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EINLEITUNG
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Hintergrund
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1. EDNO reguliert den
vaskulären
Tonus.
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EDNO
("endothelium derived
nitric oxide"; vom
Endothel stammendes Stickstoffmonoxid) ist das wirkungsvollste bekannte
endogene Vasodilatans und aufgrund seiner Wirkung auf die Gefäßwiderstandsfähigkeit
und die Herzkontraktilität
ein Hauptregulator des Blutdrucks (Moncada und Higgs, 1993; Cooke
und Dzau, 1997). NO übt
seine Wirkung als Vasodilatans teilweise durch Stimulieren der löslichen
Guanylatcyclase aus, wobei cGMP produziert wird. Ein Mangel an EDNO
(wie im Endothel-NOS-Knockout,
oder bei Verabreichung von NOS-Antagonisten) verursacht eine Hypertension
(Dananberg et al., 1993; Shesely et al., 1996). Eine Überproduktion
von NO (wie bei der Sepsis) verursacht eine Hypotension und einen
kardiovaskulären
Kollaps (Rees et al., 1990; Petros et al.; 1991).
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NO
wird vom Endothel in Reaktion auf eine große Vielzahl von physiologischen
Stimuli freigesetzt. Über
ein Jahrhundert lang haben Physiologen erkannt, dass sich mit zunehmendem
Blutfluss durch ein leitendes Gefäß das Gefäß erweitert. Diese Durchfluss-bedingte
Vasodilatation ist von der Integrität des Endothels abhängig und
beruht hauptsächlich
auf der Freisetzung von EDNO in Reaktion auf endothelialen Scherstress (Cooke
et al., 1990; Cooke et al., 1991a). Endothelzellen reagieren auch
auf pharmakologische Stimuli. Die meisten Vasokonstriktoren, wie
Norepinephrin, 5-Hydroxytryptamin und Angiotensin II stimulieren
ebenfalls die Freisetzung von NO durch das Endothel (Moncada und
Higgs, 1993; Cooke und Dzau, 1997).
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Auf
diese Weise moduliert das Endothel die Gefäßkontraktilität. Diese
Reaktionen haben physiologische Folgen. Beispielsweise steigt der
Sauerstoffbedarf des Myokards bei körperlicher Belastung oder mentalem
Stress. In normalen Individuen erweitern sich die epikardialen Koronararterien,
um sich an das Bedürfnis nach
einem gesteigerten Koronar-Blutfluss anzupassen. Im Gegensatz dazu
haben Individuen mit einer Koronararterien-Erkrankung ein nicht
funktionsfähiges
Endothel mit verringerter EDNO-Produktion und/oder -Aktivität. In diesen
Individuen wird eine paradoxe Konstriktion der Koronararterien bei
Belastung oder mentalem Stress beobachtet, die zu einem verringerten
Koronarblutfluss beiträgt,
was zu einer myokardialen Ischämie führt (Cox
et al., 1989; Zeiher et al., 1989).
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Zusätzlich zu
seiner Funktion als Vasodilatans ist EDNO ein wirksamer Inhibitor
der Proliferation von vaskulärem,
glattem Muskel ("vascular
smooth muscle",
VSM). Die Proliferation von in Kultur gezüchteten VSM-Zellen wird durch
exogene NO-Donatoren
und cGMP-Analoga inhibiert (Garg und Hassid, 1989). Der Gentransfer
von Endothel-NOS in die mittels Ballonkatheter verletzte Arteria
carotis von Ratten erhöht
in vivo nachweislich die NO-Freisetzung über Tage nach der Transfektion
und verringert signifikant die myointimale Hyperplasie, die durch
Proliferation von vaskulären
glatten Muskelzellen der Intima bedingt ist (von der Leyen, et al.,
1995).
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EDNO
wirkt sich ferner auf die Gefäßstruktur
aus, indem es die Interaktion von zirkulierenden Blutelementen mit
der Gefäßwand inhibiert.
Das Anhaften von Blutplättchen
und ihre Aggregation wird durch EDNO inhibiert (Radomski et al.,
1987; Stamler et al., 1989). Das Anhaften und die Infiltration von
Leukozyten in die Gefäßwand während einer
experimentellen Entzündung
wird durch exogene Verabreichung von NO-Donatoren verringert und durch
Verabreichung von NOS-Antagonisten verstärkt (Lefer et al., 1993; Gaboury
et al., 1993).
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Zusammenfassend
gesagt trägt
ein Mangel an NO während
einer Gefäßverletzung
oder -entzündung zu
einer Thrombose, einer Infiltration von Leukozyten und zu einer
Proliferation von vaskulärem
glattem Muskel bei.
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2. Die Rolle
von NO bei der Atherosklerose
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Atherosklerose
ist der Hauptgrund für
Arbeitsunfähigkeit
in diesem Land und verantwortlich für jährlich 500.000 Todesfälle durch
Koronararterienerkrankung und Hirnschlag (cerebral vascular attack).
Atherosklerose wird durch Hypercholesterinämie, Hypertonie, Diabetes mellitus,
Tabak-Gebrauch, erhöhte
Mengen von Lipoprotein(a)("Lp(a)") und Homocystein
beschleunigt. Faszinierenderweise sind alle diese Störungen in
Menschen durch eine endotheliale vasodilatorische Dysfunktion charakterisiert,
noch bevor es irgendwelche klinischen Hinweise auf Atherosklerose
gibt (Cooke und Dzau, 1997). In all diesen Zuständen scheint die Abnormalität größtenteils
auf einer Störung
des NOS-Wegs zu beruhen. Bei den meisten dieser Zustände wird
die Anormalität
durch Verabreichung des NO-Vorläufermoleküls L-Arginin
rückgängig gemacht
oder abgemildert (Cooke und Dzau, 1997). L-Arginin wird durch NOS
zu Citrullin und NO metabolisiert.
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Dr.
