DE60024843T2

DE60024843T2 - Impfstoffe zur oralen verwendung die liposomen sowie eine nukleinsäure enthalten

Info

Publication number: DE60024843T2
Application number: DE60024843T
Authority: DE
Inventors: Gregory Gregoriadis; Yvonne Perrie
Original assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Current assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-10-02
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2020-10-03
Also published as: CN1196474C; WO2001024773B1; US7008791B1; CA2386024A1; WO2001024773A1; CN1376056A; DE60024843D1; EP1217989A1; KR100744237B1; JP2003529550A; ATE312599T1; KR20030011763A; EP1217989B1; ES2256043T3; AU7540500A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft oral verabreichbare Vakzine, umfassend kationische Liposome und eine Genvakzine, die mit den Liposomen komplexiert oder darin eingeschlossen ist und eine Nucleinsäure ist, die für ein Antigen kodiert, gegen das eine Impfung erwünscht ist.
In WO-A-9810748 werden Genvakzine beschrieben, die Nucleinsäuren umfassen, die ein Antigen kodieren, gegen das eine Impfung erforderlich ist, wobei die Nucleinsäure in den Liposomen eingeschlossen ist. Die Liposomen werden aus Liposome bildenden Komponenten einschließlich kationisches Lipid gebildet. Es wird angegeben, dass die Zusammensetzungen u.a. zur Verabreichung über orale Wege geeignet sind, aber in den Beispielen werden die Zusammensetzungen intramuskulär, subkutan, intravenös oder intraperitoneal verabreicht.
Damit eine Vakzine eine Immunantwort nach der oralen Verabreichung erzeugt, muss die Zusammensetzung mit dem lymphatischen System im Darm wechselwirken. Die Vakzine muss folglich im Magen-Darm-Trakt stabil sein und muss stabil genug sein, um mit den relevanten Zellen des Systems zu wechselwirken, bevor sie durch Gallensalze zerstört werden. Es ist eindeutig zweckmäßig, dass Vakzine oral verabreichbar sind und nicht injiziert werden müssen. Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, und oral verabreichbare Vakzine und Verfahren zur Vakzination von menschlichen oder nicht menschlichen Tieren durch orale Verabreichung der Vakzine.
Nach einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer oral zu verabreichenden Vakzine wie in Anspruch 1 definiert bereitgestellt. Bei der kationischen Verbindung kann es sich um
a) mindestens eine kationische Verbindung mit der allgemeinen Formel I R¹OCH₂CH(OR²)CH₂R⁵X¹R⁶ _n Iworin R¹ und R² gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus Gruppen der Formel CH₃(CH₂)_a(CH=GH-CH₂)_b(CH₂)_c(CO)_d-
worin b 0 bis 6 ist, a und c jeweils ausgewählt sind aus 0 bis 23 und (a + c + 3b) im Bereich von 12 bis 23 liegt und d 0 oder 1 ist;
R⁵ eine Bindung oder eine C_1-8-Alkandiylgruppe, eine C_1-4-Alkoxy-C_1-4-alkylgruppe oder eine C_1-8-Oxyalkylengruppe ist;
X¹ N, P oder S ist;
n 3 ist, wenn X¹ N oder P ist, und 2 ist, wenn X¹ S ist; und
die Gruppen R⁶ gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus Wasserstoff, C_1-8-Alkyl, C_6-12-Aryl oder Aralkyl oder zwei oder drei der Gruppen R⁶ zusammen mit X¹ eine gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Gruppe mit 5 bis 7 Ringatomen bilden können, handeln.
Die Zusammensetzung kann pharmazeutisch verträgliche Verdünnungsmittel umfassen und kann Komponenten beinhalten, die das Immunreaktion auslösende Verhalten der Vakzine verbessern kann, wie herkömmliche Adjuvantien.
Die Liposome bildenden Komponenten sollten, in Mischung, eine Übergangstemperatur von mindestens 37°C aufweisen, vorzugsweise im Bereich von 38 bis 50°C.
