DE60029440T2

DE60029440T2 - Methoden und materialien zur synthese von organischen produkten

Info

Publication number: DE60029440T2
Application number: DE60029440T
Authority: DE
Inventors: Vineet Minnetonka RAJGARHIA; Vassily Minneapolis HATZIMANIKATIS; Stacey Minneapolis OLSON; Ting Liu Dayton CARLSON; John N. Chaska STARR; Jeffrey J. Wayzata KOLSTAD; M. Aharon EYAL
Original assignee: Cargill Dow LLC
Current assignee: NatureWorks LLC
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2020-05-20
Also published as: US7229805B2; CA2374482C; US7700332B1; BR0010806A; YU83101A; BR0010806B1; EP1183385A1; US20040029238A1; HK1045174A1; NO326775B1; CZ299320B6; PT1183385E; CA2374482A1; HUP0201204A3; WO2000071738A1; JP4637372B2; DE60029440D1; KR20020048910A; AU5034400A; PL352434A1

Description

1. Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Materialien, die in die Erzeugung organischer Produkte verwickelt sind.
2. Hintergrundinformationen
Organische Produkte wie Milchsäure haben viele wichtige, industrielle Verwendungen, zum Beispiel können organische Säuren verwendet werden, um Plastikmaterialien sowie andere Produkte zu synthetisieren. Um die steigende Nachfrage nach organischen Produkten zu befriedigen, werden effizientere und kosteneffizientere Produktionsverfahren entwickelt. Ein solches Verfahren involviert die Verwendung von Bakterien. Bestimmte Bakterien können spezifisch große Menge von speziellen organischen Produkten unter bestimmten Fermentationsbedingungen erzeugen. Die Verwendung von lebenden Bakterien als Fabriken ist hingegen begrenzt durch die Unfähigkeit der Bakterien, zu wachsen, wenn sich das organische Produkt im Wachstumsmedium ansammelt. Um solche Begrenzungen zu umgehen, sind verschiedene Produktreinigungstechniken bei der Produktsynthese eingesetzt worden. Zusätzlich ist die Verwendung von anderen Mikroorganismen als Bakterien versucht worden. Tatsächlich wurde Saccharomyces cerevisiae, welches als säuretolerant bekannt ist, genetisch modifiziert, um Milchsäure zu erzeugen. Spezifisch werden S. cerevisiae-Zellen modifiziert durch Versehen der Zellen mit Rinderlactatdehydrogenase-cDNA und unterbrechen von endogenen Pyruvatdcarboxylasegenen (PDC1, PDC5 und PDC6). Während diese modifizierten S. cerevisiae-Zellen etwas Milchsäure erzeugten, war das Zellwachstum unterdrückt, was zu der Schlußfolgerung führt, daß sowohl Zellwachstum als auch Milchsäureproduktion der Verbesserung bedürfen.
WO 97/16528 beschreibt einen mutanten E.-Coli-Stamm, welchem das Vermögen fehlt, Pyruvat zu katabolisieren. Mutanten werden ausgewählt aufgrund von deren Vermögen, auf Glucose in einer anaeroben Umgebung zu wachsen. Der Mutantenstamm ist nützlich zur Erzeugung von Succinsäure.
Gemäß EP 0 370 160 A , ein gefrier-toleranter Stamm von Kluyveromyces thermotolerans, wird erzeugt zur Verwendung als Bäckerhefe durch Wachsen der Zellen in einem stickstoff- und phosphorhaltigen Medium bis 40 bis 150 g/l an Zellen erzeugt sind und dann Auffüllen auf 200 Gew.-% an Melassen, basierend auf dem Gewicht der Hefezellen und Vermindern der Belüftung. Diesem Verfahren wird nachgesagt, daß es eine Bäckerhefe erzeugt, die hervorragendes Fermentationsvermögen beim Backvorgang hat.
Porro und Mitarbeiter haben einen S. cerevisiae-Stamm beschrieben, der ein exogenes Lactatdehydrogenasegen (LDH) enthält und verminderte PDC-Aktivität. Siehe WO 99/14335 und Biotech. Prog. 1995, 11, 294–298.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Materialen zur Herstellung von organischer Produkte. Spezifischer gibt die Erfindung Hefezellen, Verfahren zur Kultivierung von Hefezellen, Verfahren zur Herstellung von Hefezellen, Nukleinsäurenkonstrukten und Verfahren und Materialien zur Herstellung verschiedener organischer Produkte an. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß spezielle Mikroorganismen (z.B. Bakterien- und Pilzorganismen) allgemein so genetisch manipuliert werden können, daß sie das Vermögen unter spezifischen Kulturbedingungen haben, zu wachsen und verschiedene Kohlenstoffquellen zum Wachstum als auch zur Produktherstellung verwenden können und ein gewünschtes, organisches Produkt für kommerzielle Zwecke herzustellen. Die Hefezellen, die hier bereitgestellt werden, können wachsen und ein organisches Produkt erzeugen, wenn sie kultiviert werden bei niedrigem pH und hoher Temperatur. Das Vermögen zu haben, schnell zu wachsen und ein organisches Produkt effizient zu erzeugen, zum Beispiel unter niedrigem pH und hohen Temperaturbedingungen, ist speziell vorteilhaft. Das Vermögen eines Mikroorganismus, niedrigen pH zu tolerieren, umgeht speziell den Bedarf, eine neutral pH-Umgebung aufrecht zu erhalten, was schwierig und kostspielig bei Produktionsvorgängen in großem Maßstab sein kann. Zusätzlich können die Verfahren und Materialen, die benötigt werden, um das gewünschte, organische Produkt aus einem niedrig pH-Wachstumsmedium zu gewinnen, praktischer und effizienter sein als jene, die erforderlich sind, um dasselbe organische Produkt aus einem Wachstumsmedium zu gewinnen, das einen neutraleren pH hat. Bestimmte organische Säureprodukte können zum Beispiel aus einer Lösung ausfällen, wenn der pH unter den pKa des Produkts fällt, was die Gewinnung recht einfach macht. Das Vermögen eines Mikroorganismus, hohe Temperaturen zu tolerieren, umgeht ferner den Bedarf kühle Temperaturen bei Wachstums- und Herstellungsphasen aufrecht zu erhalten. Das Reduzieren des Bedarfs, die Temperatur in einem großvolumigen Wachstumsmediumstank bei Produktionsvorgängen im großen Maßstab ab zusenken, macht das Gesamtverfahren deutlich effizienter und weniger teuer. Das Vermögen eines Mikroorganismus, sowohl niedrigen pH als auch hohe Temperatur zu tolerieren, ergibt ein bequemes Verfahren zur Vermeidung von Kontamination durch andere weniger tolerante Mikroorganismen bei den Produktionsverfahren im großen Maßstab.
Es ist wichtig, anzumerken, daß ein kritischer Aspekt, der das Vermögen betrifft ein gewünschtes, organisches Produkt für kommerzielle Zwecke zu erzeugen, die spezifische Produktivität sein kann, bei welcher das gewünschte, organische Produkt erzeugt wird. Das Bereitstellen einer hohen spezifischen Produktivität unter Verwendung von Verfahren und Materialien, die hierin beschrieben werden, kann es einem Mikroorganismus beispielsweise erlauben, die Energie zu erzeugen, die zum Zellerhalt benötigt wird, wenn sie Kulturbedingungen wie niedriger pH und hohe Temperatur ausgesetzt ist. Die erforderliche Energie kann erzeugt werden durch einen Fermentationsstoffwechselweg unter im wesentlichen anaeroben Bedingungen eher als Stützung auf die Erzeugung von Energie über den Atmungsstoffwechsel.
Der Erhalt über einen Fermentationsstoffwechselweg ist speziell vorteilhaft beim Erzeugen eines organischen Produkts, das den Atmungsstoffwechsel nicht erfordert, da im wesentlichen die gesamte erforderliche Kohlenstoffquelle verwendet werden kann, um das gewünschte, organische Produkt zu erzeugen.
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß die Verwendung einer Kohlenstoffquelle durch bestimmte genetisch-manipulierte Mikroorganismen kontrolliert und gerichtet werden kann, vorwiegend auf die Produktion von entweder Biomasse oder einem gewünschten organischen Produkt. Im Allgemeinen, involviert die Erfindung zwei Typen von Kultivierungsverfahren. Ein Kultivierungsverfahren involviert die Kultivierung von Mikroorganismen unter spezifischen Kulturbedingungen, abhängig von dem Mikroorganismus und dem gewünschten Ergebnis, daß Biomassenerzeugung fördern kann, während das andere ein unterschiedliches Set von Kulturbedingungen involviert, welches auch vom Mikroorganismus und gewünschten Resultat abhängt, welches die Erzeugung eines gewünschten organisches Produktes fördert. Mit dem Vermögen, die Verwendung einer Kohlenstoffquelle bei Produktionsverfahren in großem Maßstab zu manipulieren, versieht es Hersteller mit deutlich größerer Flexibilität und mehr Kontrolle als andernfalls möglich.
Die Erfindung basiert zusätzlich auf der Entdeckung, daß bestimmte Mikroorganismen genetisch so manipuliert werden können, daß das Meiste, wenn nicht alles von einer Kohlenstoffquelle verwendet wird für Produktion von entweder Biomasse oder einem gewünschten organischen Produkt. Spezifisch ergibt die Erfindung Hefezellen, die modifiziert sind derart, daß Biosynthesestoffwechselwege die Verwendung einer Kohlenstoffquelle weg von der Erzeugung von Biomasse leiten oder daß das gewünschte, organische Produkt inaktiviert wird. Die Inaktivierung solcher Biosynthesestoffwechselwege ergibt Mikroorganismen, die effizient wachsen und das gewünschte Produkt erzeugen können.
Die Erfindung betrifft allgemein eine Hefezelle, die ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthält, wobei das exogene Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid mit einer enzymatischen Aktivität in der Zelle codiert. Die Nukleinsäure kann in das Genom der Zelle einverleibt werden. Die enzymatische Aktivität führt zur Bildung eines organischen Produktes, welches in einigen Ausführungen aus der Zelle sekretiert wird. Die Zelle hat weiterhin einen Crabtree-negativen-Phänotyp und erzeugt das organische Produkt. Die Zelle kann zum Beispiel aus der Art Kluyveromyces, Pichia, Hansennula, Candida, Trichosporon oder Yamadazyma sein. Das organische Produkt kann zum Beispiel ein Fermentationsprodukt, ein pyruvatderivatisiertes Produkt, eine organische Säure oder ein Carboxylat wie Lactat sein. In einer Ausführung kann das Polypetid Lactatdehydrogenaseaktivität haben. Die exogene Nukleinsäure kann eine bakterielle Lactatdehydrogenase codieren oder Pilzlactatdehydrogenase wie eine K. Lactis-Pilzlactatdehydrogenase.
In einer anderen Ausführung enthält die Zelle vier exogene Nukleinsäuremoleküle, von denen jedes der vier Nukleinsäuremoleküle ein unterschiedliches Polypeptid codiert. Zum Beispiel kann das erste von vier exogenen Nukleinsäuremolekülen ein erstes Polypeptid mit Lactatdehydrogenaseaktivität codieren, das zweite kann ein zweites Polypeptid mit CoA-Transferaseaktivität codieren, das dritte kann ein drittes Polypeptid mit Lactyl-CoA-Dehydrataseaktivität codieren, und das vierte kann ein viertes Polypeptid mit Acryl-CoA-Hydrataseaktivität codieren. Solch eine Zelle kann Acrylat als Carboxylatprodukt erzeugen. Alternativ kann das erste von vier exogenen Nukleinsäuremolekülen ein erstes Polypeptid mit 2-Dehydro-3-Deoxy-D-Pentanoataldolaseaktivität codieren, das zweite kann ein zweites Polypeptid mit Xylonatdehydataseaktivität codieren, das dritte kann ein drittes Polypeptid mit Xylonolacataseaktivität und das dritte kann ein viertes Polypeptid mit D-Xylosedehydrogenaseaktivität codieren. Solch eine Zelle ein Kohlenhydrat erzeugen wie D-Xylose als das organische Produkt.
In einer anderen Ausführung enthält die Zellen sechs exogene Nukleinsäuremoleküle, von denen jedes der sechs exogenen Nukleinsäuremoleküle ein unterschiedliches Peptid codiert. Das erste von den sechs exogenen Nukleinsäuremolekülen kann zum Beispiel ein erstes Polypeptid mit 2,5-Dioxovaleratdehydrogenaseaktivität codieren, das zweite kann ein zweites Polypeptid mit 5-Dehydro-4-Deoxy-D-Glucaratdehydrogenaseaktivität codieren, das dritte kann ein drittes Polypeptid mit Glucaratdehydrogenaseaktivität codieren, das vierte kann ein viertes Polypeptid mit Aldehyddehydrogenaseaktivität codieren, das fünfte kann ein fünftes Polypeptid mit Glucuronolactonreduktaseaktivität codieren und das sechste kann ein sechstes Polypeptid mit L-Guconolactonoxidaseaktivität codieren. Solch eine Zelle kann ein Vitamin erzeugen, zum Beispiel L-Ascorbat als organisches Produkt.
Das organische Produkt kann mehr als 3 Kohlenstoffatome enthalten und kann zum Beispiel eine Aminosäure sein.
In einer anderen Ausführung ist die Zelle in der Lage, einen Pentosekohlenwasserstoff zu katabolisieren wie Ribose, Arabinose, Xylose und Lyxose.
In einer anderen Ausführungsform hat die Zelle verminderte Pyruvatdecarboxylaseaktivität oder verminderte Alkoholdehydrogenaseaktivität. Der Zelle kann zum Beispiel sämtliche Pyruvatdecarboxylaseaktivität fehlen. Die verminderte Pyruvatdecarboxylaseaktivität kann aufgrund eines unterbrochenen Genortes sein, wo der Ort normalerweise die Nukleinsäuresequenz hat, die Pyruvatdecarboxylase codiert. Alternativ könnte die Zelle ein Antisense-Molekül enthalten, wie ein Ribozym, das einer endogenen Nukleinsäuresequenz entspricht, wo das Antisense-Molekül die Pyruvatdecarboxylaseaktivität vermindert. Die Zelle kann auch ein zusätzliches exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das als ein Killerplasmid wirkt.
In einer anderen Ausführung führt die enzymatische Aktivität des Polypeptids, das codiert ist durch die exogene Nukleinsäure, zur Bildung des organischen Produkts in einer NADH-verbrauchenden Weise.
In einer anderen Ausführung erzeugt die Zelle wenigstens 60 Gramm des organischen Produkts pro 100 Gramm Glucose, die verbraucht wird, wenn die Zelle unter optimalen Bedingungen für die Erzeugung des organischen Produkts kultiviert wird.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Zelle, zum Beispiel eine Hefezelle, die ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthält, wo das exogene Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid codiert, das Katabolismus eines Pentosekohlenhydrats durch die Zelle fördert. Das Polypeptid kann zum Beispiel Xylosereduktase, Xylitoldehydrogenase oder Xylulokinase sein, und der Pentosekohlenwasserstoff kann zum Beispiel Ribose, Arabinose, Xylose oder Lyxose sein. Die Zelle kann weiterhin einen Hexosekohlenstoff katabolisieren und kann, wenn gewünscht, gleichzeitig den Hexosekohlenstoff und den Pentosekohlenstoff katabolisieren. Der Hexosekohlenwasserstoff kann zum Beispiel Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Iodose, Fructose, Galactose und Talose sein.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Hefezelle, die ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthält, wobei das exogene Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid codiert, das die Ansammlung von Acetyl-CoA in dem Cytoplasma der Zelle fördert. Das Polypeptid kann ein Polypeptid sein, das Citratlyaseaktivität hat, oder kann ein mitochondriales Membranprotein sein, das Acetyl-CoA-Permeabilität über die Mitochondrienmembran fördert. Die Zelle kann verminderte Pyruvatdecarboxylaseaktivität oder verminderte Alkoholdehydrogenaseaktivität haben. Alternativ kann der Zelle Ethanolproduktion fehlen und sie kann eine Wachstumsgeschwindigkeit unter Kulturbedingungen fehlenden Ethanols und Acetats haben, die größer ist als die Wachstumsgeschwindigkeit, die für eine vergleichbare Zelle beobachtet wird, der Ethanolproduktion fehlt.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung wenigstens eine Zelle mit verminderter Aktivität eines mitochondrialen Polypeptids, wo die Zelle einen Crabtree-negativen Phänotyp hat. Solch eine Zelle kann zum Beispiel von der Art Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon oder Yamadazyma sein. Der Zelle kann die Aktivität vollständig fehlen. Die Zelle kann an einem unterbrochenen Ort, wo der Ort normalerweise eine Nukleinsäuresequenz einschließt, die das mitochondriale Polypeptid codiert, enthalten. Das mitochondriale Polypeptid kann ein Citratzyklusenzym sein. Die Zelle kann ein Citratzyklusprodukt ansammeln. Die Zelle kann ein exogenes Nukleinsäuremolekül umfassen, wobei das exogene Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid mit Enzymaktivität in der Zelle codiert, wobei die Enzymaktivität zur Bildung eines organischen Produktes führt, so daß die Zelle das organische Produkt erzeugt. Das organische Produkt kann zum Beispiel Citrat, α-Ketoglutarat, Succinat, Fumarat, Malat und Oxalacetat sein. Das Polypeptid kann ein Polypeptid sein, das beim Katabolismus von Lactat oder Acetat teilnimmt.
Unter einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines organischen Produktes. Das Verfahren umfaßt das Bereitstellen von Hefezellen, wobei die Zellen ein exogenes Nukleinsäuremolekül umfassen, das ein Polypeptid codiert, mit enzymatischer Aktivität in den Zellen, wobei die enzymatische Aktivität zur Bildung des organischen Produktes führt und wobei die Zellen eine Crabtree-negativen Phänotyp haben und Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium, so daß das organische Produkt erzeugt wird. Die Hefezellen können gewählt sein aus der Art Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon oder Yamadazyma sein. Das organische Produkt kann ein Fermentationsprodukt, ein pyruvatderivatisiertes Produkt, ein organisches Produkt, das mehr als drei Kohlenstoffatome enthält, ein Carboxylat, ein Kohlehydrat, eine Aminosäure, Vitamin oder ein Lipidprodukt sein. Das organische Produkt kann ferner Lactat, Glyzerin, Acrylat, Xylose, Ascorbat, Citrat, Isocitrat, α-Ketoglutarat, Succinyl-CoA, Succinat, Fumarat, Malat oder Oxalacetat sein. In einigen Ausführungen wird das organische Produkt sekretiert durch die Zellen. Das Verfahren kann resultieren in Zellen mit verminderter Pyruvatdecarboxylaseaktivität oder verminderter Alkoholdehydrogenaseaktivität. Die enzymatische Aktivität kann zur Bildung des organischen Produktes in NADH-verbrauchender Weise führen.
Zellen, die durch diese Verfahren hergestellt sind, können wenigstens 60 Gramm des organischen Produkts pro 100 Gramm Glucose erzeugen, die konsumiert wird, wenn der Kultivierungsschritt optimal zur Erzeugung des organischen Produkts ist. Das Kulturmedium, welches flüssig sein kann, umfaßt einen Inhibitor der Zellatmung, wie Antimycin A, Cyanid oder Azid. Der Kultivierungsschritt kann das Wachsen der Zellen unter aeroben Wachstumsbedingungen, gefolgt vom Kontaktieren der Zellen mit einem Inhibitor der Zellatmung umfassen.
In einer alternativen Ausführung umfaßt der Kultivierungsschritt das Inkubieren der Zellen unter anaeroben Kulturbedingungen. In einer weiteren alternativen Ausführung umfaßt der Kultivierungsschritt das Wachsen der Zellen unter aeroben Wachstumsbedingungen, gefolgt vom Inkubieren der Zellen unter anaeroben Wachstumsbedingungen. Der Kultivierungsschritt kann auch das Kultivieren der Zellen bei einer Temperatur größer als etwa 35°C umfassen.
In einer Ausführung hat das Kulturmedium einen organischen pH-Wert kleiner als 3,0 und/oder einen anorganischen pH-Wert kleiner als 3,0. In einer anderen Ausführung enthält das Medium einen Pentosekohlenwasserstoff wie Ribose, Arabinose, Xylose oder Lyxose. Das Medium kann ein Maisstärkefaserhydrolysat mit zum Beispiel einem pH-Wert zwischen etwa 2,0 und etwa 6,5 umfassen.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines organischen Produktes, wobei das Verfahren umfaßt, a) Bereitstellen von Hefezellen, die ein exogenes Nukleinsäuremolekül haben, das ein Polypeptid codiert, das den Katabolismus eines Pentosekohlenstoffs durch die Zelle fördert, wobei die Zelle eine enzymatische Aktivität enthält, die zur Bildung des organischen Produktes führt und b) Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium, sodaß das organische Produkt erzeugt wird.
Unter einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines organischen Produktes, wobei das Verfahren umfaßt a) Bereitstellen von Hefezellen, wobei die Zellen ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid codiert, welches die Ansammlung von Acetyl-CoA im Cytoplasma der Zelle fördert und wobei die Zelle eine enzymatische Aktivität enthält, die zur Bildung des organischen Produktes führt und b) Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium, sodaß das organische Produkt erzeugt wird.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines organischen Produktes, wobei das Verfahren umfaßt a) Bereitstellen von Hefezellen mit verminderter Aktivität eines mitochondrialen Enzyms, wobei die Verminderung der Aktivität zur Ansammlung des organischen Produktes führt, und b) Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium, sodaß das organische Produkt erzeugt wird.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren von Hefezellen mit einem Crabtree-negativen Phänotyp, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium umfaßt, wobei das Kulturmedium einen organischen pH-Wert kleiner als etwa 3,0 und/oder einen anorganischen pH-Wert kleiner als etwa 3,0 hat. Der Kultivierungsschritt kann das Kultivieren der Zellen bei einer Temperatur größer als 35°C umfassen. Das Kulturmedium kann einen Inhibitor der Zellatmung umfassen. Das Kulturmedium kann einen Pentosekohlenwasserstoff umfassen. In einer anderen Ausführung kann das Kulturmedium ein Maisstärkefaserhydrolysat umfassen.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Kultivierung von Hefezellen mit einem Crabtree-negativen Phänotyp, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium umfaßt, wobei das Kulturmedium ein Maisstärkefaserhydrolysat umfaßt.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Kultivierung von Hefezellen mit einem Crabtree-negativen Phänotyp, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium bei einer Temperatur größer als 35°C umfaßt, wobei das Kulturmedium einen anorganischen pH-Wert kleiner als etwa 3,0 hat.
Unter einem anderen Aspekt zeigt die Erfindung das Kultivieren von Hefezellen mit einem Crabtree-negativen Phänotyp, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium bei einer Temperatur größer als 35°C umfaßt, wobei das Kulturmedium einen Pentosekohlenwasserstoff umfaßt.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren von Hefezellen mit einem Crabtree-negativen Phänotyp, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zellen mit Kulturmedium bei einer Temperatur größer als etwa 35°C umfaßt, wobei das Kulturmedium ein Maisstärkefaserhydrolysat umfaßt.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine Rekombinationssequenz umfaßt und eine ausgewählte Sequenz, wobei die Rekombinationssequenz einer genomischen Sequenz einer Zelle entspricht, die einen Crabtree-negativen Phänotyp hat, wobei die genomische Sequenz ein Enzym codiert, das exprimiert wird durch die Zelle und wobei die ausgewählte Sequenz ein Enzym codiert, das zur Bildung eines organischen Produkts in der Zelle führt. Die ausgewählte Sequenz kann in der Rekombinationssequenz derart sein, daß die ausgewählte Sequenz flankiert ist an jedem Ende durch die Rekombinationssequenz.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung einer rekombinanten Hefezelle, umfassend die Bereitstellung einer Hefezelle mit einem Crabtree-negativen Phänotyp, Auswählen eines Endproduktes, Identifizieren, welches exogene Enzym oder welche exogenen Enzyme zugegeben werden müssen zu der Zelle, um das Endprodukt zu erzeugen, zu identifizieren, welches endogene Enzym oder endogene Enzyme, deren Aktivität zu vermindern ist, in der Zelle die Erzeugung des Endprodukts erlaubt, Zugeben des identifizierten exogenen Enzyms oder von Enzymen zu der bereitgestellten Hefezelle und Vermindern der Aktivität des identifizierten endogenen Enzyms oder der endogenen Enzyme in der bereitgestellten Hefezelle, sodaß die Zelle das Endprodukt unter Kulturbedingungen erzeugt.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Maisstärkefaserhydrolysat, wobei das Hydrolysat einen pH-Wert zwischen etwa 2,0 und etwa 6,5 hat. Das Hydrolysat kann Glucose, Xylose und Arabinose umfassen. Das Hydrolysat kann etwa 40 Gramm pro Liter Glucose, etwa 40 Gramm/Liter Xylose, etwa 20 Gramm/Liter Arabinose umfassen. Alternativ kann das Hydrolysat etwa 38,7 Gramm/Liter Glucose, etwa 39,1 Gramm/Liter Xylose, etwa 20,7 Gramm/Liter Arabinose und etwa 1,6 Gramm/Liter Furfural umfassen.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines organischen Produkts umfassend a) Kultivieren eines Mikroorganismus unter Kulturbedingungen, wobei der Mikroorganismus verminderte Enzymaktivität hat. Die Enzymaktivität kann Pyruvatdecarboxylase, Alkoholdehyrogenase, Aldehyddehydrogenase oder Acetyl-CoA-Synthaseaktivität sein; Der Mikroorganismus zeigt eine Wachstumsgeschwindigkeit in Abwesenheit von Ethanol und Acetat, die wenigstens 30% von jener ist, die für einen entsprechenden Mikroorganismus ohne die genannte verminderte Enzymaktivität beobachtet wird, und b) Wechseln der Kulturbedingungen, um die Erzeugung des organischen Produkts zu fördern.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines organischen Produkts umfassend a) Kultivieren eines Mikroorganismus unter Kulturbedingungen, die Zellatmung fördern, wobei der Mikroorganismus verminderte Enzymaktivität hat. Die Enzymaktivität kann Pyruvatdecarboxylase, Alkoholdehydrogenase, Aldehyddehydrogenase oder Acetyl-CoA-Synthaseaktivität sein, wobei der Mikroorganismus eine Wachstumsgeschwindigkeit in Abwesenheit von Ethanol und Acetat zeigt, die wenigstens 30% von jener ist, die für einen entsprechenden Mikroorganismus ohne solche reduzierte Enzymaktivität beobachtet wird, und b) Wechseln der Kulturbedingungen, um Zellatmung zu vermindern und dadurch die Erzeugung des organischen Produktes zu fördern.
Wenn nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie gewöhnlich von Fachleuten verstanden werden auf dem Gebiet, zu welchem die Erfindung gehört. Obwohl Verfahren und Materialien ähnlich oder gleichwertig zu jeden hierin beschriebenen in der Praxis oder zum Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien hierunter beschrieben. Alle Publikationen, Patentanmeldungen, Patente und andere hier erwähnten Referenzen werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingefügt. Im Falle eines Konfliktes wird die vorliegende Beschreibung einschließlich Definitionen entscheiden. Die Materialien, Methoden und Beispiele sind nur veranschaulichend und nicht als begrenzend zusätzlich vorgesehen.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden offensichtlich aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen.
Beschreibung von Zeichnungen
1 ist ein Schema, das das pHES-Plasmid abbildet.
2 ist ein Schema, das das pSEH-Plasmid abbildet.
3 ist ein Schema, das die Erzeugung von pCRII-Plasmiden abbildet, die entweder Lh-ldh oder Pa-ldh enthalten.
4 ist ein Schema, das die ldh/pCRII-Plasmide abbildet.
5 ist ein Schema, das die Erzeugung von pHES-Plasmiden abbildet, die entweder Lh-ldh oder Pa-ldh enthalten.
6a ist ein Schema, das die Erzeugung von Pyruvatdecarboxylase-Knockoutfragment (PDC) abbildet.
6b ist ein Schema, das das 5,5 kbp-Fragment abbildet, das K. marxianus 1,7 kbp PDC1 umgibt.
6c ist ein Schema, das die Deletion von 400 Basenpaaren der 5,5 kbp homologen PDC-Region und die Insertion eines Gens für Kanamycinresistenz abbildet.
6d ist ein Schema, das die 4 kb-Region abbildet, die das Kanamycinresistenzgen enthält und die umgebenden 2,3 kbp des PDC1.
6e ist ein Schema, das die 7,5 kbp K. thermotolerans PDC1 und umgebende Region abbildet.
6f ist ein Schema, das die Deletion von 750 bp von dem 1,7 kbp PDC1-Gen und die Insertion des Kanamycinresistenzgens abbildet.
