DE60025739T2 - Verfahren um die anwesenheit von doppelsträngiger dns in einer probe nachzuweisen - Google Patents

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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Description

  • DANKSAGUNG UND ANERKENNUNG
  • Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten unter Verwendung der im Rahmen der Grant Nos. NIH R01 HG/OD01360-01 und HG 01826-01B von den NIH (National Institutes of Health) zuerkannten Mitteln entwickelt. Die Regierung der Vereinigten Staaten verfügt in Bezug auf diese Erfindung über bestimmte Rechte.
  • Diese Anmeldung beansprucht Priorität gegenüber dem Einreichungsdatum der vorläufigen US-Patentanmeldung der Serien-Nr. 60/152.673, eingereicht am 7. September 1999.
  • EINFÜHRUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Das Gebiet der Erfindung ist Nucleinsäurehybridisierung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Detektion von Nucleinsäure-Hybridisierungsereignissen ist eine grundlegende Messung in zahlreichen verschiedenen Forschungsgebieten der Biowissenschaften, bei diagnostischen, forensischen und damit verwandten Anwendungen. Eine gemeinsame Eigenschaft von Nucleinsäure-Hybridisierungstests ist, dass Target- und Sonden-Nucleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen kombiniert und jegliche Hybridisierungsereignisse, die zwischen komplementären Target- und Sonden-Nucleinsäuren auftreten, nachgewiesen werden. Die Detektion von Hybridisierungsereignissen, d.h. von Target/Sonden-Duplexen, wird dann verwendet, um daraus Informationen zur Quelle der Target-Nucleinsäuren abzuleiten, z.B. zu den Genen, die in einem Zell- oder Gewebetyp exprimiert werden und dergleichen.
  • In zur Zeit verwendeten Hybridisierungstests muss die Target-Nucleinsäure mit einer nachweisbaren Markierung markiert werden (wobei die Markierung entweder direkt oder indirekt nachweisbar sein kann), so dass die Gegenwart von Sonden/Target-Duplexen nach Hybridisierung nachgewiesen werden kann. Aktuell verwendete Markierungen umfassen Isotopen- und Fluoreszenzmarkierungen, worin Fluoreszenzmarkierungen als Markierung der Wahl, insbesondere für Hybridisierungstests auf Datenfeldbasis, immer beliebter werden.
  • Wenn Fluoreszenzmarkierungen gegenüber anderen Arten von Markierungen in Hybridisierungstests auch zahlreiche Vorteile bieten, sind sie doch nicht ideal. Es ist zum Beispiel schwierig, mit Fluoreszenzmarkierungen quantitative Resultate zu erzielen. Weiters können auf Fluoreszenzmarkierungen basierende Tests relativ viel Zeit in Anspruch nehmen und schwierig im größeren Maßstab durchzuführen sein.
  • Folglich gibt es ein permanentes Interesse an der Entwicklung neuer Vorschriften für Hybridisierungstests. Von besonderem Interesse wäre die Entwicklung einer Hybridisierungstestvorschrift, bei der die Gegenwart von hybridisiertem/r Target und Sonde ohne die Verwendung von Markierungen wie beispielsweise Fluoreszenzmarkierungen nachgewiesen werden könnte.
  • Relevante Literatur
  • Bean et al., J. Appl. Phys 41, 1454–1459 (1970); DeBlois et al., J. Coll. Interfacce 61, 323–335 (1977); und Kasianowicz et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93, 13770–13773 (1996). Das US-Patent Nr. 5.795.782 betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung einzelner Polymermoleküle basierend auf Monomer-Grenzflächen-Wechselwirkungen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Bereitgestellt werden Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Probe. In den vorliegenden Verfahren werden Nucleinsäuren, die in einer Fluidprobe vorhanden sind, durch eine Nanopore, z.B. durch Anlegen eines elektrischen Feldes an die Fluidprobe, transloziert. Die Stromamplitude durch die Nanopore wird während des Translokationsvorgangs überwacht, und Ver änderungen der Amplitude werden mit dem Durchtritt von einzel- oder doppelsträngigen Molekülen durch die Nanopore in Verbindung gebracht. Die vorliegenden Verfahren finden in zahlreichen verschiedenen Anwendungen Verwendung, bei denen der Nachweis der Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Probe erwünscht ist, z.B. in Hybridisierungstests, wie Northern-Blot-Tests, Southern-Blot-Tests, datenfeldbasierte Hybridisierungstests und dergleichen.
  • Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen in einer wässrigen Probe bereit, von der angenommen wird, dass sie sowohl doppel- als auch einzelsträngige Nucleinsäuren aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (a) das Kontaktieren der Probe mit einer Nanoporen-Vorrichtung, die eine einzige Nanopore umfasst, die in einer Trennschicht vorhanden ist, die eine cis- und eine trans-Kammer voneinander trennt;
    • (b) das Translozieren von zumindest einem Teil der doppel- und einzelsträngigen Nucleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind, durch die Nanopore;
    • (c) das Beobachten der Stromamplitude durch die Nanopore während der Translokation; und
    • (d) das Beziehen jeglicher Veränderung dieser Stromamplitude während der Translokation auf die Gegenwart oder Abwesenheit von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen in der Probe;
    um die Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen in der Probe nachzuweisen.
  • Die Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Bestimmung der relativen Mengen von einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen in einer wässrigen Probe bereit, worin das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (a) das Kontaktieren der wässrigen Probe mit einer Nanoporen-Vorrichtung, die eine Trennschicht umfasst, die eine einzige Nanopore einbindet;
    • (b) das Translozieren von im Wesentlichen allen in der Probe vorhandenen DNA-Molekülen durch die Nanopore durch Anlegen eines elektrischen Feldes an die Probe;
    • (c) das Beobachten der Stromamplitude durch die Nanopore während der Translokation und das Ableiten eines Stromblockadeprofils; und
    • (d) das Beziehen des Stromblockadeprofils auf die relativen Mengen an einzel- oder doppelsträngigen DNA-Molekülen in der Probe;
    um die relativen Mengen von einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen in der Probe zu detektieren.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A und B sind Darstellungen zur Herstellung einer Glimmer-Nanoporen-Vorrichtung, die verwendet werden kann, um die Verfahren der vorliegenden Erfindung in die Praxis umzusetzen.
  • Die 2A und 2B sind Darstellungen der vorliegenden Verfahren.
  • BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es werden Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von doppelsträngigen oder hybridisierten Nucleinsäuren in einer Fluidprobe bereitgestellt. In den vorliegenden Verfahren wird eine Probe, von der angenommen wird, dass sie doppelsträngige Nucleinsäuren aufweist, mit einer Nanopore kontaktiert, und Nucleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind, werden nacheinander durch die Nanopore transloziert, z.B. durch Anlegen eines elektrischen Feldes an die Fluidprobe und über die Nanopore. Die Stromamplitude durch die Nanopore wird während des Translokationsschrittes überwacht. Die Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuren, die in den Proben vorhanden sind, wird dann aus den gemessenen Stromamplitudenwerten bestimmt. Die vorliegenden Verfahren finden in zahlreichen verschiedenen Anwendungen Verwendung und sind besonders zur Überwachung von Hybridisierungsereignissen in auf Hybridisierung basierenden Tests, z.B. Northern-Blots, Southern-Blots, Datenfeld-basierten Hybridisierungstests und dergleichen, nützlich.
  • Bevor die vorliegende Erfindung näher beschrieben wird, gilt es zu verstehen, dass die Erfindung nicht auf die nachstehend beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung beschränkt ist, da an den speziellen Ausführungsformen Veränderungen vorgenommen werden können, die weiterhin in den Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche fallen. Es gilt ebenfalls zu verstehen, dass die verwendete Terminologie dem Zwecke der Beschreibung spezieller Ausführungsformen dient und wiederum nicht als Einschränkung zu verstehen ist. Vielmehr ist der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung durch die beiliegenden Ansprüche definiert.