Es ist bevorzugt, dass die Gruppen R¹ und R² zueinander gleich sind. Im allgemeinen haben die Erfinder festgestellt, dass es zweckmäßig ist, dass R¹ und R² ungesättigt und R³ und R⁴ gesättigt sind oder umgekehrt. Die kationische Verbindung umfasst bevorzugt eine einzelne Verbindung der Formel I.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden zwei zwitterionische Phospholipide mit unterschiedlicher Formel in den Liposome bildenden Komponenten verwendet.
In der kationischen Verbindung der Formel I können die hydrophoben Gruppen R¹ und R² über Etherverknüpfungen (d.h. d ist 0) oder Esterverknüpfungen (worin d 1 ist) mit dem Rest des Moleküls verbunden sein. In den Verbindungen der Formel I ist R⁵ bevorzugt C_1-4-Alkandiyl. Die kationische Verbindung ist bevorzugt permanent kationisch, d.h. bei allen pH-Werten, die voraussichtlich in vivo vorkommen, im Bereich von 5 bis 9, im wesentlichen vollständig ionisiert Jede der Gruppen R⁶ ist bevorzugt von Wasserstoff verschieden, deswegen insbesondere C_1-4-Alkyl, wobei jede Gruppe R⁶ am meisten bevorzugt Methyl ist.
R⁵ ist bevorzugt eine Bindung oder eine Methylengruppe.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung der Erfindung wird eine Verbindung der allgemeinen Formel I verwendet, worin jede der Gruppen R¹ und R² eine Oleolygruppe ist und worin die Gruppe R⁵ eine Bindung ist, X¹ N ist und jede der Gruppen R⁶ Methyl ist (1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP)). Eine alternative kationische Verbindung ist die analoge Verbindung, in der die hydrophoben Oleoylgruppen durch Oleylgruppen ersetzt sind, d.h. statt durch Esterverknüpfungen durch Etherverknüpfungen verbunden sind. Eine geeignete kationische Verbindung, in der die hydrophoben Gruppen gesättigt sind, ist 1,2-Bis(hexadecyloxy)-3-trimethylammoniumpropan (BisHOP).
Die zwitterionischen, Liposome bildenden Phospholipide beinhalten Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE), Distearoyloxyphosphatidylcholin (DSPC), Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Mischungen.
Eine Mischung von zwei zwitterionischen Phospholipiden umfasst im allgemeinen die beiden Verbindungen in einem Gewichtsverhältnis im Bereich von 10:1 bis 1:10, am meisten bevorzugt im Bereich von 5:1 bis 1:5, bevorzugter 2:1 bis 1:2.
Im allgemeinen liegt das Verhältnis der kationischen Verbindung zum zwitterionischen Phospholipid (insgesamt) im Bereich von 1:1 bis 1:20, bevorzugter im Bereich von 1:1 bis 1:10, bevorzugter im Bereich von 1:1 bis 1:5.
In allen Aspekten der Erfindung ist es bevorzugt, dass die Liposome bildenden Komponenten in Kombination eine Übergangstemperatur von mindestens 37°C aufweisen. Die Übergangstemperaturen werden durch Differentialscanningkalometrie bestimmt.
Die kationische Verbindung ist bevorzugt ein 2,3-Di(acyloxy oder alkoxy)substituierfes Propylaminderivat, z.B. mit der obigen allgemeinen Formel I. Alternativ kann die Verbindung aus einfachen kationischen amphiphilen Verbindungen gebildet werden, wie Mono- oder Distearylamin oder anderem langkettigem Alkylamin oder sekundären, tertiären oder quaternären Derivaten davon mit 1, 2 oder 3 N-Niederalkyl (C_1-4-alkyl)-Substituenten, wie Dimethyldioctadecylammoniumhalogeniden. Eine andere Kategorie von amphiphilen kationischen Verbindungen, die zur Aufnahme in Liposome geeignet sind, sind Sperminkonjugate mit Di(fettacyl)glyceriden oder N,N-Di(C_12-24)alkylacylamidverbindungen oder 3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carba myl]cholesterin (DC-Chol). Eine Reihe von geeigneten kationischen amphiphilen Verbindungen wird von Kabanov A.V. et al. in Bioconjugate Chem. (1995), 6(1), 7–20, beschrieben.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer oral verabreichbaren Vakzine beschrieben, die eine ein Antigen kodierende Nucleinsäure umfasst, die mit Liposomen komplexiert und/oder darin eingeschlossen ist, die aus Liposome bildenden Komponenten gebildet sind, die mindestens eine kationische Verbindung und mindestens ein zwitterionisches Phospholipid beeinhalten, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposome bildenden Komponenten mindestens 50 Mol-% DSPE, DSPC, DPPE oder DPPC beinhalten, die individuell eine Übergangstemperatur von mehr als 40°C aufweisen.