7 ist ein Graph, der das Wachstum (optische Dichte; OD) gegen die Zeit (Stunden) für Kluyveromyces marxianus aufträgt, welches kultiviert ist unter niedrigem pH (pH 2,5) und bei hohen Temperaturbedingungen (40°C).
8 ist ein Graph, der das Wachstum (OD) gegenüber der Zeit (Stunden) für K. marxianus aufträgt, kultiviert mit Glucose, Xylose oder Arabinose bei 30°C.
9 ist ein Graph, der das Wachstum (OD) gegenüber der Zeit (Stunden) für K. marxianus aufträgt, kultiviert mit Maisstärkefaserhydrolysat bei 30°C.
10 ist ein Graph, der das Wachstum (OD) gegenüber der Zeit (Stunden) für K. marxianus aufträgt, kultiviert bei 30°C und dem angezeigten pH.
11 ist ein Graph, der das Wachstum (OD) gegenüber der Zeit (Stunden) für K. marxianus aufträgt, kultiviert bei 30°C und dem angegebenen pH in Gegenwart von 40 Gramm Milchsäure.
12 zeigt drei Graphen, die (A) Biomasseerzeugung; (B) Glucoseverbrauch und (C) Ethanolerzeugung von S. uvarum und K. marxianus aufträgt, wenn sie kultiviert werden auf mineralischem Medium mit 2% Glucose unter aeroben Bedingungen.
13 zeigt drei Graphen, die (A) Biomasseproduktion, (B) Glucoseverbrauch und (C) Ethanolerzeugung von S. uvarum und K. marxianus auftragen, wenn sie kultiviert werden auf mineralischem Medium mit 2% Glucose unter aeroben Bedingungen.
14 ist eine Plasmidkarte des PDC1-Promotorvektors.
Detaillierte Beschreibung
Die Erfindung ergibt Verfahren und Materialien, die die Erzeugung von organischen Produkten betreffen. Die Erfindung ergibt spezifisch Hefezellen, Verfahren zum Kultivieren von Hefezellen, Verfahren zum Herstellen von Hefezellen, Nukleinsäurekonstrukten und Verfahren und Materialien zum Herstellen von verschiedenen organischen Produkten.
Die Hefezellen, die hier bereitgestellt werden, können verwendet werden um organische Produkte zu erzeugen. Solche organische Produkte können verwendet werden in einem weiten Bereich von Anwendungen. Zum Beispiel können organische Produkte, die durch die hier beschriebenen Hefezellen hergestellt werden, verwendet werden als Konservierungsstoffe oder Zusätze bei Nahrungsmitteln, pharmazeutischen oder kosmetischen Produkten und können verwendet werden, um Plastik und andere Produkte herzustellen.
Zum Zwecke dieser Erfindung ist ein organisches Produkt, jede Verbindung, die ein Kohlenstoffatom enthält. Carboxylate (z.B. Lactat, Acrylat, Citrat, Isocitrat, α-Ketoglutamat, Succinat, Fumarat, Malat, Oxalacetat), Kohlenhydrate (z.B. D-Xylose), Alditols (z.B., Xylitol, Arabitol, Ribitol), Aminosäuren (z.B. Glycin, Tryptophan, Glutamat), Lipide, Ester, Vitamine (z.B. L-Ascorbat), Polyole (z.B., Glycerin, 1,3-Propandiol, Erythritol), Aldehyde, Alkene, Alkyne und Ketone sind z.B. organische Produkte. Ein organisches Produkt kann daher ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehr Kohlenstoffatome enthalten. Zusätzlich können organische Produkte ein Molekulargewicht haben, das kleiner als etwa 1000 ist (z.B. kleiner als etwa 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 oder 100). Zum Beispiel ist D-Xylose (C₅H₁₀O₅) ein organisches Produkt, das ein Molekulargewicht von 150 hat. Organische Produkte können weiter Fermentationsprodukte sein. Der Ausdruck „Fermentationsprodukt", wie hier verwendet, betrifft jede organische Verbindung, die erzeugt wird durch ein Fermentationsverfahren. Allgemein ausgedrückt, involviert ein Fermentationsverfahren die anaerobe Enzymumwandlung von organischen Verbindungen wie Kohlenwasserstoffen in Verbindungen wie Ethylalkohol, was Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) ergibt. Die Fermentation unterscheidet sich daher von zellulärer Atmung darin, daß organische Produkte eher als molekularer Sauerstoff als Elektronenakzeptoren verwendet werden. Beispiele von Fermentationsprodukten umfassen ohne Begrenzung Acetat, Ethanol, Butyrat und Lactat.
Organische Produkte können auch pyruvat-derivatisierte Produkte sein. Der Ausdruck „puravat-derivatisiertes Produkt" wie hier verwendet, betrifft jede Verbindung, die synthetisiert wird aus Pyruvat in nicht mehr als 15 enzymatischen Schritten. Ein enzymatischer Schritt ist jede Reaktion oder Reihe von Reaktionen, die katalysiert wird (werden) durch ein Polypeptid mit Enzymaktivität. Der Ausdruck „Polypeptid mit Enzymaktivität" wie hier verwendet, betrifft jedes Polypeptid, das eine chemische Reaktion von anderen Substanzen katalysiert ohne selbst bei der Vervollständigung der Reaktion oder Reaktionen zerstört oder verändert zu werden. Typischerweise katalysiert ein enzymatisches Polypeptid die Bildung von einem oder mehreren Produkten aus einem oder mehreren Substraten. Solche Polypetide haben jeden Enzymaktivitätstyp, ohne Begrenzung, umfassend die enzymatische Aktivität, die mit einem Enzym verbunden ist wie Aconitase, Isocitratdehydrogenase, Ketoglutaratdehydrogenase, Succinatthiokinase, Succinatdehydrogenase, Fumarase, Malatdehydrogenase, Citratsynthase, 2,5-Dioxovaleratdehydrogenase, 5-Dehydro-4-Deoxy-D-Glucaratdehydrogenase, Glucaratdehydratase, Aldehyddehydrogenase, Glucuronolactonreduktase, L-Gulonolactonoxidase, 2-Dehydro-3-Deoxy-D-Pentanoataldolase, Xylonatdehydratase, Xylonolactonase, D-Xylosedehydrogenase, Lactatdehydrogenase, CoA-Transferase, Lactyl-CoA-Dehydratase oder Acrylyl-CoA-Hydratase.
Es ist wichtig, zu bemerken, daß ein Polypeptid mit einer speziellen Enzymaktivität ein Polypeptid sein kann, das entweder natürlich vorkommend oder nicht natürlich vorkommend ist. Ein natürlich vorkommendes Polypeptid ist jedes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz wie in der Natur gefunden, einschließlich Wildtyp-Polypeptide und polymorphe Polypeptide. Solche natürlich auftretenden Polypeptide können erhalten werden von jeder Spezies ohne Begrenzung einschließend Säugetier-, Pilz-, und Bakterienspezies. Ein nicht natürlich auftretendes Polypeptid ist jedes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht gefunden wird. Ein nicht natürlich auftretendes Polypeptid kann daher eine mutierte Version eines natürlich auftretenden Polypeptids oder ein konstruiertes Polypeptid sein. Ein nicht natürlich auftretendes Polypeptid mit Citratsynthaseaktivität kann zum Beispiel eine mutierte Version eines natürlich auftretenden Peptids mit Citratsynthaseaktivität sein, das wenigstens etwas Citratsynthaseaktivität beibehält. Ein Polypeptid kann zum Beispiel mutiert werden durch Sequenzadditionen, -deletionen und/oder -substitutionen.
Ein organisches Produkt ist nicht ein pyruvat-derivatisiertes Produkt, wenn das Produkt aus Pyruvat unter Erfordern von mehr als 15 enzymatischen Schritten synthetisiert ist. Beispiel von pyruvatderivatisierten Produkten umfassen ohne Begrenzung Citrat, α-Ketoglutarat, Succinat, Fumarat, Malat, Oxalacetat, 2-Dehydro-3-Deoxy-D-Xylonat, D-Xylonat, D-Xylonolacton, D-Xylose, Acrylat, Acetat, Ethanol, Butyrat und Lactat.
Für Zwecke dieser Erfindung werden Carboxylatprodukte, welche in einer "freien Säure"- oder "Salz"-Form sein können, unter Verwendung der Salzformnomenklatur bezeichnet. Zum Beispiel wird Milchsäure als Lactat bezeichnet. In diesem Fall wird es bemerkt werden, daß der Ausdruck "Lactat" Milchsäure als auch Lactat daher umfaßt.
Der Ausdruck "Nukleinsäure", wie hierin verwendet, umfaßt sowohl RNA als auch DNA, einschließlich cDNA, genomischer DNA und synthetischer (zum Beispiel chemisch synthetisierter) DNA. Die Nukleinsäure kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Wo sie einzelsträngig ist, kann die Nukleinsäure der Sense-Strang oder der Antisense-Strang sein. Die Nukleinsäure kann ringförmig oder linear sein.
Der Ausdruck "exogen" wie hierin verwendet mit Bezug auf ein Nukleinsäuremolekül und eine spezielle Zelle betrifft jedes Nukleinsäuremolekül, das nicht aus einer bestimmten Zelle stammt, die in der Natur gefunden wird. Alle nicht natürlich auftretenden Nukleinsäuremoleküle werden daher als exogen zu einer Zelle betrachtet, wenn sie einmal in die Zelle eingeführt sind. Es ist wichtig, anzumerken, daß nicht natürlich auftretende Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente von Nukleinsäurensequenzen enthalten können, die in der Natur gefunden werden, vorausgesetzt, daß das Nukleinsäuremolekül als Ganzes nicht in der Natur vorliegt. Ein Nukleinsäuremolekül, das eine genomische DNA-Sequenz in einem Expressionsvektor beispielsweise enthält, wird betrachtet als nicht natürlich auftretendes Nukleinsäuremolekül und wird daher als exogen zu einer Zelle betrachtet, wenn es einmal in die Zelle eingeführt ist, da das Nukleinsäuremolekül als Ganzes (genomische DNA plus Vektor-DNA) nicht in der Natur vorliegt. Jeder Vektor, autonom replizierendes Plasmid oder Virus (zum Beispiel Retrovirus, Adenovirus, oder Herpesvirus), der als Ganzes nicht in der Natur vorliegt, wird daher als nicht natürlich auftretendes Nukleinsäuremolekül betrachtet. Daraus folgt, daß genomische DNA-Fragmente, die erzeugt werden durch PCR oder Restriktionsendonukleasebehandlung wie cDNAs als nicht natürlich auftretende Nukleinsäuremoleküle betrachtet werden, da sie als getrennte Moleküle vorliegen, die nicht in der Natur gefunden werden. Es folgt daraus auch, daß jedes Nukleinsäuremolekül, das eine Promotorsequenz enthält und eine Polypeptid codierende Sequenz (zum Beispiel cDNA oder genomische DNA) in einer Anordnung, die nicht in der Natur gefunden wird, als nicht natürlich auftretendes Nukleinsäuremolekül betrachtet wird.
Der Ausdruck "endogen" bezeichnet genomisches Material, das nicht exogen ist. Allgemein entwickelt sich endogenes genomisches Material in einem Organismus, Gewebe oder Zelle und wird nicht durch rekombinante Technologie eingeführt oder modifiziert. Endogenes genomisches Material umfaßt in seiner Reichweite natürlich auftretende Variationen.
Es ist auch wichtig, anzumerken, daß ein Nukleinsäuremolekül, das natürlich auftritt, exogen zu einer speziellen Zelle sein kann. Zum Beispiel würde ein gesamtes Chromosom, das isoliert ist aus einer Zelle von Person X als exogenes Nukleinsäuremolekül mit Bezug auf eine Zelle von Person Y betrachtet, wenn das Chromosom einmal in die Zelle von Y eingefügt ist.
Wie hierin verwendet betrifft der Ausdruck "genetisch modifiziert" einen Organismus, dessen Genom modifiziert worden ist, zum Beispiel durch Zufügen, Ersetzung oder Deletion von genetischem Material. Verfahren zum Zufügen oder Deletieren von genetischem Material sind bekannt und umfassen aber sind nicht begrenzt auf Zufallsmutagenese, Punktmutationen, einschließlich Insertionen, Deletionen und Substitutionen, Knock-out-Technologie und Transformation eines Organismus mit einer Nukleinsäuresequenz, die rekombinante Technologie verwendet, umfassend sowohl stabile als auch transiente Transformanten. Die Hefezellen können Stärke entweder natürlich katabolisieren oder aufgrund einer genetischen Modifikation und können selbst genetisch modifiziert sein, um Zellulose durch Zugabe von zum Beispiel pilzbasierten Zellulasen zu katabolisieren.
1. Hefezellen, die einen Crabtree-negativen Phänotyp haben
Die Erfindung ergibt eine Vielzahl von genetisch manipulierten Hefezellen, die einen Crabtree-negativen Phänotyp haben. Solche rekombinanten Hefezellen können verwendet werden, um organische Produkte zu erzeugen. Die Erfindung ergibt zum Beispiel eine Hefezelle, die einen Crabtree-negativen Phänotyp hat und ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthält, das ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität codiert, die zur Bildung eines organischen Produktes führt. Solche Hefezellen sind im Rahmen der Erfindung, vorausgesetzt, daß sie das organische Produkt erzeugen. Es wird angemerkt, daß das erzeugte organische Produkt sekretiert werden kann aus der Hefezelle unter Erübrigen des Bedarfs, die Zellmembran aufzubrechen, um das organische Produkt zu gewinnen. Die Hefezellen der Erfindung erzeugen typischerweise das organische Produkt, wobei die Ausbeute wenigstens etwa 40 Gramm (zum Beispiel wenigstens etwa 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90 oder 95 Gramm) organisches Produkt pro 100 Gramm Glucose ist, die verbraucht wird, wenn unter optimalen Bedingungen zur Produkterzeugung kultiviert wird. Wenn die Ausbeute der organischen Produktherstellung für eine spezielle Hefezelle bestimmt wird, kann jedes Verfahren verwendet werden. Siehe zum Beispiel Kiers et al. Yeast, 14 (5): 459–469 (1998). Es wird auch angemerkt, daß die enzymatische Aktivität des codierten Polypeptids zur Bildung des organischen Produkts in einer NADH-verbrauchenden Weise führen kann. Anders ausgedrückt kann die Produktion der organischen Verbindung NADH als Energiequelle erfordern. Der Ausdruck "NAD" betrifft die Co-Faktoren, die als Elektronen- und Wasserstoffträger in speziellen Redoxreaktionen agieren, während der Ausdruck "NADH" die reduzierte Form von NAD bezeichnet. Beispiele von organischen Produkten, deren Synthese NADH erfordert, umfassen ohne Begrenzung Lactat, Ethanol, Acetat und Acrylat. Typischerweise katabolisieren die Hefezellen im Rahmen der Erfindung einen Hexosekohlenwasserstoff wie Glucose. Hingegen können solche Hefezellen auch einen Pentosekohlenstoff katabolisieren, zum Beispiel Ribose, Arabinose, Xylose und Lyxose). Anders ausgedrückt kann eine Hefezelle im Rahmen der Erfindung entweder natürlich einen Pentosekohlenstoff verwenden oder kann konstruiert werden, um einen Pentosekohlenstoff zu verwenden. Einer Hefezelle kann zum Beispiel in ein exogenes Nukleinsäuremolekül gegeben werden, das Xylosereduktase, Xylitoldehydrogenase und/oder Xylulokinase so codiert, daß Xylose katabolisiert werden kann. Die Hefezellen können auch Stärke katabolisieren, entweder natürlich oder aufgrund einer Genmodifikation und können genetisch modifiziert sein, um Zellulosen durch Addition von zum Beispiel pilzbasierten Zellulasen zu katabolisieren.
Eine Hefezelle mit einem Crabtree-negativen Phänotyp ist jede Hefezelle, die keinen Crabtree-Effekt zeigt. Der Ausdruck "Crabtree-negativ" betrifft sowohl natürlich auftretende als auch genetisch modifizierte Organismen. Kurz gesagt wird der Crabtree-Effekt definiert als die Inhibition von Sauerstoffverbrauch durch einen Mikroorganismus, wenn er unter aeroben Bedingungen kultiviert wird aufgrund einer hohen Glucosekonzentration (zum Beispiel 50 Gramm Glucose pro Liter). Anders ausgedrückt fährt eine Hefezelle mit einem Crabtree-positiven Phänotyp fort, zu fermentieren, unabhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit aufgrund der Anwesenheit von Glucose, während eine Hefezelle mit Crabtree-negativem Phänotyp keine Glucose vermittelte Inhibition des Sauerstoffverbrauchs zeigt. Beispiele von Hefezellen, die typischerweise einen Crabtree-negativen Phänotyp haben, umfassen ohne Begrenzung Hefezellen der folgenden Arten: Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon und Yamadazyma.
Wie hierin beschrieben, ergibt die Erfindung viele unterschiedliche Typen von rekombinanten Hefezellen, die in der Lage sind, eine große Vielzahl verschiedener organischer Produkte herzustellen. Eine Hefezelle kann zum Beispiel ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid codiert mit Lactatdehydrogenaseaktivität, so daß Lactat erzeugt wird. Beispiele eines solchen Polypeptids umfassen ohne Begrenzung Rinderlactatdehydrogenase, Bakterienlactatdehydrogenase und Pilzlactatdehydrogenase (zum Beispiel K. lactis- oder K. thermotolerans-Pilzlactatdehydrogenase). Auch Polypeptide mit Enzymaktivität wie eine Lactatdehydrogenaseaktivität können natürlich auftretend oder nicht natürlich auftretend sein.
Es ist wichtig anzumerken, daß die hierin beschriebenen Hefezellen eine einzige Kopie oder mehrere Kopien (zum Beispiel etwa 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 oder 150 Kopien) eines speziellen exogenen Nukleinsäuremoleküls enthalten. Eine Hefezelle kann zum Beispiel etwa 50 Kopien eines exogenen Nukleinsäuremoleküls X enthalten. Es ist auch wichtig anzumerken, daß die hierin beschriebenen Hefezellen mehr als ein spezielles exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten. Zum Beispiel kann eine Hefezelle etwa 50 Kopien eines exogenen Nukleinsäuremoleküls X sowie etwa 75 Kopien eines exogenen Nukleinsäuremoleküls Y enthalten. In diesen Fällen kann jedes unterschiedliche Nukleinsäuremolekül ein unterschiedliches Polypeptid mit seiner eigenen einzigartigen Enzymaktivität codieren. Eine Hefezelle kann zum Beispiel 4 unterschiedliche exogene Nukleinsäuremoleküle so enthalten, daß Acrylat erzeugt wird. In diesem Beispiel kann eine solche Hefezelle ein erstes exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid mit Lactatdehydrogenaseaktivität codiert, ein zweites, das ein Polypeptid mit CoA-Transferaseaktivität codiert, ein drittes, das ein Polypeptid mit Lactyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität, und ein viertes, das ein Polypeptid mit Acrylyl-CoA-Hydrataseaktivität codiert. In einem anderen Beispiel kann eine Hefezelle vier unterschiedliche exogene Nukleinsäuremoleküle so enthalten, daß D-Xylose produziert wird. Spezifisch kann eine solche Hefezelle ein erstes exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid mit 2-Dehydro-3-Deoxy- D-Pentanoataldolaseaktivität codiert, ein zweites, das ein Polypeptid mit Xylonatdehydrataseaktivität codiert, ein drittes, das ein Polypeptid mit Xylonolactonaseaktivität codiert, und ein viertes, das ein Polypeptid mit D-Xylosedehydrogenaseaktivität codiert. In einem weiteren Beispiel kann eine Hefezelle sechs unterschiedliche exogene Nukleotidsäuremoleküle enthalten, so, daß das Vitamin L-Ascorbat erzeugt wird. Spezifisch kann eine solche Hefezelle ein erstes exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid mit 2,5-Dioxovaleratdehydrogenaseaktivität codiert, ein zweites, das ein Polypeptid mit 5-dehydro-4-Deoxy-D-Glucaratdehydrogenaseaktivität codiert, ein drittes, das ein Polypeptid mit Glucaratdehydrataseaktivität codiert, ein viertes, das ein Polypeptid mit Aldehyddehydrogenaseaktivität codiert, ein fünftes, das ein Polypeptid mit Glucuronolactonreduktaseaktivität codiert, und ein sechstes, das ein Polypeptid mit L-Gulonolactonoxidaseaktivität codiert.
Es ist wichtig anzumerken, daß enzymatische Polypeptide so verwendet werden können, daß das organische Produkt optisch rein ist (zum Beispiel etwa 90, 95, 99% Reinheit). Ein Polypeptid mit einer (L)-Lactatdehydrogenaseaktivität kann verwendet werden zum Beispiel, um (L)-Lactat zu erzeugen.
Hefezellen im Rahmen der Erfindung können verminderte Enzymaktivität wie verminderte Pyruvatdecarboxylase- und/oder Alkoholdehydrogenaseaktivität haben. Der Ausdruck "vermindert", wie hierin verwendet in Bezug auf eine Zelle und eine spezielle Enzymaktivität, betrifft einen niedrigeren Gehalt an Enzymaktivität als jener, der in einer vergleichbaren Hefezelle derselben Spezies gemessen wird. Eine Hefezelle, der Pyruvatdecarboxylaseaktivität fehlt, wird daher betrachtet als verminderte Pyruvatdecarboxylaseaktivität habend, da die meisten, wenn nicht alle vergleichbaren Hefezellen, wenigstens etwas Pyruvatdecarboxylaseaktivität haben. Solche verminderten Enzymaktivitäten können das Ergebnis von niedrigerer Enzymkonzentration, niedrigerer spezifischer Aktivität eines Enzyms oder Kombinationen davon sein. Viele unterschiedliche Verfahren können verwendet werden, um eine Hefezelle mit verminderter Enzymaktivität herzustellen. Zum Beispiel kann eine Hefezelle konstruiert werden, um einen unterbrochenen enzymcodierenden Ort zu haben, unter Verwendung von gewöhnlicher Mutagenese oder Knockout-Technologie. Siehe zum Beispiel Methods in Yeast Genetics (1997 Edition), Adams, Gottschling, Kaiser, und Sterns, Cold Spring Harbor Press (1998). Alternativ kann Antisense-Technologie verwendet werden, um die Enzymaktivität zu vermindern. Eine Hefezelle kann zum Beispiel konstruiert werden, um eine cDNA zu enthalten, die ein Antisense-Molekül codiert, das ein Enzym daran hindert, hergestellt zu werden. Der Ausdruck "Antisense-Molekül" wie hierin verwendet umfaßt jedes Nukleinsäuremolekül, das Sequenzen enthält, die dem Codierungsstrang eines endogenen Polypeptids entsprechen. Ein Antisense-Molekül kann auch flankierende Sequenzen (zum Beispiel regulatorische Sequenzen) haben. Anti-Sense-Moleküle können Ribozyme oder Antisense-Oligonukleotide daher sein. Ein Ribozym kann jede allgemeine Struktur haben, ohne Begrenzung umfassend Haarnadelschleife, Hammerkopf- oder Axtkopfstrukturen, vorausgesetzt, daß das Molekül RNA spaltet.
Hefezellen mit einer verminderten Enzymaktivität können identifiziert werden unter Verwendung von jeglichem Verfahren. Zum Beispiel kann eine Hefezelle mit verminderter Pyruvatdecarboxylaseaktivität leicht unter Verwendung von gewöhnlichen Verfahren identifiziert werden. Siehe zum Beispiel Ulbrich, Methods in Enzymology 18: 109–115 (1970).
2. Hefezellen mit Crabtree-positivem oder Crabtree-negativem Phänotyp
Die Erfindung ergibt auch eine Vielzahl von genetisch manipulierten Hefezellen, die keinen Crabtree-negativen Phänotyp haben müssen, das heißt, solche Zellen können entweder Crabtree-positiv oder Crabtree-negativ sein. Solche rekombinanten Hefezellen können verwendet werden, um organische Produkte zu erzeugen. Die Erfindung ergibt zum Beispiel eine Hefezelle, die ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthält, das ein Polypeptid codiert, das den Katabolismus eines Pentosekohlenstoffkörpers (zum Beispiel Ribose, Arabinose, Xylose und Lyxose) durch die Zelle fördert. Spezifisch kann eine Hefezelle ein exogenes Nukleinsäuremolekül haben, das Xylosereduktase, Xylitoldehydrogenase und/oder Xylulokinase so erzeugt, daß Xylose in effizienter Weise katabolisiert werden kann. Zusätzlich können Hefezellen, die zum Katabolisieren eines Pentosekohlenstoffkörpers in der Lage sind, auch zum Kataboliseren eines Hexosekohlenstoffkörpers (zum Beispiel Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Iodose, Galactose und Talose) entweder sequentiell oder gleichzeitig in der Lage sein. Eine Hefezelle kann zum Beispiel so konstruiert werden, daß Xylose und Glucose gleichzeitig katabolisiert werden. Es wird angemerkt, daß Hefezellen mit einem verstärkten Vermögen, einen Pentosekohlenstoffkörper zu katabolisieren, verwendet werden können, um Hefezellen zu konstruieren, die organische Produkte aus Pentosekohlenstoffquellen erzeugen. Dieses Merkmal ist speziell vorteilhaft, da Pentosekohlenstoffquellen wie Xylose allgemein weniger kostspielig sind als Hexosekohlenstoffquellen wie Glucose. Andere Kohlenstoffkörperquellen, die katabolisiert werden, umfassen ohne Begrenzung Melibiose, Sucrose, Fructose, Raffinose, Stachyose, Stärke (zum Beispiel Maisstärke und Weizenstärke) und Hydrolysat (zum Beispiel Maisstärkefaserhydrolysat und andere Zellulosehydrolysate).
Die Erfindung ergibt zusätzlich eine Hefezelle, die ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthält, das ein Polypeptid codiert, das die Ansammlung von Acetyl-CoA im Cytoplasma der Zelle fördert. Zum Beispiel kann eine Hefezelle ein exogenes Nukleinsäuremolekül haben, das ein Polypeptid mit Citratlyaseaktivität codiert. Eine Hefezelle kann alternativ ein exogenes Nukleinsäuremolekül haben, das ein mitochondriales Membranprotein codiert, das Acetyl-CoA-Permeabilität über die Mitochondrienmembran fördert. Es wird angemerkt, daß viele Hefezellen, denen das Vermögen, Alkohol herzustellen, fehlt, in Abwesenheit von Ethanol und Acetat wachsen können. Typischerweise wird einer Hefezelle das Vermögen fehlen, Ethanol zu erzeugen, wenn entweder Pyruvatdecarboxylase- oder Alkoholdehydrogenaseaktivität in gewisser Weise fehlt. Crabtree-positive Hefe (zum Beispiel Saccharomyces), der Pyruvatdecarboxylaseaktivität fehlt, wächst beispielsweise schwach in Gegenwart von Ethanol und Acetat. Die Manipulation von solcher Crabtree-positver Hefe in einer Weise, so, daß die Ethanolproduktion vermindert wird, um die Verwendung von Pyruvat zu anderen organischen Produkten umzuleiten (zum Beispiel Lactat und Acrylat) führt daher zu schlechten Wachstumsmerkmalen, wenn Ethanol und Acetat abwesend sind, insbesondere weil Crabtree-positive Hefe die Zellatmung in Gegenwart von Glucose begrenzt. Wie hier beschrieben, können Hefezellen, die die Ansammlung von cytoplasmatischem Acetyl-CoA in gewisser Weise fördern, anders als jene, welche auf cytoplasmatischer Acetatkonzentration und Acetyl-CoA-Aktivität beruhen, in Abwesenheit von Ethanol und Acetat wachsen, selbst wenn sie unfähig sind, Ethanol zu erzeugen. Es wird angemerkt, daß in Hefezellen mit dem Vermögen, in Abwesenheit von Ethanol und Acetat zu wachsen, während das Vermögen fehlt, Ethanol herzustellen, die Verwendung von Pyruvat umleiten können, um andere organische Produkte als Ethanol zu erzeugen.
Jeder Hefetyp kann ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid codiert, das die Ansammlung von Acetyl-CoA im Cytoplasma der Zelle fördert. Eine Hefezelle mit einem Crabtree-negativen oder Crabtree-positiven Phänotyp kann zum Beispiel ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid codiert, das die Ansammlung von Acetyl-CoA im Cytoplasma der Zelle fördert. Solche Hefezellen können typischerweise identifiziert werden durch (1) Manipulieren der Zelle, die das exogene Nukleinsäuremolekül enthält, so daß ihr Pyruvatdecarboxylase- oder Alkoholdehydrogenaseaktivität fehlt, (2) Bestimmen der Wachstumscharakteristiken der Zelle beim Kultivieren der Zelle in Gegenwart von Titriermengen eines Atmungsinhibitors (zum Beispiel Antimycin A, Cyanid oder Azid), und (3) Vergleichen dieser Wachstumsmerkmale mit jenen, die für eine vergleichbare Hefezelle beobachtet werden, die nicht das exogene Nukleinsäuremolekül enthält, und die auch noch manipuliert wurde, damit ihr Pyruvatdecarboxylase- oder Alkoholdehydrogenaseaktivität fehlt. Hefezellen, die als günstigere Wachstumsmerkmale habend bestimmt wurden, aufgrund der Anwesenheit des exogenen Nukleinsäuremoleküls durch solch einen Vergleich, werden betrachtet als ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthaltend, das ein Peptid codiert, welches die Ansammlung von Acetyl-CoA im Cytoplasma der Zelle fördert.