John Cooke und seine Mitarbeiter waren die ersten die zeigen konnten,
dass die endotheliale Vasodilatans-Dysfunktion durch Verabreichung
des NO-Vorläufermoleküls rückgängig gemacht
werden kann. In Kaninchen mit Hypercholesterinämie führt die Verabreichung von L-Arginin
zur Normalisierung der NO-abhängigen Vasodilatation
in Reaktion auf Acetylcholin (Girerd et al., 1990; Cooke et al.,
1991b). Anschließend
wurde von Dr. Cooke und anderen gezeigt, dass die akute Verabreichung
von L-Arginin die endotheliale Vasodilatans-Dysfunktion rückgängig machen
kann, die bei der koronaren und peripheren Blutzirkulation in Patienten mit
Atherosklerose und in Subjekten mit Risiko für eine Atherosklerose beobachtet
wird.
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Da
NO inhibitorische Wirkungen auf zahlreiche der Schlüsselprozesse
ausübt,
die die Atherosklerose fördern
(Monozyten-Anhaftung,
Blutplättchen-Aggregation,
Proliferation von vaskulärem
glatten Muskel), postulierte Cooke, dass die chronische Verstärkung der
vaskulären
NO-Produktion die Atherogenese inhibieren könnte. Tatsächlich zeigte sein Labor, dass
die chronische orale Verabreichung von L-Arginin bei Kaninchen mit
Hypercholesterinämie
die vaskuläre
NO-Aktivität
verstärken
kann (Cooke et al., 1992; Wang et al., 1994; Tsao et al., 1994).
Diese Wirkung war mit einer auffallenden Verringerung der vaskulären Läsionen assoziiert. Die
Verabreichung von NOS-Antagonisten
hingegen verringerte die vaskuläre
NO-Synthese, erhöhte
die endotheliale Haftfähigkeit
für Monozyten
und beschleunigte die Bildung von Läsionen (Tsao et al., 1994;
Naruse et al., 1994; Cayatte et al., 1994). Cooke und andere haben
gezeigt, dass EDNO seine Wirkungen auf die Atherogenese durch Unterdrückung der
Expression und der Signalübertragung
von endothelialen Adhäsionsmolekülen wie
VCAM-1 und durch Verringerung der Expression von Chemokinen wie
dem Monozyten-chemotaktischen
Protein-1 ausübt
(Marui et al., 1993; Tsao et al., im Druck). Die Inhibierung von
Adhäsion
und Signalübertragung
durch NO scheint durch cGMP vermittelt zu werden, wohingegen die
Transkriptions-Wirkungen von NO teilweise auf der Aufhebung eines
Oxidationsmittel-sensitiven Transkriptionswegs zu beruhen scheinen, der
durch NF6B vermittelt wird (Marui et al., 1993; Tsao et al., im
Druck; Tsao et al., 1995).
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Überraschenderweise
verlangsamt die Verabreichung von L-Arginin bei Kaninchen mit Hypercholesterinämie und
vorexi stierenden Läsionen
nicht nur das Fortschreiten der Erkrankung sondern induziert sogar die
Zurückbildung
der Atherosklerose (Candipan et al., 1996).
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Demgemäß könnte die
Verstärkung
des vaskulären
NO eine neue therapeutische Strategie für kardiovaskuläre Erkrankungen
darstellen. Die anfänglichen
Studien in Menschen sind vielversprechend. Cooke und andere haben
kürzlich
gezeigt, dass die chronische orale Verabreichung von L-Arginin bei
Menschen mit Hypercholesterinämie
oder solchen mit Koronararterienerkrankung die vaskuläre NO-Aktivität (wie durch
vaskuläre
Reaktivitätsstudien
und Messung der Stickstoffoxide im Harn bestimmt wird) verstärken kann,
die Aggregabilität
von Blutplättchen
inhibieren kann und die Haftfähigkeit
von peripheren mononuklearen Blutzellen reduzieren kann (Bode-Böger et al.,
1994; Wolfe et al., 1995; Theilmeier et al., im Druck); Lerman et
al., 1997).
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3. ADMA, eine Determinante
der endothelialen Dysfunktion und neuer Risikofaktor für Atherosklerose
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ADMA
(asymmetrisches Dimethylarginin) ist ein endogener Antagonist der
Stickstoffmonoxidsynthase. Vor einigen Jahren haben Vallance und
Moncada gezeigt, dass in urämischen
Ratten und in Patienten mit Nierenversagen die Plasma-ADMA-Werte
um das 5 bis 10fache im Vergleich zu normalen Werten von etwa 1 μM erhöht waren
(Vallance et al., 1992a, b). Plasma von urämischen Tieren und Patienten
(nicht jedoch von Kontrollen) induzierten die Konstriktion von isolierten
Gefäßringen.
Diese Vasokonstriktion wurde durch L-Arginin rückgängig gemacht. Darüber hinaus
führten
Infusionen von ADMA in die Arteria brachialis von normalen Freiwilligen
bei Konzentrationen von ADMA, die in Patienten mit Nierenversagen
vorgefunden werden, zu einem si gnifikanten Anstieg des Unterarm-Gefäßwiderstands
(forearm vascular resistance; Vallance et al., 1992b).
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Kürzlich wurde
das Enzym charakterisiert, das für
den Abbau von ADMA verantwortlich ist (Dimethylarginin-dimethylaminohydrolase
oder DDAH). Es wurde ein Antagonist für die DDAH entwickelt, der
den Abbau von ADMA blockiert (MacAllister et al., 1996). Wenn der
DDAH-Antagonist in vitro zu Gefäßringen
gegeben wird, wird ein gradueller Anstieg des Tonus beobachtet.
Diese Vasokonstriktion wird wiederum durch L-Arginin rückgängig gemacht.
Diese Studien verweisen darauf, dass ADMA kontinuierlich synthetisiert
und abgebaut wird. Eine Änderung
im Turnover von ADMA kann die Aktivität der NO-Synthase beeinflussen.