Bei diesem Aspekt der Erfindung besteht die Wirkung der Verwendung von relativ hohen Konzentrationen von Lipidkomponenten mit hoher Übergangstemperatur darin, dass die Übergangstemperatur der Mischung der Liposome zur Verwendung der Komponenten über 37°C ist. Die Übergangstemperatur einer Mischung ist in der Regel in der Nähe der mittleren Übergangstemperatur von einzelnen Komponenten. Es ist aber im allgemeinen einfacher, die Übergangstemperatur von einzelnen Komponenten zu bestimmen, wobei für viele von diesen die Werte bekannt sind. Bevorzugte zwitterionische Phospholipide mit hoher Übergangstemperatur sind DPPC (T_c 41,4°C), DSPC (T_c 55,1°C), DPPE (T_c 64°C) und DSPE (T_c 74,2°C).
Gemäß allen Aspekten der Erfindung können andere Komponenten in der Liposome bildenden Mischung enthalten sein, wie Cholesterin. Die Liposome bildenden Komponenten sind bevorzugt frei von Cholesterin.
Die Menge an kationischer Verbindung liegt im Bereich von 5 bis 50% der Gesamtmolzahl an Liposome bildenden Komponenten, vorzugsweise im Bereich von 10 bis 25 Mol-%.
Die Liposomzusammensetzung liegt im allgemeinen in Form einer wässrigen Suspension vor, z.B. als physiologischer Puffer. Alternativ könnte es sich um eine getrocknete Zusammensetzung zur erneuten Wasseraufnahme handeln.
Die Liposome können durch irgendeine der allgemein verwendeten, Liposome bildenden Techniken hergestellt werden. Die Produktliposome können multilamellare oder unilamellare Vesikel sein und sie können relativ groß (Vesikeldurchmesser im Bereich von 300 nm bis 2.000 nm, bevorzugt mit mittleren Durchmessern im Bereich von 500 bis 1.000 nm) oder klein (Vesikeldurchmesser im Bereich von 100 nm bis 400 nm, bevorzugt mit mittleren Durchmessern im Bereich von 200 bis 300 nm) sein. Die Liposome haben bevorzugt einen mittleren Durchmesser von nicht über 1.000 nm und bevorzugt besitzen alle einen Durchmesser von weniger als 2.000 nm. Der mittlere Durchmesser liegt am meisten bevorzugt im Bereich von 200 bis 750 nm.
In den neuen Zusammensetzungen kann die Nucleinsäure mit Liposomen komplexiert sein, wobei sie sich außerhalb der Liposome befindet. Die Nucleinsäure ist jedoch bevorzugt zumindest teilweise eingeschlossen.
Die Liposome werden bevorzugt durch ein Verfahren gebildet, bei dem Vesikel gebildet, mit der einzuschließenden Nucleinsäure gemischt und dann dehydratisiert, bevorzugt durch Gefriertrocknen, und anschließend erneut zu einer wässrigen Zusammensetzung hydratisiert werden, um Dehydratations-Rehydratations-Vesikel (DRV) zu bilden, die DRV können gegebenenfalls anschließend einer Mikrofluidisierung unterworfen werden, um die mittlere Größe zu verringern. Die DRV werden aber bevorzugt keiner Mikrofluidisierung oder nur einem oder zwei Mikrofluidisierungszyklen unterworfen. Das nicht eingeschlossene Material wird bevorzugt von den Liposomen durch Zentrifugieren oder Molekularsiebchromatographie nach den Rehydratations- und/oder Mikrofluidisierungsschritten abgetrennt, obwohl dies nicht nötig sein muss.
Ein Verfahren zum Einfangen von Polynucleotid in Liposomen kann folgende Schritte beinhalten:

i) Bilden einer wässrigen Suspension, die ein nacktes Polynucleotid, das wirksam ein eine Immunreaktion auslösendes Polypeptid kodiert, das zur Induzierung einer gewünschten Immunantwort in einem menschlichen oder tierischen Patienten geeignet ist, und vorgeformte Liposome, die aus Liposome bildenden Komponenten wie oben für die neuen Zusammensetzungen angegeben gebildet sind, umfasst,
ii) Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen der Suspension und
iii) Rehydratisieren des Produkts von Schritt ii), um Dehydratations/Rehydratations-Vesikel zu bilden. Weitere Schritte, die durchgeführt werden können, aber nicht wesentlich sind, sind:
iv) Mikrofluidisieren der wässrigen Suspension der Dehydratations-Rehydratations-Vesikel von Schritt iii), um die Größe zu steuern; und/oder
v) gegebenenfalls Trennen von nicht eingeschlossenem Polynucleotid von den Liposomen.

Allgemein wird festgestellt, dass Schritt iv) nicht nötig ist für die Dehydratations-Rehydratations-Vesikel.
Es wird im allgemeinen festgestellt, dass der letzte Schritt nicht nötig ist, da externe Nucleinsäure vor der Umgebung teilweise geschützt sein kann, indem sie an die kationisch geladenen Liposome komplexiert ist.
Die Dehydratations-Rehydratations-Schritte sind im wesentlichen wie von Kirby und Gregoriadis (1984), Biotechnology, 2, 979–984, beschrieben. So sind die Liposome in Schritt i) bevorzugt klein und unilamellar (SUV) (obwohl es sich um MLV handeln kann, z.B. mit einer Größe von 2 μm) und in Schritt iii) ergeben sich bevorzugt multilamellare Liposome (MLV). Die Produktliposome von Schritt iii) werden im allgemeinen als Dehydratations-Rehydratations-Vesikel (DRV) bezeichnet.
Die Mikrofluidisierung der DRV wird im wesentlichen wie in WO-A-92/04009 und von Gregoriadis et al. (1990), Int. J. Pharm. 65, 235–242, beschrieben durchgeführt. Wie vorstehend ausgeführt ist es bei Durchführung der Mikrofluidisierung bevorzugt, dass nicht mehr als ein oder zwei Zyklen durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet nicht das Polymerisieren der Liposome bildenden Komponenten, um die Übergangstemperatur anzuheben. Dies kann die Verabreichungsrate des Wirkstoffs verringern und ist ein unerwünschter Zusatzschritt bei der Verarbeitung.
Durch Verwendung der DRV-Technik haben die Erfinder gezeigt, dass bis zu 90% oder sogar mehr des in der wässrigen Suspension vorhandenen Polynucleotids, die dem Trocknungsschritt unterworfen werden, mit den Liposomen komplexiert oder darin eingeschlossen werden können. Der Grad an Polynucleotideinschluss und/oder -komplexierung in der Liposomzusammensetzung liegt bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 100, bevorzugt 1 bis 50, bevorzugter 5 bis 50 μg/μmol Lipid.
Es ist festgestellt worden, dass die Liposomzusammensetzungen gegen Gallensalze beständig sind, und es wird angenommen, dass dies mit der Stabilität im Magen-Darm-Trakt korreliert.
Die wirksame Nukleinsäure kann RNA sein, die z.B. direkt für die Synthese des Antigens transkribierbar und translatierbar ist oder die zuerst revers transkribiert werden muss, um DNA zur Replikation zu bilden. Die Nucleinsäure ist bevorzugt DNA, die vorzugsweise repliziert ist, und transkribiert und translatiert wird, um das ausgewählte Antigen zu bilden. Die DNA ist bevorzugt eine ds-Plasmid-DNA.
Die Erfindung ist auf die Verwendung der Zusammensetzungen von Liposomen, die durch die Verfahren der Erfindung hergestellt werden, bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in einem Therapie- oder Prophylaxeverfahren gerichtet. Bei dem Verfahren kann es sich z.B. um eine Immunisierung (Impfung) eines menschlichen oder tierischen Patienten handeln, um ihn vor Infektion durch infektiöse Mikroorganismen zu schützen. Alternativ kann eine Immunantwort durch das Genprodukt erzeugt werden, was bei der Immuntherapie zweckmäßig ist, z.B. zur Behandlung von Krebs oder anderen Krankheiten, einschließlich Infektionen.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter erläutert:
BEISPIEL 1
Methodik: Immunisierungsversuch 1 durch orale Verabreichung
Liposomherstellung
Liposome mit den folgenden Zusammensetzungen wurden nach dem Dehydratations-Rehydratations-Verfahren (DRV) hergestellt;