  • In dieser Beschreibung und in den beiliegenden Ansprüchen umfassen die Singularformen „ein" und „der", „die" oder „das" auch Pluralbezüge, außer der Zusammenhang verlangt es eindeutig anders. Sofern es nicht spezifisch anders definiert ist, haben alle fachlichen und wissenschaftlichen Bezeichnungen hierin dieselbe Bedeutung wie jene, die durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist.
  • Wie zuvor bereits kurz zusammengefasst stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart doppelsträngiger Nucleinsäuren in einer Fluidprobe bereit. Unter Nucleinsäuren wird ein Polymer verstanden, das sich aus Nucleotiden, z.B. Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden, zusammensetzt. Als solche umfassen Nucleinsäuren „Ribonucleinsäure" oder „RNA" und „Desoxyribonucleinsäure" oder „DNA". In manchen Ausführungsformen sind die Nucleinsäuren von Interesse DNA-Moleküle. Die Länge der Nucleinsäuren, die mittels der vorliegenden Verfahren als einzel- oder doppelsträngig charakterisiert werden können, liegen im Allgemeinen im Bereich von zumindest etwa 5 nt, üblicherweise zumindest etwa 10 nt und noch üblicher zumindest etwa 100 nt bis hin zu Längen von 1.000 nt oder länger. Als solche umfassen Nucleinsäuren, die gemäß der vorliegenden Erfindung charakterisiert werden können, Oligonucleotide und Polynucleotide einschließlich, in manchen Ausführungsformen, langer Polynucleotide, z.B. cDNAs, und dergleichen.
  • Die Nucleinsäuren, die mittels der vorliegenden Verfahren charakterisiert werden können, sind in einer Fluidprobe, insbesondere einer Flüssigprobe, vorhanden. Die Probe muss eine elektrisch leitende Probe sein, d.h. dass die Nucleinsäuren in einem elektrisch leitenden Lösungsmittel gelöst sein müssen. Jegliches geeignete elektrisch leitende Lösungsmittel kann verwendet werden. In zahlreichen Ausführungsformen ist das Lösungsmittel ein wässriges Lösungsmittel, worin das Lösungsmittel reines Wasser oder Wasser sein kann, in dem ein oder mehrere Mittel, z.B. Puffermittel, Salze (z.B. Kaliumchlorid) und dergleichen, vorhanden sind. Der pH der Fluidprobe liegt typischerweise im Bereich von etwa 6,0 bis 9,0, und noch üblicher im Bereich von etwa 7,0 bis 8,5. Die Bezugsquelle für die Probe variiert je nach speziellem Anwendungsbereich, in dem die vorliegenden Verfahren zum Einsatz kommen, stark, wobei repräsentative Anwendungen nachstehend noch näher beschrieben werden. Die Probe kann beispielsweise ein Fluid-Spot auf einem Datenfeld, eine angefeuchtete Bande auf einem Blot und dergleichen sein.
  • Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Verfahren umfasst der erste Schritt (nach jeglichen Probenvorbereitungsschritten, je nach Bedarf) das Kontaktieren der Probe mit einer einzelnen Nanopore. Typischerweise ist die Nanopore eine Komponente einer Nanoporen-Vorrichtung, in der die Nanopore an einer Trennschicht vorhanden ist, die eine cis- und eine trans-Seite der Nanopore definiert, so dass die Probe durch Platzieren der Probe an einer der beiden Seiten, cis oder trans, der Nanopore mit der Nanopore kontaktiert wird. Die der Fluidprobe gegenüberliegende Seite steht auch mit einem leitfähigen Fluid in Kontakt, wobei das Fluid dasselbe wie oder ein anderes als das Lösungsmittel der Fluidprobe sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist die Vorrichtung so strukturiert, dass Wände bereitgestellt werden, um das Fluid entweder an der cis- oder der trans-Seite der Nanopore zu halten, z.B. sind cis- oder trans-Fluidkammern oder -Wells vorhanden, worin die Kammern oder Wells durch die Trennschicht/Nanoporenstruktur voneinander getrennt sind.