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Erhöhte Werte
von ADMA wurden in Patienten mit Hypercholesterinämie und
Atherosklerose gefunden (Bode-Böger
et al., 1996; Yu und Xiong, 1994).
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ADMA
wird in erster Linie durch Methylierung des Arginins von Proteinen
im Inneren von Zellen gebildet, wo es eine wichtige Rolle bei der
Modulation der Protein-RNA-Interaktionen spielt (Liu und Dreyfuss, 1995).
Freies ADMA wird beim Protein-Turnover
freigesetzt und wahrscheinlich von den meisten Geweben ausgeschieden
und entweder in den Harn geleitet oder in der Niere metabolisiert
(Tojo et al., 1997). Zahlreiche Arten von physiologischem Stress,
wie beispielsweise chronischer entzündlicher Stress, der mit der
Bildung eines Atheroms assoziiert ist, oxidativer Stress durch Umwelt-Toxine,
sowie Stress, der durch schlechte Ernährung, Übergewicht oder Alter bedingt
sein könnte,
sind mit einer chronischen Zellschädigung verbunden und führen zu
einer erhöhten
Geschwindigkeit des Protein-Turnovers, die wiederum zu einer erhöhten Sekretion
von methylierten Aminosäuren
und zu höheren
zirkulierenden Mengen dieser Aminosäuren (einschließlich ADMA)
führen
kann.
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Tatsächlich sind
ausgeschiedene methylierte Aminosäuren auf vielfache Weise als
Marker für
den Protein-Turnover verwendet worden, beispielsweise beim Fasten
oder in dystrophischen Tieren (Mizobuchi et al., 1985; Bates et
al., 1983).
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Nahezu
alle Risikofaktoren, die mit beschleunigter Atherosklerose assoziiert
sind, sind ebenfalls dafür bekannt,
dass sie die Synthese und/oder die Aktivität von EDNO abschwächen. Als
zirkulierender Antagonist der NO-Biosynthese könnte ADMA eine wichtige Terminante
der endothelialen Vasodilatans-Dysfunktion sein und möglicherweise
ein wichtiger neuer Risikofaktor für die Arterosklerose. Um die
Rolle von ADMA weiter zu erforschen und die Bedeutung von ADMA bei
der kardiovaskulären
Erkrankung zu untersuchen muss eine Methode entwickelt werden, um
ADMA mit größerer Sensitivität, Spezifität und mit
höherem
Durchsatz zu untersuchen.
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Die
heutigen Standard-Assays haben zahlreiche Nachteile. Das derzeitige
Verfahren erfordert eine Hochleistungsflüssigchromatographie-Trennung
aller primären
Amin-enthaltenden Bestandteile des Plasmas nachdem sie mit einer
fluoreszenten Markierung derivatisiert worden sind, z.B. o-Phthalaldehyd.
Die Reproduzierbarkeit ist bekannterweise empfindlich in Bezug auf
die Bedingungen der Säule
und der mobilen Phase, und es ist eine häufige Reinigung der Säule sowie
ein wiederholtes Aufnehmen von Standardkurven erforderlich. Zusätzlich können Parallelansätze nicht
auf einfache Weise durchgeführt
werden, wodurch die Anzahl der Bestimmungen, die gemacht werden
können,
begrenzt wird. Schließlich
müssen
die Peakflächen
integriert und mit Standardkurven verglichen werden.
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Normalerweise
würde aufgrund
der leichten Handhabung und der Geschwindigkeit ein Immunassay für ADMA in
Körperflüssigkeiten
erwünscht
sein. Zahlreiche Hindernisse erschweren jedoch die Entwicklung von
genauen, auf Antikörpern
basierenden Assays für
ADMA in Körperflüssigkeiten.
Das größte Hindernis
besteht darin, dass jeder anti-ADMA-Antikörper in der Lage sein muss,
ADMA quantitativ von vier strukturellen Analoga, die in verschiedenen
Mengen in den Körperflüssigkeiten
vorhanden sind, zu unterscheiden. Diese umfassen Arginin, symmetrisches
NGNG-Dimethyl-L-Arginin
(SDMA), NG-Monomethyl-L-Arginin (MMA) und
Citrullin. Arginin ist in gesunden Subjekten in 100-fachem Überschuss
zu ADMA vorhanden. SDMA ist in 1–5-fachem Überschuss vorhanden, MMA ist
in kleinen Mengen vorhanden, und Citrullin ist in 30-fachem Überschuss
zu ADMA vorhanden. In der Praxis ist es nicht realistisch zu erwarten,
dass hochaffine Antikörper
in der Lage sind, ähnliche
Analoga durch einen Faktor von mehr als 10 oder 20 bezüglich der
Affinität
zu unterscheiden. Jedoch ist es möglich, den Großteil des
Arginins oder Citrullins enzymatisch oder durch Festphasenextraktion
zu entfernen, wie nachfolgend beschrieben wird. SDMA ist bei weitem
das problematischste Analog, da es ein Isomer von ADMA mit identischem
Molekulargewicht ist. SDMA und ADMA können durch Festphasenextraktion
nicht getrennt werden und sind chromatographisch nur sehr schwierig
zu trennen; man würde
erwarten, dass es für
einen Antikörper
sehr schwierig sein wird, in angemessener Weise zwischen diesen zu
unterscheiden, um eine genaue Messung von ADMA zu ermöglichen.
Da SDMA im Vergleich zu ADMA eine abweichende physiologische Herkunft
aufweist und kein Inhibitor von NOS ist, besteht kein Grund zu erwarten, dass
SDMA mit ADMA korreliert oder mit der vaskulären Dysfunktion korreliert.
Aus diesem Grund ist es absolut notwendig zwischen diesen Analoga
zu unterscheiden, und es würde
außerordentlich
schwierig, wenn nicht sogar unmöglich
sein, dies mit einem ADMA-Immunassay zu erreichen.