1) 32 μmol Ei-Phosphatidylcholin (PC), (Mischung von Difettsäureacylphosphatidylcholinen, einschließlich einigen gesättigten Gruppen) 16 μmol Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), 8 μmol Dioleoyltrimethylammoniumpropan (DOTAP).
2) 32 μmol Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), 16 μmol DOPE, 8 μmol DOTAP.
3) 32 μmol DSPC, 16 μmol Cholesterin (CHOL), 8 μmol DOTAP.

600 μg pRc/CMV HBS-Plasmid-DNA, die den S (small)-Bereich von Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg; Subtyp ayw) kodiert, wurden in den obigen Liposom-Formulierungen mit der folgenden Technik eingeschlossen.
Das Dehydratisierungs-Rehydratisierungs-Verfahren (Kirby und Gregoriadis, (1984) aO.) wurde zur Einverleibung von pRc/CMV HBS-Plasmid-DNA in Liposome eingesetzt. Kurz gefasst wurden 2 ml kleiner unilamellarer Vesikel (SUV) aus den angegebenen, Liposome bildenden Komponenten hergestellt, mit Plasmid-DNA gemischt, bei –20°C gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Die Liposome wurden dann einer gesteuerten Rehydratation unterworfen, um multilamellare (Gregoriadis et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1147, 185–193) Dehydratations-Rehydratations-Vesikel (DRV) zu bilden. Das Produkt wurde keinen Schritten unterworfen, um nicht eingeschlossene DNA zu entfernen, und beinhaltet wahrscheinlich außen gelegene DNA, die an die Liposome komplexiert ist. Es wurde keine Mikrofluidisierung durchgeführt.
Der Einschluss-Komplexierungs-Wirkungsgrad für jede Zusammensetzung betrug nach Bestimmung durch ³⁵S-markierte DNA hergestellt aus ³⁵S-dATP 85 bis 95%. Die DRV hatten mittlere Durchmesser im Bereich von 550 bis 750 nm.
Immunisierung
Das Verfahren basiert auf Roy, K. et al. (1999) Nature Medicine 5(4) 387–391.
Gruppen von 4 weiblichen Balb/c-Mäusen (20–24 g) wurden durch orale Verabreichung mit entweder "nackter" (Gruppe 4) oder in Liposom eingeschlossener (Gruppen 1–3) DNA mit Zuführnadeln für Tiere, die an eine 1 ml Spritze angebracht waren, immunisiert. Jede Maus erhielt 100 μg DNA in einem Volumen von 500 μl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) an den Tagen 0, 28 und 38.
Immunisierungsgruppen:

1) PC:DOPE:DOTAP (100 μg DNA) (Erfindung)
2) DSPC:DOPE:DOTAP (100 μg DNA) (Erfindung)
3) DSPC:CHOL:DOTAP (100 μg DNA) (Erfindung)
4) "nackte" DNA (100 μg DNA) (Referenz)
5) Kontrolle (keine DNA)

IgA-Extraktion aus Fäkalpellets
Fäkalpellets wurden aus den Mäusekäfigen an den Tagen 0, 14, 21, 32, 40, 48, 62, 84, 96 und 119 gesammelt.
Die Pellets wurden mit einer Konzentration von 100 mg/ml in PBS suspendiert, zentrifugiert und der Überstand (enthaltend IgA) wurde analysiert.
ELISA-Messungen
Es erfolgte eine ELISA an den Fäkalextrakten zur Messung des sekretorischen IgA. Platten wurden mit dem S (small)-Bereich von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAg; Subtyp ayw) beschichtet, mit 1 % BSA blockiert, um unspezifische Bindung zu vermeiden, und dann wurden Pelletextrakte in doppelter Ausführung zugegeben (unverdünnt). Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Maus IgA wurde zugegeben und anschließend o-Phenylendiaminsubstrat. Die Extinktion bei 450 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse in den 1a–i stellen das Mittel von zweifachen Messungen für jede Gruppe von Mäusen dar.
BEISPIEL 2
Methodik: Immunisierungsversuch 2 durch orale Verabreichung
Liposomherstellung
Liposome mit den folgenden Zusammensetzungen wurden mit dem Dehydratations-Rehydratations-Verfahren (DRV) hergestellt:

1) 32 μmol DSPC, 16 μmol DOPE, 8 μmol DOTAP.
2) 32 μmol DSPC, 16 μmol Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE), 8 μmol DOTAP.
3) 32 μmol DSPC, 16 μmol Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPE), 8 μmol DOTAP.
4) 32 μmol DSPC, 16 μmol DOPE.