  • Unter Nanopore wird eine Struktur mit einem Kanal oder einer Pore mit einem Durchmesser mit „nano"-Abmessungen verstanden, worin der innere Durchmesser der Pore oder des Kanals typischerweise im Bereich von etwa 1 bis 10 nm, üblicherweise im Bereich von zumindest etwa 2 bis 4 bis etwa 3 bis 6 nm, liegt, worin in manchen Ausführungsformen der Durchmesser im Bereich von etwa 3 bis 6 nm liegt. Die Nanopore kann synthetisch oder natürlich sein, wobei in der Natur vorkommende Nanoporen oligomere Proteinkanäle wie Porine und synthetische Peptide und dergleichen umfassen. Synthetische Nanoporen von Interesse umfassen Kanäle, die durch feste Materialien gebohrt werden, wie sie beispielsweise in der synthetischen Nanoporen-Vorrichtung zu finden sind, die nachstehend beschrieben wird.
  • Wie zuvor erwähnt sind die Nanoporen-Vorrichtungen dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtungen eine einzelne Nanopore aufweisen, die an einer Trennschicht vorhanden ist. Die Trennschicht kann eine steife Trennschicht oder eine flexible Trenn schicht sein, beispielsweise eine dünne Folie, z.B. eine Lipiddoppelschicht. In einer Ausführungsform ist die Trennschicht, in die die Nanopore insertiert ist, eine Lipiddoppelschicht, die aus einer großen Vielfalt aus einem oder mehreren unterschiedlichen Lipiden hergestellt wird, worin geeignete Lipide Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Glycerinmonooleat und Cholesterin umfassen. In wiederum anderen Ausführungsformen ist die Trennschicht eine dünne Folie aus einem steifen kristallinen Material, z.B. Glimmer, Formvar-Folien, Polycarbonatfolien oder ein ähnliches, gering dielektrisches Material, worin die Dicke der Folie im Bereich von 2 bis 1.000 nm, üblicherweise von etwa 5 bis 100 nm, liegt. Wie bereits erwähnt weist die Trennschicht/Einzelnanoporenstruktur eine cis- und eine trans-Seite auf, die während der Verwendung der Vorrichtung die Fluidprobe von dem übrigen Fluid trennt, das dasselbe wie oder ein anderes als die Lösungsmittelkomponente der Fluidprobe (d.h. die Fluidprobe ohne die Nucleinsäuren) sein kann.
  • Zusätzlich zur Trennschicht/Einzelnanoporenstruktur umfassen die Nanoporen-Vorrichtungen, die in den vorliegenden Verfahren Verwendung finden, weiters ein Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes an der Fluidprobe und über die Nanopore, und dies in einer Weise, dass Nucleinsäuremoleküle, die in der Fluidprobe vorhanden sind, nacheinander durch die Nanopore auf die andere Seite der Trennschicht hin transloziert werden, wie nachstehend noch näher beschrieben wird. Wenn auch jedes beliebige, geeignete Mittel verwendet werden kann, besteht das Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Allgemeinen aus zwei Elektroden, wovon die eine an der cis-Seite der Trennschicht vorhanden ist und die andere an der trans-Seite der Trennschicht vorhanden ist.
  • In der Literatur wurden bereits zahlreiche verschiedene, geeignete dünne Folienträgervorrichtungen beschrieben, die verwendet werden können, um die in den vorliegenden Verfahren verwendete Nanopore/Trennschicht zu tragen. Solche Vorrichtungen umfassen jene, die in Brutyan et al., Biochimica et Biophysica Acta 1236, 339–344 (1995); Wonderlin et al., Biophys. J. 58, 289–297 (1990); Suarez-Isla et al., Biochemistry 22, 2319–2323 (1983), beschrieben werden, sowie jene, die im US-Patent Nr. 5.795.782 mit dem Titel „Characterization of Individual Polymer Molecules Based on Monomer-Interface Interactions" („Charakterisierung einzelner Polymermoleküle, basierend auf Monomer-Grenzflächen-Wechselwirkungen"), eingereicht am 17. März 1995, mit der Referenznummer der University of California 91-287-2 geoffenbart sind; und die Vorrichtung, die im US-Patent Nr. 6.267.307 beschrieben wird.