Hefezellen, die ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid codiert, das die Ansammlung von Acetyl-CoA im Cytoplasma der Zelle fördert, kann verminderte Enzymaktivität wie verminderte Pyruvatdecarboxylase- und/oder Alkoholdehydrogenaseaktivität haben. Zum Beispiel kann einer Hefezelle das Vermögen fehlen, Ethanol zu erzeugen. Typischerweise haben solche Hefezellen eine Wachstumsgeschwindigkeit unter Kulturbedingungen, denen Ethanol und Acetat fehlt, welche größer ist (zum Beispiel etwa 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100, 150, 200 Prozent, oder höher) als die Wachstumsgeschwindigkeit, die beobachtet wird für vergleichbare Hefezellen (d.h. Hefezellen, denen das Vermögen fehlt, Ethanol zu erzeugen), welche die exogene Nukleinsäure nicht enthalten und unter ähnlichen Bedingungen kultiviert wurden (d.h. Kulturbedingungen, frei von Ethanol und Acetat).
Die Erfindung ergibt auch eine Hefezelle mit verminderter Aktivität von einem Polypeptid. Solche Hefezellen können einen Crabtree-positiven oder einen Crabtree-negativen Phänotyp haben. Eine Hefezelle im Rahmen der Erfindung kann verminderte Aktivität eines Plasmamembranpolypeptids haben (zum Beispiel eines Plasmamembrantransporters), eines cytoplasmatischen Polypeptids (zum Beispiel Pyruvatdecarboxylase), und/oder eines mitochondrialen Polypeptids (zum Beispiel Pyruvatdehydrogenase). Der Ausdruck "Plasmamembrantransporter" betrifft Polypeptide, die die Bewegung von organischen Produkten über die Plasmamembran erleichtern. Beispiele eines solchen Polypeptids umfassen ohne Begrenzung Carboxylsäuretransporter wie JEN1 in S. cerevisiae (Genbank-Zugangsnummer U24155). Der Ausdruck "mitochondriales Polypeptid" betrifft jedes Polypeptid, das in den Mitochondrien funktioniert, einschließlich, ohne Begrenzung, Pyruvatdehydrogenase, Polypeptide, die beim Katabolismus von Lactat oder Acetyl-CoA teilnehmen (zum Beispiel Cytochrom-b2-Polypeptide), und Citratzyklusenzyme. Citratzyklusenzyme umfassen Aconitase, Isocitratdehydrogenase, Ketoglutaratdehydrogenase, Succinatthiokinase, Succinatdehydrogenase, Fumarase, Malatdehydrogenase und Citratsynthase. Wie hierin beschrieben, umfaßt eine Hefezelle mit verminderter Enzymaktivität eine Hefezelle, der vollständig eine spezielle Enzymaktivität fehlt. Es ist wichtig anzumerken, daß der Ausdruck "vermindert", wie hierin verwendet in Bezug auf eine Hefezelle und Polypeptid, ein geringeres Aktivitätsniveau betrifft als jenes, das in einer vergleichbaren Hefezelle aus derselben Spezies unter ähnlichen Bedingungen gemessen wird. Eine Hefezelle, der eine spezielle Transportaktivität fehlt, wird daher betrachtet als verminderte Transportaktivität habend, wenn eine vergleichbare Zelle wenigstens etwas Transportaktivität hat. Solche verminderten Polypeptidaktivitäten können das Ergebnis von niedrigerer Polypeptidkonzentration, niedrigerer spezifischer Aktivität des Polypeptids oder Kombinationen davon sein. Alle Variationen von Verfahren können verwendet werden, um Hefezellen mit verminderter Polypeptidaktivität zu erzeugen. Der Ort mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein mitochondriales Polypeptid codiert, kann zum Beispiel inaktiviert werden, zum Beispiel durch gewöhnliche Mutagenese- oder Knockout-Technologie.
Es wird angemerkt, daß Hefezellen mit verminderter Aktivität eines Mitochondrienenzyms Citratzyklusprodukte ansammeln können (zum Beispiel Citrat, Isocitrat, α-Ketoglutarat, Succinyl-CoA, Succinat, Fumarat, Malat und Oxalacetat). Hefezellen mit verminderter Fumaraseaktivität können Fumarat ansammeln. Zusätzlich kann die Hefezelle ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid codiert mit Enzymaktivität, die zur Bildung eines organischen Produktes so führt, daß die Zelle das organische Produkt erzeugt.
Es ist wichtig anzumerken, daß einige Citratzyklusprodukte nicht die Mitochondrienmembran durchdringen können (zum Beispiel α-Ketoglutarat und Succinyl-CoA). Die Verminderung der Aktivität eines speziellen Citratzyklusenzyms wird zur Ansammlung von bestimmten Cirtratzyklusprodukten im Lumen der Mitochondrien führen. In diesen Fällen können Hefezellen mit einer verminderten Aktivität eines Citratzyklusenzyms konstruiert werden, um eines oder mehrere exogene Nukleinsäuremoleküle zu enthalten, von denen jedes ein Polypeptid mit einer unterschiedlichen Enzymaktivität so codiert, daß sich das gewünschte Citratzyklusprodukt im Cytoplasma ansammelt. Die Verminderung der Aktivität von Ketoglutaratdehydrogenase wird zur Ansammlung von α-Ketoglutarat führen, was im Gegenzug zur Ansammlung von Isocitrat führen wird. α-Ketoglutarat kann die Mitochondrienmembran nicht durchdringen, während Citrat die Mitochondrienmembran durchdringen kann. Isocitrat kann sich daher im Cytoplasma der Zelle ansammeln. Hefezellen, die ein exogenes Nukleinsäuremolekül haben, das ein Polypeptid mit Isocitratdehydrogenaseaktivität codiert und dieses funktionelle Polypeptid im Cytoplasma exprimieren, können cytoplasmatisches α-Ketoglutarat erzeugen. Die Verminderung der Aktivität von speziellen Citratzyklusenzymen unter Bereitstellung von exogenen Nukleinsäuremolekülen, die dieselben (oder verschiedene) Citratzyklusenzyme so codieren, daß sie im Cytoplasma funktionell sind, können daher zur Erzeugung verschiedener Citratzyklusprodukte (oder Produkte, die aus den Citratzyklusprodukten abgeleitet sind) im Cytoplasma führen.
Die Erfindung ergibt weiterhin eine Hefezelle mit verminderter Aktivität von einem Enzym, das die Verwertung einer Kohlenstoffquelle wegleitet von der Produktion von entweder Biomasse oder dem gewünschten Produkt. Enzyme in den Glycerin- oder Acetoinstoffwechselwegen können zum Beispiel unterbrochen werden, sodaß die Kohlenstoffquelle im Kulturmedium vorwiegend zur Produktion von Biomasse oder des gewünschten organischen Produkts verwendet wird. Beispiele von Glycerinstoffwechselwegen umfassen ohne Begrenzung Dihydroxyacetonphosphatreductase. Beispiele von Acetoinstoffwechselenzymen umfassen ohne Begrenzung α-Acetolactatsynthase und α-Acetolactatdecarboxylase. Jedes Verfahren kann wieder verwendet werden, um die Aktivität eines Enzyms zu vermindern.
Darüber hinaus kann jede der Hefezellen, die hier bereitgestellt werden, ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das als ein Killerplasmid agiert. Wie hierin verwendet bezeichnet „Killerplasmid" ein Nukleinsäuremolekül, das eine Hefespezies mit dem Vermögen bereitstellt, eine andere Hefespezies zu töten. Hefezellen der Art Kluyveromyces, die ein Killerplasmid enthalten, können zum Beispiel das Wachstum von Hefe aus der Art Saccharomyces verhindern. Hefezellen mit einem Killerplasmid können verwendet werden, um Kontaminierungsprobleme der Art zu verhindern, die bei Herstellungsverfahren im großen Maßstab auftreten. Zusätzlich kann jeder Typ eines Killerplasmides einer Hefezelle zugegeben werden. Zum Beispiel kann ein Killerplasmid, das aus K. lactis isoliert wird, zu K. marxianus Hefezelle zugegeben werden. Hefezellen, die ein Killerplasmid enthalten, können leicht identifiziert werden unter Verwendung von gewöhnlichen Verfahren. Siehe z.B. Gunge et al., J. Bacteriol. 145 (1): 382–390 (1981); Gunge und Kitada, Eur. J. Epidemiol., 4: 409–414 (1988); und Wesolowski-Louvel et al., Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, Herausgeber Klaus Wolf, Springer Verlag, Berlin, S. 138–201 (1996).
Jede der Hefezellen, die hier bereit gestellt werden, kann gleichfalls ein endogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid codiert mit einer ATPase-Aktivität, die so modifiziert ist, daß die Hefezelle toleranter gegenüber Umgebungen mit niedrigem pH wird. Einer Hefezelle kann zum Beispiel eine ATPase-Aktivität verliehen werden, die effizient eine niedrige zytoplasmatische Protonenkonzentration aufrecht erhält, wenn die extrazelluläre Protonenkonzentration hoch ist. Solche Polypeptide können konstruiert werden wie beschrieben von Morsomme et al. (EMBO J. 15: 5513–5526 (1996)).
Es ist wichtig anzumerken, daß jede der rekombinanten Hefezellen, die hier beschrieben werden, jede Kombination von beschriebenen genetischen Manipulationen enthalten kann. Eine Hefezelle mit einem Crabtree-positiven Phänotyp kann beispielsweise ein exogenes Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Polypeptid mit Citratlyaseaktivität, codiert als auch ein exogenes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit Enzymaktivität codiert, die zur Bildung eines organischen Produktes führt.
3. Geeignete Organismen
Eine Vielzahl von Organismen ist geeignet zur Verwendung gemäß der Erfindung. Zusätzlich zu Crabtree-negativen und Crabtree-positiven Mikroorganismen wie: Saccharomyces sp., einschließlich S. cerevisiae und S. uvarum, Kluyveromyces, einschließlich K. thermotolerans, K. lactis, und K. marxianus, Pichia, Hansebula, einschließlich H. polymorpha, Candidia, Trichosporon, Yamadazyma, einschließlich Y. stipitis, oder Torulaspora pretoriensis, könnten Organismen aus einem weitem Bereich mikrobieller Spezies auch als Wirte für Milchsäureproduktion dienen. Ein Organismus wie Rhizopus oryzae, ein natürlicher Milchsäureproduzent könnte genetisch modifiziert werden für eine Säuretoleranz, Ausbeuteverbesserung und optisch-reine Milchsäure. Aspergillus spp. sind auch dafür bekannt, eine Vielzahl von organischen Säuren zu erzeugen wie Zitronensäure und niedrige pH zu tolerieren. Verfahren zum genetischen Modifizieren von Aspergillus spp., um Milchsäure zu erzeugen, sind verfügbar. Darüber hinaus erzeugen Pilze wie Rhizopus und Aspergillus spp. Enzyme, welche es ihnen ermöglichen, Stärke oder andere Kohlenhydratpolymere zu monomeren Kohlenhydraten zur Verwendung als Kohlenstoff abzubauen.
Prokaryoten wie Escherichia coli, Zymomonas mobilis, und Bacillus spp. sind genetisch modifiziert worden oder können genetisch modifiziert werden zur Milchsäureproduktion. Mikroorganismen, die identifiziert worden sind wie Bacillus coagulans sind natürliche Erzeuger von Milchsäure, die weiter genetisch modifiziert werden können, um Milchsäureproduktion mit niedrigem pH zu verbessern.
Zusätzlich können extremeophile Organismen aus der Familie Archea extrem niedrigen pH und hohe Temperaturen tolerieren. Genetische Modifikationen von ausgewählten Spezies aus dieser Familie könnten einen milchsäureproduzierenden Stamm ergeben.
4. Genetische Aspekte
Ein Nukleinsäuremolekül, das ein Peptid mit Enzymaktivität codiert, kann identifiziert und erhalten werden unter Verwendung von jeglichem Verfahren. Standardnukleinsäuresequenziertechniken und Softwareprogramme, die Nukleinsäuresequenzen in Aminosäuresequenzen übersetzen, basierend auf dem zu verwendenden genetischen Code, können zum Beispiel verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine spezielle Nukleinsäure Sequenzhomologie mit bekannten enzymatischen Polypetiden hat oder nicht. Sequenzausrichtsoftware (Alignment Software) wie MEGALIGN^® (DNASTAR, Madison, W1, 1997) können verwendet werden, um verschiedene Sequenzen zu vergleichen. Zusätzlich können Nukleinsäuremoleküle, die bekannte enzymatische Polypeptide codieren, mutiert werden unter Verwendung von gewöhnlichen molekularen Klonierungstechniken, (z.B. ortspezifischen Mutagenesen bzw. site-directed Mutagenesis). Mögliche Mutationen umfassen ohne Begrenzung Deletionen, Insertionen und Basensubstitutionen sowie Kombinationen von Deletionen, Insertionen und Basensubstitution. Nukleinsäure- und Aminosäurendatenbanken (z.B. GenBank^®) können weiterhin verwendet werden, um eine Nukleinsäuresequenz zu identifizieren, die ein Polypeptid mit Enzymaktivität codiert. Jede Aminosäuresequenz mit etwas Homologie zu einem Polypeptid mit Enzymaktivität oder jede Aminosäuresequenz mit etwas Homologie zu einer Sequenz, die ein Polypeptid mit Enzymaktivität codiert, kann kurz gesagt, verwendet werden als Abfrage, um die GenBank^® abzufragen. Die identifizierten Polypeptide können dann analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie Enzymaktivität zeigen.
Nukleinsäuremoleküle, die ein Polypeptid mit Enzymaktivität codieren, können identifiziert und erhalten werden unter Verwendung von gewöhnlichen molekularen Klonierungstechniken oder chemischen Nukleinsäuresyntheseverfahren und -techniken, einschließlich PCR. PCR betrifft ein Verfahren oder eine Technik, in welcher Zielnukleinsäure in einer Weise amplifiziert wird, die zu jener im U.S. Patentnummer 4,683,195 beschriebenen ähnlich ist, und spätere Modifikationen des dort beschriebenen Verfahrens. Allgemein wird Sequenzinformation von Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus verwendet, um Oligonucleotidprimer zu konstruieren, die identisch oder ähnlich in der Sequenz zu Gegensträngen eines potentiellen Templats sind, das zu vervielfältigen ist. Eine Nukleinsäuresequenz kann aus RNA oder DNA amplifiziert werden unter Verwendung PCR. Eine Nukleinsäuresequenz kann isoliert werden durch PCR-Amplifizierung aus Gemsamtzell-RNA, gesamter genomischer DNA und cDNA zum Beispiel aus Bakteriophagensequenzen, Plasmidsequenzen, Virensequenzen und dergleichen. Wenn RNA als Templatquelle verwendet wird, kann Reverse Transkriptase verwendet werden, um komplementäre DNA-Stränge zu synthetisieren.
Nukleinsäurehybridisierungsstechniken können weiter verwendet werden, um ein Nukleinsäuremolekül zu identifizieren und zu erhalten, das ein Polypeptid mit Enzymaktivität codiert. Jedes Nukleinsäuremolekül, das ein bekanntes Polypeptid codiert, oder ein Fragment davon kann kurz gesagt verwendet werden als Probe, um ein ähnliches Nukleinsäuremolekül durch Hybridisierung unter Bedingungen von moderater bis hoher Stringenz zu identifizieren. Solche ähnlichen Nukleinsäuremoleküle können isoliert, sequenziert und analysiert werden, um zu bestimmen, ob das codierte Polypeptid Enzymaktivität hat.
Hybridisierung kann gemacht werden durch Southern- oder Northern Analyse, um eine DNA- oder RNA-Sequenz jeweils zu identifizieren, die an einer Probe hybridisiert. Die Probe kann markiert werden mit einem Radioisotop wie ³²P, einem Enzym, wie Dioxygenin oder durch Biotinylierung. Die DNA oder RNA, die zu analysieren ist, kann elektrophoretisch getrennt werden auf einem Agarose- oder Polyacrlyamidgel, auf Nitrozellulose, Nylon oder eine andere geeignete Membran überführt werden und hybridisiert werden mit der Probe unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind wie jene, die beschrieben sind in den Abschnitten 7.39–7.52 von Sambrook at al., (1989) Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Lobaratory, Plainview, NY. Typischerweise ist eine Probe wenigstens etwa 20 Nukleotide lang. Eine Probe, die einer 20 Nukleotidsequenz entspricht, welche eine Säugetiercitratlyase codiert, kann zum Beispiel verwendet werden, um ein Nukleinsäuremolekül zu identifizieren, das ein Pilzpolypeptid mit Citratlyaseaktivität codiert. Zusätzlich können Proben, die länger oder kürzer als 20 Nukleotide sind, verwendet werden.
Jedes Verfahren kann verwendet werden, um ein exogenes Nukleinsäuremolekül in eine Zelle einzuführen. Viele Verfahren zum Einschießen von Nukleinsäure in Hefezellen sind tatsächlich Fachleuten bekannt. Zum Beispiel sind Transformation, Elektroporation, Konjugation und Fusion von Protoplasten gewöhnliche Verfahren zum Einführen von Nukleinsäuren in Hefezellen. Siehe Ito et al., Bacterol. 153: 163–168 (1983); Durrens et al., Curr. Genet. 18: 7–12 (1990); und Becker und Guarente, Methods in Enzyology 194: 182–187 (1991).
Es ist wichtig zu bemerken, daß das exogene Nukleinsäuremolekül, das in einer Hefezelle der Erfindung enthalten ist, in der Zelle in jeglicher Form beibehalten werden kann. Exogene Nukleinsäuremoleküle können zum Beispiel integriert werden in das Genom der Zellen oder beibehalten werden in einem episomalen Stadium. Anders ausgedrückt, kann eine Zelle der Erfindung eine stabile oder transiente Transformante sein. Zusätzlich können die hierin beschriebenen Hefezellen eine einzelne Kopie oder mehrere Kopien (z.B. etwa 5, 10. 20, 35, 50, 75, 100 oder 150 Kopien) von einem bestimmten exogenen Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben enthalten.
Verfahren zum Expremieren einer Aminosäuresequenz aus einem exogenen Nukleinsäuremolekül sind Fachleuten wohlbekannt. Solche Verfahren umfassen ohne Begrenzung das Konstruieren eine Nukleinsäure wie einem regulatorischen Element, das die Expression einer Nukleinsäuresequenz fördert, die ein Polypeptid codiert. Typischerweise sind regulatorische Elemente DNA-Sequenzen, die die Expression anderer DNA-Sequenzen auf Transkriptionsebene regulieren. Regulatorische Elemente umfassen daher ohne Begrenzung Promotoren, Verstärker und dergleichen. Verfahren zum Expremieren eines Polypeptids aus einem exogenen Nukleinsäuremolekül in Hefe sind darüber hinaus Fachleuten wohlbekannt. Nukleinsäurekonstrukte, die in der Lage sind zum Expremieren von exogenen Polypeptiden in Kluyveromyces sind wohlbekannt. Siehe z.B. U.S: Patentnummer 4,859,596 und 4,943,529.
Wie hier beschrieben, enthalten Hefezellen im Rahmen der Erfindung ein exogenes Nukleinsäuremolekül, das zum Beispiel ein Polypeptid mit Enzymaktivität codiert, welche zur Bildung eines organischen Produktes führt. Verfahren zum Identifizieren von Zellen, die exogene Nukleinsäure enthalten, sind Fachleuten wohlbekannt. Solche Verfahren umfassen ohne Begrenzung PCR und Nukleinsäurehybridisierungstechniken wie Northern- und Southern Analyse. In einigen Fällen können Immunohistochemie und biochemische Techniken verwendet werden, um zu bestimmten, ob eine Zelle eine bestimmte Nukleinsäure enthält, durch Detektieren der Expression des codierten enzymatischen Polypeptids, das durch das bestimmte Nukleinsäuremolekül codiert wird. Ein Antikörper mit Spezifität für ein codiertes Enzym kann zum Beispiel verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Hefezelle das codierte Enzym enthält oder nicht. Biochemische Techniken können weiterhin verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Zelle ein spezielles Nukleinsäuremolekül enthält, das ein enzymatisches Polypeptid enthält, durch Detektieren eines organischen Produkts, das als Ergebnis der Expression des enzymatischen Polypeptids erzeugt wird. Die Detektion von Lactat nach Einführung eines exogenen Nukleinsäuremoleküls, das ein Polypeptid mit Lactatdehydogenaseaktivität enthält, in eine Hefezelle, die normalerweise solch ein Polypeptid exprimiert, kann zum Beispiel anzeigen, daß diese Hefezelle nicht nur das eingeführte Nukleinsäuremolekül enthält, sondern auch das codierte enzymatische Polypeptid aus jenem eingeführten exogenen Nukleinsäuremolekül exprimiert. Verfahren zum Detektieren spezifischer Enzymaktivitäten oder der Gegenwart von speziellen Produkten sind Fachleuten wohlbekannt. Die Gegenwart von Lactat kann beispielsweise, wie anderswo beschrieben, bestimmt werden. Siehe Witte et al., J. Basics Microbiol. 29: 707–716 (1989).
Die Erfindung ergibt auch ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine Rekombinationssequenz und eine selektierte Sequenz enthält. Der Ausdruck „Rekombinationssequenz", wie hierin verwendet, betrifft jede Nukleinssäuresequenz, die einer genomischen Sequenz entspricht, die in einer Zelle gefunden wird. Die Kombinationssequenzen, die hier beschrieben sind, können verwendet werden, um Rekombinationsereignisse bei der Erzeugung von Knock-out Organismen zu steuern. Anders ausgedrückt, kann eine Rekombinationssequenz verwendet werden, um spezifisch einen Ort zu unterbrechen, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein spezielles Enzym codiert. Der Ausdruck „ausgewählte Sequenz" wie hierin verwendet, umfaßt jede Nukleinsäuresequenz. Typischerweise codiert eine ausgewählte Sequenz ein Polypeptid mit Enzymaktivität, die zur Bildung eines organischen Produkts in der Zelle führt. Die Nukleinsäurekonstrukte der Erfindung können daher verwendet werden, um eine endogene Enzymaktivität auszuknocken und eine exogene Enzymaktivität in einem einzigen Schritt hinzuzufügen. In den meisten Fällen ist die ausgewählte Sequenz in der Rekombination derart, daß die ausgewählte Sequenz flankiert ist an jedem Ende der Rekombinationssequenz.
5. Herstellung des organisches Produkts und Kultivierungsverfahren
Die Erfindung ergibt Verfahren zur Herstellung organsicher Produkte unter Verwendung von irgendeiner der Hefezellen oder mikrobiellen Zellen, die hier bereitgestellt werden. Solche Verfahren involvieren das Bereitstellen von Hefezellen und Kultivieren der bereitgestellten Zellen mit Kulturmedium, so daß ein organische Produkt (z.B. Glycerin, Acrylat, Xylose, Ascorbat, Lactat, Citrat, Isocitrat, α-Ketoglutarat, Succinyl-CoA, Succinat, Fumarat, Malat und Oxalacetat) erzeugt wird. Anders ausgedrückt, kann das Kulturmedium und/oder Kulturbedingungen klassifiziert werden in eine von zwei Kategorien: jene, die Zellatmung und/oder die Produktion von Biomasse fördern und jene, die Zellatmung vermindern. Typische Kulturmedien und/oder Kulturbedingungen, die Zellatmung fördern, werden in Situationen verwendet, wo schnelles Wachstum gebraucht wird, oder wo das zu erzeugende organische Produkt nicht ohne Zellatmung erzeugt werden kann. Solche organischen Produkte können ohne Begrenzung Citratzyklusprodukte umfassen. Andererseits werden Kulturmedium- und/oder Kulturbedingungen, die Zellatmung vermindern, verwendet in Situationen, wo schnelles Wachstum nicht gebraucht wird oder unerwünscht ist, oder wo das organische Produkt, das zu erzeugen ist, ohne Zellatmung erzeugt werden kann. Solche organischen Produkte umfassen ohne Begrenzung Lactat, Acrylat und Xylose. Wie hier verwendet bedeutet der Ausdruck „die Zellatmung fördern" oder „die Biomasseproduktion fördern" wenn bezogen auf Kulturbedingungen, daß die Zellkulturbedingungen aufrecht erhalten werden derart, daß die Kohlenstoffquelle im Kulturmedium vorwiegend durch oxidative Atmung metabolisiert wird oder um Biomasse zu erzeugen. Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck „Biomasse" das Trockengewicht des Organismus. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „vorwiegend metabolisiert, um Biomasse zu erzeugen", daß wenigstens 0,3 g Biomasse pro Gramm Kohlenstoffquelle (in Form von Kohlehydrat), die verbraucht wird, erzeugt wird (wenigstens etwa 0.4, 0.45, 0.5 oder 0.6 g Biomasse). Allgemein wird zwischen etwa 0.3 und etwa 0.6 Gramm Biomasse pro Gramm Kohlenstoffquelle erzeugt. Verfahren zum Bestimmen der Menge an Biomasse (Zelltrockengewicht) in einer Kultur sind bekannt und umfassen zum Beispiel die Verfahren, die beschrieben sind durch Postma et al., „Enzymic amalysis of the Crabtree effect in glucose-limited Saccharomyces cerevisiae, "Appl. Environ. Mocorbiol., 53, 468–477 (1989); und Kiers et al.; „Regulations of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures of Kluyveromyces lactis CBS 2359," Yeast, 14, 459–469 (1998). Verfahren zum Bestimmen der Menge einer verbrauchten Kohlenstoffquelle sind bekannt und umfassen, zum Beispiel, HPLC-Verfahren.
Es sollte angemerkt werden, daß die Effizienz einer Kohlenstoffquellenverwertung von der Kohlenstoffquelle und dem Organismus abhängen kann. Während ein komplexes Wachstumsmedium, welches andere Kohlenstoffquellen als Kohlenhydrat umfaßt, daher verwendet werden kann, bezeichnet die Menge pro Gramm Kohlenstoffquelle erzeugter Biomasse nur die Menge an Biomasse, die pro Gramm Kohlenhydratkohlenstoffquelle, die verbraucht wird, erzeugt wird.
Kulturmedium, das einen Inhibitor der Zellatmung enthält (z.B. Antimycin A, Cyanid und Azid) kann allgemein Zellatmung vermindern, während die Abwesenheit solcher Inhibtoren die Zellatmung fördern kann. Anaerobe Kulturbedingungen können die Zellatmung vermindern, während aerobe Kulturbedingungen die Zellatmung fördern können. Eine aerobe Kulturbedingung ist jede Bedingung, wo Sauerstoff eingeführt wird oder natürlich auftritt und als Substrat für den Atmungsstoffwechsel dient. Allgemein bezeichnet der Ausdruck „aerob" eine Kulturbedingung, bei welcher das Medium unter einem Luftstrom für wenigstens 0,1 VVM (Luftvolumen/Flüssigvolumen/Minute) gehalten wird (z.B. größer als 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 1.5, oder 2.0 VVM). Wenn ein anderes Gas als Luft verwendet wird, wird das nominale VVM eingestellt auf ein Luftäquivalent, basierend auf den Sauerstoffgehalt des Gases. Alternativ kann aerob definiert werden als ein Kulturmedium, welches einen gelösten Sauerstoffgehalt von wenigstens 2% (z.B. wenigstens 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75 oder 80 Prozent) bezüglich der Menge hat, die bei gesättigten Bedingungen mit Luft bei Atmosphärendruck vorliegt.
Eine anaerobe Bedingung ist jeder Zustand, wo Sauerstoff absichtlich oder natürlich im wesentlichen unverfügbar für den Atmungsstoffwechsel ist, was zum Beispiel zur Erzeugung eines reduzierten Produkts wie Ethanol führt. Ein Zustand, wo Kulturmedium einen gelösten Sauerstoffgehalt (DO) kleiner als etwa 2.0% hat (z.B. weniger als etwa 1.5, 1.0, oder 0.5 oder gleich etwa 0%), wird als ein anaerober Zustand betrachtet. Entsprechend wird ein Zustand mit einem VVM (Luftvolumen/Flüssigvolumen/Minute) kleiner als etwa 0.1 (z.B. kleiner als etwa 0.05, oder gleich 0) als anaerober Zustand betrachtet. Typischerweise betrifft der Ausdruck „Luft", wie hierin verwendet, bezüglich dem VVM, Luft wie sie in der Atmosphäre vorliegt. Andere Kulturbedingungen, die die Zellatmung beeinflussen können, umfassen ohne Begrenzung pH, Temperatur und die Gegenwart von bestimmten Kohlenstoffquellen (z.B. Glucose). Es ist wichtig anzumerken, daß einige Kulturmedien und/oder Kulturbedingungen die Zellatmung in einer Hefespezies fördern, Zellatmung in anderen Spezies reduzieren können. Zum Beispiel reduziert die Gegenwart von Glucose im Kulturmedium Zellatmung in Hefezellen mit einem Crabtree-positiven Phänotyp, während sie wenig oder keine Wirkung auf Zellatmung in Hefezellen mit einem Crabtree-negativen Phänotyp hat.