PRc/CMV HBS-Plasmid-DIVA wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1 in die obigen Liposomformulierungen eingeschlossen. Die DRV-Zusammensetzungen 1, 2 und 3 schlossen 85 bis 95% der Gesamtmenge an eingesetztem DNA ein. Die nicht kationischen DRV-Liposome (Zusammensetzung 4) hatten einen Einschlusswirkungsgrad von 45 bis 55% (von der Gesamtmenge an eingesetzter DNA). Die Größe der DRV-Liposome lag im gleichen Bereich wie in Beispiel 1.
Immunisierung
Gruppen von 4 weiblichen Balb/c-Mäusen (20–24 g) wurden durch orale Verabreichung von entweder "nackter" (Gruppe 6) oder in Liposom eingeschlossener (Gruppen 1 bis 5) DNA mit Zuführnadeln für Tiere, die an einer 1 ml Spritze angebracht waren, immunisiert. Jede Maus wurde mit entweder 50 μg (Gruppe 5) oder 100 μg (Gruppen 1, 2, 3, 4 und 6) DNA in einem Volumen von 500 μl PBS an den Tagen 0, 32 gefüttert.
Immunisierungsgruppen:

1) DSPC:DOPE:DOTAP (100 μg DNA) (Erfindung)
2) DSPC:DSPE:DOTAP (100 μg DNA) (Erfindung)
3) DSPC:DPPE:DOTAP (100 μg DNA) (Erfindung)
4) DSPC:DOPE (100 μg DNA) (Referenz)
5) DSPC:DOPE:DOTAP (50 μg DNA) (Erfindung)
6) "nackte" DNA (100 μg DNA)
7) Kontrolle (keine DNA)

IgA-Extraktion aus Fäkalpellets
Fäkalpellets wurden aus den Mäusekäfigen an den Tagen 0, 42, 55, 65 und 92 gesammelt. Diese Pellets wurden mit einer Konzentration von 100 mg/ml in PBS suspendiert, zentrifugiert und der Überstand (enthaltend IgA) wurde analysiert.
ELISA-Messungen
An den Fäkalextrakten wurde ELISA zur Messung des sekretorischen IgA wie bei dem ersten Immunisierungsversuch durch orale Verabreichung durchgeführt. Wie bei dem ersten Versuch stellen die Ergebnisse in den 2a–d stellen das Mittel von doppelten Messungen für jede Gruppe von Mäusen dar.
Immunisierungsversuch 3 durch orale Verabreichung
Mit diesem Versuch soll der Einfluss der Liposomzusammensetzung auf die Liposom-vermittelte orale Immunisierung weiter untersucht werden. Zwei Faktoren werden gemessen:

1) Der Einfluss der Kombination der Anwesenheit von Phosphatidylcholin und Cholesterin in der Doppelschicht.
2) Die Wirkung der Substitution des kationischen Dioleoyltrimethylammoniumpropans mit Cholesterol-3β-N-(dimethylaminoethyl)carbamat (DC-Chol).

Methodik:
Liposomherstellung
Liposome mit den folgenden Zusammensetzungen wurden nach dem Dehydratations-Rehydratations-Verfahren (DRV) wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.

1) 32 μmol Phosphatidylcholin (PC), 16 μmol Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), 8 μmol Dioleoyltrimethylammoniumpropan (DOTAP).
2) 32 μmol Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), 16 μmol DOPE, 8 μmol DOTAP.
3) 32 μmol PC, 16 μmol Cholesterin (CHOL), 8 μmol DOTAP.
4) 32 μmol DSPC, 16 μmol Cholesterin (CHOL), 8 μmol Cholesterol-3β-N-(dimethylaminoethyl)carbamat (DC-CHOL).