  • Eine repräsentative Glimmer-Nanoporen-Vorrichtung, die in den vorliegenden Verfahren verwendet werden kann, ist in den 1A und 1B dargestellt und im Detail in Beispiel I, s.u., beschrieben. Kurz zusammengefasst stellen die 1A und 1B ein Diagramm einer Glimmerfolie bereit, die geätzt wurde, um eine Nanopore hervorzubringen. Eine dünne Glimmerfolie wird an ein Glaskapillarröhrchen zementiert und gegenüber 252Cf-Spaltprodukten ausgesetzt, die im Mittel eine einzelne Kernspur durch den Glimmer ziehen. Das Röhrchen wird dann mit 1,0 M KCl-Elektrolyt gefüllt, und eine Silber-Silberchlorid-Elektrode wird insertiert. Ein zweites Kunststoffkapillarröhrchen wird mit KCl gefüllt, und eine Elektrode wird über dem Glimmer wie gezeigt platziert, und ein Gemisch aus 1,0 M KCl-20 % Fluorwasserstoffsäure wird zugesetzt, um den Zwischenraum zu füllen. Eine Spannung von 100 mV wird angelegt. Innerhalb eines Zeitraums von mehreren Minuten ätzt das HF die Spur in den Glimmer und bildet eine Nanopore mit 6 nm Durchmesser. Wenn die Pore vollständig durch den Glimmer geätzt ist, wird der Ionenstrom gemessen, und der Glimmer wird gespült, um HF zu entfernen. Die Vorrichtung ist nun zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren bereit.
  • Nach Kontaktieren der Fluidprobe mit der Nanopore, z.B. mit der cis- oder trans-Seite der Nanoporen/Trennschichtstruktur der Nanoporen-Vorrichtung, wird ein Teil der Nucleinsäuren, die in der Fluidprobe vorhanden sind, wenn nicht sogar alle, durch die Nanopore transloziert, d.h. sie werden von der cis- zur trans-Seite der Nanopore oder umgekehrt bewegt. Unter „nacheinander" wird verstanden, dass nur eine Nucleinsäure, die in der Probe vorhanden ist, zugleich durch die Nanopore bewegt wird, da die Nanopore so dimensioniert ist, dass sie das Passieren von nur einer einzelnen Nucleinsäure zugleich zulässt. Unter „zumindest ein Teil von" werden zumindest etwa 5 %, üblicherweise zumindest etwa 10 % und noch üblicher zumindest etwa 15 %, der in der Probe vorhanden Nucleinsäuren verstanden. Translokation oder Bewegung der Nucleinsäuren in der Probe durch die Nanopore wird unter Anwendung jedes beliebigen geeigneten Mittels erreicht, worin Bewegung im Allgemeinen durch Anlegen eines elektrischen Feldes an der Probe und durch die Nanopore erzielt wird. Das angelegte elektrische Feld ist ausreichend stark, um die Nucleinsäuren durch die Nanopore zu bewegen. Das tatsächliche gemessene elektrische Feld, das über eine typische Nanopore mit 5 nm Länge angelegt wird, liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 50 bis 400 mV und üblicherweise von 100 bis 200 mV. Wird dies in Volt pro cm ausgedrückt, so kann das elektrische Feld, das angelegt wird, im Bereich von etwa 50.000 bis 500.000 Volt pro cm liegen, worin das angelegte elektrische Feld typischerweise im Bereich von etwa 100.000 bis 400.000 Volt pro cm und noch üblicher im Bereich von etwa 150.000 bis 300.000 Volt pro cm liegt.
  • Die Dauer, während der das elektrische Feld an der Fluidprobe und über die Nanopore angelegt wird, variiert je nachdem, ob nur ein Teil oder im Wesentlichen alle der Nucleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind, transloziert werden. Im Allgemeinen wird das elektrische Feld zumindest etwa 1 ms, üblicherweise zumindest etwa 1 s und noch üblicher zumindest etwa 10 s angelegt, worin das elektrische Feld 1 min oder länger angelegt werden kann, im Allgemeinen jedoch nicht länger als etwa 10 min und üblicherweise nicht länger als etwa 1 h angelegt wird.
