DE60029979T2

DE60029979T2 - Liposomen-Formulierung der Verbindung 6,9-BIS-[(2-aminoethyl)benzo[g]isochinolin-5,10-dionidimaleat

Info

Publication number: DE60029979T2
Application number: DE60029979T
Authority: DE
Inventors: Carlo Bugatti
Original assignee: Cell Therapeutics Europe SRL
Current assignee: Cell Therapeutics Europe SRL
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-19
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2020-10-20
Also published as: US20060078607A1; ES2269200T3; WO2001028521A2; DE60029979D1; NZ518005A; PL197412B1; BR0014881A; CN1164261C; HUP0203473A2; SK5382002A3; KR20020063880A; MXPA02003939A; ZA200203128B; IL149212A0; NO20021867D0; SK284247B6; WO2001028521A3; EA004477B1; CZ20021388A3; JP2003512313A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Liposomen-Formulierung der Verbindung 6,9-Bis-[(2-aminoethyl)amino]benzo[g]isochinolin-5,10-diondimaleat (BBR 2778).
Liposomen sind wässrige Dispersionen von natürlichen und/oder synthetischen Phospholipiden (biokompatibel und biologisch abbaubar), die in einer oder mehreren Doppelschichten organisiert sind. Wenn Phospholipide in wässrigem Medium hydratisiert werden, bilden sie spontan kolloide Mikropartikel oder Träger, üblicherweise von 0,05-5,0 μm im Durchmesser. Liposom-Partikelgrößen reichen von 0,025 μm bis 2,5 μm, abhängig von ihrer Struktur, die eine Einzel- oder Mehrfach-Doppelschichtstruktur sein kann. Die Vesikelgröße ist ein kritischer Parameter bei der Bestimmung von Liposomen-Halbwertszeit und sie beeinflusst das Volumen des verkapselbaren Medikaments.
Liposomen können entsprechend ihrer Zusammensetzung in natürliche und/oder synthetische Phospholipide (Phospho-Sphingolipide) eingeteilt werden und ihre Doppelschicht kann weiterhin andere Bestandteile, z. B. Cholesterin und Lipidkonjugierte hydrophile Polymere, enthalten. Abhängig von ihrer Größe und Anzahl an Doppelschichten können Liposomen auch in die folgenden Kategorien eingeteilt werden: (a) multilamellare Vesikeln (MLV), (b) große unilamellare Vesikeln (LUV), (c) kleine unilamellare Vesikeln (SUV), (d) Multivesikel-Vesikeln (MVV), (e) oligolamellare Vesikeln (OLV).
Die chemisch-physikalischen Eigenschaften von Phospholipiden, die Liposomen konstituieren bzw. bilden, z. B. Membranfluidität, Ladungsdichte, sterische Hinderung und Permeabilität be einflussen die Wechselwirkung zwischen Liposomen und Blutbestandteilen, Geweben und Zellen.
Liposomen sind als potenziell wertvolle Carrier bzw. Träger für Medikamente anerkannt. Die Fähigkeit von Liposomen Medikamente zu enthalten, zu transportieren und freizusetzen hat zu einer Anzahl klinischer Anwendungen geführt. Die einfachste Verwendung von Liposomen auf dem pharmazeutischen Gebiet ist als nicht-toxische Träger für unlösliche Arzneimittel bzw. Wirkstoffe. Komplexere Anwendungen umfassen die Verwendung von Liposomen als „Reservoire" zur protrahierten bzw. verzögerten Freisetzung von Arzneimitteln oder zur Lokalisation des Arzneimittels, um ein spezifisches Gewebe entweder zu vermeiden oder zu erreichen. Arzneimittel in Liposom-Form ergaben vorteilhafte Ergebnisse bei der Behandlung und Verhütung einer Anzahl von Erkrankungen, z. B. bei antimikrobieller Therapie, bei Anti-Krebs-Therapie, als Adjovantien in Vakzinen, bei Hormon- und Enzymtherapien, bei Diagnosetechniken und bei der Behandlung von Haut- und Augenerkrankungen. Die bei der Behandlung von Erkrankungen wie Krebs verwendeten Arzneimittel haben üblicherweise