Die gezielte Manipulation von Kulturbedingungen bei einer kommerziellen Herstellung kann ein wichtiger Schritt beim Erzielen von optimalen Gehalten eines gewünschten organischen Produkts, wie hier beschrieben, sein. Eine Hefezelle im Rahmen der Erfindung wird typischerweise angezogen unter Kulturbedingungen, die Zellatmung fördern, um eine signifikante Zelldichte zu erzeugen. Hefezellen können beispielsweise in einem Kulturgefäß plaziert werden und mit einem Überfluß an Glucose und Sauerstoff versorgt werden. Unter Bedingungen, die Zellatmung fördern, ist die Verdopplungszeit für die hier bereitgestellten Mikroorganismen typischerweise kleiner als 10 Tage (z.B. weniger als 8.5 oder 3 Stunden). Wenn die Zellen einmal eine signifikante Dichte erreichen, können die Kulturbedingungen auf Bedingungen umgeschaltet werden, die Zellatmung reduzieren, derart, daß ein organisches Produkt, das keine Zellatmung erfordert, erzeugt wird. Die Hefezellen können beispielsweise überführt werden in ein Kulturgefäß und versehen werden mit einem Überfluß an Glucose aber nicht Sauerstoff. Das direkte Manipulieren der Kulturbedingungen, so daß sie von aerob nach anaerob umgeschaltet werden, kann in diesem Fall optimale Gehalte eines gewünschten organischen Produkts erzeugen. In einigen Fällen können die Zellen alternativ allein unter Bedingungen kultiviert werden, die Zellatmung so fördern, so daß ein organisches Produkt, das Zellatmung erfordert, erzeugt wird. Es wird angemerkt, daß die Zellmasse in dem Herstellungsgefäß typischerweise größer als 2 g/L ist (z.B.: größer als 4, 6 oder 8 g/L).
Beim Kultivieren kann die Temperatur größer als etwa 35°C sein (z.B. größer als etwa 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, oder 45°C). Das Kulturmedium kann zusätzlich flüssig sein. Das Kulturmedium enthält typischer weise eine Kohlenstoffquelle. Die Kohlenstoffquelle umfaßt allgemein ein Kohlenhydrat, das an Rohmaterialen enthält. Typischerweise enthält das Nährstoffmedium einer Stickstoffquelle. Bevorzugt umfaßt die Stickstoffquelle eine Kombination von organischen und anorganischen Stickstoffverbindungen.
In einer Ausführung kann es gewünscht werden, ein großes Fermentationsgefäß mit einem Kulturmedium zu füllen, das alle Nährstoffe umfaßt, die erforderlich sind, und sämtliches Kohlenhydrat, das sowohl ausreichend zur Biomasseerzeugung als auch zur Erzeugung des gewünschten Produkts ist. Das Gefäß kann unter Bedingungen derart gehandhabt werden, daß Biomasseproduktion anfangs gefördert wird, zum Beispiel durch Bereitstellen von aeroben Bedingungen und dann umgeschaltet werden auf anaerobe Bedingungen zur Produktion des gewünschten Produkts.
In einer anderen Ausführung wird ein kleineres Gefäß zur Biomasseproduktion verwendet mit einem hohen Gehalt an Nährstoffen und ausreichend Kohlenhydrat um zum Beispiel etwa 100 g/l Biomasse zu erzeugen. Die Gehalte dieses Gefäßes können dann auf ein größeres Gefäß überführt werden, das ein zweites Kulturmedium enthält, welches weniger Nährstoffe enthält, zum Beispiel nur Glucose als Kohlenstoffquelle oder eine andere Kohlenhydratkohlenstoffquelle in Wasser. Dieses Gefäß kann unter anaeroben Bedingungen für die Erzeugung des gewünschten organischen Produktes betrieben werden. Biomassenwachstum wird vermindert aufgrund des verminderten Gehaltes von Nährstoffen und der anaeroben Bedingungen.
In einer bevorzugten Ausführung wird das Nährstoffmedium nur auf die erforderlichen Materialen gehalten, um die Gewinnung des gewünschten Produkts zu vereinfachen. Die Verwendung von aerobem Wachstum kann es zulassen, ein vereinfachtes Medium zu verwenden, im Vergleich zu jenem, das benötigt wird, wenn Wachstum unter anaeroben Bedingungen gebraucht wird. Viele der hier beschriebenen Hefen können unter aeroben Bedingungen angezogen werden, auf einem Medium, das nur aus Zucker, einer organischen Stickstoffquelle, Spurenmineralien und einigen Vitaminen besteht.
Vor Zugabe von organischem Produkt zu dem Kulturmedium als Ergebnis einer Fermentation oder eines anderen Vorganges hat das Kulturmedium allgemein einen pH von 5.0 und 7.0. Wenn organische Produkte wie organische Säuren in das Kulturmedium durch den Mikroorganismus hingegen sekretiert werden, neigt der pH des Kulturmediums dazu abzusinken. Der Ausdruck „organischer pH", wie hierin verwendet, bezeichnet den pH des Kulturmediums, der organischen Verbindungen zuzuschreiben ist, die im Medium vorliegen, wie Carboxylate, wie zum Beispiel, Milchsäure. Der Ausdruck „anorganischer pH" wie hierin verwendet, bezeichnet den pH, der anorganischen Verbindungen wie HCl und H₂SO₄ zuzuschreiben ist. Das Kulturmedium kann einen organischen pH-Wert kleiner als etwa 3.0 haben (z.B. kleiner als etwa 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6 oder 1.5) oder einen anorganischen pH-Wert kleiner als etwa 3.0 (z.B. kleiner als etwa 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6 oder 1.5). Jede Kohlenstoffquelle kann verwendet werden bei dem Kultivierungsverfahren. Medium, das einen Pentosekohlenstoff beispielsweise enthält (z.B. Ribose, Arabinose, Xylose und Lyxose) kann verwendet werden. Zusätzlich kann ein Medium verwendet werden, das Maisstärkefaserhydrolysat enthält. Ein Maisstärkefaserhydrolysat kann einen pH-Wert zwischen 2.0 und 6.5 haben. Typischerweise enthält ein Maisstärkefaserhydrolysat Glucose, Xylose und Arabinose. Ein Maisstärkefaserhydrolysat kann beispielsweise etwa 40 Gramm/l Glucose, etwa 40 Gramm/l Xylose und etwa 20 Gramm/l Arabinose enthalten.
Für Produktionsverfahren in großem Maßstab können die folgenden Verfahren verwendet werden. Zuerst wird ein großer Tank (z.B. ein 190-, 380-, 760-Liter (50-, 100-, 200-Gallonen) oder größere Tanks), der ein geeignetes Kulturmedium enthält, mit zum Beispiel Hexose- und/oder Pentosekohlenstoffen angeimpft mit einem bestimmten Mikroorganismus. Nach Animpfen können die Kulturbedingungen so manipuliert werden, daß die Kohlenstoffquelle vorwiegend verwendet wird, um Biomasse zu erzeugen. Das Kulturmedium kann zum Beispiel manipuliert werden, um einen pH-Wert von etwa 7,0, eine Temperatur von etwa 35°C und einen gelösten Sauerstoffgehalt zu haben, der eine aerobe Umgebung über den gesamten Tank erzeugt. Es wird angemerkt, daß das gewünschte organische Produkt bei dieser Biomasseherstellungsphase erzeugt werden kann. Wenn einmal eine ausreichende Biomasse erreicht ist, kann das Wachstumsmedium, das die Mikroorganismen enthält, in einen zweiten Tank überführt werden. Dieser zweite Tank kann von jeglicher Größe sein. Der zweite Tank kann zum Beispiel größer, kleiner oder von derselben Größe wie der erste Tank sein. Der zweite Tank ist typischerweise größer als der erste, derart, daß ein zusätzlichen Kulturmedium zu dem Wachstummedium von dem ersten Tank zugegeben werden kann. Zusätzlich kann das Kulturmedium in dem zweiten Tank dasselbe wie oder verschieden von jenem sein, das in dem ersten Tank verwendet wird. Der erste Tank kann zum Beispiel Medium mit Xylose und Arabinose enthalten, während der zweite Tank Medium mit Glucose enthält.
Einmal überführt, können die Kulturbedingungen in dem zweiten Tank so manipuliert werden, daß die Kohlenstoffquelle vorwiegend verwendet wird, um organisches Produkt zu erzeugen, wobei „organisches Produkt" unter anderen pyruvat-derivatisierte Produkte und Kohlendioxyd (CO₂) umfaßt aber nicht Biomasse umfaßt (d.h. Trockenzellgewicht). Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „vorwiegend ein ausgewähltes organisches Produkt erzeugen" oder ein „ausgewähltes pyruvatderivatisiertes Produkt", wenn er sich auf Kulturbedingungen bezieht, daß die Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium metabolisiert wird, typischerweise durch ein Fermentationsverfahren metabolisiert wird (obwohl nicht notwendig), um wenigstens 0.5 Gramm eines organisches Produkt pro Gramm verbrauchter Kohlenstoffquelle zu erzeugen (z.B. 0.6, 0.75, oder 0.8 Gramm organisches Produkt). Verfahren zum Bestimmen der Menge an organischem Produkt, das erzeugt wird, und/oder verbrauchter Kohlenstoffquelle sind bekannt und umfassen zum Beispiel HPLC.
Wie oben beschrieben, kann die Effizienz einer Kohlenstoffquellenverwertung variieren, abhängig von dem Substrat und dem Organismus. Während ein komplexes Wachstumsmedium, welches andere Kohlenstoffquellen als Kohlenhydrat enthält (z.B. Aminosäuren) daher verwendet werden kann, betrifft die Menge von organischem Produkt oder pyruvat-derivatisiertem Produkt, das pro Gramm Kohlenstoffquelle erzeugt wird, nur die Menge an organischem Produkt oder pyruvat-derivatisiertem Produkt, das erzeugt wird pro Gramm Kohlenhydratkohlenstoffquelle, die verbraucht wird. Zu diesem Stadium wird bevorzugt nicht mehr als 0.3 Gramm Biomasse pro Gramm Kohlenstoffquelle erzeugt (z.B. nicht mehr als 0.2, 0.1 oder 0.05 Gramm Biomasse).
Das Kulturmedium kann zum Beispiel manipuliert werden, um einen gelösten Sauerstoffgehalt zu haben, der eine anaerobe Umgebung über den gesamten Tank erzeugt oder um einen Inhibitor der Zellatmung zu enthalten. Zusätzlich kann das Kulturmedium manipuliert werden, derart, daß ein bestimmter pH-Wert (z.B. saurer, neutraler oder basischer pH-Wert) aufrecht erhalten wird. Alternativ kann der pH der Kultur periodisch ohne Aufrechterhalten eines bestimmten pH-Werts eingestellt werden. Wenn eine organische Säure erzeugt wird, wird der pH-Wert des Mediums typischerweise etwa wenigstens 1.5 sein (z.B. weniger als 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 oder 7.0). Wenn der Mikroorganismus weiterhin die bereitgestellten Kohlenstoffquellen katabolisiert, wird die Temperatur im Tank ansteigen. Das Kulturmedium kann daher so gehandhabt, daß eine spezielle Temperatur aufrecht erhalten wird. Die Temperatur des Kulturmediums kann alternativ, periodisch eingestellt werden, ohne Aufrechterhaltung einer bestimmten Temperatur. Eine Temperatur kleiner als 35°C (z.B. kleiner als etwa 34, 33, 32, 31 oder 30°C) wird typischerweise aufrecht erhalten, wenn hitzempfindliche Mikroorganismen verwendet werden, während eine Temperatur kleiner als etwa 45°C (z.B. kleiner als etwa 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36 oder 35°C) aufrecht erhalten wird, wenn hitzeintensive Mikroorganismen verwendet werden. Es wird angemerkt, daß Biomasse bei dieser Produktionsphase organischen Produkts erzeugt werden kann. Die Kulturbedingungen in dem zweiten Tank können zusätzlich umgeschaltet werden von jenen, die die Produkterzeugung fördern, zu jenen, die Biomasseproduktion fördern und umgekehrt für ein oder mehrere Male. Die Kulturbedingungen in dem zweiten Tank können beispielsweise die meiste Zeit aerob sein mit kurzen Pulsen von gelöstem Sauerstoff, so daß aerobe Bedingungen periodisch vorliegen.
In anderen Verfahren können die anaeroben Kulturbedingungen modifiziert werden, um die metabolische Energie von kultivierten Mikroorganismen zu erhöhen zum Beispiel durch Zugabe eines terminalen Elektronenakzeptors. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „metabolische Energie" die Energie (ausgedrückt in ATP), die von dem Organismus aus einer Energiequelle abgeleitet wird (wie einer Kohlenstoffquelle). Unter einigen Bedingungen ist die Menge an metabolischer Energie, die erhalten wird durch den Organismus aus dem Metabolismus einer Kohlenstoffquelle, größer als die Energie, die erhalten wird aus derselben Kohlenstoffquelle unter unterschiedlichen Bedingungen.
Lebende Zellen haben einen hohen Ordnungszustand und müssen Ordnungen in ihnen erzeugen, um zu überleben und zu wachsen. Um Ordnung in den Organismus zu erhalten, treten Tausende unterschiedlicher chemischer Reaktionen im Organismus gleichzeitig auf. Zellen brauchen zum Beispiel Energie für Biosynthesereaktionen wie DNA-, RNA- und Proteinpolymerisierungsreaktionen und die Bildung von metabolischen Produkten. Zellen brauchen auch Energie, um Substrate in die Zellen zu bringen, Metabolite in den Zellen zu halten, einen geeigneten Schwellungsdruck und internen pH aufrecht zu halten und zur Beweglichkeit.
Da Energie nicht erzeugt oder vernichtet werden kann, braucht die Zelle eine Energieeinführung aus der Umgebung, um Ordnung aufrecht zu halten. Energie wird allgemein geliefert aus der Umgebung in Form von elektromagnetischer Strahlung oder chemischer Energie. Die Energie, die erhalten wird aus der Umgebung, wird durch die verwendete Zelle nutzbar gemacht durch einen von zwei biochemischen Mechanismen: Phosphorylierung auf Substratebene und Elektronentransport.
Unter anaeroben Bedingungen wird ATP (die „Zellwährung" als Energie) erzeugt durch Phosphorylierung auf Substratebene. Bei solcher Phosphorylierung auf Substratebene wird Energie freigesetzt aus chemischen Verbindungen und vorwiegend in Form von ATP gespeichert.
Ein Beispiel von Bildung auf Substratebene ist die Umwandlung von Glucose in Pyruvat durch Glycolyse: Glucose = 2Pyruvate + 2ATP + 2H₂
Pyruvat kann dann in Milchsäure umgewandelt werden: Pyruvat + 2H₂ = Lactat
Die durch die obige Umwandlung erzeugte Nettoenergie ist gleich 2ATP.
Pyruvat kann ferner zum Citratzyklus (TCA) verarbeitet werden und zusätzliche Energie und Wasserstoffatome erzeugen: Pyruvat + 3H₂O = 3CO₂ + ATP + 5H₂
Die Nettoreaktion für Glucoseatmung: Glucose + 6H₂O = 6CO₂ + 4ATP + 12H₂
Durch Phosphorylierung auf Substratebene wird die vollständige Atmung von Glucose zu CO₂ ein Nettoenergieäquivalent von 4 ATP und 24 Wasserstoffatomen liefern.
Beim „Elektronentransport" werden die Oxidations-Reduktions-Potentiale der Verbindungen, die Glieder einer „Elektronentransportkette" bilden, so ausbalanciert, daß jedes Glied reduziert werden kann durch die reduzierte Form des vorhergehenden Gliedes. Reduktionsleistung wie Elektronen kann daher durch die Kette von Trägermolekülen zu einem terminalen Elektronenakzeptor wie Sauerstoff (O₂), Nitrat (NO₃ ^–) und Fumarat fließen. Die Zugabe eines terminalen Elektronenakzeptors wie Sauerstoff, Nitrat oder Fumarat zu einem Kulturmedium kann den Mikroorganismus mit verstärkter metabolische Energie versehen (z.B. verstärkter ATP-Produktion für dieselbe Menge verbrauchte Kohlenstoffquelle). Sauerstoff ist der bevorzugteste terminale Elektronenakzeptor.
Wenn beispielsweise Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor verwendet wird, kann Wasserstoff über die Elektronentransportkette verarbeitet werden und die Zelle mit zusätzlichen 1.5 ATP pro Wasserstoffatomen und 3 ATP pro Sauerstoffatom versorgen. Die Menge an metabolischer Energie kann allgemein bestimmt werden durch Messen des Verhältnisses der verbrauchten Sauerstoffmenge zur verbrauchten Glucosemenge. Tabelle 1 zeigt erwartete Maximal- und Minimalverbesserungen der Energieausbeute (Mol ATP pro Mol Glucose) wenn Sauerstoff bei der Herstellung zugegeben wird, als Funktion der Produktausbeute, welche aufgrund des Verlustes von Pyruvat an den TCA-Zyklus sich vermindert (und folglich auch die Atmung). Maximale prozentuale Verbesserung wurde berechnet unter der Annahme eines P/O-Verhältnisses von 3, während minimale prozentuale Verbesserung ein P/O-Verhältnis von 0.5 annahm. Tabelle 2 zeigt die geschätzte maximale Sauerstoffmenge, die pro verbrauchtes Mol Glucose verbraucht wurde. Die Zugabe von Sauerstoff kann minimales Wachstum fördern, das Kohlenstoff zur Biosynthese absondern wird, unter Belassen einer kleinen Kohlenstoffmenge, die zur Atmung verfügbar ist (und daher zur Sauerstoffverwertung).
Tabelle 1.
Tabelle 2.
Um die metabolische Energie der Mikroorganismen in der Zellkultur zu verbessern, kann Sauerstoff zu der Zellkultur als terminaler Elektronenakzeptor zugegeben werden. Während die maximale, molare Ausbeute an Milchsäure aus Glucose 2 Mol Lactat pro Mol Glucose und die molare Ausbeute von ATP aus Glucose 2 Mol ATP pro Mol Glucose ist, erlaubt die Zugabe von Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor es dem Pyruvat, in den Zitronensäurezyklus (TCA) umgeleitet zu werden, wo es zu CO₂ und Energie umgewandelt wird. Das Bereitstellen eines terminalen Elektronenakzeptors „erhöht die metabolische Energie" des Mikroorganismus somit.
Das Ableiten des Pyruvats in den TCA-Zyklus wird dazu neigen, die Menge anderer pyruvat-derivatisierter Produkte (wie Milchsäure), die erzeugt werden, zu vermindern. Eine 10% Verminderung bei der Ausbeute kann beispielsweise zu einer Erzeugung von 2.6 mal mehr metabolischer Energie für den Mikroorganismus führen, 20% Verminderung der Ausbeute kann zu Erzeugung 4.2 mal mehr metabolischer Energie für den Mikroorganismus führen und eine 50% Verminderung bei der Ausbeute kann zu eine 9-fach höheren Erzeugung metabolischer Energie für den Mikroorganismus führen.
Es wird vorweggenommen, daß in den späteren Stadien eines Vorgangs, wenn hohe Gehalte metabolischer Produkte wie Milchsäure vorliegen, die Zelle mehr metabolischer Energie erfordern kann, um Funktionen aufrecht zu erhalten.
Es kann wünschenswert sein, die Mikroorganismen in einem anaeroben Kulturmedium daher für kurze Pulse von gelöstem Sauerstoff auszusetzen. Bevorzugt wird der „kurze Puls von gelösten Sauerstoff" in dem Kulturmedium zu einer gelösten Sauerstoffkonzentration nicht größer als 0.5%, vorzugsweise zwischen 0.1 und 0.5% in dem Kulturmedium führen. Alternativ können die Wachstumsgeschwindigkeit oder der Zellerhalt von Mikroorganismen bei anaerober Fermentierung vergrößert werden durch Zugabe anderer terminaler Elektronenakzeptoren wie Nitrat oder Fumarat. Sauerstoff wird bei einem Gehalt zugegeben, der gerade ausreichend ist, um die metabolische Energie des Mikroorganismus zu erhöhen unter Aufrechthalten der Produktivität auf einem gewünschtem Niveau. Es muß Sorgfalt angewendet werden, um übermäßige Ausbeuteverluste zu vermeiden. Diese Technik kann verwendet werden, um dabei zu helfen, restliche Zucker zu verbrauchen und daher das Gewinnungsverfahren weiter zu vereinfachen.
6. Reinigungsverfahren des organischen Produkts
Einmal erzeugt, kann jedes Verfahren verwendet werden, um das gewünschte Produkt zu isolieren. Gewöhnliche Trenntechniken können zum Beispiel verwendet werden, um Biomasse von Wachstumsmedium zu trennen, und gewöhnliche Isolierungsverfahren (z.B. Extraktion, Destillation und Ionenaustauschverfahren) können verwendet werden, um das organische Produkt aus dem Mikroorganismen freie von Medium zu erhalten, siehe zum Beispiel U.S. Patent Nummer 4,275,234; U.S. Patent Nummer 5,510,526; U.S. Patent Nummer 5,831,122; U.S. Patent Nummer 5,641,406; und Internationale Patentanmeldung Nummer WO 93/00440. Zusätzlich kann man das gewünschte, organische Produkt isolieren, während es erzeugt wird oder es kann isoliert werden vom Wachstumsmedium, nachdem die Produktproduktionsphase beendet worden ist. Es ist wichtig anzumerken, daß die Kulturbedingungen in den zweiten Tank so gehandhabt werden, daß das Isolierungsverfahren verbessert ist. Der pH und die Temperatur in dem zweiten Tank können so manipuliert werden, daß das gewünschte, organische Produkt aus der Lösung ausfällt oder in einer der Isolierung zugänglicheren Form ist. Spezifisch kann der pH-Wert von organischen Säuren aus einer Lösung ausfällen, wenn der pH des Wachstumsmediums kleiner als der pKa-Wert für die organische Säure ist. Die Kulturbedingungen beim Erzeugen von Glutaminsäure können zum Beispiel so sein, daß der pH kleiner als 2.19 ist, was der pKa-Wert von Glutaminsäure ist. Manipulieren des pH, der Temperatur und des Gehalts des Wachstumsmediums kann daher die Isolierung des organischen Produkts erleichtern. Speziell genetisch manipulierte Hefe kann zusätzlich ausgewählt werden und/oder spezifische Kulturbedingungen können so manipuliert werden, daß jegliche Nebenprodukte im Wachstumsmedium derart sind, daß sie nicht die Gewinnung des gewünschten organischen Produktes beeinträchtigen können.
Es wird bedacht werden, daß das Verfahren und die Materialien, die hier beschrieben sind, angepaßt und verwendet werden können in jedem Typ von Kultivierungsverfahren, einschließlich ohne Begrenzung der Verfahren, die gewöhnlich als „kontinuierliche Fermentation" und „stufenweise Fermentation" bezeichnet werden. Zusätzlich können die Mikroorganismen, die bei einem Herstellungsverfahren verwendet werden, in nachfolgenden Herstellungsvorgängen gewonnen und wiederverwendet werden. Die Mikroorganismen können beispielsweise mehrmals wieder verwendet werden, um ein gewünschtes, organisches Produkt zu ergeben. Weiterhin kann jede Kohlenstoffquelle verwendet werden. Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Iodose, Galactose, Talose, Melibiose, Sucrose, Fructose, Raffinose, Stachyose, Ribose, Arabiose, Xylose, Lyxose, Stärken wie Maisstärke und Weizenstärke und Hydrolysate wie Maisstärkefaserhydrolysate und andere Cellulosehydrolysate können beispielsweise als Kohlenstoffquelle für die Herstellung von entweder Biomasse oder dem gewünschten organischen Produkt verwendet werden. Weiterhin kann jedes Medium verwendet werden. Standard Kulturmedium (z.B. Hefeminimalmedium und YP-Medium (Hefeextrakt 10 g/l, Peptonwachstumsmedium 20 g/l) sowie Medien wie Maissirupwasser und Maissirupflüssigkeit können beispielsweise verwendet werden.
Ein signifikanter Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die bevorzugen Mikroorganismen speziell, wenn sie unter aeroben Bedingung angezogen werden, Minimalmedium verwenden können. Die anaerobe Produktion wird typischerweise keine zusätzlichen Nährstoffe erfordern, so daß das Endprodukt isoliert werden kann aus einem relativ sauberen Fermentationswachstumsmedium unter Verwendung von jeder aus einer Vielzahl von Trenntechniken. Flüssig-flüssig Extraktion ist eine wohlbekannte Technik zur Trennung von organischen Säuren aus Fermentationswachstumsmedien und führt zu einer beträchtlichen Reinigung. Mit der vorliegenden Erfindung wird vermutet, daß einfachere, billigere, weniger energiekonsumierende Systeme verwendet werden können.
In einer Ausführung verwendet die vorliegende Erfindung genetisch modifizierte Hefe mit einem Crabtree-negativen Phänotyp in einem fließbandartigen Verfahren, daß ein „Umschalten" in den metabolischen Stoffwechsel umfaßt, nachdem eine kritische Zelldichte erreicht worden ist und bei welcher Zeit es gewünscht wird, die spezifische Produktivität des gewünschten organischen Produktes dramatisch zu vergrößern. Ein typisches Verfahren zum Induzieren des metabolischen Stoffwechselwegumschaltens geschieht durch Versetzen der Biomasse aus einem hochgradig belüfteten Gefäß in ein im wesentlich anaerobes Gefäß, was Sauerstoffhungern hervorruft. Es wird angemerkt, daß ein gewöhnliches Kohlehydrat (z.B. Glucose oder Xylose) als Kohlenstoffquelle sowohl bei der Wachstumsphase als auch der Produktionsphase verwendet werden kann. Die Verwendung von genetisch modifizierten Hefezellen mit Crabtree-negativem Phänotyp kann kritisch für den Erfolg dieser Ausführung sein. Die spezifische Produktivität des gewünschten organischen Produkts kann zusätzlich kritisch für den Erfolg sein. Der Ausdruck „spezifische Produktivität", wie hierin verwendet, spiegelt die Menge an Produkt wieder, das erzeugt wird und wird dargestellt als die Anzahl Gramm organischen Produkts, die erzeugt werden pro Gramm Biomasse (Trockengewicht) pro Stunde, d.h. g/(g·Stunde). Die spezifische Produktivität für organische Produkte wie Lactat und Acrylat ist typischerweise größer als etwa 0.1 g/(g·Stunde), zum Beispiel größer als etwa 0.2 g/(g·Stunde), oder größer als etwa 0.5 g/(g·Stunde). Durch Bereitstellen einer hohen spezifischen Produktivität wie hier beschrieben, kann die für den Zellerhalt erforderliche Energie über den fermentativen Produktstoffwechselweg unter im wesentlichen anaeroben Bedingungen eher erhalten werden als unter Stützung auf Belüftung, um hohe Energiemengen über den Atmungsstoffwechselweg zu erzeugen. Es wird angemerkt, daß im wesentlichen anaerobe Gefäße bei einer Geschwindigkeit von weniger als 0.1 VVM belüftet werden. Unter bestimmten Produktionssituationen wird keine Belüftung verwendet. Zusätzlich ist die Ausbeute (d.h. g organisches Produkt/g verbrauchter Kohlenstoffquelle) in dieser Ausführung typischerweise als etwa 70 Gew.-% und wird ohne Zugabe von Kohlenstoffquellen wie Ethanol und Acetat erzeugt. In einigen Fällen kann es, um die spezifische Produktivität zu erhalten, die erforderlich ist, um die zum Zellerhalt erforderliche Energie zu erzeugen, notwendig sein, um den Stoffwechselweg von Glucose zu Pyruvat zusätzlich zu verstärken, um die notwendigen Enzyme zu liefern, um das gewünschte Produkt zu erzeugen.