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DDAH
weist jedoch eine mindestens 1000fach höhere Aktivität gegenüber ADMA
als gegenüber SDMA
auf und ist daher als einziges geeignet, um in einem enzymatischen
Assay für
eine eindeutige Messung von ADMA in komplexen Mischungen verwendet
zu werden. Nichtsdestotrotz ist ein enzymatischer ADMA-Assay unter
Verwendung von DDAH problematisch, da im Blut mehrere interferierende
Bestandteile vorliegen. Citrullin ist im Blut vorhanden, sodass
es einen starken Hintergrund erzeugen würde, der die Genauigkeit eines Assays,
bei dem Citrullin das Endprodukt ist, welches als Maß für die Menge
von ADMA in der Probe bestimmt wird, wesentlich verringern würde. Darüber hinaus
führt Harnstoff,
der ebenfalls im Blut vorhanden ist, im Citrullin-Assay zu Kreuzreaktionen.
Schließlich
interferieren die im Blut vorhandenen Porphyrine mit der spektrophotometrischen
Bestimmung von Citrullin. Um einen enzymatischen Assay unter Verwendung
von DDAH zu erhalten, ist es notwendig, diese verschiedenen Blutbestandteile
daran zu hindern, mit dem Assay zu interferieren.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
werden ein enzymatisches Assay-Protokoll sowie Zusammensetzungen
zur Bestimmung von ADMA in einer Blutprobe bereitgestellt. Das Verfahren
entfernt zunächst
Blutbestandteile, die mit dem Assay interferieren könnten (z.B.
Proteinentfernung und Enzym-Inhibitoren oder kreuzreaktive Spezies),
gefolgt von Aufkonzentrieren der Probe und Kombinieren der konzentrierten
Probe in der flüssigen
Phase mit rekombinant hergestellter NG,NG-Dimethylarginin-dimethylaminohydrolase
("DDAH"). Citrullin, das
enzymatische Produkt, wird anschließend kolorimetrisch bestimmt.
Der Assay weist eine hohe Reproduzierbarkeit und Genauigkeit im Vergleich
zu anderen Assays auf, die weniger leicht in der Handhabung sind
und nur auf komplizierte Weise automatisiert werden können.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUR
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1 ist
eine Standardkurve zur Bestimmung von ADMA unter Verwendung von
gesundem Blutplasma in den angegebenen Mengen, wobei die Assays
nach dem Protokoll im experimentellen Teil mit 1 ml Aliquots in
Dreifachansätzen
durchgeführt
wurden.
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BESCHREIBUNG
DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ADMA in Blutproben, die als Plasma hergestellt werden,
genau bestimmt. Das Plasma wird auf herkömmliche Weise aus Blutproben
hergestellt. Interferierende Bestandteile des Bluts werden in zwei
Stufen entfernt, gefolgt von einem Aufkonzentrieren, der enzymatischen
Hydrolyse des ADMA mit rekombinanter DDAH zu Citrullin und anschließender spektrophotometrischer
Bestimmung des Citrullins nach herkömmlichen Verfahren.
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Die
Probengröße kann
in starkem Maße
variieren, und wird üblicherweise
im Bereich von etwa 0,1 bis 5 ml liegen, wobei 1 ml besonders praktisch
ist. Üblicherweise
wird kein Vollblut verwendet, sondern Plasma oder Serum.
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Der
erste Schritt des Assays ist die Entfernung von interferierenden
Bestandteilen. Citrullin ist im Blut vorhanden und würde zu einem
nicht akzeptablen Hintergrundwert führen. Arginin weist ungefähr 4% der
Reaktivität
des Citrullins im Citrullin-Assay auf, und da es im 100-fachen Überschuss
vorhanden sein kann, ist es eine ernsthafte Verunreinigung und muss
entfernt werden. Normales Plasma enthält ebenfalls bis zu 100 mM Harnstoff
und andere unbekannte Verbindungen und Proteine, die im Citrullin-Assay
zu Kreuzreaktionen führen,
und dabei einen Hintergrund erzeugen. Die Hintergrundfarbe von Porphyrinen
im Plasma interferiert mit der kolorimetrischen Bestimmung von Citrullin.
Um über
einen akzeptablen Assay zu verfügen
ist es notwendig, die Auswirkungen dieser Plasmabestandteile auf
den Assay auszuschalten.
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In
einem ersten Schritt wird das in Plasma vorhandene Protein präzipitiert.
Dies kann unter Verwendung einer Vielzahl von präzipitierenden Mitteln erreicht
werden (Chambers, J. A. A., in Biochemistry LABFAX, J. A. A. Chambers & D. Rickwood (Hrsg.),
BIOS Scientific Publishers, Oxford (1993), Seiten 13–17). Im
Allgemeinen sind organische Säuren,
wie beispielsweise Essigsäure,
Trichloressigsäure,
Perchlorsäure,
und Sulfosalicylsäuren
in einem Bereich von 5 bis 20% wirksam; organische Lösungsmittel,
wie beispielsweise Ethanol, Methanol, Chloroform/Isoamylalkohol
(24 : 1 Vol/Vol) und Phenol sind ebenfalls hinreichend wirksam im Bereich
von 1–10
Volumen. Es wurde beispielsweise herausgefunden, dass das Einstellen
des Plasmas auf etwa 10% Trichloressigsäure ("TCA")
wirksam ist, obwohl geringere oder höhere Mengen von TCA Anwendung
finden können, üblicherweise
im Bereich von 5 bis 20% TCA. Die Mischung wird zentrifugiert, um
eine eindeutige Abgrenzung zwischen dem Präzipitat und dem Überstand
zu erreichen, und der getrennte Überstand
wird abgetrennt.
