DE60033553T2

DE60033553T2 - Verfahren zur herstellung von tripeptiden

Info

Publication number: DE60033553T2
Application number: DE60033553T
Authority: DE
Inventors: Naoyuki Sagamihara-shi Yamamoto; Keita Ueno; Masahiro Shibuya-Ku EJIRI
Original assignee: Calpis Co Ltd
Current assignee: Asahi Soft Drinks Co Ltd
Priority date: 1999-11-11
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2020-11-11
Also published as: EP1231279A1; DK1231279T3; NZ518957A; WO2001034828A1; CN1423704A; CN100523212C; ATE354668T1; AU1306001A; ES2281361T3; EP1231279A4; JP2001136995A; PT1231279E; AU773587B2; CY1106620T1; US6994987B1; EP1231279B1; DE60033553D1; JP4633876B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Tripeptids, durch das die Tripeptide Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro wirksam hergestellt werden können.
Es ist im Stand der Technik bekannt, dass verschiedene Peptide, die spezifische Sequenzen haben, verschiedene physiologische Aktivitäten besitzen. Beispiele solcher Peptide schließen die Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro ein. Diese Tripeptide können in einer Milch gefunden werden, die mit Milchsäurebakterien fermentiert wurde, und man weiß von ihnen, dass sie eine starke hemmende Wirkung auf das Angiotensin umwandelnde Enzym (das hierin als ACE bezeichnet wird) besitzen und dass sie eine starke blutdrucksenkende Aktivität bei Ratten mit Spontanhypertension (SHR) sowie eine blutdrucksenkende Wirkung bei Patienten mit Bluthochdruck besitzen (J. Dairy Sci. 1995, 78: 777-783; J. Dairy Sci. 1995, 78: 1253-1257; Am. J. Clin. Nutr. 1996, 64: 767-771). Weiterhin wird berichtet, dass die Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro auch eine Antistresswirkung besitzen (JP-A-11-100328).
Als Verfahren für die Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro wurde ein Beispiel für die wirksame Herstellung mittels Fermentierung von Milchsäurebakterien berichtet (JP-A-11-98978). Jedoch hört die Fermentierung der Milchsäurebakterien aufgrund des niedrigen pH-Werts als Ergebnis der Milchsäurefermentierung vor dem kompletten Verdau auf, was zu einer großen Menge an unverdünntem Casein führt. Weiterhin enthält die Kulturflüssigkeit, die durch die Fermentierung der Milchsäurebakterien hergestellt wurde, eine große Menge an Milchsäure, was zu einem Nachteil bei der Verarbeitung der Kulturflüssigkeit zu einer Vielzahl von Produkten führen kann. Zum Beispiel verhindert die gleichzeitig existierende Milchsäure die Bildung von Pulvern, und so ist es notwendig, zur Bildung von Pulvern die Säuren aus der Kulturflüssigkeit zu entfernen.
Ein weiteres mögliches Verfahren für die Herstellung der Tripeptide ist ein enzymologisches Verfahren. Im Vergleich zum Verfahren der Milchsäurefermentierung wird erwartet, dass das enzymologische Verfahren Vorteile besitzt, wie eine verbesserte Ausbeute an Peptiden, eine stabile Herstellung, verkürzte Herstellungsschritte und eine geringere Anzahl an ausführenden Personen sowie keine Erzeugung von Milchsäure. Jedoch ist beim Verdau von Proteinen durch das enzymologische Verfahren für die Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro die Verdaungsreaktiviät durch Peptidase bei Aminosäuresequenzen, die Prolin wie Xaa-Pro oder Pro-Xaa enthalten (Xaa stellt eine beliebige Aminosäure dar), auffallend niedrig. Daher ist es schwierig, die Sequenz Pro-Xaa bei der Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro durch das enzymologische Verfahren zu verdauen, und es wurde mit dem enzymologischen Verfahren keine höhere Ausbeute als bei dem Verfahren der Milchsäurefermentierung erzielt. Zum Beispiel offenbart JP-A-11-100328 ein Verfahren, bei dem Milchcasein mit Proteinase und anschließend mit Carboxypeptidase behandelt wird, als Beispiel eines Verfahrens zum Erhalt der Tripeptide Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro. Jedoch gibt es keine Offenbarung der spezifischen Behandlungsschritte. JP-A-11-100328 offenbart lediglich in den Beispielen andere Verfahren als das enzymologische Verfahren, wie die Milchsäurefermentierung.
Als Verfahren für die Herstellung anderer nützlicher Peptide als der Tripeptide Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro durch Verdau von Proteinen mit der Kombination von Proteinase und Peptidase wurde ein Verfahren für den Erhalt eines Tripeptids Leu-Pro-Pro mit ACE-hemmender Aktivität aus gamma-Zein (Japanisches Patent Nr. 2873327) und ein Verfahren zum Erhalt eines Peptids Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Xaa-Asn aus beta-Casein (JP-A-6-128287) vorgeschlagen. Jedoch waren diese Verfahren aufgrund unzureichender Ausbeute und Instabilität für die industrielle Herstellung nicht praktizierbar.
WO 99/16461 offenbart ein Verfahren für die Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro durch aufeinanderfolgendes Spalten von Nahrungsmittelmaterial wie zum Beispiel Milchcasein durch eine Proteinase und eine Carboxypeptidase.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines industriell nützlichen Verfahrens für die Herstellung der Tripeptide, wobei die Tripeptide Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro, die als Antibuthochdruckmittel oder Antistressmittel nützlich sind, stabil und einfach mit einer hohen Ausbeute hergestellt werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein in-Vitro-Verfahren zur Herstellung eines Tripeptids durch Verdau von Material, das Milchcasein enthält, mit einer isolierten Proteinase und einer isolierten Peptidase bereitgestellt, um mindestens eines der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro zu erhalten, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Verdau des Materials, das das Milchcasein enthält, mit der Proteinase, um ein Zwischenpeptid herzustellen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, das eine Sequenz Val-Pro-Pro enthält, jedoch keine anderen Pro als die in dieser Sequenz enthält, einem Peptid, das eine Sequenz Ile-Pro-Pro enthält, jedoch keine anderen Pro als die in dieser Sequenz enthält, und Gemischen davon, und Verdau des Zwischenpeptids mit der Peptidase zur Herstellung von mindestens einem der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro, wobei die Peptidase