einen beschränkten therapeutischen Index und können für normale Gewebe hochgradig toxisch sein. Eine Liposomen-Formulierung kann den therapeutischen Index verbessern, wobei die Arzneimittel-Biodistribution bzw. -Bioverteilung modifiziert wird. Einige Experimente mit Liposom-verkapselten Antrazyklinen mit verlängerter Plasma-Halbwertszeit haben eine Verringerung der Cardiotoxizität und ein besseres Überleben der Tiere im Vergleich zu Kontrollen, denen das freie Arzneimittel gegeben worden war, gezeigt. Im Falle von Doxorubizin, einem Anthrachinon-Anti-Tumor-Arzneimittel, stellte sich heraus, dass die Verwendung von Liposomen-Formulierungen beim Reduzieren der Toxizität wirksam war. Die gefährlichste Nebenwirkung von Doxorubizin ist ein voranschreitender bzw. progressiver irreversibler Herzschaden. Liposom-verkapseltes Doxorubizin zeig te geringere Toxizität, während es seine therapeutische Wirksamkeit beibehielt. US-Patentschrift 4,797,285, US-Patentschrift 4,898,735 und US-Patentschrift 5,043,166 offenbaren Doxorubizin/Liposomen-Formulierungen und deren Verwendung bei der Behandlung von Krebs.
Die Verbindung BBR 2778 ist ein Anthrachinon-Anti-Tumor-Arzneimittel mit Anti-Tumoraktivität und reduzierter Cardiotoxizität, das die folgende Formel hat:
Die vollständige Beschreibung der Verbindung BBR 2778 ist berichtet in US-Patentschrift 5,587,382, US-Patentschrift 5,717,099, US-Patentschrift 5,506,232, US-Patenschrift 5,616,709 und in J. Med. Chem., 1994, Band 37, 828-837.
Nach i.v.-Verabreichung von Dosen von 40 oder 60 mg/kg an BBR 2778 als ein Bolus an CD1-Mäuse wird der Tod einiger Tiere entweder während oder sofort nach der Behandlung beobachtet.
Derartige plötzliche Tode beruhen vermutlich auf einem der folgenden Faktoren, die mit der Verwendung von BBR 2778 verbunden sind: trombogene Aktivität; Veränderung von Blutgerinnungsparametern, mit nachfolgender Bildung disseminierter intravasaler Gerinnungen; Induktion eines anaphylaktischen Schocks; direkte toxische Wirkung auf das zentrale Nervensystem; arrhythmogene Aktivität; elektrolytisches Ungleichgewicht. Dieses Dosis-abhängige Phänomen nimmt ab, wenn die In jektionsgeschwindigkeit abnimmt (0,1 ml/min, 7-8 Minuten pro Injektion) und nimmt auch durch intraperitoneale Verabreichung ab.
Das Problem, das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegt, war daher eine geeignete Formulierung der Verbindung BBR 2778 zu finden, um die oben erwähnten Nachteile, insbesondere die nach Bolus-Verabreichung des aktiven Inhaltsstoffs beobachteten plötzlichen Tode, zu überwinden. Es ist überraschenderweise festgestellt worden, dass eine BBR 2778-Liposomen-Formulierung, die durch eine bestimmte Zusammensetzung gekennzeichnet ist, dieses Problem erfolgreich löst.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung eine Liposomen-Formulierung der Verbindung BBR 2778 bereit, die aus Liposomen besteht, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und BBR 2778 in einem Gewichtsverhältnis von Cholesterin/Phospholipid von 1:2 bis 1:7 und in einem Gewichtsverhältnis von BBR 2778/Phospholipid 1:4 bis 1:25 enthalten. Phosphatidylcholin umfasst bevorzugt Reste von Fettsäuren, die aus Palmitin-, Olein- bzw. Öl-, Linol-, Gamma-Linol-, Linolen- und Stearinsäure ausgewählt sind, und das Liposom wird durch ein Gemisch der hydrierten und nicht-hydrierten Phosphatidylcholine, die die angegebene Fettsäurezusammensetzung in einem Verhältnis von 1:2 bis 2:1 haben, gebildet, bevorzugter besteht die Mischung aus hydriertem Phosphatidylcholin mit einem Schmelzpunkt von 120°C und einem Kristallisationspunkt von 90°C und nicht-hydriertem Phosphatidylcholin, das ein Thermogramm wie in 5 gezeigt besitzt. Die hydrierten und nicht-hydrierten Phosphatidylcholine mit der oben angegebenen Zusammensetzung sind im Handel jeweils unter dem Namen PHOSPHOLIPON^® 90 H und PHOSPHOLIPON^® 90 erhältlich. Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung zusätzlich zu den oben erwähnten Bestandteilen geladene Verbindungen wie Stearylamin und Dicetylphosphat. Der Zusatz dieser Bestandteile ergibt Liposomen mit einer Oberflächenladung, die ihre gegenseitige Abstoßung induziert, wodurch ihr Zusammenbruch verhindert wird.
Das Phospholipid-Gemisch kann auch Natrium-Dodecylsulfat, Cremophor RH60, Alpha-Tocopherolphosphat und Calciumacetat enthalten. Zudem können kleine Fraktionen (5-19 Mol%) von Verbindungen mit hydrophilen Gruppen, z. B. Monosialogangliosid, hydriertes Phosphatidylinositol und Lipid-konjugierte Polyethylenglycole (PEG-DSPE), in der Membran-Doppelschicht enthalten sein, um die Interaktion bzw. Wechselwirkung zwischen Liposomen und Zellen und Blutbestandteilen zu verringern.
Die erfindungsgemäßen Liposomen-Formulierungen wurden in vivo auf Anti-Tumor-Aktivität und Toxizität getestet. P388-Leukämie der Maus („P388 murine leukemia") wurde als Tumormodell verwendet. Insbesondere wurde die Hemmungsaktivität auf plötzliche Tode, verglichen mit der Kontrollgruppe, der eine Formulierung des freien Arzneimittels verabreicht wurde, bewertet. Details werden in den Beispielen berichtet. Die Testergebnisse beweisen, dass die erfindungsgemäßen Liposomen-Formulierungen eine bemerkenswerte Verbesserung der mittleren Überlebenszeit und eine merkliche Verringerung der Toxizität bewirken. Weiterhin wird plötzlicher Tod nicht mehr beobachtet.
Zusammenfassend kann deshalb festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Formulierungen die Anti-Tumor-Aktivität beibehalten ohne plötzlichen Tod zu induzieren bzw. auszulösen, der im Fall des freien Arzneimittels oder anderer konventioneller Formulierungen des aktiven Inhaltsstoffs beobachtet wird. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung detaillierter.
Beispiel 1 – Reinigung von Lecithin zu Phosphatidylcholin
Die Hauptquelle von Lecithin sind pflanzliche Öle aus Sojabohnen-, Baumwoll-, Sonnenblumen- und Rapssamen oder aus tierischen Geweben (Eier). Soja- und Ei-Lecithine sind hinsichtlich der produzierten Mengen am wichtigsten. Sojabohnen werden einer Extraktion mit Hexan unterzogen, um Rohlecithin von halbfester Konsistenz zu erhalten, welches enthält:
52% Phospholipide, 35% Öle und Fette, 10% Glycolipide und Zucker, 2% nicht-verseifbare Stoffe und 1% Wasser.
Aus dem Rohlecithin werden Fettsäuren extrahiert, um ein feines oder körniges Lecithinpulver zu erhalten, das weiter mit Ethanol extrahiert und fraktioniert wird, um reinere Lecithine mit höheren Phosphatidylcholingehalten zu erhalten.
Rohlecithin wurde auch unter Verwendung eines einzelnen Verfahrens zur industriellen Produktion von Phosphatidylcholin durch Extraktion mit Aceton gereinigt, wie es in US-Patentschrift 5,442,276 offenbart ist. Reinigung von Rohlecithin
PHOSPHOLIPON® 90H (PHO 90H) wurde durch Hydrierung von PHOSPHOLIPON® 90 (PHO 90) erhalten.
Die zwei kommerziellen Phospholipide (Rhone – Poulenc Rorer) haben die folgenden Charakteristika bzw. Merkmale:
PHOSPHOLIPON^® 90:

– Peroxidzahl: max. 5
– Säurezahl: max. 0,5
– Ethanol: max. 0,5%
– Wasser max. 1,5%
– Form: gelber pastöser Feststoff
– Zusatz von d, l α-tocopherol min. 0,1%

PHOSPHOLIPON^® 90H

– Iodzahl: max. 1
– Wasser: max. 2,0%
– Phasenübergangstemperatur der 20%-igen Dispersion in H₂O etwa 54°C
– Form: weißer kristalliner Feststoff.

Die 1- und 2-Positionen von Glycerin im Phosphatidylcholinmolekül sind mit Fettsäuren, z. B. Palmitin-, Olein-, Linol-, Linolen- und Stearinsäure, verestert.
Beispiel 2 – Chromatographische Analyse der Phospholipide
Die Fettsäurezusammensetzung der Phosphatidylcholin-Proben wurde sowohl in quantitativer als auch qualitativer Hinsicht durch GLC-Analyse bestimmt. Die Fettsäuren in den Phospholipid-Proben wurden detektiert und unter Verwendung von sowohl reinen Fettsäuremethylestern (Carlo Erba) als auch Standard-Olivenöl quantitativ bestimmt.
Verseifung der Probe: 50 mg an Produkt wurden in ein Teströhrchen gegeben und 3 ml 1N Natriumhydroxid (Baker) wurden zugegeben. Das Teströhrchen wurde dicht verschlossen und für eine Stunde bei 110°C in einem geeigneten Ofen platziert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Probe mit 2N Salzsäure (Baker) angesäuert und mit 10 ml eines 90/10-Gemischs n-Hexan/Ethylacetat (Merck) extrahiert. Das organische Lösungsmittel wurde unter einem sanften Stickstoffstrom entfernt.
Veresterung der Proben: Die organische Phase wurde aus dem Teströhrchen entfernt, 1 ml BF₃ in Methanol wurde zugesetzt, das Teströhrchen wurde dicht verschlossen und eine Stunde lang bei 100°C gehalten. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden der Probe 5 ml destilliertes Wasser zugesetzt und sie wurde zweimal mit je 5 ml des 90/10-Gemischs von n-Hexan/Ethylacetat extrahiert. 1 μ1 der organischen Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, dann in das Gaschromatographiegerät eingespritzt.
Betriebsbedingungen
Gaschromatograph: Mega 5300 Carlo Erba
Säule: Megawax, Länge 30 m, Innendurchmesser 0,32 mm, Filmdicke 0,25 μm
Trägergas: Helium sp 45 cm/s
Einspritzvorrichtung: split bzw. Teilung 1/100 bei 250°C
Detektor: F.I.D. bei 280°C
Ofen: 120°C für 1 min
Endtemperatur: 250°C, mit Temperaturerhöhungen von 5°C/min
Die 1–3 zeigen jeweils die Gaschromatogramme des Standarts, von PHO 90 und von PHO 90H.
Tabelle 1 zeigt die prozentualen Anteile der Säuren in den untersuchten Lipiden. Tabelle 1
Beispiel 3 – Thermoanalyse der Phospholipide
Die kommerziellen Phospholipe PHO 90 und PHO 90H wurden sowohl einzeln als auch in Mischung durch DSC analysiert.
Die Proben wurden wie folgt hergestellt: 500 mg PHO 90 wurden in 10 ml Dichlormethan + 1 ml MeOH (S1) gelöst; 500 mg PHO 90H wurden in 10 ml Dichlormethan + 1 ml MeOH (S₂) gelöst.
Probe 1: 2 ml S₁
Probe 2: 2 ml S₂
Probe 3: 0,5 ml S₁ + 1,5 ml S₂
Probe 4: 1 ml S₁ + 1 ml S₂
Probe 5: 1, 5 ml S₁ + 0, 5 ml S₂
Die Proben wurden unter einem Stickstoffstrom und unter sanfter Erwärmung getrocknet, dann wurden sie durch DSC analysiert. Die Analyse wurde mit einem Mettler DSC 20 durchgeführt, wobei bis 200°C mit einem Gradienten von 3°C/Minute erhitzt wurde, dann wurde die Probe abkühlen gelassen.
4–5 zeigen die Thermogramme der zwei Phospholipide. Wie es in 4 beobachtet werden kann, hat PHO 90H einen merklichen, gut definierten Schmelzpunkt bei 120°C und einen Kristallisationspunkt bei 90°C.