In einer anderen Ausführung kann das fließbandartige Verfahren so konstruiert werden, daß nur das stark belüftete Wachstumsgefäß mit Sterilisierfähigkeit versehen ist. Das anaerobe Produktionsgefäß wird typischerweise bei Temperaturen größer als etwa 35°C gehandhabt (z.B. größer als etwa 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 oder 45°C). Wenig Wildtyphefe wird in der Lage sein, zu überleben und mit der genetisch modifizierten Hefe bei solchen Temperaturen in Konkurrenz zu treten, wenn der pH bei der Produkterzeugung abfällt, speziell weil sie keinen verstärkten Fermentierungsstoffwechselweg haben, der Energie zum Zellerhalt erzeugen kann. Die Hefe kann zusätzlich konstruiert werden um „Killerplasmide", wie hier beschrieben, zu enthalten, welche die Hefe vor dem Überleben anderer Spezies schützen können.
Die Erfindung ergibt auch verschiedene Verfahren zum Kultivieren von Hefezellen. Eine Hefezelle mit einem Crabtree-negativen Phänotyp kann zum Beispiel kultiviert werden mit Kulturmedium, das entweder einen organischen pH-Wert kleiner als etwa 3.0 hat oder ein Maisstärkefaserhydrolysat enthält. Andere Verfahren zum Kultivieren von Hefezellen umfassen ohne Begrenzung das Kultivieren von Hefezellen mit einem Crabtree-negativen Phänotyp bei einer Temperatur größer als etwa 35°C mit Kulturmedium, das entweder einen anorganischen pH-Wert kleiner als etwa 3.0 hat oder einen Pentosekohlenstoff oder Maisstärkefaserhydrolysat enthält.
Die Erfindung ergibt weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines organischen Produkts. Dieses Verfahren umfaßt, das Anziehen eines Mikroorganismus unter Kulturbedingungen und Auswechseln der Kulturbedingungen, um die Erzeugung des organischen Produkts zu fördern. In diesem Verfahren hat der Mikroorganismus verminderte Aktivität von Pyruvat-Decarboxylase, Alkohol-Dehydrongenase, Aldehyd-Dehydrogenase und/oder Acetyl-CoA-Synthase und zeigt eine Wachstumsgeschwindigkeit in Abwesenheit von Ethanol und Acetat, die etwa wenigstens 30% (z.B. etwa 35, 40, 50, 75, 150, 200 Prozent oder mehr) von jener ist, die in einem entsprechenden Mikroorganismus beobachtet wird, der keine verminderte Aktivität von Pyruvat-Decarboxylase, Alkohol-Dehydrongenase, Aldehyd-Dehydrogenase und/oder Acetyl-CoA-Synthase hat. Kulturbedingungen, die Zellatmung fördern, werden typischerweise verwendet in Situationen, wo schnelles Wachstum benötigt wird, oder wo das organische Produkt, das herzustellen ist, nicht ohne Zellatmung hergestellt werden kann, während Kulturbedingungen, die Zellatmung vermindern in Situationen verwendet werden, wo Wachstum nicht gebraucht wird, oder wo das zu produzierende organische Produkt ohne Zellatmung erzeugt wird.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben werden, welche den Umfang der in den Ansprüchen beschriebenen Erfindung nicht begrenzen.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Rekombinantes Plasmid pHES/pSEH
0,5 μg von Plasmid pGAD424 beschrieben von Chien et al. (Proc. Acad. Acad. Sci., 88 (21): 9578–9582 (1991)) wurde verdaut mit dem Restriktionsenzym HindIII. Das verdaute Gemisch wurde aufgetrennt durch Gelelektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel unter Verwendung von TBE-Puffer. Ein 5,9 kbp-Fragment wurde dann gereinigt aus dem Gel wie beschrieben in Sambrook et a., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Ein komplementäres Paar von 92 bp synthetischen Oligomeren mit mehrfachen Restriktionsenzymerkennungsstellen wurde entworfen.
Das erste wurde fw hes oligo genannt und hatte die folgende Sequenz:
Das zweite wurde comp hes oligo genannt und hatte die folgende Sequenz:
500 nmol der zwei komplementären Oligomere wurden angelagert aneinander durch Kochen für zehn Minuten und graduelles Kühlen auf Raumtemperatur. Die doppelsträngige 92 bp DNA wurde verdaut mit HindIII und ligiert an das HindIII verdaute 5,9 kbp pGAD424. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E.coli DH10B (electromax cells, Life Technologies, Rockville, MD) durch Elektroporation zu transformieren, wie beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Rekombinantes E.coli wurde ausplattiert auf Luria-Bertani-Wachstumsmediumsplatten und Zellen, die Plasmid enthalten, wurden selektiert unter Verwendung von 100 μg/ml des Antibiotikums Ampicillin. Die Plasmid-DNA von ampicillinresistenten E.coli-Klonen wurde gescreent, um die beiden Plasmide pHES und pSEH zu erhalten (1 und 2). Die beiden Plasmiden unterscheiden sich in der Orientierung des synthetischen Oligomers bezüglich des Alkoholdehydrogenase-ADH1-Promotors auf dem Vektor.
Beispiel 2 – PCR-amplifizierung von Nukleinsäure, die Lactatdehydrogenase enthält, aus Lactobacillus helveticus und Pediococcus acidilactici
Genomische DNA wurde isoliert aus Übernachtkulturen von Lactobacillus helveticus (ATCC 10797) und Pediococcus acidilactici (ATCC 25741) unter Verwendung des PUREGENE^®-Kits zur Isolierung genomischer DNA (Gentra systems, Minneapolis, MN). PCR Primer wurden entworfen, um Lactatdehydrogenase-codierende Nukleinsäure aus genomischer DNA von L. helveticus (Ih-ldh Oligos) und P. acidilactici (pa-ldh Oligos) zu isolieren. Die Primer wurden entworfen basierend auf den verfügbaren Gensequenzen für Lactatdehydrogenasen in den Genbank-Datenbanken und haben die folgenden Sequenzen:
Die Primer wurden optimiert unter Verwendung von Primer Designer Software, die erhalten wurde von Sci-ed Software (Durham, NC). Ein μmol der genomischen DNA wurde verwendet zusammen mit 100 nmol Primern. Pfu DNA-Polymerase (New England Biolabs) wurde verwendet, um Lactatdehydrogenase-Nukleinsäure (LDH) zu amplifizieren wie beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor, Laboratory, Plainview, NY (1989)).
Eine ähnliche Strategie wird eingesetzt, um L-Lactatdehydrogenase-codierende Aminosäuren aus genomischer DNA von einem Mikroorganismus wie Bacillus sp. zu isolieren, zum Beispiel Bacillus megaterium (ATCC 6458) oder Rhizopus oryzae (ATCC 76275) oder jedem anderen Lactat liefernden Organismus (einschließlich Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien und mehrzellige Organismen wie Säugetiere) oder aus Gewebe von einem Lactat produzierenden Organismus. Genomische DNA wird isoliert aus einer wachsenden Kultur des Organismus unter Verwendung von dem PUREGENE^®-Kit zur Isolierung genomischer DNA (Gentra systems, Minneapolis, MN). Geeignete PCR Primer werden entworfen, um Lactatdehydrogenase-codierende Nukleinsäure basierend auf den LDH-Gensequenzen für diese aus der Genbank verfügbaren Spezies zu isolieren. Allgemein wird ein μmol genomischer DNA verwendet zusammen mit 100 nmol der geeigneten Primer. Pfu DNA-Polymerase (New England Biolabs) oder jede andere geeignete DNA-Polymerase wird verwendet, um Lactatdehydrogenase (LDH) Nukleinsäure aus der jeweiligen genomischen DNA unter Verwendung von PCR Technologie zu amplifizieren wie zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)).
Lactatdehydrogenase-codierende Nukleinsäure wird alternativ isoliert aus Kluyveromyces theromotolerans ATCC 52709, Trichoderma Reesei ATCC 13631, Torulaspora pretoriensis ATCC36245 oder jedem anderen Lactatdehydrogenase erzeugenden Organismus unter Verwendung von einer der folgenden Methoden.

1) Eine genomische cDNA-Bibliothek von einem dieser Organismen wird kloniert in einen Standard E.coli Expressionsvektor wie pUC19 unter Verwendung von Standardtechniken (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning. a laboratory manual 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Ein mutierter E.coli-Stamm (ldh pfl) NZN111 (Bunch et al., (1997) "The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli," Microbiology, 143: 187–95) wird transformiert mit dieser Bibliothek und die Zellen werden angezogen unter anaeroben Bedingungen in M9 Medium, das mit Casaminosäure ergänzt ist. Jedes E.coli, das unter diesen Bedingungen wächst, codiert entweder eine Lactatdehydrogenase oder eine Revertante bei ldh oder pfl. Positive (Kolonien, die unter anaeroben Wachstumsbedingungen sich bilden) werden gescreent auf LDH-Aktivität unter Verwendung eines colorimetrischen Tests einer milchsäurespezifischen Weichagarschicht (LASSO), die in der Lage ist, zwischen (L)-LDH und (D)-LDH zu differenzieren (Witte et al. (J. Basic Microbiol. 29: 707–716 (1989)). Plasmid-DNA aus Klonen, von denen vermutet wird, daß sie L-Lactatdehydrogenase exprimieren, wird dann isoliert und sequenziert.
2) K. thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 13631 und Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 sind alle Eukaryoten, die L-Milchsäure erzeugen, wenn sie unter anaeroben Bedingungen kultiviert werden (Witte et al. (J. Microbiol. 29: 707–716 (1989)). Gemäß diesem Verfahren wird daher zumindest einer dieser Stämme angezogen unter anaeroben Bedingungen, um Lactatdehydrogenaseenzymaktivität zu induzieren. Ein zellfreies Extrakt wird dann erhalten unter Verwendung von Standardmethoden und bekannten Proteinreinigungsstrategien unterzogen, um das Lactatdehydrogenaseenzym zu isolieren. Verfahren zur Reinigung von Lactatdehydrogenase sind bekannt (Kelly et al., (1978) "Affinity chromatography of bacterial lactate dehydrogenases," Biochem J, 171 (3): 543–7). Nachdem das Protein gereinigt ist, wird es partiell gespalten und sequenziert, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen. Diese Aminosäuresequenz wird dann verwendet, um degenerierte Primer zu entwerfen, um das Gen zu isolieren, das Lactatdehydrogenase codiert, aus der genomischen DNA. Eine eukaryotische LDH wie eine, die isoliert ist aus K. thermotolerans or Trichoderma reseei oder Torulaspora pretoriensis kann besser funktionieren (hinsichtlich Transkriptionseffizienz, Translationseffizienz und/oder Proteinaktivität) in der Hefe K. marxianus, verglichen mit einer LDH aus Bakterienquellen wie Bacillus oder Lactobacillus.
3) Unter Verwendung der bekannten eukaryotischen Lactatdehydrogenasegensequenzen, die verfügbar sind aus der Genbank, werden degenerierte Primer entworfen, um das Gen für Lactatdehydrogenase aus genomischer DNA von K. thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 13631 oder Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 zu isolieren. Die konservierte NAD+ Bindungsstelle und Pyruvatbindungsstelle unter den LDH Gensequenzen wird verwendet, um degenerierte Primer zu entwerten. Ein μmol genomischer DNA wird verwendet mit 100 nmol Primer. Pfu DNA-Polymerase (New England Biolabs) oder eine andere geeignete DNA-Polymerase wird verwendet, um die Fragmente von L+ Lactatdehydrogenase-Nukleinsäure (LDH) gemäß bekannten PCR-Verfahren zu amplifizieren, zum Beispiel jenen die beschrieben sind Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)).

Beispiel 3 – Klonierung von L. helveticus und P. acidilactici in pCRII Vektor
PCR-amplifizierte LDH-DNA Produkte wurden ligiert mit pCRII Vektoren (3 und 4), unter Verwendung des TA-Klonierungskits, erhalten von Invitrogen (Carlsbad, CA). Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E.coli DH10B zu transformieren, unter Verwendung von Verfahren, die beschrieben sind in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Die pCRII Vektoren, die mit dem Kit geliefert wurden, erlaubten schnelle Klonierung der PCR Produkte gemäß den Herstelleranweisungen. Die pCRII Vektoren mit den LDH Genen aus L. helveticus und P. acidilactici sind in 4 abgebildet.
Beispiel 4 – Rekombinantes Plasmid pLh ldh-HES/pPa ldh-HEX mit L. helveticus und P. acidilactici LDH Genen im pHES-Vektor
Die pCRII-Vektoren, die LDH Gen aus L. helveticus und P. acidilactici enthalten, wurden verdaut mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen. Der pHES-Vektor wurde ähnlich verdaut mit denselben Restriktionsendonukleasen. Ein 1 kbp Insert, das LDH aus pCRII Vektoren enthält, wurde dann ligiert in den 6,0 kbp pHES-Vektor unter Verwendung von T4 DNA Ligase wie beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E.coli DH10B zu transformieren (Elektromaxzellen, Life Technologies, Rockville, MD) und rekombinante Klone wurden auf Ampicillinresistenz selektiert. DNA, die isoliert wurde aus rekombinanten Klonen, wurde analysiert, um die pLh ldh-HES und pPa ldh-HES Vektoren zu bestätigen (5). Diese Vektoren enthalten die Gene, die LDH aus L. helveticus und P. acidilactici codieren, in dem pHES-Vektor unter der Kontrolle des Hefealkohldehydrogenasepromotors (ADH1) enthalten.
Beispiel 5 – Klonierung von Bacillus sp., Rhizopus oryzae, K. thermotolerans, Trichoderma reseei oder Torulaspora pretoriensis LDH Gen zur Expression unter Verwendung des Saccharomyces PDC1-Genpromotors
Obwohl es möglich ist, den Lactatdehydrogenasepromotor zu verwenden, der in Rhizopus oryzae, K. thermomotolerans, Trichoderma reseei oder Torulaspora pretoriensis gefunden wurde, um die Expression von einem Lactatdehydrogenasegen zu kontrollieren, das in K. marxianus kloniert ist, kann der PDC1-Promotor von Saccharomyces cerevisiae verwendet werden, um die Expression von dem isolierten Lactatdehydrogenasegen zu kontrollieren. Glykolytische Saccharomyces cerevisiae-Promotoren sind erfolgreich verwendet worden, um Gene in Kluyveromyces-Stämmen zu exprimieren. (Gellissen und Hollenberg, (1997) "Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis – a review," Gene, 190 (1): 87–97).
Demgemäß wird der PDC1-Promotor aus Saccharomyces cerevisiae erhalten durch Entwerfen geeigneter Oligomerprimer unter Verwendung der Saccharomyces cerevisiae Genomsequenz, die in der Genbank verfügbar ist. Die PDC1-Gensequenz und 1 Kb Regionen, die das PDC1-Gen umgeben, werden durch PCR Technologien amplifiziert. Das resultierende 4 Kb DNA Fragment enthält sowohl den Promotor als auch Terminatoren, die PDC1-Genexpression kontrollieren. Mehrfache Restriktionsenzymstellen sind zwischen den Promotoren und den Terminatoren eingeschlossen, die PDC1-Genexpression so kontrollieren, daß eine Vielzahl von LDH Genen unter Kontrolle des PDC1-Promotors und der Terminatoren eingefügt werden kann. Das 4 Kb DNA Fragment, das in einen geeigneten Vektor eingefügt ist, wie ein pUC19, basierend auf Saccharomyces cerevisiae oder E.coli Shuttlevektor. Das LDH Gen wird dann eingefügt in einen Vektor an der Mehrfachklonierungsstelle (multiple cloning site) unter Kontrolle des Promotors und der Terminatoren, derart, daß die Lactatdehydrogenasegenexpression kontrolliert wird durch den PDC1-Promotor und Terminator (14). Alternativ können andere glykolytische Saccharomyces Promotoren ähnlich wie solche verwendet werden, die die Expression von Saccharomyces cerevisiae Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase oder Phosphoglyceratkinasegene kontrollieren, um das klonierte LDH Gen in K. marxianus zu exprimieren.
Beispiel 6 – Amplifizierung von linearen Fragmenten von homologer DNA für Genunterbrechungen von Pyruvatdecarboxylase
Ein 82 bp Oligomerprimer (5'kmPDC1Ko) wurde so entworfen, daß er 51 bp identisch zum 5'-Ende der Pyruvatdecarboxylase (PDC) aus K. marxianus und 30 bp identisch zum 5'-Ende des ADH1 Promotors aus pHES-Vektoren enthielt. Die Sequenz von 5'kmPDC1Ko ist wie folgt:
Die Sequenz für die PDC Gene aus Hefen (K. marxianus oder Y. stipitis oder H. polymorpha) wurde erhalten aus der übermittelten Genbanksequenz. Ähnlich wurde ein 79 bp Oligomer (3'kmPDC1Ko) entworfen, so, daß 54 bp identisch waren mit dem 3'-Ende des PDC Gens und 22 bp identisch waren mit dem 3'-Ende des ADH1 Terminators. Die Sequenz von 3'kmPDC1Ko ist wie folgt:
Die Primer wurden entworfen, um ein lineares DNA Fragment aus pLhldh-HES- und pPaldh-HES-Plasmiden zu amplifizieren, so daß das Fragment das gesamte Lactatdehydrogenasegen zusammen mit dem ADH1-Promotor und -Terminator enthält (6). Das PCR-amplifizierte Produkt enthält auch Enden, die homolog zu den Sequenzen von K. marxianus PDC1, Yamadazyma stipitis PDC1 und PDC2, und Hansenula polymorpha PDC1 und PDC2 waren. Die Amplifizierungsreaktion wurde ausgeführt unter Verwendung von Pfu DNA-Polymerase (New England Biolabs; Beverly, MA). 100 ng von pLhldh-HES oder pPaldh-HES wurde verwendet bei der Reaktion zusammen mit 5 Einheiten Polymerase und 100 nmol der Oligomere. Die Reaktion wurde durchgeführt gemäß Protokollen, die beschrieben sind in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Die 6 bildet das endgültige lineare Produkt mit den beschriebenen Homologien ab.
Andere Konstrukte wurden hergestellt, um die Wahrscheinlichkeiten des Erhalts eines pdc negativen Stammes von K. marxianus zu erhalten. Um diese Konstrukte herzustellen, wurde das 5,5 kbp-Fragment konstruiert, das das K. marxianus 1,7 kbp PDC1-Gen umgibt (6b) unter Verwendung von PCR und Genomwanderungstechniken (Clonetech). Das 5,5 kbp-Fragment wurde kloniert in pCRII TA Klonierungsvektor (Invitrogen) unter Verwendung von Standardverfahren. Ein Teil von annähernd 370 bp nahe der Mitte der 1,7 kbp Codierungsregion von PDC1 wurde entfernt aus dem K. marxianus 5,5 kbp-Fragment durch Restriktionsverdaus (Sambrook). Das entfernte Fragment hat die folgende Sequenz:
Ein Kanamycinresistenzgen und sein Promotor wurde dann isoliert aus einem pPIC9K Vektor (Invitrogen) unter Verwendung von Standardrestriktionstechnologien (siehe Sambrook et al.) und kloniert in dem Ort in den 5,5 kbp, aus welchem das oben identifizierte Fragment entfernt wurde. Das pPIC9K-(Invitrogen)-Kanamycinresistenzgen und sein Promotor wurde so eingefügt, daß die Sequenz des eingefügten Bereichs wie folgt ist:
Das resultierende Konstrukt enthält G418-Resistenzgen, umgeben von etwa 5 kbp und der PDC-Bereich ist in 6c gezeigt. Ein ähnliches DNA Konstrukt wurde angefertigt, welches das interne G418 Gen umgeben von 2,3 kbp von K. marxianus PDC1 in dem PCRII Vektor enthält, wie in 6d gezeigt.
Beispiel 7 – Verwendung von linearem DNA Fragment, um die endogene PDC-Codierungssequenz zu unterbrechen und eine LDH-codierende Sequenz gleichzeitig einzufügen
Das lineare durch PCR erzeugte DNA Fragment, das in Beispiel 5 beschrieben ist, wird verwendet, um K. marxianus, Yamadazyma stipitis oder Hansenula polymorpha zu transformieren. Das Protokoll, das zur Transformation verwendet wird, ist wie beschrieben von Wesolowski-Louvel et al. (Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, Hrsg., Klaus Wolf, Springer Verlag, Berlin, S. 138–201 (1996)). Kurz gesagt wird 5 ml einer Übernachtkultur abzentrifugiert und gewaschen mit Elektroporationspuffer (10 nM Tris-HCl, 270 nM Sucrose, 1 nM MgCl₂, pH 7,5). Die gewaschenen Zellen wurden dann inkubiert für 30 Minuten bei 30°C in Inkubationspuffer (Hefeextrakt 5 g/l, Peptonwachstumsmedium 10 g/l, Glucose 10 g/l, 25 nM DTT, 20 nM HEPES, pH 8,0). Am Ende dieses Zeitraums werden Zellen erneut gewaschen und resuspendiert in 400 μl Inkubationspuffer. 200 ng DNA wird zu diesen Zellen zugegeben und die Zellen werden gepulst unter Verwendung des Biod-Rad Gen Pulser bei 1800 Volt, 1000 Ω und 25 μF in einer 0,4 cm Küvette.
Die Zellen werden platziert auf regulären YPD-Platten (Hefeextrakt 10 g/l, Peptonwachstumsmedium 20 g/l, Glucose 20 g/l, Agar 15%) und Kolonien ließ man über 72 Stunden regenerieren. Jede der Platten mit Kolonien wird replikaplattiert auf frischen YPD-Platten und inkubiert für 48 Stunden. Die Kolonien wurden dann überlegt mit 6,5% Weichagar (0,5% Agar in 300 mM Tris-HCl, 187 mM Glutamat, pH 8,3). Ein Färbungsgemisch (3,2 ml von 1% Agar, 1,6 ml von 120 mM Tris, 75 mM Glutamat, pH 8,3, 0,4 ml von 2 mg/ml Phenazinmethosulfat, 7 Einheiten von Giutamatpyruvattransaminase und 7 Einheiten von L(+)- Schweinemuskellactatdehydrogenase) werden zugegeben zu den überlegten Platten. Hefestämme mit hohem L(+) bilden blaue Flecken innerhalb 10–120 Minuten. Dieses Verfahren ist ähnlich zu dem Verfahren, das vorgeschlagen wurde durch Subden et al. (Canadian J. Microbiol., 28: 883–886 (1982)) und modifiziert durch Witte et al. (J. Basic Microbiol. 29: 707–716 (1989)). Die Kolonien werden selektiert und die aus den Kolonien isolierte DNA wird getestet durch PCR-Analyse und sequenziert, um das unterbrochene Pyruvatdecarboxylasegen zu detektieren.
In einer anderen Ausführung werden die im obigen Beispiel 6 und in 6c und 6d abgebildeten Klone verdaut mit zwei Restriktionsenzymen (siehe Sambrook et al.), um annähernd 3 Mikrogramm DNA Fragment zu ergeben, das die homologe PDC Region enthält, welche die mittlere Sequenz einschließt, die in ein Kanamycinresistenzgen eingefügt ist. K. marxianus wird transformiert mit dem Fragment unter Verwendung von bekannten Techniken wie Elektroporation, um pdc von K. marxianus zu unterbrechen.
Die Elektroporation wird allgemein wie folgt ausgeführt: a) Wachsen einer Kultur des Mikroorganismus in YPAD über Nacht (~15 Std.) in einem Volumen von 20 ml; b) Überführung von 500 μl aus der Kultur in eine Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren @ 4K, 4 Minuten, verwerfen des Überstands, c) Waschen des Pellets mit 1 ml kaltem EB (EB = Elektroporationspuffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 270 mM Sucrose; 1 mM MgCl₂); d) Resuspendieren in 1 ml IB (IB = Inkubationspuffer: YPD; 25 mM DTT; 20 mM Hepes, pH 8,0); e) Schütteln @ 800 Upm, 30°C für 30 Minuten in einem Eppendorf Thermomixer; f) Herunterzentrifugieren, einmal Waschen mit EB, Resuspendieren in 400 μl EB; g) Zugeben von drei Mikrogramm Fragment-DNA (in Wasser 10 mM Tris-Cl, pH 8,5), Inkubieren auf Eis für 30 Minuten; h) Überführen in eine 0,4 cm Elektroporationsküvette. Bio-Rad Gen Pulser Einstellungen: 1000 V, 1000 Ω, 50 μF. Die Zeitkonstante nach dem Puls: ~20 msek; i) Überführen in ein 3 ml Morton-Closure-Röhrchen, Inkubieren ohne Schütteln bei 30°C für 1 Stunde. Zugeben von 400 μl flüssigem YPAD Medium (YPAD: 10 g Hefeextrakt; 20 g Pepton; 20 g Glucose; 100 mg Adeninhemisulfat. Volumen = 1 L. Keine pH Einstellung), Schütteln @ 800 Upm, 30°C für 1 Stunde im Eppendorf Thermomixer. Zugeben 400 μl flüssiges YPAD und Gewinnen über 4–6 Stunden; j) Herunterzentrifugieren in einem Mikrozentrifugenrohr @ 4K, 4 Minuten, Verwerfen des Überstands, Resuspendieren in 400 μl 1 M Sorbitol; k) Ausplattieren auf 200 μg/ml G418 selektiven Platten; und l) Inkubieren bei 30°C für drei bis fünf Tage.
Die Kolonien werden zuerst durch ein zweites Beflecken auf 300 μg/ml G418 gescreent. Die genomische DNA wird isoliert aus den sekundären Hefeflecken durch Standard genomische Präparationen (Sambrook). Diese werden dann gescreent über PCR auf 1) die Anwesenheit von dem Kanamycinfragment unter Verwendung geeigneter Primer und Bedingungen (Sambrook) und 2) die Abwesenheit der unterbrochenen pdc-Region unter Verwendung geeigneter Primer und PCR Bedingungen. Kolonien, die für den Selektionsmarker positiv waren und negativ für den pdc-Unterbrechungsbereich, wurden angezogen und durch HPLC auf die Physiologie analysiert. Genomische DNA von solchen Stämmen wurde weiter durch Southern-Hybridisierungsanalysen analysiert.
Beispiel 8 – Wachstumscharakteristika von Zellen
1. Niedriger pH/Hohe Temperatur
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft auf 50 ml Hefeminimalmedium gemäß Kiers et al. (Yeast, 14 (5): 459–469 (1998)). 100 g/l Glucose wurden als Kohlenstoffquelle verwendet. Die Übernachtkulturen wurden gehalten bei 40°C und angeimpft in Medium, das auch bei 40°C gehalten wurde. Die Zugabe der Animpfung änderte den pH des Mediums von 5,5 auf 2,5. Bei diesem Experiment blieb der pH 2,5. Die Glucosekonzentration wurde gemessen über YSI-Membran und die optische Dichte (OD) wurde gemessen unter Verwendung eines Spektrophotometers.
Glucose wurde in 72 Stunden verwendet, was anzeigt, daß die metabolische Aktivität unter niedrigem pH und hohen Temperaturkulturbedingungen in dem Zeitraum (7) auftritt. Die Zugabe von Biomasse verminderte sich gering über den 48 bis 72 Stunden Zeitraum, was anzeigt, daß Zellkatalbolismus den Anabolismus ausbremst (7).
2. Pentosekohlenstoffquellen
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft in drei 50 ml Kolben, die Hefeminimalmedium enthalten, gemäß Kiers et al. (Yeast, 14 (5): 459–469 (1998)). Jeder der drei Kolben enthielt eine unterschiedliche Kohlenstoffquelle. Die erste enthielt 10 Prozent Glucose, die zweite enthielt 10 Prozent D-Xylose und die dritte enthielt 10 Prozent L-Arabinose. Die Kolben wurden inkubiert bei 30°C und OD-Messungen wurden periodisch durchgeführt.
Nach 40 Stunden war die Biomasseausbeute für Hefe, die kultiviert war mit Glucose oder Xylose, ähnlich während die Biomasseausbeute für Hefe, die kultiviert war mit Arabinose, geringer war (8). Vergleichen des Wachstumsmediums von Hefe, die kultiviert ist mit Glucose, mit jener, die kultiviert ist mit Xylose oder Arabinose, zeigte eine anfängliche Latenzzeit beim Wachstum. Die Hefe, die mit Arabinose kultiviert ist, zeigte eine Latenzzeit von wenigen Stunden, während die Latenzzeit für Hefe, die mit Xylose kultiviert ist, ausgeprägter war (8). Die Gegenwart dieser Latenzzeit zeigt an, daß die Hefezellen Zeit brauchen, um sich an Xylose- und Arabinosekohlenstoffquellen anzupassen. Vermutlich wird diese Zeit benötigt, um die Synthese von normalerweise nicht exprimierten Polypeptiden zu induzieren.