a) eine Aminopeptidase und eine Carboxypeptidase;
b) eine Endopeptidase; oder
c) ein Gemisch aus a) und b)

Bei dem Verfahren zur Herstellung eines Tripeptids der vorliegenden Erfindung wurde ein Material, das Milchcasein enthält, mit einer spezifischen Proteinase und Peptidase verdaut, um ein Tripeptid Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro zu erhalten.
Das Material, das das Milchcasein enthält, kann geeigneterweise ausgewählt werden, wobei der Gehalt der spezifischen Tripeptidsequenz, die Materialkosten und die Einfachheit der gewerblichen Anwendung in Betracht bezogen werden. Beispiele davon können Materialien einschließen, die ein Milchcasein wie beta-Casein und alpha-Casein enthalten, wie eine tierische Milch, eine fettarme Milch, ein fettarmes Milchpulver, ein Milchcasein und verarbeitete Produkte davon.
Unter einigen Klassen von Caseinen enthalten beta-Casein und alpha-Casein die Sequenzen Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro. Somit kann das Material, das das Milchcasein enthält, bevorzugt ein Material sein, das diese Caseine enthält.
Ein gewöhnliches Milchcasein enthält 25 bis 30 Gew.-% beta-Casein und 10 bis 15 Gew.-% alpha-Casein, das heißt größere Mengen an beta-Casein als alpha-Casein. Somit kann das vorliegende Herstellungsverfahren beta-Casein als dominierendes Substrat verwenden.
Die vorstehend genannte spezifische Proteinase ist eine Proteinase, die Milchcasein verdaut und das spezifische Zwischenpeptid herstellt.
Das spezifische Zwischenpeptid ist ein Peptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, das eine Sequenz Val-Pro-Pro enthält, jedoch keine anderen Pro als die in dieser Sequenz enthält, einem Peptid, das eine Sequenz Ile-Pro-Pro enthält, jedoch keine anderen Pro als die in dieser Sequenz enthält, und Gemischen davon. Dies bedeutet, dass das spezifische Zwischenpeptid ein Peptid, das eine Sequenz Val-Pro-Pro enthält, jedoch keine anderen Pro als die in dieser Sequenz enthält, und/oder ein Peptid ist, das eine Sequenz Ile-Pro-Pro enthält, jedoch keine anderen Pro als die in dieser Sequenz enthält. Spezifisch kann das Zwischenpeptid ein Peptid Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr, dessen Sequenz Teil der Sequenz des beta-Caseins ist, oder ein oder mehrere Peptide einschließen, die mit Peptiden identisch sind, die durch Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren von diesem Peptid am Aminoterminus und/oder Carboxyterminus erhalten werden, bis aus dieser Sequenz Ile-Pro-Pro wird (die folgende SEQ ID NO: 1-15), oder kann ein Peptid Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln, dessen Sequenz Teil der Sequenz des beta-Caseins ist, oder ein oder mehrere Peptide einschließen, die mit Peptiden identisch sind, die durch Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren von diesem Peptid am Aminoterminus und/oder Carboxyterminus erhalten werden, bis aus dieser Sequenz Val-Pro-Pro (die folgende SEQ ID NO: 16-27) wird.
Die Proteinase kann Papain, Protease A (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), Protease M (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), Protease P (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) oder Kombinationen davon einschließen.