Soweit PHO 90 betroffen ist, zeigt 5, dass dies nicht ein kristallines Pulver, sondern eine pastöse Masse ist, deshalb hat es, wie es bei allen Fetten der Fall ist, keinen gut definierten Schmelzpunkt, sondern einen Erweichungspunkt, der die Temperatur ist, bei der das Fett zu fließen beginnt und einen Klarpunkt („clearness point"), der die Temperatur ist, bei der das Fett vollständig klar bzw. durchsichtig ist.
Dies wird durch das Thermogramm von PHO 90 bestätigt, worin eine breite Bande, die dem Erweichungspunkt entspricht, beobachtet wird, statt eines definierten Peaks, wie es beim PHO 90H-Thermogramm der Fall ist.
Betreffend die Thermogramme der Mischungen wird bei niedrigeren Temperaturen eine Senkung des Kristallisationspunktes beobachtet, der weiter von der PHO 90H:PH0 90-2:1-Mischung zur 1:1-Mischung sinkt und schließlich bei der PHO 90H:PH0 90-1:2-Mischung vollständig verschwindet, wobei das Verhalten von PHO 90 vorherrscht.
Beispiel 4 – Herstellung der Liposomen-Formulierung (nicht gemäß der Erfindung)
3,6 g PHO 90, 1,8 g PHO 90H (Verhältnis 2:1) und 0,52 g Cholesterin wurden in einen 500 ml-Rundkolben gegeben und 50 ml Dichlormethan wurden zugegeben. Die Mischung wurde etwa 10 Minuten lang Ultraschall behandelt, um Solubilisierung zu fördern. Die resultierende Lösung wurde bis zur Trockne in einem Rotations-Dünnschichtverdampfer („rotary film evapora tor")(Rotavapor) bei 40°C und unter leichter Rotation verdampft, bis ein homogener Phospholipid-Film erhalten wurde.
Der resultierende Phospholipid-Film wurde abgekühlt, dann wurden eine BBR 2778-Lösung, hergestellt durch Auflösen von 300 mg BBR 2778 in 60 ml Wasser/Propylenglycol 60/40 und Filtrieren durch einen 0,22 μm-Filter, und 10 ml Glaskügelchen mit 2 mm mittlerem Durchmesser zugegeben. Der mit dem Rotavapor verbundene Rundkolben wurde bis zur vollständigen Rehydrierung über Nacht unter langsamer Bewegung (15 Stunden, 300 Umdrehungen/min) bei Raumtemperatur und -druck gelassen. Tabelle 2 gibt die Analyse der resultierenden BBR 2778-Formulierung wieder. Tabelle 2
Beispiel 5 – Bewertung der Anti-Tumor-Aktivität von BBR 2778-Liposomen
Tiere: Mäuse wurden durch Charles River Breeding Laboratories (Calco, Como, Italien) bereitgestellt; sie waren männliche Mäuse von 6-8 Wochen unter Standardhaltungsbedingungen.
Formulierungen: BBR 2778, gelöst und verdünnt in sterilem Wasser, kurz vor der Verabreichung von 10 mg/kg an Mäuse wurde als Referenz bzw. Vergleichsprobe verwendet. Die Liposomen-Formulierung von Beispiel 4 wurde verwendet.
Tumormodell: P388-Leukämie der Mäuse, bereitgestellt durch NCI Frederick Cancer Facility (USA), wird durch eine Reihe von intraperitonealen Transplantaten in DBA2-Mäusen aufrecht erhalten. Mäusen wurden 10⁶ P388-Leukemiezellen/Maus transplantiert, die Liposomen-Verbindung („liposome compound") und der Referenzstandard wurden an den Tagen 1, 4, 7 nach der Tumortransplantation i.v. verabreicht.
Die Anti-Tumor-Aktivität wurde als Prozentsatz der Erhöhung der Überlebenszeit der Mäuse bestimmt, ausgedrückt durch das B/K-Prozentsatzverhältnis der mittleren Überlebenszeit (MÜZ) der behandelten Gruppe (B) zur mittleren Überlebenszeit der Kontrollgruppe (K):
Tabelle 3 gibt die Resultate der Anti-Tumor-Aktivität von BBR 2778 in der getesteten Formulierung an. Tabelle 3