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Das
Standardverfahren zum Entfernen von Citrullin und Harnstoff aus
Plasma ist die enzymatische Hydrolyse (Ceriotti, G. & Gazzaniga, A.,
1966, Clinica Chimica Acta 14, 57–62). Citrullin wird durch
die Ornithincarbamyltransferase in Gegenwart von Arsenat zu Ornithin
und Carbamylarsenat hydrolysiert, und Harnstoff wird durch die Urease
zu CO2 und Ammoniak umgewandelt. Arginin
kann ferner schnell und quantitativ durch Behandlung mit 1000 Einheiten
Arginase (Sigma A8013) für
5–10 Minuten
bei Raumtemperatur entfernt werden. Bei einem ADMA-Assay mit hohem Durchsatz
ist die Entfernung von Citrullin und Harnstoff mühsam. Daher wird ein neuartiges
Festphasenextraktionsverfahren (solid phase extraction procedure;
SPE) verwen det, durch das ADMA in einem einzigen Schritt quantitativ
aus Plasma gewonnen werden kann, wobei Citrullin, Harnstoff und
anderen Verbindungen, die mit der Citrullin-Bestimmung interferieren,
quantitativ entfernt werden. Die Festphasenextraktion von ADMA aus
Plasma kann entweder unter Verwendung eines Kationenaustauschers
oder einer reversen Phase erreicht werden. Durch Kombinieren der
zwei Methoden, beispielsweise mit einem Mischphasen-Medium, welches
Silika-gebundene Hydrocarbon- und Acylgruppen umfasst, kann jedoch
eine quantitative Trennung von ADMA von Citrullin, Harnstoff und
anderen Verbindungen, die mit der Bestimmung von Citrullin interferieren
in einem einzelnen Schritt erzielt werden.
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Um
eine Festphasenextraktion von ADMA unmittelbar aus sauren Lösungen,
wie beispielsweise 10% TCA, zu ermöglichen, ist ein starker Kationenaustauscher
wie Sulfonat notwendig. Ein praktisches Medium für diesen Zweck ist daher an
Silika gebundene Benzensulfonsäure
(SCX), und die Verwendung von SCX wird im Folgenden beispielhaft
beschrieben. SCX-Patronen (z.B. von Varian) sind mit einer Vielzahl
von Formaten kompatibel, einschließlich mit einem 96-Vertiefungs-Verteiler
und Standard-Vakuum-Verteiler
zur Festphasenextraktion. Bei Beladen werden die meisten Kationen
und viele hydrophobe Verbindungen auf SCX zurückgehalten werden. Kationen
von schwacher bis moderater Stärke,
die moderate Polaritäten
aufweisen, wie beispielsweise Citrullin, werden durch Waschen mit
alkalischem Puffer effizient entfernt, wohingegen ADMA durch Ladungsinteraktionen
und hydrophobe Interaktionen quantitativ zurückgehalten wird. Dieser Grad
der Trennung von Analoga ist verhältnismäßig unüblich für eine Festphasenextraktion
und konnte nicht erwartet werden, da NG-Monomethylarginin,
welches sich von ADMA durch eine einzelne Methylgruppe unterscheidet und
einen höheren
Guanidin-pKa aufweist, wird hingegen durch
dasselbe Sorptionsmittel beim Waschen bei pH 8 nicht zurückgehalten,
vermutlich aufgrund seiner geringfügig höheren Polarität.
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Nach
dem Waschen bei pH 8 wird die Säule
mit einem Lösungsmittel
gewaschen, um neutrale hydrophobe Substanzen zu entfernen, wobei
lediglich starke Kationen mit geringer Polarität, wie beispielsweise ADMA,
gebunden zurückbleiben.
Das ADMA kann schließlich
quantitativ mit einem alkalischen Lösungsmittel, wie einem Alkoholtriethylamin
oder Ammoniumhydroxid quantitativ eluiert werden, wobei alle restlichen
polaren Verbindungen zurückbleiben.
Das Säulenvolumen
wird üblicherweise
im Bereich des 0,1 bis 2 fachen des Volumens der ursprünglichen
Probe liegen. Man bereitet die Säule
mit Methanol, anschließend
mit Wasser und danach mit verdünnter
Säure auf.
Die Volumen werden üblicherweise
im Bereich des 10 bis 30 fachen des Säulenvolumens liegen. Die Probe
kann anschließend
unter Druckdifferenz (positivem oder negativem) aufgetragen werden,
um die Probe durch die Säule
zu transportieren. Das ADMA wird auf der Säule zurückgehalten. Die Säule kann
anschließend
mit einer schwach sauren Lösung
gewaschen werden, gefolgt von einem schwach basischen Puffer (pH
7,5 bis 9) und Methanol. Einer 2%igen Trichloressigsäurelösung folgt
Kaliumphosphat pH 8 und anschließend Methanol. Das ADMA kann
unter Verwendung von methanolischem Hydroxid von der Säule eluiert
werden. Praktischerweise wird verdünntes Triethylamin (1 bis 5%,
wässrig)
mit Methanol gemischt, um eine Mischung von etwa 50–80% Methanol
zu bilden.
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Im
nächsten
Schritt wird das Eluat unter Verwendung von Eindampfen unter Stickstoff
aufkonzentriert und kann im Vakuum unter milden Bedingungen bis
zur Trockenheit aufkonzentriert werden, beispielsweise bei Raumtemperatur
in einem Stickstoff-evakuiertem
Speed-Vac-Verdampfer (Savant), wobei diese Bedingungen den Verlust
von jeglichem ADMA verhindern. Das Spülen des Systems mit Stickstoff
vor und während
des Verdampfens verhindert die Oxidation des Guanidinstickstoffs
von ADMA. Die Proben werden anschließend in einem Assay-Puffer
gelöst,
der für
die enzymatische Hydrolyse durch DDAH praktisch ist. Es wird ein
schwach saurer Puffer verwendet, der die restliche Base neutralisiert,
praktischerweise ein Phosphatpuffer, pH 5,5 bis 6,5. 0,01 Einheiten
DDAH sind mehr als ausreichend für
die vollständige
Hydrolyse von 0,5 nmol ADMA bei 30 Minuten und 42°C, und können proportional
in Abhängigkeit
vom Volumen der Probe und dem angenommenen Bereich von ADMA modifiziert
werden. Abhängig
von der Vorbehandlung der Probe, beispielsweise der Verdünnung und
dem Volumen des Assaymediums sowie dem Volumen der Plasmaprobe,
kann die Menge des Enzyms entsprechend eingestellt werden, um einen
vernünftigen
Zeitraum für
den Assay bereitzustellen. Üblicherweise
wird der Zeitraum für
die Hydrolysereaktion im Bereich von etwa 30 bis 120 Minuten liegen,
wobei etwa 60 Minuten besonders üblich
sind. Kürzere
Zeiten werden mit geringeren Volumen und geringeren Konzentrationen
von ADMA assoziiert sein.