3. Maisstärkefaserhydrolysat bei niedrigem pH
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft in Kolben, die Hefeminimalmedium enthalten, nach Kiers et al. (Yeast, 14 (5): 459–469 (1998)). Jeder Kolben enthielt 30% Maisfaserhydrolysat als Kohlenstoffquelle. Kurz gesagt wurde das Maisstärkefaserhydrolysat gefertigt durch Reagieren von Maisstärkefaser mit 1,2% Schwefelsäure bei 145°C für 25 Minuten. Bei der Reaktion wurde Hemizellulose in die monomeren Produkte Arabinose, Xylose und Glucose zerlegt. Wegen der hohen Temperatur bei der Reaktion degradierte etwas Arabinose und Xylose in Furfural während etwas Glucose in Hydroxymethylfurfural degradierte. HPLC-Analyse des Hydrolysats zeigte die Gegenwart vom 38,7 Gramm/l Glucose, 39,1 Gramm/l Xylose, 20, Gramm/l Arabinose und 1,6 Gramm/l Furfural. Das Hydrolysat hatte zusätzlich einen pH von 1,51. Vorm Kultivieren der Hefe wurde der pH des Maisstärkefaserhydrolysats eingestellt auf 3,0. Bei dem Kultivierungsexperiment wurden OD-Messungen periodisch vorgenommen.
Die Hefezellen waren in der Lage, Biomasse zu generieren, wenn sie mit Maisstärkefaserhydrolysat kultiviert wurden (9).
4. Verschiedene pH-Bedingungen
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft in vier Kolben, die 50 ml Hefe-YPD-Medium (Hefeextrakt 10 g/l, Peptonwachstumsmedium 20 g/l, Glucose 20 g/l) enthalten. Jeder Kolben hatte einen unterschiedlichen pH, welcher unter Verwendung von HCl eingestellt wurde. Bei dem Kultivierungsexperiment wurde die Temperatur auf 30°C gehalten und OD-Messungen wurden periodisch vorgenommen. Das Wachstum wurde beobachtet in jedem Kolben (10).
5. Verschiedene pH-Bedingungen/Milchsäure
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft in vier Kolben, die 50 ml Hefe YPD-Medium (Hefeextrakt 10 g/l, Peptonwachstumsmedium 20 g/l, Glucose 20 g/l) sowie 40 g/l Milchsäure enthielten. Die Zugabe der Milchsäure führte zu einem pH von 2,8. Der pH in drei Kolben wurde dann auf den angezeigten pH unter Verwendung von NaOH eingestellt. Bei dem Kultivierungsexperiment wurde die Temperatur bei 30°C gehalten und OD-Messungen wurden periodisch vorgenommen. Das Wachstum wurde in jedem Kolben beobachtet (11).
Beispiel 9 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, Acrylyl-CoA zu erzeugen
Ein Organismus, der in der Lage ist, Acrylat als Kohlenstoffquelle zu verwenden (z.B. E.coli) wurde transformiert mit einer genomischen Clostridium propionicum DNA-Bibliothek. Die genomische C. propionicum DNA-Bibliothek wurde erzeugt unter Verwendung des pHES Plasmids, so daß sie 10 kbp-Fragmente des C. propionicum Genoms erzeugt. Die transformierten E.coli wurden plattiert auf einem Auswahlmedium mit lediglich Acrylsäure als Kohlenstoffquelle. Nur solche Zellen, die das Vermögen hatten, Acrylat zu assimilieren, werden wachsen. Arcylat wird normalerweise assimiliert durch seine enyzmvermittelte Umwandlung in Lactat. Im Gegenzug kann Lactat umgewandelt werden in Pyruvat und verwendet werden durch Zellen über den Citratzyklus.
Wenn ein transformiertes E.coli einmal ausgewählt ist, wird das DNA Plasmid von genomischen Bibliothek isoliert und das eingesetzte Fragment sequenziert. Wenn es einmal sequenziert ist, wird das Fragment auf offene Leseraster abgesucht, um die codierende Sequenz für Enzyme zu bestimmen, die in der Umwandlung zwischen Lactat und Acrylat beteiligt sind (z.B. Lactoyl-CoA-Dehydrogenase und CoA-Transferasen).
Die isolierten Klone, die die codierende Sequenz für diese Enzyme enthalten, werden in die Hefezellen eingeführt, die in Beispiel 6 beschrieben sind, welche Lactatdehydrogenase enthalten und welchen Pyruvatdecarboxylaseaktivität fehlt. Die Selektion von rekombinanten Hefezellen, die die eingeführte Nukleinsäure enthalten, wird ausgeführt unter Verwendung von G418 (300 g/l). Einmal isoliert, werden die rekombinanten Hefezellen aerob auf Glucose angezogen und dann umgeschaltet auf anaeroben Bedingungen. Das Wachstumsmedium wird dann geerntet und auf Acrylat getestet unter Verwendung von Standard HPLC-Verfahren wie beschrieben von Danner et al. (Biotechnological production of acrylic acid from biomass, In: Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 70–72 (1998)).
Beispiel 10 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, Ascorbat herzustellen
Die Expressionsvektoren wurden so konstruiert, daß die folgenden Polypeptide exprimiert werden: 2,5-Dioxovaleratdehydrogenase, 5-Dehydro-4-Desoxy-D-Glucaratdehydratase, Glucaratdehydratase, Aldehyddehydratase, Glucuronolactonreduktase und L-Gluonolactonoxidase. Die Nukleinsäuresequenz, die die Polypeptide codiert, wird isoliert aus verschiedenen Mikroorganismen. Einmal konstruiert werden die Expressionsvektoren transformiert in Hefezellen durch Elektroporation. Einmal transformiert werden die Hefezellen analysiert, um zu bestimmen, ob sie L-Ascorbat erzeugen.
Beispiel 11 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, D-Xylose zu erzeugen
Expressionsvektoren werden so konstruiert, daß die folgenden Polypeptide exprimiert werden: 2-Dehydro-3-Desoxy-D-Pentanoataldolase, Xylonatdehydratase, Xylonolactonase und D-Xylosedehydrogenase. Die Nukleinsäuresequenzen, die diese Polypeptide codieren, werden isoliert aus Pseudomonas sp. Einmal konstruiert werden die Expressionsvektoren transformiert in Hefezellen durch Elektroporation. Einmal transformiert werden die Hefezellen analysiert, um zu bestimmen, ob sie D-Xylose oder andere Pentosekohlenstoffverbindungen erzeugen.
Beispiel 12 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, Citrat zu erzeugen
PCR Primer werden entworfen basierend auf der S. cerevisiae Aconitasenukleinsäuresequenz (ACO1, Genbank-Zugangsnummer M33131). Diese Primer werden verwendet, um Aconitase zu klonieren, die eine Nukleinsäure codiert aus einer Spezies von Kluyveromyces, Yamadazyma oder Hansenula. Einmal sequenziert werden die linearen Konstrukte gemacht wie in Beispiel 5 beschrieben und verwendet, um Aconitase-codierende Nukleinsäure in Hefezellen zu codieren. Der Selektionsmarker, der verwendet wird, ist antibiotisches G418 anstelle von Lactatproduktion wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Nukleinsäure, die Resistenz gegen das Antibiotikum G418 liefert, ist das Neomycin-/Kanamycingen. Dieses Gen, erhalten aus dem pPIC9K Vektor (InVitrogen) wird eingefügt in den pHES-Vektor. Hefezellen werden transformiert mit PCR-erzeugten linearen Fragmenten, die konstruiert werden, um zu dem oben beschriebenen ACO1 homologe Enden zu haben. Das lineare Fragment wird entworfen, um das G418 Resistenzgen zu codieren. Nur Zellen, die das lineare Fragment in den Ort von Aconitase-codierender Nukleinsäure integriert haben, sind gegen Antibiotika resistent. Solche Zellen werden analysiert für die geeignete Integration unter Verwendung von PCR. Die Hefezellen, die erhalten werden durch dieses Verfahren haben einen partiell funktionellen TCA-Zyklus und können daher Citrat überproduzieren. Das Citrat wird transportiert über die Mitochondrienmembran und in das Wachstumsmedium. Zusätzlich werden diese Hefezellen versetzt mit einem exogenen Nukleinsäuremolekül, das ein Enzym codiert wie ATP-Citratlyase, so daß es die Umwandlung angesammelten Citrats in Oxaloacetat katalysieren kann (siehe Beispiel 13).
Beispiel 13 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, Citratlyase im Cytosol zu exprimieren
Eine Crabtree-positive Hefezelle wird transformiert mit dem pHES-Plasmid, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid codiert, das ATP-Citratlyaseaktivität hat. Die Nukleinsäure wird isoliert aus E.coli, Klebsiella pneumoniae (Genbank-Zugangsnummer X79817) oder anderen veröffentlichten Quellen. Einmal transformiert werden die Hefezellen analysiert, um zu bestimmen, ob sie Zucker verwenden können, um große Mengen von Lipidansammlung zu erzeugen oder nicht. Zusätzlich werden die Hefezellen analysiert, um zu bestimmen, ob sie ATP-Citratlyaseaktivität zeigen wie beschrieben durch Holdsworth et al. (J. Gen. Microbiol., 134: 2907–2915 (1998)). Die Hefezellen haben ATP-Citratlyaseaktivität und sind der Lage, zytosolisches Acetat und aeroben Bedingungen über einen anderen Weg als den Abbau von Aldehyd zu Acetat über Aldehyddehydrogenase bereitzustellen. Wenn einer solchen Hefe zusätzlich Pyruvatdecarboxylase- oder Aldehyddehydrogenaseaktivität fehlt, sollte sie in der Lage sein, Acetat für Biosynthesen über den Citratzyklus bereitzustellen.
Beispiel 14 – Rekombinante Zellen, die nicht in der Lage sind, Lactat als Kohlenstoffquelle zu verwenden
Hefezellen werden so konstruiert, daß die Aktivität eines Carboxylsäuretransporters ähnlich zum S. cerevisiae JEN1-Polypeptid vermindert ist. Solche Hefezellen werden eine verminderte Fähigkeit haben, Lactat zu transportieren und daher Lactat weniger effizient verwerten. Die Aktivität des Carboxylsäuretransporters in Hefezellen ist vermindert durch Unterbrechen des Ortes, der die Codierungssequenz dieses Polypeptids enthält. Das Homologe des JEN1-Polypeptids wird zuerst isoliert aus einer Wirtszelle unter Verwendung von degenerierten Primern, die basierend auf der verfügbaren Sequenz für JEN1 geplant sind (Genbank-Zugangsnummer U24155). Wenn die Nukleinsäure einmal aus der Wirtszelle isoliert ist, wird sie sequenziert. Die Unterbrechung der Codierungssequenz für dieses Polypeptid wird gemacht unter Verwendung von Verfahren, die in Beispiel 11 beschrieben sind. Lineare Fragmente werden erzeugt, die homologe Bereiche der JEN1-Sequenz codieren sowie das gesamte G418 Resistenzgen. Dieses lineare Fragment wird integriert in die genomische JEN1-Sequenz unter Hervorrufen einer Unterbrechung der Aktivität.
Zellen, denen Carboxylsäuretransporteraktivität fehlt, werden identifiziert durch deren Unfähigkeit, Carboxylsäure zu transportieren und daher deren Unfähigkeit, zu wachsen, wenn sie auf Lactat kultiviert werden.
Zusätzlich werden Zellen so modifiziert, daß die Aktivität eines funktionellen Äquivalents von S. cerevisiae Cytochrom b2-Polypeptid vermindert ist. Das Cytochrom b2-Polypeptid versetzt S. cerevisiae Zellen in die Lage, Lactat in den Mitochondrien zu metabolisieren. Degenerierte Primer werden zuerst geplant aus der Saccharomyces Cytochrom b2-Sequenz (Genbank-Zugangsnummer Z46729). Einmal isoliert wird der Klon sequenziert. Die Unterbrechung des Hefewirtshomologen von Cytochrom b2 wird gemacht unter Verwendung von Methoden, die in beschrieben sind Methods in Yeast Genetics (Hrsg., Alison et al., Cold Spring Harbor Press (1997)). Diese rekombinante Hefezelle wird nicht in der Lage sein, Lactat als Kohlenstoffquelle zu verwenden.
Beispiel 15 – Lactatproduktion in großem Maßstab
Mehrere Varianten von K. marxianus Zellen mit verminderter PDC-Aktivität werden erzeugt und isoliert. Jede Variante wird konstruiert, um eine unterschiedliche Anzahl von Kopien von exogenem Nukleinsäuremolekül zu enthalten, das ein Polypeptid mit LDH-Aktivität codiert. Die LDH-Polypeptid kommt von mehreren verschiedenen Quellen. Solche varianten Zellen können eine spezifische Produktivität für Milchsäure bei 40°C haben.
Jede Variante wird angezogen in einem Gefäß unter aeroben Bedingungen mit einem Luftstrom von 1,5 VVM und einem gelösten Sauerstoffgehalt von 30%, um eine Zelldichte von etwa 60 g/l auf Trockenbasis zu erreichen. Wenn die Dichte einmal ausreichend ist, wird der Luftstrom abgeschaltet und die Bedingungen in dem Gefäß werden zu anaeroben Bedingungen umgeschaltet. Keine Basis wird zugefügt. Die Varianten mit der höchsten spezifischen Produktivität bei der anaeroben Phase können nicht nur als schneller Milchsäure produzierend herausgefunden werden sondern auch als eine höhere Konzentration bei niedrigerem pH erzielend als die Varianten mit niedriger spezifischer Produktivität. Die Produktausbeute auf Glucose bei der Herstellungsphase kann 90% überschreiten.
Bestimmte Varianten werden ausgewählt und denselben Kultivierungsverfahren unterzogen, außer, daß der Luftstrom vermindert wird auf 0,1 VVM, eher als daß er komplett abgeschaltet wird. Unter solchen Bedingungen kann der endgültige pH in dem Gefäß niedriger sein und die Lactatkonzentration kann höher sein als unter Bedingungen ohne Luftstrom. Die Produktausbeute auf Glucose kann vermindert sein, aber kann bei etwa 90% verbleiben. Wenn der Test wiederholt wird, aber mit einem Luftstrom von 0,5 VVM, kann das Produkt, das auf Glucose gewonnen wird, auf weniger als 80% vermindert werden.
Beispiel 16 – Produktion von Lactat in großem Maßstab unter Verwendung von Reihen von stufenweisen Fermentationen
Eine Kultur von K. marxianus, der PDC-Aktivität fehlt und mit LDH-Aktivität wird verwendet als Animpfung einer Reihe von Batchfermentationen. Jede Fermentation wird in fortschreitend größeren Gefäßen ausgeführt, wobei jedes davon unmittelbar vor Verwendung sterilisiert wird. Jedes Gefäß wird zusätzlich mit einem Luftstrom von 1,5 VVM versehen und ausreichendem Rühren, um einen gelösten Sauerstoffgehalt oberhalb 10% aufrecht zu erhalten. Das endgültige Gefäß hat ein Volumen von 6.000 l. Die Gefäße werden bei einer Temperatur von 45°C gehalten, um das Überleben der genetisch modifizierten K. marxianus Zellen gegenüber Wildtyphefe und anderen Mikroorganismen zu verstärken. Jedes Gefäß wird gefüllt mit Standardkulturmedium für optimales Wachstum.
Die Gehalte des endgültigen Gefäßes mit einer Zelldichte von 100 Gramm Zellen/l auf Trockenbasis werden überführt zu einem kurz zuvor dampfbehandelten Herstellungsgefäß mit einem Volumen von 300.000 l. Zusätzliche Zellen, die aus der Filtration eines vorhergehenden Herstellungsvorgangs erhalten sind, werden optional zugegeben. Die Zelldichte des Herstellungsgefäßes ist 6 Gramm Zellen/l auf Trockenbasis. Glucose wird zu einem Gehalt von 80 g/l zugegeben. Die Bedingungen in dem Gefäß sind anaerob, wobei die Temperatur 42°C für einen Zeitraum von 25 Stunden ist. Die spezifische Produktivität ist größer als 0,5 Gramm Lactat/(Gramm Biomasse·Stunde) bis nahe dem Ende des Vorgangs, zu welchem Zeitpunkt die Produktivität beginnt abzufallen. Wenn die Produktivität einmal beginnt abzufallen, werden die Zellen entfernt und zur Wiederverwendung aufbewahrt. Die endgültige Lactatkonzentration kann 75 g/l sein, wobei der pH 2,8 ist. Nach Biomasseentfernung wird die Lösung konzentriert durch Eindampfen auf eine Konzentration von 50% Lactat. Die freie Säure (etwa 86% des Gesamtlactats) wird extrahiert durch Flüssigextraktion in organischer Phase und rückextrahiert bei einer höheren Temperatur in Wasser. Das Raffinat, das das Lactatsalz enthält, wird entweder gereinigt und rezykliert als Puffer in das Wachstumsgefäß oder mit zum Beispiel Schwefelsäure angesäuert und gereinigt.
Beispiel 17 – Vergleich von aeroben Produktion von einem Crabtree-negativen (K. marxianus) und einem Crabtree-positiven (S. uvarum) Organismus
Ein Crabtree-negativer (K. marxianus) und ein Crabtree-positiver (S. uvarum) Organismus wurden angezogen in aeroben und anaeroben Batchfermentoren. Die stufenweise Kultivierung wurde ausgeführt bei 30°C in Laborfermentoren mit einem Arbeitsvolumen von 1,5 l. Der pH wurde bei 5,0 ± 0,1 durch automatisierte Zugabe von 2 mol·l^–1 Kaliumhydroxid (KOH) gehalten. Der Fermenter wurde mit Luft (aerobe Kulturen) oder Stickstoffgas (anaerobe Kulturen) durchpustet bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 l·Min^–1und gerührt bei 800 UpM. Die gelöste Sauerstoffkonzentration wurde kontinuierlich überwacht mit einer Sauerstoffelektrode (Ingold, Typ 34 100 3002). Bei den aeroben Kulturen wurde die Konzentration gelösten Sauerstoffs oberhalb 60% gehalten. 10 ml Proben wurden bei geeigneten Zeitabständen zur Bestimmung des Trockengewichts und der Metabolitkonzentrationen abgezogen. Tween-80 und Ergosterol wurden zu den anaeroben Kulturen zugegeben, um die Verbindungen zuzuführen, die zur Fettsäuresynthese erforderlich sind.
Beim exponentiellen Wachstum wurden sowohl Trockengewicht und OD660 von Hefekulturen und Glucose- und Ethanolkonzentration im Überstand bei geeigneten Intervallen bestimmt. Die spezifische Ethanolproduktionsgeschwindigkeit (g_ethanol, mmol·g^–1·h^–1) wurde berechnet durch die folgende Gleichung unter Verwendung einer linearen Regressionsanalyse:
dE/dt (Geschwindigkeit des Anstiegs der Ethanolkonzentration in der Kultur; mmol·l^–1 h^–1) und dC_x/dt (Geschwindigkeit des Biomassekonzentrationsanstiegs; g·l^–1·h^–1) wurden berechnet unter Verwendung von der Differenzierung von Plots von Ethanolkonzentration und Biomassekonzentration gegenüber der Zeit. μ_max (h^–1). Die maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit auf Glucose wurde eingeschätzt von dem exponentiellen Teil einer Auftragung von C_x gegenüber der Zeit. Um die spezifische Glucoseverbrauchsgeschwindigkeit zu berechnen (g_glucose, mmol·g^–1·h^–1) wurde dE ersetzt durch dG (Menge von pro Stunde verbrauchter Glucose).
Bei den aeroben Batchkulturen zeigten Kluyveromyces und Saccharomyces Stämme maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit auf Glucose von 0,4 h^–1 und 0,28 h^–1 jeweils. Die hohe Glucosekonzentration und die resultierende hohe spezifische Wachstumsgeschwindigkeit der Saccharomyces-Kultur resultierte in hohen Geschwindigkeiten von aerober alkoholischer Fermentation (Tabelle 3, 12). Die spezifische Geschwindigkeit von Glucoseverbrauch war etwa 2-mal höher im Saccharomyces-Stamm verglichen mit dem Kluyveromyces-Stamm aufgrund der kräftigen alkoholischen Fermentierung. Von einem energetischen Standpunkt ist die alkoholische Fermentierung ein weniger effizienter Weg für die Zelle, um ATP zu erzeugen. Die Biomasseausbeute auf Glucose war 0,38 g/g für Kluyveromyces und 0,14 g/g für Saccharomyces uvarum. Die Ethanolausbeute auf Glucose war Null und der Kluyveromyces Stamm mit Crabtree-negativem Phänotyp und 1,83 mmol/mmol für Saccharomyces, dem Crabtree-positiven Phänotyp in Kultur.
Tabelle 3: Maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit, spezifische Geschwindigkeiten (q, mmol[g Biomasse]^–1h^–1) von Ethanolproduktion und Glucoseverbrauch, Biomasseausbeute (g/g), Produktausbeute (mmol/mmol) und Kohlenstoffgewinnung (in %; nur berechnet für anaerobe Kulturen) während exponentiellem Wachstum in Batchkulturen von Saccharomyces uvarum und Kluyveromyces marxianus auf Mineralmedium, das 2% (Gew./Vol.) Glucose enthält.
Bei anaeroben Batchkulturen war die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit und Biomasseausbeute für beide Stämme sehr gering verglichen mit jener, die unter aeroben Bedingungen gefunden wurde (Tabelle 3, 12). Für Kluyveromyces- und Saccharomyces-Stämme war die Biomasseausbeute jeweils 0,07 und 0,09 g/g. Beide Stämme arbeiten gleich gut hinsichtlich der spezifischen Geschwindigkeit von alkoholischer Fermentierung unter anaeroben Bedingungen. Dies wurde unter Verwendung von CO₂ Produktionsdaten bestätigt.
Dieses Beispiel zeigt allgemein, daß aerobe Produktion von Biomasse viel schneller ist als anaerobe und daß die Ausbeute von Biomasse unter aeroben Bedingungen höher für Crabtree-negative Organismen ist (weil in Crabtree-positiven Organismen etwas alkoholische Fermentation unter Verbrauch von Glucose stattfindet). Dieses Beispiel zeigt auch, daß das Fermentationsprodukt (Ethanol in diesem Fall) produziert wird bei derselben Geschwindigkeit für Crabtree-positive als auch -negative Organismen unter anaeroben Bedingungen. Ein aerobes Wachstumsstadium ergibt daher hohe Biomasseausbeute und ein nachfolgendes anaerobes Fermentationsstadium leitet die metabolische Energie in Produktbildung um (eher als mehr Wachstum). Ein Verfahren, in welchem die Produktion getrennt ist vom Wachstum ergibt höhere Verfahrensflexibilität insgesamt und bessere Kontrolle über die Verfahrensausbeute insgesamt.
Beispiel 18: Verbesserte Lactaterzeugung in einem Wirtsstamm, der natürlicherweise L-Milchsäure erzeugt: Amplifizierung von linearen Fragmenten homologer DNA für Genunterbrechungen von Pyruvatdecarboxylase
Die Hefe Kluyveromyces thermotolerans (K. thermotolerans) ist ein natürlicher Produzent von L-Milchsäure (Kurtzman und Fell, (1998) "The Yeasts, A Taxonomic Study". S. 240–241, Elsevier Science B. V.; Amsterdam, Niederlande). K. thermotolerans hat ein natürlich auftretendes Lactatdehydrogenasegen (LDH), welches die Produktion von L-Milchsäure erlaubt. Die produzierte Milchsäuremenge unter anaeroben Bedingungen ist annähernd 4% g/g von verwendeter Glucose, während der Rest der Glucose im Wesentlichen umgewandelt wird in Ethanol (42,5% g/g verbrauchter Glucose), Glycerin (3% g/g verbrauchter Glucose) und Acetat (0,3% g/g verbrauchter Glucose).
Tabelle 4. Ergebnisse anerober Fermentation unter Verwendung von K. thermotolerans, startend mit 100 g/l Glucose in YPAD Medium (reiches Medium).
Ein 600 bp Bereich des PDC1 wurde isoliert aus K. thermotolerans unter Verwendung von Konsensusprimern, die konstruiert sind aus einer Sequenz, die abgeleitet ist durch Vergleich der PDC1-Gensequenz von K. marxianus und K. lactis. Das PDC1-Fragment wurde dann sequenziert (Sanger) und verwendet, um ein 7,5 kbp-Fragment zu isolieren, das das K. thermotolerans PDC1 umgibt (6e) unter Verwendung von PCR und Genomwanderungstechniken (Clonetech). Das 7,5 kbp-Fragment wurde dann kloniert in pCRII TA Klonierungsvektor (Invitrogen). Ein Anteil von annähernd 730 bp nahe der Mitte des Codierungsbereichs von PDC1 wurde entfernt aus dem K. thermotolerans 7,5 kbp-Fragment. Der Anteil von K. thermotolerans PDC1, der durch Restriktionsverdau (Sambrook) entfernt ist, enthielt die folgende Sequenz:
Ein Gen, das Kanamycinresistenz codiert, einschließlich seines Promotors wurde dann isoliert aus pPIC9K Vektor (Invitrogen) durch Restriktionsverdau (Sambrook) und kloniert in die Stelle in die 7,5 kbp, von der das 730 bp-Fragment entfernt wurde. Die Sequenz des Kanamycinresistenzgens und eines Promotors aus pPIC9K (Invitrogen) war wie folgt:

Das resultierende Konstrukt umfaßt das Kanamycinresistenzgen (G418), umgeben von annähernd 6,8 kbp der PDC Region wie gezeigt in 6f.
Das in 6f abgebildete Konstrukt wird verdaut mit zwei Restriktionsenzymen (Sambrook), um annähernd 3 Mikrogramm DNA Fragment zu ergeben, das den homologen PDC-Bereich enthält und das in die mittlere Sequenz einfügte Kanamycinresistenzgen. K. thermotolerans wird transformiert mit dem Fragment unter Verwendung bekannter Transformierungstechniken wie Elektroporation, um das PDC von K. thermotolerans zu unterbrechen. Das Verfahren zur Elektroporation ist wie folgt: a) Kulturwachstum in YPAD über Nacht (~15 h) in einem Volumen von 20 ml; b) Überführung von 500 μl Kultur in ein Zentrifugenrohr, Abzentrifugieren @ 4K, 4 Minuten, Verwerfen des Überstands, c) Waschen mit 1 ml kaltem EB (EB = Elektroporationspuffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 270 mM Sucrose; 1 mM MgCl₂); d) Resuspendieren in 1 ml IB (IB = Inkubationspuffer: YPD; 25 mM DTT; 20 mM Hepes, pH 8,0); e) Schütteln @ 800 UpM, 30°C für 30 Minuten in einem Eppendorf Thermomixer; f) Herunterzentrifugieren, einmal Waschen mit EB, Resuspendieren in 400 μl EB; g) Füge drei Mikrogramm Fragment DNA hinzu (in Wasser 10 mM Tris-Cl, pH 8,5), Inkubieren auf Eis für 30 Minuten; h) Überführen in eine 0,4 cm Elektroporationsküvette. Bio-Rad Gen Pulser Einstellungen: 1000 V, 1000 Ω, 50 μF. Die Zeitkonstante nach dem Puls: ~20 msek; i) Überführung in 3 ml Morton-Closure-Röhrchen, Inkubieren ohne Schütteln bei 30°C für 1 Stunde; j) Zugeben von 400 μl flüssigem YPAD Medium (YPAD: 10 g Hefeextrakt; 20 g Pepton; 20 g Glucose; 100 mg Adeninhemisulfat. Volumen = 1 L. Keine pH Einstellung), Schütteln @ 800 UpM, 30°C für 1 Stunde im Eppendorf Thermomixer; k) Zugeben 400 μl flüssigen YPAD und Gewinnen über 4–6 Stunden; l) Herunterzentrifugieren in einem Mikrozentrifugenrohr @ 4K, 4 Minuten, Verwerfen des Überstands, Resuspendieren in 400 μl 1 M Sorbitol und Ausplattieren auf 100 μg/ml G418 selektive Platten; und m) Inkubieren bei 30°C für drei bis fünf Tage.
Kolonien werden gescreent zuerst durch eine zweite Fleckung auf einer Kulturschale, die 200 μg/ml G418 enthält. Die genomische DNA wird isoliert aus dem sekundären Hefefleck unter Verwendung von Standardgenompräparationen (Sambrook). Das isolierte Genom wird dann gescreent über PCR auf 1) die Anwesenheit von Kanamycinfragment unter Verwendung geeigneter Primer und Bedingungen (Sambrook); und 2) in Abwesenheit des unterbrochenen PDC-Bereichs unter Verwendung geeigneter Primer und PCR Bedingungen. Kolonien, die positiv sind für den Selektionsmarker und negativ für den PDC-Unterbrechungsbereich werden dann angezogen zur weiteren Untersuchung, zum Beispiel wird genomische DNA von diesen Stämmen weiter durch Southern-Hybridisierungsanalyse analysiert.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Rekombinantes Plasmid pHES/pSEH
0,5 μg von Plasmid pGAD424 beschrieben von Chien et al. (Proc. Nat'l. Acad. Sci., 88 (21): 9578–9582 (1991)) wurde verdaut mit dem Restriktionsenzym HindIII. Das verdaute Gemisch wurde aufgetrennt durch Gelelektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel unter Verwendung von TBE-Puffer. Ein 5,9 kbp-Fragment wurde dann gereinigt aus dem Gel wie beschrieben in Sambrook et a., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Gold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Ein komplementäres Paar von 92 bp synthetischen Oligomeren mit mehrfachen Restriktionsenzymerkennungsstellen wurde entworfen.