* Anzahl an toxischen Toden/Gesamtzahl an Mäusen
** Mittelwert weiterer Tests

Der Vergleich zwischen der Formulierung von Beispiel 4 und der BBR 2778-Lösung beweist deutlich das Verschwinden von plötzlichen Toden bei den Mäusen, denen die Liposomen-Formulierung verabreicht worden war. Die Analyse jeder einzelnen verabreichten Dosis zeigt Variationen sowohl hinsichtlich B/K-Prozentsatz als auch hinsichtlich der Toxizität zwischen der Liposomen-Formulierung und der Lösungsformulierung. Bei Dosen von 18 mg/kg und 27 mg/kg werden hinsichtlich des B/K-Prozentsatzes keine wesentlichen Unterschiede beobachtet, wohingegen dies hinsichtlich der Toxizität nur nach Behandlung mit nicht-verkapseltem BBR 2778 beobachtet wird.
Die erfindungsgemäße Formulierung induziert verglichen mit dem BBR 2778 in Lösung, bei einer Dosis von 40 mg/kg eine bemerkenswerte Verbesserung der mittleren Überlebenszeit: 287, 250, bzw. 159 und eine merkliche Verringerung der Toxizität (12% bzw. 60,4%). Die Dosis von 60 mg/kg ist bei beiden Formulierungen toxisch.
Es kann deshalb festgestellt werden, dass die Verabreichung der erfindungsgemäßen Liposomen-Formulierung von BBR 2778 keinen plötzlichen Tod, sowie eine Verringerung der Toxizität induziert.
Was die Tumoraktivität betrifft, wurden die Ergebnisse aus den Tests von BBR 2778 in Lösung bestätigt, sogar mit bemerkenswerten Erhöhungen des B/K-Prozentsatzes bei einigen Dosierungen.

Claims

Liposomen-Zubereitung der Verbindung 6,9-Bis[(2-aminoethyl)amino]benzo[g]isochinolin-5,10-diondimaleat (BBR 2778) der Formel:
dadurch gekennzeichnet, dass die Liposome Phosphatidylcholin, Cholesterin und die Verbindung BBR 2778 in einem Gewichtsverhältnis von Cholesterin/Phospholipid von 1:2 bis 1:7 und in einem Gewichtsverhältnis von BBR 2778/Phospholipid von 1:4 bis 1:25 enthalten.
Liposomen-Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Phosphatidylcholin Reste von Fettsäuren, ausgewählt aus Palmitinsäure, Oleinsäure, Linolsäure, Gamma-Linolsäure, Linolensäure und Stearinsäure, umfasst.
Liposomen-Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Phosphatidylcholin ein Gemisch der hydrierten und nicht-hydrierten Formen im Gewichtsverhältnis von 1:2 bis 2:1 ist.
Liposomen-Zubereitung nach Anspruch 3, wobei die hydrierte Form einen Schmelzpunkt von 120°C und einen Kristallisati onspunkt von 90°C besitzt und die nicht-hydrierte Form ein Thermogramm im Wesentlichen wie in 5 gezeigt besitzt.
Liposomen-Zubereitung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Liposome des Weiteren Stearylamin und/oder Dicetylphosphat umfassen.
Verwendung der Liposomen-Zubereitung nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung eines Antitumorwirkstoffs.