600 μg pRc/CMV BHS-Plasmid-DNA, die den S (small)-Bereich von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAG; Subtyp ayw) kodiert, wurde in den obigen Liposomformulierungen eingeschlossen. Der Einschlusswirkungsgrad für jede Zusammensetzung betrug 85 bis 95%. Die DRV-Durchmesser lagen im gleichen Bereich wie in Beispiel 1.
Immunisierung
Gruppen von 4 weiblichen Blab/c-Mäusen (20–24 g) wurden durch orale Verabreichung mit entweder "nackter" (Gruppe 4) oder in Liposome eingeschlossener (Gruppen 1–4) DNA mit Zuführnadeln für Tiere, die an einer 1 ml-Spritze angebracht sind, immunisiert. Jeder Maus wurden 100 μg DNA in einem Volumen von 500 μl PBS an den Tagen 0, 28 und 38 gegeben.
Immunisierungsgruppen:

1) PC:DOPE:DOTAP (100 μg DNA)
2) DSPC:DOPE:DOTAP (100 μg DNA)
3) PC:CHOL:DOTAP (100 μg DNA)
4) DSPC:DOPE:DC-Chol (100 μg DNA)
5) "nackte" DNA (100 μg DNA)

IgA-Extraktion aus Fäkalpellets
Fäkalpellets wurden aus den Mäusekäfigen an den Tagen 0, 30, 45, 60, 70 gesammelt.
Diese Pellets wurden mit einer Konzentration von 100 mg/ml in PBS aufgenommen, zentrifugiert und der Überstand (enthaltend IgA) wurde analysiert.
ELISA-Messungen
An den Fäkalextrakten erfolgte eine ELISA zur Messung des sekretorischen IgA. Platten wurden mit dem S (small)-Bereich von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAg; Subtyp ayw) beschichtet, mit 1 % BSA blockiert, um unspezifische Bindung zu vermeiden, und dann wurden Pelletextrakte in doppelter Ausführung zugegeben (unverdünnt). Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Maus IgA wurde zugesetzt und anschließend o-Phenylendiaminsubstrat. Die Extinktion bei 450 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse stellen mittlere Werte der doppelten Messungen für jede Gruppe an Mäusen dar.
Ergebnisse
Immunantworten auf ausgeschiedene IgA, gemessen 60 und 70 Tage nach der ersten Dosis, sind in den 1 bzw. 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass aus DPSC:DOPE:DOTAP zusammengesetzte DRV die stärksten Reaktionen in durch orale Verabreichung immunisierte Mäuse zu beiden Zeitpunkten verbesserten. Die Substitution des kationischen Lipids DOTAP mit DC-CHOL in der in Liposome ein geschlossenen DNA führt zu geringeren Anti-HBsAg IgA-Immunantworten. Ferner waren Liposome aus PC:CHOL:DOTAP auch weniger wirksam bei der Vermittlung der Immunantworten als solche, die aus DSPC:DOPE:DOTAP zusammengesetzt waren.
Schlussfolgerungen
Aus den Beispielen 1 bis 3 ist die Schlussfolgerung zu ziehen, dass die Versuche wiederholbar sind. Außerdem scheint es, dass relativ geringe Konzentrationen an eingeschlossener DNA angemessene Transfektionsraten für eine Immunantwort liefern (Vergleich der Gruppen 1 und 5 von Beispiel 2). Die gesättigten Lipide scheinen Liposome mit einem besseren Verhalten zu bilden.
BEISPIEL 4
Reportergenexpression nach oraler Dosierung
Ziel
Zum Vergleich des Grades an Genexpression in Mesenteriallymphknoten nach oraler Dosierung bei Mäusen entweder mit nackter oder mit durch Lipsome eingeschlossener Plasmid-DNA, die ein Proteinreportergen mit grüner Fluoreszenz kodiert (pCMV.efgp). Wenn das Reportergen exprimiert wird, wie durch das sichtbare grüne Protein in gewonnenen Lymphknoten angezeigt, ist dies ein Hinweis, dass die DNA die Mesenteriallymphknoten erreicht und dort durch Endocytose aufgenommen und exprimiert wird. Antigen darbietende Zellen befinden sich in den Lymphknoten, das Ziel für Genvakzine, um eine Immunantwort zu erzeugen.
Methodik:
Liposomherstellung
Liposome aus 32 μmol DSPC, 16 μmol DOPE, 8 μmol DOTAP wurden nach dem Dehydratations-Rehydratations-Verfahren (DRV) wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und 600 μg pCMV.efgp Plasmid-DNA wurden eingeschlossen.