  • Während des Translokationsschrittes wird die Wirkung über die Dauer der Translokation anhand eines messbaren Signals bestimmt. Ein geeignetes Signal ist der Ionen strom durch die Pore. Als solches wird in zahlreichen Ausführungsformen der Ionenstrom durch die Pore während der Translokation der Nucleinsäuren durch die Pore gemessen. In anderen Worten wird der Strom durch die Pore während des Translokationsschrittes überwacht. Die Messungen beziehen sich im Allgemeinen auf die Amplitude des Stroms durch die Nanopore. Bei der Überwachung der Nanopore während des Translokationsschrittes werden die Messungen des Stroms durch die Pore typischerweise zumindest jede 1 s, üblicherweise zumindest jede 0,1 s und noch üblicher zumindest jede 0,02 s vorgenommen.
  • In zahlreichen Ausführungsformen werden dann die gemessenen Datenwerte, z.B. Stromamplituden, manipuliert, um ein Stromblockadeprofil oder eine ähnliche Leistung zu liefern, das bzw. die mit Bezugsleistungen vergleichbar ist, sodass die Natur der Nucleinsäure, d.h. die Einzel- oder Doppelsträngigkeit der Nucleinsäure, die die Pore passiert, bestimmt werden kann. Unter Stromblockadeprofil wird die Sammlung von Stromblockaden-Datenpunkten verstanden, die gegenüber einer bestimmten Zeitspanne der Verwendung eines angelegten elektrischen Felds an der Nanopore in Diagrammform dargestellt werden. Die bestimmte Zeitspanne, im Laufe derer ein einzelnes Nucleinsäuremolekül untersucht wird, beträgt im Allgemeinen zumindest etwa 10 μs, üblicherweise zumindest etwa 100 μs und noch üblicher zumindest etwa 250 μs, und kann bis zu 1 s oder länger dauern, übersteigt jedoch üblicherweise eine Dauer von etwa 5 ms nicht. Die Stromblockaden-Datenpunkte werden aus der beobachteten Veränderung des Ionenstroms durch die Nanopore von der cis- zur trans-Seite bei Belegung durch die Nucleinsäure abgeleitet.
  • Nach Ableitung der Sammlung an Stromblockadeprofilen während des Translokationsverfahrens werden die abgeleiteten Stromblockadeprofile für eine Probe anschließend verwendet, um die Gegenwart oder Abwesenheit von doppelsträngigen oder hybridisierten Nucleinsäuren in der Probe zu bestimmen. Durch Vergleichen der beobachteten Gesamtstromblockadeprofile mit Bezugsstromblockadeprofilen von einzel- und doppelsträngigen Nucleinsäuren kann die Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Probe leicht bestimmt werden. In anderen Worten können die Stromblockadeprofile betrachtet werden, um Muster zu identifizieren, die mit dem Stromblockadeprofil übereinstimmen, das aus Translokation einer bekannten doppelsträngigen Nucleinsäure durch die Nanopore hervorgeht. Werden Muster identifiziert, die mit dem Kontrollmuster übereinstimmen, so kann daraus geschossen werden, dass die Probe doppelsträngige oder hybridisierte Nucleinsäuren umfasst. Der Vergleich kann manuell oder automatisch unter Verwendung von Computern und geeigneter Software erfolgen.
  • Die vorliegenden Verfahren können zusätzlich dazu, dass sie zur Bestimmung der Gegenwart von einzel- oder doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Probe nützlich sind auch verwendet werden, um die relativen Mengen von einzel- oder doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Probe zu bestimmen. Um die relativen Mengen von einzel- oder doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Probe zu bestimmen, können die einzelnen Blockadeprofile, die während der Translokation gemessen werden, qualitativ oder quantitativ betrachtet und daraus ein proportionaler Anteil an einzel- oder doppelsträngigen Nucleinsäuren in der Probe abgeleitet werden. Die vorliegenden Verfahren können auch verwendet werden, um die Anzahl einzel- oder doppelsträngiger Nucleinsäuren in der Probe, z.B. durch Zählen der Anzahl an einzelsträngigen Blockadeprofilen und der Anzahl an doppelsträngigen Nucleinsäure-Stromblockadeprofilen, die während der Translokation beobachtet wurden, quantitativ zu bestimmen. Diese Bestimmungen können wiederum manuell oder unter Verwendung eines Computers und der geeigneten Software erfolgen.