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Zahlreiche
chromogene Reaktionen von Citrullin sind beschrieben worden, wobei
die meisten von der Kondensation eines Aldehyds oder Ketons mit
einer Harnstoffgruppe des Citrullins in saurer Lösung abhängen, gefolgt von einer Oxidation,
wobei ein farbiges cyclisches Produkt gebildet wird (Fearon 1939,
Biochem. 33, 902–7).
Eine verbreitet verwendete Variante dieses Assays basiert auf einer
hochspezifischen Kondensation von Harnstoffgruppen mit Diacetylmonoxim
und Antipyrin, wobei ein oranges Produkt mit einem Absorptionsmaximum
von 466 nm gebildet wird (Prescott und Jones 1969, Anal. Biochem.
32, 408–19).
Die Farbentwicklung wird initiiert, indem ein chromogenes Reagenz,
das spezifisch mit Harnstoffgruppen reagiert, direkt zu der DDAH-Reaktionsmischung
gegeben wird. Ein übliches
Reagenz besteht aus 0,5% Antipyrin in 50% Schwefelsäure und
0,8% Diacetylmonoxim in 5% Essigsäure (Prescott und Jones 1969,
Anal. Biochem. 32, 408–19). Die
Farbentwicklung benötigt
etwa 90 Minuten bei 75 bis 90 EC, wobei nach Ablauf dieser Zeit
die Proben auf Raumtemperatur gekühlt werden, bei der die Farbe stabil
ist. Die Absorption kann in einem Spektrophotometer bei 466 nm bestimmt
werden, wobei 1 nmol Citrullin eine A466 von
~0,6 ergeben.
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Um
einen Wert für
die Menge an ADMA zu erhalten, werden Assays mit Kontrollproben
durchgeführt, die
bekannte Mengen an ADMA enthalten, um eine Standardkurve zu erhalten,
bei der die Menge an ADMA gegen das beobachtete Signal aufgetragen
ist. Diese Kurve kann anschließend
dazu verwendet werden, die Menge an ADMA, die in der Probe vorhanden
ist, anhand des Signals abzulesen, welches im Verlauf des Assays
beobachtet wird.
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Andere
Assays können
verwendet werden, um die Endkonzentration von Citrullin zu bestimmen.
Das Material ist in dieser Phase beispielsweise so rein, dass Citrullin
in weniger als 15 Minuten durch Reverse Phase-HPLC unter Verwendung
einer C18-Säule von 5 cm mit Acetonitril
in Kaliumphosphat pH 6,5 als mobile Phase quantifiziert werden kann.
Die Detektion wird durch Vorsäulen-Inline-Derivatisierung
(pre-column in-line derivatization) von primären Amingruppen mit o-Phthalaldehyd
und Nachsäulen-Inline-Fluorometrie
(post-column in-line fluorometry) erreicht, wobei im fernen UV-Bereich
bestrahlt wird und die Emission bei 450 nm detektiert wird. Citrullin
wird durch Integration des Peaks und Vergleich mit der Standardkurve
quantifiziert. Die Ausbeute wird durch einen internen Standard wie
beispielsweise Homoarginin bestimmt. Ein weiterer gewöhnlicherweise
verwendeter Assay für
Citrullin umfasst die enzymatische Umwandlung von Ornithin, NH3 und CO2 unter Verwendung
der Ornithincarbamyl-Transferase in Gegenwart von AMP oder ADP,
um die Vorwärtsreaktion
zu inhibieren. Das Produkt Ammoniak ist stöchiometrisch für Citrullin
und wird durch klinische Standard-Verfahren bestimmt. Glutamatdehydrogenase
wird verwendet, um α-Keto-Glutarat
zu Glutamat und H2O zu aminieren wobei NADPH
oxidiert wird, was spektrophotometrisch gemessen wird.
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Es
können
Kits bereitgestellt werden, die Reagenzien umfassen, welche notwendig
für die
Durchführung
des Assays sind, einschließlich
DDAH und wahlweise Puffer, Säure-Lösungen,
chromogene Reagenzien und Ähnliches.
Darüber
hinaus können
die Kits Vorrichtungen zur parallelen Verarbeitung zahlreicher Proben umfassen.
Beispielsweise können
Festphasenextraktionsverteiler kommerziell in 8 × 12-Array (96-Vertiefungen)-Mikrotiter-Format erhalten werden
(z.B. EmporeTM, 3M Corp.; SPE MicroluteTM, Varian Corp.). Üblicherweise umfassen diese
Vorrichtungen Platten mit Extraktionsplättchen, bei denen bis zu 2
ml Flüssigkeit
in jede Vertiefung eingebracht werden kann. Am Boden jeder Vertiefung
ist eine Vorfilter-Anordnung, um Partikel abzufangen, einschließlich präzipitierte
Proteine. Unter dem Vorfilter befindet sich ein Extraktionsplättchen,
das üblicherweise
aus gebundenen Silika-Sorptionsmitteln besteht, welche in eine Membran
eingebettet sind. Unter jedem Extraktionsplättchen befindet sich eine Öffnung,
die den Durchfluss zulässt.