Das erste wurde fw hes oligo genannt und hatte die folgende Sequenz:

Das zweite wurde comp hes oligo genannt und hatte die folgende Sequenz:
500 nmol der zwei komplementären Oligomere wurden angelagert aneinander durch Kochen für zehn Minuten und graduelles Kühlen auf Raumtemperatur. Die doppelsträngige 92 bp DNA wurde verdaut mit HindIII und ligiert an das HindIII verdaute 5,9 kbp pGAD424. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E.coli DH10B (electroxmax cells, Life Technologies, Rockville, MD) durch Elektroporation zu transformieren, wie beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Rekombinantes E.coli wurde ausplattiert auf Luria-Bertani-Wachstumsmediumsplatten und Zellen, die Plasmid enthalten, wurden selektiert unter Verwendung von 100 μg/ml des Antibiotikums Ampicillin. Die Plasmid-DNA von ampicillinresistenten E.coli-Klonen wurde gescreent, um die beiden Plasmide pHES und pSEH zu erhalten (1 und 2). Die beiden Plasmiden unterscheiden sich in der Orientierung des synthetischen Oligomers bezüglich des Alkoholdehydrogenase-ADH1-Promotors auf dem Vektor.
Beispiel 2 – PCR-amplifizierung von Nukleinsäure, die Lactatdehydrogenase enthält, aus Lactobacillus helveticus und Pediococcus acidilactici
Genomische DNA wurde isoliert aus Übernachtkulturen von Lactobacillus helveticus (ATCC 10797) und Pediococcus acidilactici (ATCC 25741) unter Verwendung des PUREGENE^®-Kits zur Isolierung genomischer DNA (Gentra systems, Minneapolis, MN). PCR Primer wurden entworfen, um Lactatdehydrogenase-codierende Nukleinsäure aus genomischer DNA von L. helveticus (Ih-ldh Oligos) und P. acidilactici (pa-ldh Oligos) zu isolieren. Die Primer wurden entworfen basierend auf den verfügbaren Gensequenzen für Lactatdehydrogenasen in den Genbank-Datenbanken und haben die folgenden Sequenzen:
Die Primer wurden optimiert unter Verwendung von Primer Designer Software, die erhalten wurde von Sci-ed Software (Durham, NC). Ein μmol der genomischen DNA wurde verwendet zusammen mit 100 nmol Primern. Pfu DNA-Polymerase (New England Biolabs) wurde verwendet, um Lactatdehydrogenase-Nukleinsäure (LDH) zu amplifizieren wie beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor, Laboratory, Plainview, NY (1989)).
Eine ähnliche Strategie wird eingesetzt, um L-Lactatdehydrogenase-codierende Aminosäuren aus genomischer DNA von einem Mikroorganismus wie Bacillus sp. zu isolieren, zum Beispiel Bacillus megaterium (ATCC 6458) oder Rhizopus oryzae (ATCC 76275) oder jedem anderen Lactat liefernden Organismus (einschließlich Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien und mehrzellige Organismen wie Säugetiere) oder aus Gewebe von einem Lactat produzierenden Organismus. Genomische DNA wird isoliert aus einer wachsenden Kultur des Organismus unter Verwendung von dem PUREGENE^®-Kit zur Isolierung genomischer DNA (Gentra systems, Minneapolis, MN). Geeignete PCR Primer werden entworfen, um Lactatdehydrogenase-codierende Nukleinsäure basierend auf den LDH-Gensequenzen für diese aus der Genkbank verfügbaren Spezies zu isolieren. Allgemein wird ein μmol genomischer DNA verwendet zusammen mit 100 nmol der geeigneten Primer. Pfu DNA-Polymerase (New England Biolabs) oder jede andere geeignete DNA-Polymerase wird verwendet, um Lactatdehydrogenase (LDH) Nukleinsäure aus der jeweiligen genomischen DNA unter Verwendung von PCR Technologie zu amplifizieren wie zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)).
Lactatdehydrogenase-codierende Nukleinsäure wird alternativ isoliert aus Kluyveromyces theromotolerans ATCC 52709, Trichoderma Reesei ATCC 13631, Torulaspora pretoriensis ATCC36245 oder jedem anderen Lactatdehydrogenase erzeugenden Organismus unter Verwendung von einer der folgenden Methoden.

1) Eine genomische cDNA-Bibliothek von einem dieser Organismen wird kloniert in einen Standard E.coli Expressionsvektor wie pUC19 unter Verwendung von Standardtechniken (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Ein mutierter E.coli-Stamm (ldh pfl) NZN111 (Bunch et al., (1997) "The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli," Microbiology, 143: 187–95) wird transformiert mit dieser Bibliothek und die Zellen werden angezogen unter anaeroben Bedingungen in M9 Medium, das mit Casaminosäure ergänzt ist. Jedes E.coli, das unter diesen Bedingungen wächst, codiert entweder eine Lactatdehydrogenase oder eine Revertante bei ldh oder pfl. Positive (Kolonien, die unter anaeroben Wachstumsbedingungen sich bilden) werden gescreent auf LDH-Aktivität unter Verwendung eines colorimetrischen Tests einer milchsäurespezifischen Weichagarschicht (LASSO), die in der Lage ist, zwischen (L)-LDH und (D)-LDH zu differenzieren (Witte et al. (J. Basic Microbiol. 29: 707–716 (1989)). Plasmid-DNA aus Klonen, von denen vermutet wird, daß sie L-Lactatdehydrogenase exprimieren, wird dann isoliert und sequenziert.
2) K. thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 13631 und Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 sind alle Eukaryoten, die L-Milchsäure erzeugen, wenn sie unter anaeroben Bedingungen kultiviert werden (Witte et al. (J. Microbiol. 29: 707–716 (1989)). Gemäß diesem Verfahren wird daher zumindest einer dieser Stämme angezogen unter anaeroben Bedingungen, um Lactatdehydrogenaseenzymaktivität zu induzieren. Ein zellfreies Extrakt wird dann erhalten unter Verwendung von Standardmethoden und bekannten Proteinreinigungsstrategien unterzogen, um das Lactatdehydrogenaseenzym zu isolieren. Verfahren zur Reinigung von Lactatdehydrogenase sind bekannt (Kelly et al., (1978) "Affinity chromatography of bacterial lactate dehydrogenases," Biochem J, 171 (3): 543–7). Nachdem das Protein gereinigt ist, wird es partiell gespalten und sequenziert, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen. Diese Aminosäuresequenz wird dann verwendet, um degenerierte Primer zu entwerten, um das Gen zu isolieren, das Lactatdehydrogenase codiert, aus der genomischen DNA. Eine eukaryotische LDH wie eine, die isoliert ist aus K. thermotolerans of Trichoderma reseei oder Torulaspora pretoriensis kann besser funktionieren (hinsichtlich Transkriptionseffizienz, Translationseffizienz und/oder Proteinaktivität) in der Hefe K. marxianus, verglichen mit einer LDH aus Bakterienquellen wie Bacillus oder Lactobacillus.
3) Unter Verwendung der bekannten eukaryotischen Lactatdehydrogenasegensequenzen, die verfügbar sind aus der Genbank, werden degenerierte Primer entworfen, um das Gen für Lactatdehydrogenase aus genomischer DNA von K. thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 13631 oder Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 zu isolieren. Die konservierte NAD+ Bindungsstelle und Pyruvatbindungsstelle unter den LDH Gensequenzen wird verwendet, um degenerierte Primer zu entwerfen. Ein μmol genomischer DNA wird verwendet mit 100 nmol Primer. Pfu DNA-Polymerase (New England Biolabs) oder eine andere geeignete DNA-Polymerase wird verwendet, um die Fragmente von L+ Lactatdehydrogenase-Nukleinsäure (LDH) gemäß bekannten PCR-Verfahren zu amplifizieren, zum Beispiel jenen die beschrieben sind Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)).

Beispiel 3 – Klonierung von L. helveticus und P. acidilactici in pCRII Vektor
PCR-amplifizierte LDH-DNA Produkte wurden ligiert mit pCRII Vektoren (3 und 4), unter Verwendung des TA-Klonierungskits, erhalten von Invitrogen (Carlsbad, CA). Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E.coli DH10B zu transformieren, unter Verwendung von Verfahren, die beschrieben sind in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Die pCRII Vektoren, die mit dem Kit geliefert wurden, erlaubten schnelle Klonierung der PCR Produkte gemäß den Herstelleranweisungen. Die pCRII Vektoren mit den LDH Genen aus L. helveticus und P. acidilactici sind in 4 abgebildet.
Beispiel 4 – Rekombinantes Plasmid pLh ldh-HES/pPa ldh-HEX mit L. helveticus und P. acidilactici LDH Genen im pHES-Vektor
Die pCRII-Vektoren, die LDH Gen aus L. helveticus und P. acidilactici enthalten, wurden verdaut mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen. Der pHES-Vektor wurde ähnlich verdaut mit denselben Restriktionsendonukleasen. Ein 1 kbp Insert, das LDH aus pCRII Vektoren enthält, wurde dann ligiert in den 6,0 kbp pHES-Vektor unter Verwendung von T4 DNA Ligase wie beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E.coli DH10B zu transformieren (Elektromaxzellen, Life Technologies, Rockville, MD) und rekombinante Klone wurden auf Ampicillinresistenz selektiert. DNA, die isoliert wurde aus rekombinanten Klonen, wurde analysiert, um die pLh ldh-HES und pPa ldh-HES Vektoren zu bestätigen (5). Diese Vektoren enthalten die Gene, die LDH aus L. helveticus und P. acidilactici codieren, in dem pHES-Vektor unter der Kontrolle des Hefealkohldehydrogenasepromotors (ADH1) enthalten.
Beispiel 5 – Klonierung von Bacillus sp., Rhizopus oryzae, K. thermotolerans, Trichoderma reseei oder Torulaspora pretoriensis LDH Gen zur Expression unter Verwendung des Saccharomyces PDC1-Genpromotors
Obwohl es möglich ist, den Lactatdehydrogenasepromotor zu verwenden, der in Rhizopus oryzae, K. thermomotolerans, Trichoderma reseei oder Torulaspora pretoriensis gefunden wurde, um die Expression von einem Lactatdehydrogenasegen zu kontrollieren, das in K. marxianus kloniert ist, kann der PDC1-Promotor von Saccharomyces cerevisiae verwendet werden, um die Expression von dem isolierten Lactatdehydrogenasegen zu kontrollieren. Glykolytische Saccharomyces cerevisiae-Promotoren sind erfolgreich verwendet worden, um Gene in Kluyveromyces-Stämmen zu exprimieren. (Gellissen und Hollenberg, (1997) "Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis – a review," Gene, 190 (1): 87–97).
Demgemäß wird der PDC1-Promotor aus Saccharomyces cerevisiae erhalten durch Entwerten geeigneter Oligomerprimer unter Verwendung der Saccharomyces cerevisiae Genomsequenz, die in der Genbank verfügbar ist. Die PDC1-Gensequenz und 1 Kb Regionen, die das PDC1-Gen umgeben, werden durch PCR Technologien amplifiziert. Das resultierende 4 Kb DNA Fragment enthält sowohl den Promotor als auch Terminatoren, die PDC1-Genexpression kontrollieren. Mehrfache Restriktionsenzymstellen sind zwischen den Promotoren und den Terminatoren eingeschlossen, die PDC1-Genexpression so kontrollieren, daß eine Vielzahl von LDH Genen unter Kontrolle des PDC1-Promotors und der Terminatoren eingefügt werden kann. Das 4 Kb DNA Fragment, das in einen geeigneten Vektor eingefügt ist, wie ein pUC19, basierend auf Saccharomyces cereivisiae oder E.coli Shuttlevektor. Das LDH Gen wird dann eingefügt in einen Vektor an der Mehrfachklonierungsstelle (multiple cloning site) unter Kontrolle des Promotors und der Terminatoren, derart, daß die Lactatdehydrogenasegenexpression kontrolliert wird durch den PDC1-Promotor und Terminator. (14). Alternativ können andere glykolytische Saccharomyces Promotoren ähnlich wie solche verwendet werden, die die Expression von Saccharomyces cerevisiae Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase oder Phosphoglyceratkinasegene kontrollieren, um das klonierte LDH Gen in K. marxianus zu exprimieren.
Beispiel 6 – Amplifizierung von linearen Fragmenten von homologer DNA für Genunterbrechungen von Pyruvatdecarboxylase
Ein 82 bp Oligomerprimer (5'kmPDC1Ko) wurde so entworfen, daß er 51 bp identisch zum 5'-Ende der Pyruvatdecarboxylase (PDC) aus K. marxianus und 30 bp identisch zum 5'-Ende des ADH1 Promotors aus pHES-Vektoren enthielt. Die Sequenz von 5'kmPDC1Ko ist wie folgt:
Die Sequenz für die PDC Gene aus Hefen (K. marxianus oder Y. stipitis oder H. polymorpha) wurde erhalten aus der übermittelten Genbanksequenz. Ähnlich wurde ein 79 bp Oligomer (3'kmPDC1Ko) entworfen, so, daß 54 bp identisch waren mit dem 3'-Ende des PDC Gens und 22 bp identisch waren mit dem 3'-Ende des ADH1 Terminators. Die Sequenz von 3'kmPDC1Ko ist wie folgt:
Die Primer wurden entworfen, um ein lineares DNA Fragment aus pLhldh-HES- und pPaldh-HES-Plasmiden zu amplifizieren, so daß das Fragment das gesamte Lactatdehydrogenasegen zusammen mit dem ADH1-Promotor und -Terminator enthält (6). Das PCR-amplifizierte Produkt enthält auch Enden, die homolog zu den Sequenzen von K. marxianus PDC1, Yamadazyma stipitis PDC1 und PDC2, und Hansenula polymorpha PDC1 und PDC2 waren. Die Amplifizierungsreaktion wurde ausgeführt unter Verwendung von Pfu DNA-Polymerase (New England Biolabs; Beverly, MA). 100 ng von pLhldh-HES oder pPaldh-HES wurde verwendet bei der Reaktion zusammen mit 5 Einheiten Polymerase und 100 nmol der Oligomere. Die Reaktion wurde durchgeführt gemäß Protokollen, die beschrieben sind in Sambrook et al., (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Die 6 bildet das endgültige lineare Produkt mit den beschriebenen Homologien ab.
Andere Konstrukte wurden hergestellt, um die Wahrscheinlichkeiten des Erhalts eines pdc negativen Stammes von K. marxianus zu erhalten. Um diese Konstrukte herzustellen, wurde das 5,5 kbp-Fragment konstruiert, das das K. marxianus 1,7 kbp PDC1-Gen umgibt (6b) unter Verwendung von PCR und Genomwanderungstechniken (Clonetech). Das 5,5 kbp-Fragment wurde kloniert in pCRII TA Klonierungsvektor (Invitrogen) unter Verwendung von Standardverfahren. Ein Teil von annähernd 370 bp nahe der Mitte der 1,7 kbp Codierungsregion von PDC1 wurde entfernt aus dem K. marxianus 5,5 kbp-Fragment durch Restriktionsverdaus (Sambrook). Das entfernte Fragment hat die folgende Sequenz:
Ein Kanamycinresistenzgen und sein Promotor wurde dann isoliert aus einem pPIC9K Vektor (Invitrogen) unter Verwendung von Standardrestriktionstechnologien (siehe Sambrook et al.) und kloniert in dem Ort in den 5,5 kbp, aus welchem das oben identifizierte Fragment entfernt wurde. Das pPIC9K-(Invitrogen)-Kanamycinresistenzgen und sein Promotor wurde so eingefügt, daß die Sequenz des eingefügten Bereichs wie folgt ist:
Das resultierende Konstrukt enthält G418 Resistenzgen, umgeben von etwa 5 kbp und der PDC-Bereich ist in 6c gezeigt. Ein ähnliches DNA Konstrukt wurde angefertigt, welches das interne G418 Gen umgeben von 2,3 kbp von K. marxianus PDC1 in dem PCRII Vektor enthält, wie in 6d gezeigt.
Beispiel 7 – Verwendung von linearem DNA Fragment, um die endogene PDC-Codierungssequenz zu unterbrechen und eine LDH-codierende Sequenz gleichzeitig einzufügen
Das lineare durch PCR erzeugte DNA Fragment, das in Beispiel 5 beschrieben ist, wird verwendet, um K. marxianus, Yamadazyma stipitis oder Hansenula polymorpha zu transformieren. Das Protokoll, das zur Transformation verwendet wird, ist wie beschrieben von Wesolowski-Louvel et al. (Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, Hrsg., Klaus Wolf, Springer Verlag, Berlin, S. 138–201 (1996)). Kurz gesagt wird 5 ml einer Übernachtkultur abzentrifugiert und gewaschen mit Elektroporationspuffer (10 nM Tris-HCl, 270 nM Sucrose, 1 nM MgCl₂, pH 7,5). Die gewaschenen Zellen wurden dann inkubiert für 30 Minuten bei 30°C in Inkubationspuffer (Hefeextrakt 5 g/l, Peptonwachstumsmedium 10 g/l, Glucose 10 g/l, 25 nM DTT, 20 nM HEPES, pH 8,0). Am Ende dieses Zeitraums werden Zellen erneut gewaschen und resuspendiert in 400 μl Inkubationspuffer. 200 ng DNA wird zu diesen Zellen zugegeben und die Zellen werden gepulst unter Verwendung des Biod-Rad Gen Pulser bei 1800 Volt, 1000 Ω und 25 μF in einer 0,4 cm Küvette.
Die Zellen werden platziert auf regulären YPD-Platten (Hefeextrakt 10 g/l, Peptonwachstumsmedium 20 g/l, Glucose 20 g/l, Agar 15%) und Kolonien ließ man über 72 Stunden regenerieren. Jede der Platten mit Kolonien wird replikaplattiert auf frischen YPD-Platten und inkubiert für 48 Stunden. Die Kolonien wurden dann überlegt mit 6,5% Weichagar (0,5% Agar in 300 mM Tris-HCl, 187 mM Glutamat, pH 8,3). Ein Färbungsgemisch (3,2 ml von 1% Agar, 1,6 ml von 120 mM Tris, 75 mM Glutamat, pH 8,3, 0,4 ml von 2 mg/ml Phenazinmethosulfat, 7 Einheiten von Glutamatpyruvattransaminase und 7 Einheiten von L(+)- Schweinemuskellactatdehydrogenase) werden zugegeben zu den überlegten Platten. Hefestämme mit hohem L(+) bilden blaue Flecken innerhalb 10–120 Minuten. Dieses Verfahren ist ähnlich zu dem Verfahren, das vorgeschlagen wurde durch Subden et al. (Canadian J. Microbiol., 28: 883–886 (1982)) und modifiziert durch Witte et al. (J. Basic Microbiol. 29: 707–716 (1989)). Die Kolonien werden selektiert und die aus den Kolonien isolierte DNA wird getestet durch PCR-Analyse und sequenziert, um das unterbrochene Pyruvatdecarboxylasegen zu detektieren.
In einer anderen Ausführung werden die im obigen Beispiel 6 und in 6c und 6d abgebildeten Klone verdaut mit zwei Restriktionsenzymen (siehe Sambrook et al.), um annähernd 3 Mikrogramm DNA Fragment zu ergeben, das die homologe PDC Region enthält, welche die mittlere Sequenz einschließt, die in ein Kanamycinresistenzgen eingefügt ist. K. marxianus wird transformiert mit dem Fragment unter Verwendung von bekannten Techniken wie Elektroporation, um pdc von K. marxianus zu unterbrechen.
Die Elektroporation wird allgemein wie folgt ausgeführt: a) Wachsen einer Kultur des Mikroorganismus in YPAD über Nacht (~15 Std.) in einem Volumen von 20 ml; b) Überführung von 500 μl aus der Kultur in eine Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren @ 4K, 4 Minuten, verwerfen des Überstands, c) Waschen des Pellets mit 1 ml kaltem EB (EB = Elektroporationspuffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 270 mM Sucrose; 1 mM MgCl₂); d) Resuspendieren in 1 ml IB (IB = Inkubationspuffer: YPD; 25 mM DTT; 20 mM Hepes, pH 8,0); e) Schütteln @ 800 Upm, 30°C für 30 Minuten in einem Eppendorf Thermomixer; f) Herunterzentrifugieren, einmal Waschen mit EB, Resuspendieren in 400 μl EB; g) Zugeben von drei Mikrogramm Fragment-DNA (in Wasser 10 mM Tris-Cl, pH 8,5), Inkubieren auf Eis für 30 Minuten; h) Überführen in eine 0,4 cm Elektroporationsküvette. Bio-Rad Gen Pulser Einstellungen: 1000 V, 1000 Ω, 50 μF. Die Zeitkonstante nach dem Puls: ~20 msek; i) Überführen in ein 3 ml Morton-Closure-Röhrchen, Inkubieren ohne Schütteln bei 30°C für 1 Stunde. Zugeben von 400 μl flüssigem YPAD Medium (YPAD: 10 g Hefeextrakt; 20 g Pepton; 20 g Glucose; 100 mg Adeninhemisulfat. Volumen = 1 L. Keine pH Einstellung), Schütteln @ 800 Upm, 30°C für 1 Stunde im Eppendorf Thermomixer. Zugeben 400 μl flüssiges YPAD und Gewinnen über 4–6 Stunden; j) Herunterzentrifugieren in einem Mikrozentrifugenrohr @ 4K, 4 Minuten, Verwerfen des Überstands, Resuspendieren in 400 μl 1 M Sorbitol; k) Ausplattieren auf 200 μg/ml G418 selektiven Platten; und l) Inkubieren bei 30°C für drei bis fünf Tage.
Die Kolonien werden zuerst durch ein zweites Beflecken auf 300 μg/ml G418 gescreent. Die genomische DNA wird isoliert aus den sekundären Hefeflecken durch Standard genomische Präparationen (Sambrook). Diese werden dann gescreent über PCR auf 1) die Anwesenheit von dem Kanamycinfragment unter Verwendung geeigneter Primer und Bedingungen (Sambrook) und 2) die Abwesenheit der unterbrochenen pdc-Region unter Verwendung geeigneter Primer und PCR Bedingungen. Kolonien, die für den Selektionsmarker positiv waren und negativ für den pdc-Unterbrechungsbereich, wurden angezogen und durch HPLC auf die Physiologie analysiert. Genomische DNA von solchen Stämmen wurde weiter durch Southern-Hybridisierungsanalysen analysiert.
Beispiel 8 – Wachstumscharakteristika von Zellen
1. Niedriger pH/Hohe Temperatur
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft auf 50 ml Hefeminimalmedium gemäß Kiers et al. (Yeast, 14 (5): 459–469 (1998)). 100 g/l Glucose wurden als Kohlenstoffquelle verwendet. Die Übernachtkulturen wurden gehalten bei 40°C und angeimpft in Medium, das auch bei 40°C gehalten wurde. Die Zugabe der Animpfung änderte den pH des Mediums von 5,5 auf 2,5. Bei diesem Experiment blieb der pH 2,5. Die Glucosekonzentration wurde gemessen über YSI-Membran und die optische Dichte (OD) wurde gemessen unter Verwendung eines Spektrophotometers.
Glucose wurde in 72 Stunden verwendet, was anzeigt, daß die metabolische Aktivität unter niedrigem pH und hohen Temperaturkulturbedingungen in dem Zeitraum (7) auftritt. Die Zugabe von Biomasse verminderte sich gering über den 48 bis 72 Stunden Zeitraum, was anzeigt, daß Zellkatalbolismus den Anabolismus ausbremst (7).
2. Pentosekohlenstoffquellen
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft in drei 50 ml Kolben, die Hefeminimalmedium enthalten, gemäß Kiers et al. (Yeast, 14 (5): 459–469 (1998)). Jeder der drei Kolben enthielt eine unterschiedliche Kohlenstoffquelle. Die erste enthielt 10 Prozent Glucose, die zweite enthielt 10 Prozent D-Xylose und die dritte enthielt 10 Prozent L-Arabinose. Die Kolben wurden inkubiert bei 30°C und OD-Messungen wurden periodisch durchgeführt.
Nach 40 Stunden war die Biomasseausbeute für Hefe, die kultiviert war mit Glucose oder Xylose, ähnlich während die Biomasseausbeute für Hefe, die kultiviert war mit Arabinose, geringer war (8). Vergleichen des Wachstumsmediums von Hefe, die kultiviert ist mit Glucose, mit jener, die kultiviert ist mit Xylose oder Arabinose, zeigte eine anfängliche Latenzzeit beim Wachstum. Die Hefe, die mit Arabinose kultiviert ist, zeigte eine Latenzzeit von wenigen Stunden, während die Latenzzeit für Hefe, die mit Xylose kultiviert ist, ausgeprägter war (8). Die Gegenwart dieser Latenzzeit zeigt an, daß die Hefezellen Zeit brauchen, um sich an Xylose- und Arabinosekohlenstoffquellen anzupassen. Vermutlich wird diese Zeit benötigt, um die Synthese von normalerweise nicht exprimierten Polypeptiden zu induzieren.
3. Maisstärkefaserhydrolysat bei niedrigem pH
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft in Kolben, die Hefeminimalmedium enthalten, nach Kiers et al. (Yeast, 14 (5): 459–469 (1998)). Jeder Kolben enthielt 30% Kornfaserhydrolysat als Kohlenstoffquelle. Kurz gesagt wurde das Maisstärkefaserhydrolysat gefertigt durch Reagieren von Maisstärkefaser mit 1,2% Schwefelsäure bei 145°C für 25 Minuten. Bei der Reaktion wurde Hemizellulose in die monomeren Produkte Arabinose, Xylose und Glucose zerlegt. Wegen der hohen Temperatur bei der Reaktion degradierte etwas Arabinose und Xylose in Furfural während etwas Glucose in Hydroxymethylfurfural degradierte. HPLC-Analyse des Hydrolysats zeigte die Gegenwart vom 38,7 Gramm/l Glucose, 39,1 Gramm/l Xylose, 20, Gramm/l Arabinose und 1,6 Gramm/l Furfural. Das Hydrolysat hatte zusätzlich einen pH von 1,51. Vorm Kultivieren der Hefe wurde der pH des Maisstärkefaserhydrolysats eingestellt auf 3,0. Bei dem Kultivierungsexperiment wurden OD-Messungen periodisch vorgenommen.
Die Hefezellen waren in der Lage, Biomasse zu generieren, wenn sie mit Maisstärkefaserhydrolysat kultiviert wurden (9).
4. Verschiedene pH-Bedingungen
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft in vier Kolben, die 50 ml Hefe-YPD-Medium (Hefeextrakt 10 g/l, Peptonwachstumsmedium 20 g/l, Glucose 20 g/l) enthalten. Jeder Kolben hatte einen unterschiedlichen pH, welcher unter Verwendung von HCl eingestellt wurde. Bei dem Kultivierungsexperiment wurde die Temperatur auf 30°C gehalten und OD-Messungen wurden periodisch vorgenommen. Das Wachstum wurde beobachtet in jedem Kolben (10).
5. Verschiedene pH-Bedingungen/Milchsäure
Übernachtkulturen von K. marxianus wurden angeimpft in vier Kolben, die 50 ml Hefe YPD-Medium (Hefeextrakt 10 g/l, Peptonwachstumsmedium 20 g/l, Glucose 20 g/l) sowie 40 g/l Milchsäure enthielten. Die Zugabe der Milchsäure führte zu einem pH von 2,8. Der pH in drei Kolben wurde dann auf den angezeigten pH unter Verwendung von NaOH eingestellt. Bei dem Kultivierungsexperiment wurde die Temperatur bei 30°C gehalten und OD-Messungen wurden periodisch vorgenommen. Das Wachstum wurde in jedem Kolben beobachtet (11).
Beispiel 9 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, Acrylyl-CoA zu erzeugen
Ein Organismus, der in der Lage ist, Acrylat als Kohlenstoffquelle zu verwenden (z.B. E.coli) wurde transformiert mit einer genomischen Clostridium propionicum DNA-Bibliothek. Die genomische C. propionicum DNA-Bibliothek wurde erzeugt unter Verwendung des pHES Plasmids, so daß sie 10 kbp-Fragmente des C. propionicum Genoms erzeugt. Die transformierten E.coli wurden plattiert auf einem Auswahlmedium mit lediglich Acrylsäure als Kohlenstoffquelle. Nur solche Zellen, die das Vermögen hatten, Acrylat zu assimilieren, werden wachsen. Acrylat wird normalerweise assimiliert durch seine enyzmvermittelte Umwandlung in Lactat. Im Gegenzug kann Lactat umgewandelt werden in Pyruvat und verwendet werden durch Zellen über den Krebszyklus.