Dosierung und Messung der Genexpression
2 weibliche Balb/c-Mäuse (20–24 g) erhielten oral eine Dosis entweder mit "nackter" oder mit durch Liposome eingeschlossener DNA mit Zuführnadeln für Tiere, die an einer 1 ml Spritze angebracht sind. Jeder Maus wurden 100 μg DNA in einem Volumen von 500 μl PBS zugeführt. 44 h nach Dosierung wurden Mesenteriallymphknoten von dosierten und Kontrollmäusen (naiv) gewonnen. Die frisch gesammelten Lymphknoten wurden an Kryostat-Spannvorrichtungen mit Tissue-Teck (Miles Inc., USA) befestigt und dann in flüssigem Stickstoff gefroren. Schnitte von 20 μm wurden in einem Slee-Kryostaten erstellt. Die Bilder wurden unter einem Nikon-Mikrophotomikroskop mit einfallender Fluoreszenzstrahlung und Kodak-Ektachrom 4000 ASA aufgenommen.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Höhere Konzentrationen an dem vom Plasmid kodierten, grünen Fluoreszenzprotein sind in den Mesenteriallymphknoten von Mäusen, die eine Dosis mit in Liposom eingeschlossener pCMV.efgp erhalten haben (4a), im Vergleich zu denen, die nackte pCMV.efgp erhielten (3b), und Grundkonzentrationen in Lymphknotenschnitten aus naiven Mäusen (3c) ersichtlich. Daraus kann geschlossen werden, dass oral verabreichte DNA zum Mesenteriallymphknoten gelangt und die Expressionsgeschwindigkeit des Reportergens in dem Mesenteriallymphknoten durch Einkapselung in kationischen Liposomen umfassend gesättigte Lipide erhöht wird. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen, welche die Verstärkung der Immunantwort durch Einschluss in aus gesättigten Lipiden gebildeten kationischen Liposomen zeigen.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung umfassend eine Nucleinsäure, die für ein Antigen wirksam kodiert, komplexiert mit oder eingeschlossen in Liposomen, gebildet aus Liposomen bildenden Komponenten einschließlich kationischer Verbindungen in einer molaren Menge im Bereich von 5 bis 50% und zwitterionisches Phospholipid und umfassend a) mindestens eine kationische Verbindung b) mindestens 50 Mol-% der Liposomen bildenden Komponenten sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Distearoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, bei der Herstellung einer Vakzine zur Verwendung bei der Impfung eines menschlichen oder tierischen Patienten, bei der die Vakzine dem Patienten oral verabreicht wird, um eine Immunantwort auf das kodierte Antigen zu bewirken.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die kationische Verbindung die allgemeine Formel I aufweist R¹OCH₂CH(OR²)CH₂R⁵X¹R⁶ _n Iworin R¹ und R² gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus Gruppen der Formel CH₃(CH₂)_a(CH=CH-CH₂)_b(CH₂)_c(CO)_d-, worin b 0 bis 6 ist, a und c jeweils ausgewählt sind aus 0–23 und (a + c + 3b) im Bereich von 12–23 liegt und d 0 oder 1 ist; R⁵ eine Bindung oder eine C_1-8-Alkandiylgruppe ist; X¹ N, P oder S ist; n 3 ist, wenn X¹ N oder P ist, und 2 ist, wenn X¹ S ist; und die Gruppen R⁶ gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus Wasserstoff, C_1-8-Alkyl, C_6-12-Aryl oder Aralkyl oder zwei oder drei der Gruppen R⁶ zusammen mit X¹ eine gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Gruppe mit 5 bis 7 Ringatomen bilden können.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der R¹ = R².
Verwendung nach Anspruch 3, bei der R¹ und R² jeweils Oleyl oder Oleoyl sind, R⁵ eine Bindung ist, X¹ N ist und jedes R⁶ Methyl ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die kationische Verbindung Cholesterol-3β-N-(dimethylaminoethyl)carbamat ist.