Der Durchfluss kann durch Zentrifugation, positiven Druck oder durch
Vakuum nach Verbinden der Platte an einen Vakuumverteiler angetrieben
werden. Nach Behandlung des Sorptionsmittels können die Plasmaproben (bis
zu 2 ml) in die Vertiefungen gegeben werden, und die Proteine können durch
Ansäuern
vor Induzieren des Durchflusses präzipitiert werden. Während des
Durchflusses werden präzipitierte
Proteine auf dem Vorfilter zurückgehalten,
während
die verbleibenden löslichen
Stoffe das Extraktionsplättchen
erreichen. Bei größeren Proben
können
die ausgefällten
Proteine den Durchfluss inhibieren. In diesem Fall kann man zwei
Extraktionsplatten verwenden. Die erste Platte mit 96 Vertiefungen
kann lediglich den Vorfilter umfassen, um die Präzipitate zurückzuhalten, und
der Durchfluss kann unmittelbar in einer zweiten Extraktionsplatte
gesammelt werden, die das vorbehandelte Kationenaustausch-Sorptionsmittel oder
das Mischphasen-Sorptionsmittel umfasst. Nach dem Waschen kann das
ADMA von den Extraktionsplättchen unmittelbar
in eine Sammelplatte mit 96 Vertiefungen oder in ein Gestell mit
96 Mikrozentrifugenbehältern
eluiert werden. Die Sammelplatten oder Behältervorrichtungen können anschließend für das Verdampfen
direkt in eine Haltevorrichtung für Platten mit 96-Vertiefungen
in eine Vakuumzentrifuge (z.B. Jouan Corp.) eingepasst werden. Nach
dem Verdampfen werden die Probenreste direkt in DDAH-Puffer gelöst und nach
Zugabe von DDAH kann die ADMA-Hydrolyse direkt in der Sammelplatte durchgeführt werden.
Nach der DDAH-Reaktion kann auch die Farbentwicklung direkt in der
Sammelplatte durch Zugabe der chromogenen Reagenzien durchgeführt werden.
Schließlich
kann eine spektrophotometrische Mikrotiterplatten-Lesevorrichtung
(z.B. Bio-Rad Corp.) verwendet werden, um die Absorptionsmessung unmittelbar
von den Sammelplatten zu erhalten.
-
Zusätzliche
Vorteile bezüglich
des Durchsatzes können
durch Automatisieren des Vorgehens erreicht werden, was ferner menschliche
Fehler beim Pipettieren und bei anderen Verfahrensschritten reduziert.
Zahlreiche verfügbare
Arbeitssysteme für
den Umgang mit Flüssigkeiten
(liquid handling workstations) sind speziell entworfen worden, um
sich an das Mikrotiterformat mit 96-Vertiefungen anzupassen (z.B.
Packard, Beckmann, Hamilton, Tomtec). Diese Arbeitssysteme können alle
manuellen Schritte in diesem Assays, mit der möglichen Ausnahme des Verdampfungsschrittes,
ausschalten. Der letztgenannte Schritt würde lediglich eine manuelle Entfernung
der Sammelplatten aus dem Roboter, das Einsetzen in die Vakuumzentrifuge
und nach dem Trocknen das Zurücksetzen
in den Roboter zum Zwecke der Enzymreaktion, Farbentwicklung und
der Absorptionsmessungsschritte erfordern. Man kann auch den Verdampfungsschritt
automatisieren, da die Elutionsvolumen von den Extraktionsplättchen üblicherweise
ziemlich klein sind und einige Arbeitssysteme mit Erwärmungsvorrichtungen
ausgestattet sind, die in der Lage sind, kleine Volumen an Lösungsmitteln
ziemlich verhältnismäßig wirksam
zu entfernen. Dieser wässriger Rest
kann anschließend
für die
Enzymreaktion und die nachfolgenden Schritte direkt in DDAH-Puffer
verdünnt
werden, ohne die Sammelplatte aus dem Roboter zu entfernen.
-
DDAH
(NG,NG-Dimethylarginin-dimethylaminohydrolase;
EC3.5.3.18) wurde zunächst
in Nieren von Ratten beschrieben (Ogawa et al., 1989) und wurde
anschließend
kloniert und sequenziert (Kimoto et al., 1997). Die Expression von
rekombinantem DDAH in E. coli führt üblicherweise
zu geringen Ausbeuten des löslichen
aktiven Enzyms, wobei der größte Teil
des Genprodukts zu unlöslichen
Einschlüssen
aggregiert (Mutz und Balint, nicht publiziert). Versuche, das DDAH
aus solubilisierten Einschlüssen
zurückzufalten
sind schwierig (Mutz und Balint, nicht veröffentlicht). Verbesserte Ausbeuten
konnten jedoch durch Expression von DDAH als Fusion mit stabilen
bakteriellen Proteinen, wie beispielsweise Glutathion S-Transferase
(GST) erreicht werden (Mutz und Balint, nicht publiziert; Kaelin
et al., 1992; Smith & Johnson,
1988). Beispielsweise ergibt die Expression der DDAH-GST-Fusion
ausgehend von einem pBR322-abgeleiteten
Vektor in E. coli ungefähr
10 mg (12 Einheiten) des aktiven Enzyms pro Gramm Zellen nach Reinigen
durch Affinitätschromatographie
mit immobilisiertem Glutathion.
-
Die
folgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und schränken die
Erfindung nicht ein.
-
EXPERIMENTELLER
TEIL
-
Die
beispielhafte Assay-Durchführung
ist die Folgende:
- 1. Von jedem 1 ml-Aliquot
Plasma wird das Arginin durch Zusatz von 1000 Einheiten Arginase
(Sigma) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 bis 10 Minuten entfernt,
wobei anschließend
das Protein durch das Einstellen auf 10% Trichloressigsäure (TCA)
ausgefällt
wird und durch Mikrozentrifugation bei 12000 × g für 15 Minuten entfernt wird.