  • Die vorliegenden Verfahren finden in zahlreichen verschiedenen Anwendungen Verwendung, deren Ziel die Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Probe ist. Die vorliegenden Verfahren finden beispielsweise bei der Detektion von Hybridisierungsereignissen in Tests Verwendung, in denen komplementäre Nucleinsäuren aneinander hybridisiert und anschließend nachgewiesen werden. Beispiele für solche Hybridisierungstests umfassen Tests, in denen eine oder mehrere Sonden mit Target-Nucleinsäure kombiniert werden und das Auftreten von Hybridisierungsereignissen in Lösung nachgewiesen wird. In solchen Tests wird eine unmarkierte Sonde mit der Target-Nucleinsäurenprobe kontak tiert. Anschließend wird die Fluidprobe gemäß den vorliegenden Verfahren getestet, und die Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuren in der Probe wird bestimmt. Die Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuren weist darauf hin, dass zwischen der Sonde und dem Target Hybridisierung stattgefunden hat.
  • Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung angegeben.
  • EXPERIMENTELLER TEIL
  • I. Herstellung der Glimmer-Nanoporen-Vorrichtung
  • 1 stellt ein Diagramm einer Glimmerfolie bereit, die zur Bildung einer Nanopore geätzt wird. Eine dünne Glimmerfolie wird an ein Glaskapillarröhrchen zementiert und dann gegenüber 252Cf-Spaltprodukten ausgesetzt, die im Mittel eine einzelne Kernspur durch den Glimmer ziehen. Das Röhrchen wird dann mit 1,0 M KCl-Elektrolyt gefüllt, und eine Silber-Silberchlorid-Elektrode wird eingesetzt. Ein zweites Kunststoffkapillarröhrchen, das mit KCl gefüllt ist, wird über dem Glimmer wie gezeigt platziert, und ein Gemisch aus 1,0 M KCl-20 % Fluorwasserstoffsäure wird zugesetzt, um den Zwischenraum zu füllen. Eine Spannung von 100 mV wird angelegt. Innerhalb eines Zeitraums von mehreren Minuten ätzt das HF die Spur in den Glimmer und bildet eine Nanopore mit 6 nm Durchmesser aus (siehe z.B. Bean et al., J. Appl. Phys. 41, 1454–1459 (1970)). Wenn die Pore vollständig durch den Glimmer geätzt ist, wird der Ionenstrom gemessen, und der Glimmer wird gespült, um HF zu entfernen.
  • II. Detektion von doppelsträngiger DNA in einer Probe
  • Eine 10-μl-Aliquote von 10 μM einzelsträngigen 100-mer-DNA-Sondenmolekülen, hergestellt an einem DNA-Syntheseautomaten in 1,0 M KCl, wird in zwei Wells platziert, wobei jeder Well am Boden eine in Beispiel I ausgebildete 6-nm-Glimmer- Nanopore und einen Stromkreis aufweist, sodass eine Spannung von 100 mV durch die Pore angelegt werden kann. Unter diesen Bedingungen befördert eine 6-nm-Nanopore einen Strom von etwa 1,0 nA. Wen die 100-mer-Sondenmoleküle nun mittels der Spannung durch die Nanopore bewegt werden, erzeugen sie eine Reihe von Stromblockaden, die jeweils einige hundert μs andauern und den Strom während der Blockade um 20 % (auf 0,8 nA) verringern. Siehe 2A. Zwei unbekannte einzelsträngige DNA-Fragmente werden zu den Wells zugesetzt, eines zusammen mit einer komplementären Basensequenz. Eine neue Serie von Blockaden größeren Ausmaßes wird im Well beobachtet, dem das komplementäre Fragment zugesetzt wurde. Die Blockaden größerer Amplitude treten im Well, der die nicht komplementären Fragmente enthält, nicht auf. Siehe 2B.