Wenn ein transformiertes E.coli einmal ausgewählt ist, wird das DNA Plasmid von genomischen Bibliothek isoliert und das eingesetzte Fragment sequenziert. Wenn es einmal sequenziert ist, wird das Fragment auf offene Leseraster abgesucht, um die codierende Sequenz für Enzyme zu bestimmen, die in der Umwandlung zwischen Lactat und Acrylat beteiligt sind (z.B. Lactoyl-CoA-Dehydrogenase und CoA-Transferasen).
Die isolierten Klone, die die codierende Sequenz für diese Enzyme enthalten, werden in die Hefezellen eingeführt, die in Beispiel 6 beschrieben sind, welche Lactatdehydrogenase enthalten und welchen Pyruvatdecarboxylaseaktivität fehlt. Die Selektion von rekombinanten Hefezellen, die die eingeführte Nukleinsäure enthalten, wird ausgeführt unter Verwendung von G418 (300 g/l). Einmal isoliert, werden die rekombinanten Hefezellen aerob auf Glucose angezogen und dann umgeschaltet auf anaeroben Bedingungen. Das Wachstumsmedium wird dann geerntet und auf Acrylat getestet unter Verwendung von Standard HPLC-Verfahren wie beschrieben von Danner et al. (Biotechnological production of acrylic acid from biomass, In: Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 70–72 (1998)).
Beispiel 10 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, Ascorbat herzustellen
Die Expressionsvektoren wurden so konstruiert, daß die folgenden Polypeptide exprimiert werden: 2,5-Dioxovaleratdehydrogenase, 5-Dehydro-4-Desoxy-D-Glucaratdehydratase, Glucaratdehydratase, Aldehyddehydratase, Glucuronolactonreduktase und L-Gluonolactonoxidase. Die Nukleinsäuresequenz, die die Polypeptide codiert, wird isoliert aus verschiedenen Mikroorganismen. Einmal konstruiert werden die Expressionsvektoren transformiert in Hefezellen durch Elektroporation. Einmal transformiert werden die Hefezellen analysiert, um zu bestimmen, ob sie L-Ascorbat erzeugen.
Beispiel 11 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, D-Xylose zu erzeugen
Expressionsvektoren werden so konstruiert, daß die folgenden Polypeptide exprimiert werden: 2-Dehydro-3-Desoxy-D-Pentanoataldolase, Xylonatdehydratase, Xylonolactonase und D-Xylosedehydrogenase. Die Nukleinsäuresequenzen, die diese Polypeptide codieren, werden isoliert aus Pseudomonas sp. Einmal konstruiert werden die Expressionsvektoren transformiert in Hefezellen durch Elektroporation. Einmal transformiert werden die Hefezellen analysiert, um zu bestimmen, ob sie D-Xylose oder andere Pentosekohlenstoffverbindungen erzeugen.
Beispiel 12 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, Zitrat zu erzeugen
PCR Primer werden entworfen basierend auf der S. cerevisiae Aconitasenukleinsäuresequenz (ACO1, Genbank-Zugangsnummer M33131). Diese Primer werden verwendet, um Aconitase zu klonieren, die eine Nukleinsäure codiert aus einer Spezies von Kluyveromyces, Yamadazyma oder Hansenula. Einmal sequenziert werden die linearen Konstrukte gemacht wie in Beispiel 5 beschrieben und verwendet, um Aconitase-codierende Nukleinsäure in Hefezellen zu codieren. Der Selektionsmarker, der verwendet wird, ist antibiotisches G418 anstelle von Lactatproduktion wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Nukleinsäure, die Resistenz gegen das Antibiotikum G418 liefert, ist das Neomycin-/Kanamycingen. Dieses Gen, erhalten aus dem pPIC9K Vektor (InVitrogen) wird eingefügt in den pHES-Vektor. Hefezellen werden transformiert mit PCR-erzeugten linearen Fragmenten, die konstruiert werden, um zu dem oben beschriebenen ACO1 homologe Enden zu haben. Das lineare Fragment wird entworfen, um das G418 Resistenzgen zu codieren. Nur Zellen, die das lineare Fragment in den Ort von Aconitase-codierender Nukleinsäure integriert haben, sind gegen Antibiotika resistent. Solche Zellen werden analysiert für die geeignete Integration unter Verwendung von PCR. Die Hefezellen, die erhalten werden durch dieses Verfahren haben einen partiell funktionellen TCA-Zyklus und können daher Zitrat überproduzieren. Das Zitrat wird transportiert über die Mitochondrienmembran und in das Wachstumsmedium. Zusätzlich werden diese Hefezellen versetzt mit einem exogenen Nukleinsäuremolekül, das ein Enzym codiert wie ATP-Zitratlyase, so daß es die Umwandlung angesammelten Zitrats in Oxaloacetat katalysieren kann (siehe Beispiel 13).
Beispiel 13 – Rekombinante Zellen, die in der Lage sind, Zitratlyase im Cytosol zu exprimieren
Eine Crabtree-positive Hefezelle wird transformiert mit dem pHES-Plasmid, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid codiert, das ATP-Zitratlyaseaktivität hat. Die Nukleinsäure wird isoliert aus E.coli, Klebsiella pneumoniae (Genbank-Zugangsnummer X79817) oder anderen veröffentlichten Quellen. Einmal transformiert werden die Hefezellen analysiert, um zu bestimmen, ob sie Zucker verwenden können, um große Mengen von Lipidansammlung zu erzeugen oder nicht. Zusätzlich werden die Hefezellen analysiert, um zu bestimmen, ob sie ATP-Zitratlyaseaktivität zeigen wie beschrieben durch Holdsworth et al. (J. Gen. Microbiol., 134: 2907–2915 (1998)). Die Hefezellen haben ATP-Zitratlyaseaktivität und sind der Lage, zytosolisches Acetat und aeroben Bedingungen über einen anderen Weg als den Abbau von Aldehyd zu Acetat über Aldehyddehydrogenase bereitzustellen. Wenn einer solchen Hefe zusätzlich Pyruvatdecarboxylase- oder Aldehyddehydrogenaseaktivität fehlt, sollte sie in der Lage sein, Acetat für Biosynthesen über den Krebszyklus bereitzustellen.
Beispiel 14 – Rekombinante Zellen, die nicht in der Lage sind, Lactat als Kohlenstoffquelle zu verwenden
Hefezellen werden so konstruiert, daß die Aktivität eines Carboxylsäuretransporters ähnlich zum S. cerevisiae JEN1-Polypeptid vermindert ist. Solche Hefezellen werden eine verminderte Fähigkeit haben, Lactat zu transportieren und daher Lactat weniger effizient verwerten. Die Aktivität des Carboxylsäuretransporters in Hefezellen ist vermindert durch Unterbrechen des Ortes, der die Codierungssequenz dieses Polypeptids enthält. Das Homologe des JEN1-Polypeptids wird zuerst isoliert aus einer Wirtszelle unter Verwendung von degenerierten Primern, die basierend auf der verfügbaren Sequenz für JEN1 geplant sind (Genbank-Zugangsnummer U24155). Wenn die Nukleinsäure einmal aus der Wirtszelle isoliert ist, wird sie sequenziert. Die Unterbrechung der Codierungssequenz für dieses Polypeptid wird gemacht unter Verwendung von Verfahren, die in Beispiel 11 beschrieben sind. Lineare Fragmente werden erzeugt, die homologe Bereiche der JEN1-Sequenz codieren sowie das gesamte G418 Resistenzgen. Dieses lineare Fragment wird integriert in die genomische JEN1-Sequenz unter Hervorrufen einer Unterbrechung der Aktivität.
Zellen, denen Carboxylsäuretransporteraktivität fehlt, werden identifiziert durch deren Unfähigkeit, Carboxylsäure zu transportieren und daher deren Unfähigkeit, zu wachsen, wenn sie auf Lactat kultiviert werden.
Zusätzlich werden Zellen so modifiziert, daß die Aktivität eines funktionellen Äquivalents von S. cerevisiae Cytochrom b2-Polypeptid vermindert ist. Das Cytochrom b2-Polypeptid versetzt S. cerevisiae Zellen in die Lage, Lactat in den Mitochondrien zu metabolisieren. Degenerierte Primer werden zuerst geplant aus der Saccharomyces Cytochrom b2-Sequenz (Genbank-Zugangsnummer Z46729). Einmal isoliert wird der Klon sequenziert. Die Unterbrechung des Hefewirtshomologen von Cytochrom b2 wird gemacht unter Verwendung von Methoden, die in beschrieben sind Methods in Yeast Genetics (Hrsg., Alison et al., Cold Spring Harbor Press (1997)). Diese rekombinante Hefezelle wird nicht in der Lage sein, Lactat als Kohlenstoffquelle zu verwenden.
Beispiel 15 – Lactatproduktion in großem Maßstab
Mehrere Varianten von K. marxianus Zellen mit verminderter PDC-Aktivität werden erzeugt und isoliert. Jede Variante wird konstruiert, um eine unterschiedliche Anzahl von Kopien von exogenem Nukleinsäuremolekül zu enthalten, das ein Polypeptid mit LDH-Aktivität codiert. Das LDH-Polypeptid kommt von mehreren verschiedenen Quellen. Solche varianten Zellen können eine spezifische Produktivität für Milchsäure bei 40°C haben.
Jede Variante wird angezogen in einem Gefäß unter aeroben Bedingungen mit einem Luftstrom von 1,5 VVM und einem gelösten Sauerstoffgehalt von 30%, um eine Zelldichte von etwa 60 g/l auf Trockenbasis zu erreichen. Wenn die Dichte einmal ausreichend ist, wird der Luftstrom abgeschaltet und die Bedingungen in dem Gefäß werden zu anaeroben Bedingungen umgeschaltet. Keine Basis wird zugefügt. Die Varianten mit der höchsten spezifischen Produktivität bei der anaeroben Phase können nicht nur als schneller Milchsäure produzierend herausgefunden werden sondern auch als eine höhere Konzentration bei niedrigerem pH erzielend als die Varianten mit niedriger spezifischer Produktivität. Die Produktausbeute auf Glucose bei der Herstellungsphase kann 90% überschreiten.
Bestimmte Varianten werden ausgewählt und denselben Kultivierungsverfahren unterzogen, außer, daß der Luftstrom vermindert wird auf 0,1 VVM, eher als daß er komplett abgeschaltet wird. Unter solchen Bedingungen kann der endgültige pH in dem Gefäß niedriger sein und die Lactatkonzentration kann höher sein als unter Bedingungen ohne Luftstrom. Die Produktausbeute auf Glucose kann vermindert sein, aber kann bei etwa 90% verbleiben. Wenn der Test wiederholt wird, aber mit einem Luftstrom von 0,5 VVM, kann das Produkt, das auf Glucose gewonnen wird, auf weniger als 80% vermindert werden.
Beispiel 16 – Produktion von Lactat in großem Maßstab unter Verwendung von Reihen von stufenweisen Fermentationen
Eine Kultur von K. marxianus, der PDC-Aktivität fehlt und mit LDH-Aktivität wird verwendet als Animpfung einer Reihe von Batchfermentationen. Jede Fermentation wird in fortschreitend größeren Gefäßen ausgeführt, wobei jedes davon unmittelbar vor Verwendung sterilisiert wird. Jedes Gefäß wird zusätzlich mit einem Luftstrom von 1,5 VVM versehen und ausreichendem Rühren, um einen gelösten Sauerstoffgehalt oberhalb 10% aufrecht zu erhalten. Das endgültige Gefäß hat ein Volumen von 6.000 l. Die Gefäße werden bei einer Temperatur von 45°C gehalten, um das Überleben der genetisch modifizierten K. marxianus Zellen gegenüber Wildtyphefe und anderen Mikroorganismen zu verstärken. Jedes Gefäß wird gefüllt mit Standardkulturmedium für optimales Wachstum.
Die Gehalte des endgültigen Gefäßes mit einer Zelldichte von 100 Gramm Zellen/l auf Trockenbasis werden überführt zu einem kurz zuvor dampfbehandelten Herstellungsgefäß mit einem Volumen von 300.000 l. Zusätzliche Zellen, die aus der Filtration eines vorhergehenden Herstellungsvorgangs erhalten sind, werden optional zugegeben. Die Zelldichte des Herstellungsgefäßes ist 6 Gramm Zellen/l auf Trockenbasis. Glucose wird zu einem Gehalt von 80 g/l zugegeben. Die Bedingungen in dem Gefäß sind anaerob, wobei die Temperatur 42°C für einen Zeitraum von 25 Stunden ist. Die spezifische Produktivität ist größer als 0,5 Gramm Lactat/(Gramm Biomasse·Stunde) bis nahe dem Ende des Vorgangs, zu welchem Zeitpunkt die Produktivität beginnt abzufallen. Wenn die Produktivität einmal beginnt abzufallen, werden die Zellen entfernt und zur Wiederverwendung aufbewahrt. Die endgültige Lactatkonzentration kann 75 g/l sein, wobei der pH 2,8 ist. Nach Biomasseentfernung wird die Lösung konzentriert durch Eindampfen auf eine Konzentration von 50% Lactat. Die freie Säure (etwa 86% des Gesamtlactats) wird extrahiert durch Flüssigextraktion in organischer Phase und rückextrahiert bei einer höheren Temperatur in Wasser. Das Raffinat, das das Lactatsalz enthält, wird entweder gereinigt und rezykliert als Puffer in das Wachstumsgefäß oder mit zum Beispiel Schwefelsäure angesäuert und gereinigt.
Beispiel 17 – Vergleich von aerober Produktion von einem Crabtree-negativen (K. marxianus) und einem Crabtree-positiven (S. uvarum) Organismus
Ein Crabtree-negativer (K. marxianus) und ein Crabtree-positiver (S. uvarum) Organismus wurden angezogen in aeroben und anaeroben Batchfermentoren. Die stufenweise Kultivierung wurde ausgeführt bei 30°C in Laborfermentoren mit einem Arbeitsvolumen von 1,5 l. Der pH wurde bei 5,0 ± 0,1 durch automatisierte Zugabe von 2 mol·l^–1 Kaliumhydroxid (KOH) gehalten. Der Fermenter wurde mit Luft (aerobe Kulturen) oder Stickstoffgas (anaerobe Kulturen) durchpustet bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 l·Min^–1 und gerührt bei 800 UpM. Die gelöste Sauerstoffkonzentration wurde kontinuierlich überwacht mit einer Sauerstoffelektrode (Ingold, Typ 34 100 3002). Bei den aeroben Kulturen wurde die Konzentration gelösten Sauerstoffs oberhalb 60% gehalten. 10 ml Proben wurden bei geeigneten Zeitabständen zur Bestimmung des Trockengewichts und der Metabolitkonzentrationen abgezogen. Tween-80 und Ergosterol wurden zu den anaeroben Kulturen zugegeben, um die Verbindungen zuzuführen, die zur Fettsäuresynthese erforderlich sind.
Beim exponentiellen Wachstum wurden sowohl Trockengewicht und OD660 von Hefekulturen und Glucose- und Ethanolkonzentration im Überstand bei geeigneten Intervallen bestimmt. Die spezifische Ethanolproduktionsgeschwindigkeit (g_ethanol, mmol g^–1·h^–1) wurde berechnet durch die folgende Gleichung unter Verwendung einer linearen Regressionsanalyse:
dE/dt (Geschwindigkeit des Anstiegs der Ethanolkonzentration in der Kultur; mmol·l^–1·h^–1) und dC_x/dt (Geschwindigkeit des Biomassekonzentrationsanstiegs; g·l^–1·h^–1) wurden berechnet unter Verwendung von der Differenzierung von Plots von Ethanolkonzentration und Biomassekonzentration gegenüber der Zeit. μ_max (h^–1). Die maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit auf Glucose wurde eingeschätzt von dem exponentiellen Teil einer Auftragung von C_x gegenüber der Zeit. Um die spezifische Glucoseverbrauchsgeschwindigkeit zu berechnen (g_glucose, mmol·g^–1·h^–1) wurde dE ersetzt durch dG (Menge von pro Stunde verbrauchter Glucose).
Bei den aeroben Batchkulturen zeigten Kluyveromyces und Saccharomyces Stämme maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit auf Glucose von 0,4 h^–1 und 0,28 h^–1 jeweils. Die hohe Glucosekonzentration und die resultierende hohe spezifische Wachstumsgeschwindigkeit der Saccharomyces-Kultur resultierte in hohen Geschwindigkeiten von aerober alkoholischer Fermentation (Tabelle 3, 12). Die spezifische Geschwindigkeit von Glucoseverbrauch war etwa 2-mal höher im Saccharomyces-Stamm verglichen mit dem Kluyveromyces-Stamm aufgrund der kräftigen alkoholischen Fermentierung. Von einem energetischen Standpunkt ist die alkoholische Fermentierung ein weniger effizienter Weg für die Zelle, um ATP zu erzeugen. Die Biomasseausbeute auf Glucose war 0,38 g/g für Kluyveromyces und 0,14 g/g für Saccharomyces uvarum. Die Ethanolausbeute auf Glucose war Null und der Kluyveromyces Stamm mit Crabtree-negativem Phänotyp und 1,83 mmol/mmol für Saccharomyces, dem Crabtree-positiven Phänotyp in Kultur.
Tabelle 3: Maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit, spezifische Geschwindigkeiten (q, mmol[g Biomasse]^–1h^–1) von Ethanolproduktion und Glucoseverbrauch, Biomasseausbeute (g/g), Produktausbeute (mmol/mmol) und Kohlenstoffgewinnung (in %; nur berechnet für anaerobe Kulturen) während exponentiellem Wachstum in Batchkulturen von Saccharomyces uvarum und Kluyveromyces marxianus auf Mineralmedium, das 2% (Gew/Vol) Glucose enthält.
Bei anaeroben Batchkulturen war die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit und Biomasseausbeute für beide Stämme sehr gering verglichen mit jener, die unter aeroben Bedingungen gefunden wurde (Tabelle 3, 12). Für Kluyveromyces- und Saccharomyces-Stämme war die Biomasseausbeute jeweils 0,07 und 0,09 g/g. Beide Stämme arbeiten gleich gut hinsichtlich der spezifischen Geschwindigkeit von alkoholischer Fermentierung unter anaeroben Bedingungen. Dies wurde unter Verwendung von CO₂ Produktionsdaten bestätigt.
Dieses Beispiel zeigt allgemein, daß aerobe Produktion von Biomasse viel schneller ist als anaerobe und daß die Ausbeute von Biomasse unter aeroben Bedingungen höher für Crabtree-negative Organismen ist (weil in Crabtree-positiven Organismen etwas alkoholische Fermentation unter Verbrauch von Glucose stattfindet). Dieses Beispiel zeigt auch, daß das Fermentationsprodukt (Ethanol in diesem Fall) produziert wird bei derselben Geschwindigkeit für Crabtree-positive als auch -negative Organismen unter anaeroben Bedingungen. Ein aerobes Wachstumsstadium ergibt daher hohe Biomasseausbeute und ein nachfolgendes anaerobes Fermentationsstadium leitet die metabolische Energie in Produktbildung um (eher als mehr Wachstum). Ein Verfahren, in welchem die Produktion getrennt ist vom Wachstum ergibt höhere Verfahrensflexibilität insgesamt und bessere Kontrolle über die Verfahrensausbeute insgesamt.
Beispiel 18: Verbesserte Lactaterzeugung in einem Wirtsstamm, der natürlicherweise L-Milchsäure erzeugt: Amplifizierung von linearen Fragmenten homologer DNA für Genunterbrechungen von Pyruvatdecarboxylase
Die Hefe Kluyveromyces thermotolerans (K. thermotolerans) ist ein natürlicher Produzent von L-Milchsäure (Kurtzman und Fell, (1998) "The Yeasts, A Taxonomic Study". S. 240–241, Elsevier Science B. V.; Amsterdam, Niederlande). K. thermotolerans hat ein natürlich auftretendes Lactatdehydrogenasegen (LDH), welches die Produktion von L-Milchsäure erlaubt. Die produzierte Milchsäuremenge unter anaeroben Bedingungen ist annähernd 4% g/g von verwendeter Glucose, während der Rest der Glucose im Wesentlichen umgewandelt wird in Ethanol (42,5% g/g verbrauchter Glucose), Glycerin (3% g/g verbrauchter Glucose) und Acetat (0,3% g/g verbrauchter Glucose).
Tabelle 4. Ergebnisse anerober Fermentation unter Verwendung von K. thermotolerans, startend mit 100 g/l Glucose in YPAD Medium (reiches Medium).
Ein 600 bp Bereich des PDC1 wurde isoliert aus K. thermotolerans unter Verwendung von Konsensusprimern, die konstruiert sind aus einer Sequenz, die abgeleitet ist durch Vergleich der PDC1-Gensequenz von K. marxianus und K. lactis. Das PDC1-Fragment wurde dann sequenziert (Sanger) und verwendet, um ein 7,5 kbp-Fragment zu isolieren, das das K. thermotolerans PDC1 umgibt (6e) unter Verwendung von PCR und Genomwanderungstechniken (Clonetech). Das 7,5 kbp-Fragment wurde dann kloniert in pCRII TA Klonierungsvektor (Invitrogen). Ein Anteil von annähernd 730 bp nahe der Mitte des Codierungsbereichs von PDC1 wurde entfernt aus dem K. thermotolerans 7,5 kbp-Fragment. Der Anteil von K. thermotolerans PDC1, der durch Restriktionsverdau (Sambrook) entfernt ist, enthielt die folgende Sequenz:
Ein Gen, das Kanamycinresistenz codiert, einschließlich seines Promotors wurde dann isoliert aus pPIC9K Vektor (Invitrogen) durch Restriktionsverdau (Sambrook) und kloniert in die Stelle in die 7,5 kbp, von der das 730 bp-Fragment entfernt wurde. Die Sequenz des Kanamycinresistenzgens und eines Promotors aus pPIC9K (Invitrogen) war wie folgt:

Das resultierende Konstrukt umfaßt das Kanamycinresistenzgen (G418), umgeben von annähernd 6,8 kbp der PDC Region wie gezeigt in 6f.
Das in 6f abgebildete Konstrukt wird verdaut mit zwei Restriktionsenzymen (Sambrook), um annähernd 3 Mikrogramm DNA Fragment zu ergeben, das den homologen PDC-Bereich enthält und das in die mittlere Sequenz einfügte Kanamycinresistenzgen. K. thermotolerans wird transformiert mit dem Fragment unter Verwendung bekannter Transformierungstechniken wie Elektroporation, um das PDC von K. thermotolerans zu unterbrechen. Das Verfahren zur Elektroporation ist wie folgt: a) Kulturwachstum in YPAD über Nacht (~15 h) in einem Volumen von 20 ml; b) Überführung von 500 μl Kultur in ein Zentrifugenrohr,
Abzentrifugieren @ 4K, 4 Minuten, Verwerfen des Überstands, c) Waschen mit 1 ml kaltem EB (EB = Elektroporationspuffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 270 mM Sucrose; 1 mM MgCl₂); d) Resuspendieren in 1 ml IB (IB = Inkubationspuffer: YPD; 25 mM DTT; 20 mM Hepes, pH 8,0); e) Schütteln @ 800 UpM, 30°C für 30 Minuten in einem Eppendorf Thermomixer; f) Herunterzentrifugieren, einmal Waschen mit EB, Resuspendieren in 400 μl EB; g) Füge drei Mikrogramm Fragment DNA hinzu (in Wasser 10 mM Tris-Cl, pH 8,5), Inkubieren auf Eis für 30 Minuten; h) Überführen in eine 0,4 cm Elektroporationsküvette. Bio-Rad Gen Pulser Einstellungen: 1000 V, 1000 Ω, 50 μF. Die Zeitkonstante nach dem Puls: ~20 msek; i) Überführung in 3 ml Morton-Closure-Röhrchen, Inkubieren ohne Schütteln bei 30°C für 1 Stunde; j) Zugeben von 400 μl flüssigem YPAD Medium (YPAD: 10 g Hefeextrakt; 20 g Pepton; 20 g Glucose; 100 mg Adeninhemisulfat. Volumen = 1 L. Keine pH Einstellung), Schütteln @ 800 UpM, 30°C für 1 Stunde im Eppendorf Thermomixer; k) Zugeben 400 μl flüssigen YPAD und Gewinnen über 4–6 Stunden; l) Herunterzentrifugieren in einem Mikrozentrifugenrohr @ 4K, 4 Minuten, Verwerfen des Überstands, Resuspendieren in 400 μl 1 M Sorbitol und Ausplattieren auf 100 μg/ml G418 selektive Platten; und m) Inkubieren bei 30°C für drei bis fünf Tage.
Kolonien werden gescreent zuerst durch eine zweite Fleckung auf einer Kulturschale, die 200 μg/ml G418 enthält. Die genomische DNA wird isoliert aus dem sekundären Hefefleck unter Verwendung von Standardgenompräparationen (Sambrook). Das isolierte Genom wird dann gescreent über PCR auf 1) die Anwesenheit von Kanamycinfragment unter Verwendung geeigneter Primer und Bedingungen (Sambrook); und 2) in Abwesenheit des unterbrochenen PDC-Bereichs unter Verwendung geeigneter Primer und PCR Bedingungen. Kolonien, die positiv sind für den Selektionsmarker und negativ für den PDC-Unterbrechungsbereich werden dann angezogen zur weiteren Untersuchung, zum Beispiel wird genomische DNA von diesen Stämmen weiter durch Southern-Hybridisierungsanalyse analysiert.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten organischen Produkts, wobei das Verfahren umfaßt a) Bereitstellen eines Mikroorganismus, der einen Crabtree-negativen Phänotyp aufweist; b) Kultivieren des Crabtree-negativen Mikroorganismus in einem ersten Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle enthält, unter einem ersten Satz von Kulturbedingungen, welcher die Zellatmung fördert; und c) Kultivieren des Crabtree-negativen Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle enthält, unter einem zweiten Satz von Kulturbedingungen, welcher die Erzeugung des ausgewählten organischen Produkts fördert, wobei nicht mehr als 0,3 Gramm Biomasse pro Gramm verbrauchte Kohlenstoffquelle unter dem zweiten Satz von Kulturbedingungen erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Crabtree-negative Mikroorganismus genetisch verändert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das ausgewählte organische Produkt ein Pyruva-abgeleitetes Produkt umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Crabtree-negative Mikroorganismus genetisch verändert ist, so daß dieser ein exogenes Lactatdehydrogenasegen enthält und das Pyruvat-abgeleitete Produkt Lactat ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Lactatdehydrogenasegen aus der Gruppe bestehend aus boviner Lactatdehydrogenase, bakterieller Lactatdehydrogenase und pilzlicher Lactatdehydrogenase ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffquelle im ersten Kulturmedium Glucose umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffquelle im zweiten Kulturmedium Glucose umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Satz von Kulturbedingungen aerobe Bedingungen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Satz von Kulturbedingungen anaerobe Bedingungen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung eines ausgewählten Pyruvat-abgeleiteten Produkts, ferner umfassend: d) Kultivieren des Mikroorganismus unter einem dritten Satz von Kulturbedingungen, der ein Kulturmedium umfaßt, welches ein Agens beinhaltet, das die Stoffwechselenergie des Mikroorganismus erhöht.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der erste Satz von Kulturbedingungen aerobe Bedingungen und der zweite Satz von Kulturbedingungen anaerobe Bedingungen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der erste, zweite und dritte Satz von Kulturbedingungen ein Kulturmedium beinhalten, das Glucose enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Agens, das die Stoffwechselenergie des Mikroorganismus erhöht, Sauerstoff umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus eine aus der Gruppe bestehend aus Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichsporon und Yamadazyma ausgewählte Hefe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Crabtree-negative Mikroorganismus genetisch verändert ist, so daß dieser ein exogenes Lactatdehydrogenasegen enthält, das Pyruvat-abgeleitete Produkt Lactat ist, die Kohlenstoffquelle in dem ersten und dem zweiten Kulturmedium Glucose enthält, der erste Satz von Kulturbedingungen aerobe Bedingungen umfaßt und der zweite Satz von Kulturbedingungen anaerobe Bedingungen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Mikroorganismus eine Hefe der Gattung Kluyveromyces ist.
Verwendung eines genetisch veränderten Mikroorganismus, der einen Crabtree-negativen Phänotyp aufweist, in einem Verfahren zur Herstellung von Milchsäure, wobei das Verfahren eine aerobe Phase und eine anaerobe Phase umfaßt.
K. thermotolerans Hefestamm, dem die Fähigkeit zur Erzeugung von Ethanol fehlt oder der eine verringerte Fähigkeit zur Erzeugung von Ethanol in Bezug auf eine Wildtyp-Hefe desselben Stamms mit einem endogenen Lactatdehydrogenasegen aufweist.