- 2. Der Überstand
aus Schritt (1) wird anschließend
direkt auf irgendeine von mehreren kommerziell erhältlichen
Kationenaustauscher-Matrices mit Mischphase und hydrophoben Interaktions-Matrices
aufgebracht. Eine praktische Matrix ist die SCX-Einheit (SCX cartridge),
die von. Varian hergestellt wird, und die in einem Format mit 96-Vertiefungen
erhältlich
ist und die mit Standard-Vakuum-Verteilern und Verteilern mit positivem
Druck für
die Festphasenextraktion kompatibel ist. Für diese Anwendungen kann die
Einheit mit 1 ml Methanol (MeOH) gefolgt von 3 ml H2O
und danach mit 2 ml 2% TCA behandelt sein. Die Probe wird anschließend unter
moderatem Druck oder Vakuum aufgebracht. ADMA wird zurückgehalten,
und nach Waschen mit 2 ml 2% TCA, 3 ml 50 mM Kaliumphosphat, pH
8 und 1 ml MeOH, wird das ADMA quantitativ in 1,7 ml 2% Triethylamin
in 70% Methanol pro Probe quantitativ eluiert.
- 3. Das Auf konzentrieren der Proben in dieser Phase ermöglicht den
enzymatischen Schritt und ist für
die genaue kolorimetrische Bestimmung des Endproduktes Citrullins
entscheidend. Die Aufkonzentrierung wird in rascher Weise durch
Zentrifugal-Flash-Verdampfen in einem Speed-Vac-Verdampfer (Savant)
nach Spülen
mit Stickstoff erreicht.
- 4. Die Proben werden anschließend nach Zusatz von gereinigtem
rekombinanten DDAH wieder in Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) auf eine
Endkonzentration von 50 mM und auf ein Endvolumen von 100 μl gelöst. 0,01
Einheiten pro Probe (1/1200 einer 1-Liter-Präparation) sind mehr als ausreichend
für die
vollständige Hydrolyse
von 0,5 nmol ADMA in 30' bei
42°C.
- 5. Die Farbentwicklung wird initiiert, indem man 50 μl eines chromogenen
Reagenzes, das spezifisch mit Harnstoffgruppen reagiert und das
aus einer gleichförmigen
Mischung von 0,5% Antipyrin und 10 mM FeSO4 in
50% Schwefelsäure
und 0,8% Diacetylmonoxim in 5% Essigsäure besteht (Prescott & Jones, 1969,
Anal. Biochem. 32, 408–19)
direkt zu der DDAH-Reaktion
gibt. Die Farbentwicklung benötigt
40' bei 85°C. Anschließend werden
die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt, bei der die Farbe stabil
ist. Die Absorption wird in einem Spektrophotometer bei 466 nm bestimmt,
wobei 1 nmol Citrullin eine A466 von ~0,6 ergibt.
-
Die
folgenden Ausführungen
stellen eine Zusammenfassung der Assay-Schritte dar.
-
Enzymatischer
Assay für
ADMA in Plasma
-
- 1. Säurepräzipitation
von Protein und Zentrifugation
- 2. Kationenaustausch mit Misch-Phase und hydrophobe Interaktionseinheit,
um Hintergrund zu entfernen
- 3. Zentrifugales Flash-Verdampfen zum Zwecke des Aufkonzentrierens
- 4. DDAH-Behandlung, um ADMA zu Citrullin umzuwandeln
- 5. Kolorimetrische Bestimmung von Citrullin.
-
Um
eine Standardkurve zu erstellen wurde echtes ADMA (Sigma) in Mengen
von 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 und 1,4 nmol/ml zu humanem Blutplasma
von gesunden Patienten gegeben. Der Assay wurde in Dreifachansätzen durchgeführt und
die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die Steigung (0,039
A466 pro nmol) und der y-Abschnitt (0,19
A466) der angeglichenen Kurve verweisen
darauf, dass das Plasma 0,47 nmol ADMA pro ml enthielt. Dies stimmte
mit den Werten überein,
die in der Literatur beschrieben wurden und unter Verwendung von
Standardverfahren bestätigt
wurden, welche Fluoreszenzmarkierung mit o-Phthalaldehyd, Reverse Phase-HPLC
und Nachsäulen-Inline-Fluorometrie-Detektion
umfassten (Böger
et al., 1998, Circulation 98, 1842–1847; Chen et al., 1997 J
Chromatogr B Biomed Appl 692, 467–471). Tabelle 1 zeigt einen
Vergleich des Standard-Assays und des enzymatischen Assays für eine Reihe
von Plasmaproben von sechs Risiko-Patienten. Die zwei Verfahren
stimmen vortrefflich miteinander überein. Darüber hinaus sind die Standardfehler
beträchtlich
geringer als beim enzymatischen Assay.
-
Tabelle
1. Vergleich des Standardverfahrens und des enzymatischen Verfahrens
zur Bestimmung von ADMA in Plasma von sechs Risiko-Patienten.
-
Aus
der obigen Beschreibung und den Ergebnissen ist ersichtlich, dass
das vorliegende Protokoll den gegenwärtig verfügbaren Verfahren zur Messung
von ADMA im hohen Maße überlegen
ist. Das vorliegende Protokoll verhindert Immunassays die die Schwierigkeit
aufweisen würden,
ADMA in Gegenwart größerer Mengen
von L-Arginin oder symmetrischem L-NG,NG-Dimethylarginin zu identifizieren. Das
vorliegende Verfahren verhindert die Verwendung einer schwierigen
Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC)-Trennung aller primären
Amin-enthaltenden Bestandteile des Plasmas, nachdem sie mit einer
Fluoreszenzmarkierung derivatisiert worden sind, wobei die Reproduzierbarkeit
bekannterweise empfindlich in Bezug auf die Bedingungen der Säule und
der mobilen Phase ist, und wobei eine häufige Reinigung der Säule sowie
ein wiederholtes Aufnehmen von Standardkurven erforderlich ist.
Darüber
hinaus müssen
die Peakflächen
integriert und mit Standardkurven verglichen werden. Ferner erlaubt
die Verwendung der HPLC den Durchlauf von parallelen Proben nicht,
was zu einer wesentlichen Verringerung der Anzahl von Assays führt, die
mit einem einzelnen Teil der Ausstattung durchgeführt werden
können.
-
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