  • Aus den obigen Resultaten und Erläuterungen geht eindeutig hervor, dass hierin neue Verfahren zur Detektion der Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen, z.B. hybridisierten DNA-Molekülen, bereitgestellt werden. Als solche werden neue Verfahren zur Detektion der Gegenwart von hybridisierten Sonden/Target-Komplexen bereitgestellt, in denen keine nachweisbare Markierung, wie etwa Fluoreszenz- oder Isotopenmarkierung, zum Einsatz kommt. Folglich stellt die vorliegende Erfindung einen signifikanten Beitrag zum technischen Gebiet der Erfindung dar.

Claims (10)

  1. Verfahren zur Detektion der Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen in einer wässrigen Probe, von der angenommen wird, dass sie sowohl doppel- als auch einzelsträngige Nucleinsäuren beinhaltet, umfassend: (a) das Kontaktieren der Probe mit einer Nanoporen-Vorrichtung, die eine einzige Nanopore umfasst, die in einer Trennschicht vorhanden ist, die eine cis- und eine trans-Kammer voneinander trennt; (b) das Translozieren von zumindest einem Abschnitt der doppel- und einzelsträngigen Nucleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind, durch die Nanopore; (c) das Beobachten der Stromamplitude durch die Nanopore während der Translokation; und (d) das Beziehen jeglicher Veränderung in dieser Stromamplitude während der Translokation auf die Gegenwart oder Abwesenheit von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen in der Probe; um die Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen in der Probe nachzuweisen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Beobachten der Stromamplitude die Ableitung eines Strom-Blockade-Profils und das Vergleichen des Strom-Blockade-Profils mit den Strom-Blockade-Profilen für einzel- und doppelsträngige Nucleinsäure(n) umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das doppelsträngige Nucleinsäuremolekül DNA ist.
  4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin im Wesentlichen alle Nucleinsäuremoleküle, die in der Probe vorhanden sind, sequenziell durch die Nanopore bewegt werden.
  5. Verfahren zur Bestimmung der relativen Mengen von einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen in einer wässrigen Probe, umfassend: (a) das Kontaktieren der wässrigen Probe mit einer Nanoporen-Vorrichtung, die eine Trennschicht umfasst, die eine einzelne Nanopore einbindet; (b) das Translozieren von im Wesentlichen allen DNA-Molekülen, die in der Probe vorhanden sind, durch die Nanopore mittels Anlegen eines elektrischen Feldes an die Probe; (c) das Beobachten der Stromamplitude durch die Nanopore während der Translokation und das Ableiten eines Strom-Blockade-Profils; und (d) das Beziehen des Strom-Blockade-Profils auf die relativen Mengen an einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen in der Probe; um die relativen Mengen an einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen in der Probe zu bestimmen.
  6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Mengen von einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen in einer wässrigen Probe, umfassend: (a) das Kontaktieren der wässrigen Probe mit einer Nanoporen-Vorrichtung, die eine Trennschicht umfasst, die eine einzelne Nanopore einbindet; (b) das Translozieren von im Wesentlichen allen DNA-Molekülen, die in der Probe vorhanden sind, durch die Nanopore mittels Anlegen eines elektrischen Feldes an die Probe; (c) das Beobachten der Stromamplitude durch die Nanopore während der Translokation, um eine Vielzahl an Stromamplitudenmessungen zu erhalten, und das Ableiten von Strom-Blockade-Profilen von dieser Vielzahl an Stromamplitudenmessungen; und (d) das Beziehen der Strom-Blockade-Profile auf die quantitativen Mengen an einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen in der Probe; um die quantitativen Mengen an einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen in der Probe zu bestimmen.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin DNA-Moleküle in einem Längenbereich von 5 nt bis 1.000 nt liegen.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin die Nanopore einen Durchmesser im Bereich von etwa 3 nm bis 6 nm aufweist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, worin das elektrische Feld eine Stärke aufweist, die im Bereich von etwa 50 mV bis 400 mV liegt.
  10. Verfahren nach Anspruch 5, worin die quantitativen Mengen von einzel- und doppelsträngigen DNA-Molekülen, die in der Probe vorhanden sind, bestimmt werden.
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