruppe oder Konjugatgruppe ist, worin die Substituentengruppen gewählt sind aus Hydroxyl, Amino, Alkoxy, Carboxy, Benzyl, Phenyl, Nitro, Thiol, Thioalkoxy, Halogen, Alkyl, Aryl, Alkenyl und Alkynyl; oder optional, R₇ und R₈ zusammen eine Phthalimidoeinheit mit dem Stickstoffatom bilden, an welches sie angehängt sind; oder optional, R₉ und R₁₀, zusammen eine Phthalimidoeinheit mit dem Stickstoffatom bilden, an welches sie angehängt sind; jedes R₁₁ unabhängig substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, Trifluormethyl, Cyanoethyloxy, Methoxy, Ethoxy, t-Butoxy, Allyloxy, 9-Fluorenylmethoxy, 2-(Trimethylsilyl)-Ethoxy, 2,2,2-Trichlorethoxy, Benzyloxy, Butyryl, Isobutyryl, Phenyl oder Aryl ist; jedes R₁ und R₂ unabhängig, H, eine Stickstoffschutzgruppe, substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes C₂-C₁₀-Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes C₂-C₁₀-Alkynyl ist, worin die Substitution OR₃, SR₃, NH₃ ⁺, N(R₃)(R₄), Guanidino oder Acyl ist, worin das Acyl ein Säureamid oder ein Ester ist; oder R₁ und R₂, zusammen Stickstoffschutzgruppen sind oder in einer Ringstruktur vereint sind, die optional ein zusätzliches Neteroatom umfasst, das gewählt ist aus N und O; oder R₁, T und L, zusammen eine chemische funktionelle Gruppe sind; jedes R₃ und R₄ unabhängig H, C₁-C₁₀-Alkyl, eine Stickstoffschutzgruppe oder R₃ und R₄ zusammen eine Stickstoffschutzgruppe sind; oder R₃ und R₄ in einer Ringstruktur verbunden sind, die optional ein zusätzliches Heteroatom umfasst, das gewählt ist aus N und O; Z₄ OX, SX, oder N(X)₂ ist; jedes X unabhängig H, C₁-C₉-Alkyl, C₁-C₉-Haloalkyl, C(=NH)N(H)R₅, C(=O)N(H) R5 oder OC(=O)N(H)R₅ ist; R₅ H oder C₁-C₈-Alkyl ist; Z₁, Z₂ und Z₃ ein Ringsystem mit etwa 4 bis etwa 7 Kohlenstoffatomen oder mit etwa 3 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Heteroatomen umfasst, worin die Heteroatome gewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel und worin das Ringsystem aliphatisch, ungesättigt aliphatisch, aromatisch, oder gesättigt oder ungesättigt heterozyklisch ist; Z₅ Alkyl oder Haloalkyl mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, Alkynyl mit 2 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen, N(R₁)(R₂)OR₁, Halogen; SR₁ oder CN ist; jedes q₁, unabhängig, eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; jedes q₂, unabhängig, 0 oder 1 ist; q₃ 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; q₄ eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; und q₅ 0, 1 oder 2 ist; vorausgesetzt, dass wenn q₃ 0 ist, q₄ größer als 1 ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin jedes der Nukleotide des weiteren Teils unabhängig ein 2'-F-Ribonukleotid, ein 2'-O-(C₁-C₆-Alkyl)-Ribonukleotid oder ein 2'-O-(substituiertes C₁-C₆-Alkyl)-Ribonukleotid ist, worin die Substitution C₁-C₆-Ether, C₁-C₆-Thioether, Amino, Amino-(C₁-C₆-Alkyl) oder Amino-(C₁-C₆-Alkyl)₂ ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin die Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind durch 3'-5'-Phosphodiester-, 2'-5'-Phosphodiester-, Sp-Phosphorthioat-, Rp-Phosphorthioat-, Phosphordithioat-, 3'-Deoxy-3'-Aminophosphoramidat, 3'-Methylenphosphonat, Methylen-(Methylimino)-, Dimethylhydrazino-, Amid 3-, Amid 4- oder Boranphosphat-Bindungen.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin wenigstens zwei der Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind, die zum ersten Teil 3'-positioniert ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin wenigstens zwei der Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind, die zum ersten Teil 5'-positioniert ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin wenigstens zwei der Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind, die zum ersten Teil 3'-positioniert ist, und wenigstens zwei der Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind, die zum ersten Teil 5'-positioniert ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin wenigstens vier der Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind, die zum ersten Teil 3'-positioniert ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin wenigstens vier der Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind, die zum ersten Teil 5'-positioniert ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin wenigstens vier der Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind, die zum ersten Teil 3'-positioniert ist, und wenigstens vier der Nukleotide des weiteren Teils zusammen in einer kontinuierlichen Sequenz vereint sind, die zum ersten Teil 5'-positioniert ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, worin das Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid mit gemischter Sequenz ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder 20, worin das Oligonukleotid 8 bis 25 Nukleotide umfasst.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 mit RNA oder DNA in vitro.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 4 mit RNA oder DNA in vitro.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 5 mit RNA oder DNA in vitro.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 7 mit RNA oder DNA in vitro.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 20 mit RNA oder DNA in vitro.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 21 mit RNA oder DNA in vitro.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 mit RNA oder DNA in einer Zellanalyse.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 4 mit RNA oder DNA in einer Zellanalyse.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 5 mit RNA oder DNA in einer Zellanalyse.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 7 mit RNA oder DNA in einer Zellanalyse.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 20 mit RNA oder DNA in einer Zellanalyse.
Verfahren, umfassend das Kontaktieren eines Oligonukleotids nach Anspruch 21 mit RNA oder DNA in einer Zellanalyse.