Die Peptidase kann verschiedene Peptidasen, die das Zwischenpeptid verdauen können, das durch die Proteinase hergestellt wurde, zur Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro einschließen. Die Peptidase besitzt nicht unbedingt die Fähigkeit, Casein direkt zu verdauen. Die Peptidase umfasst eine Aminopeptidase und eine Carboxypeptidase; eine Endopeptidase wie eine Oligopeptidase; oder Gemische davon.
Die Peptidase kann bevorzugt eine Carboxypeptidase und eine Endopeptidase einschließen, die in der Lage ist, eine Bindung zwischen Pro und Xaa der Sequenz Val-Pro-Pro-Xaa und/oder Ile-Pro-Pro-Xaa zu schneiden. Genauer gesagt kann die Peptidase bevorzugt in der Lage sein, eine Bindung zwischen Pro-Leu und/oder Pro-Phe in den Sequenzen Ile-Pro-Pro-Leu und/oder Val-Pro-Pro-Phe zu schneiden, die in dem Milchcasein enthalten sind. Die Peptidase kann eine Spezifität gegen diese Bindungen besitzen.
Die Peptidase kann geeigneterweise in Übereinstimmung mit der Substratspezifität der gemeinsam verwendeten Proteinase und anderer Faktoren ausgewählt werden. Zum Beispiel verwendet die vorliegende Erfindung eine Kombination aus einer Peptidase, die Peptide vom N-Terminus verdaut, das heißt eine Aminopeptidase, und einer Peptidase, die Peptide vom C-Terminus verdaut, das heißt eine Carboxypeptidase; und/oder eine Oligopeptidase. In einer spezifischen Ausführungsform, wenn Papain, Protease A (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), Protease M (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), Protease P (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) oder die Gemische davon als Proteinase verwendet werden, werden eine Kombination der Aminopeptidase und der Carboxypeptidase; und/oder eine Oligopeptidase als Peptidasen verwendet.
Beispiele der Aminopeptidasen kann Aminopeptidase I, die von Streptomyces griseus stammt (hergestellt von Sigma Chemical Co.), Aminopeptidase, die von Aeromonas proteolytica (hergestellt von Sigma Chemical Co.), Leucinaminopeptidase, die von Schweinenierencytoplasma stammt, und Leucinaminopeptidase, die vom endoplasmatischen Retikulum von Schweinenieren stammt, einschließen.
Bespiele der Carboxypeptidasen können Carboxypeptidase Y (hergestellt von Sigma Chemical Co.), Carboxypeptidase A (hergestellt von Sigma Chemical Co.), Carboxypeptidase B (hergestellt von Sigma Chemical Co.) und Cathepsin G (hergestellt von Sigma Chemical Co.) einschließen.
Anders als die vorstehend beispielhaft aufgeführten Peptidasen können Beispiele der Peptidasen weiterhin Enzyme, die von Mikroorganismen wie Milchsäurebakterien, Escherichia coli-Bakterien oder Bacillus subtilis-Bakterien stammen, oder Enzyme, die von tierischem Gewebe oder von einer Pflanze stammen, einschließen. Zum Beispiel kann eine Peptidase verwendet werden, die vom Milchsäurebakterium Lactobacillus helveticus stammt.
Die Peptidase, die von Lactobacillus helveticus stammt, kann durch Sammeln der Zellkörper durch Zentrifugation von einer Kulturflüssigkeit, in der die Milchsäurebakterien gezüchtet wurden, Aufbrechen der Zellkörper durch Zerkleinern der Zellen wie Ultraschallbehandlung, Zentrifugieren zum Entfernen des Präzipitats und Sammeln des Überstands als Rohenzymextrakt und Fraktionieren des Rohextrakts mit einer Adsorptionsauftrennungssäule wie DEAE-Sepharose (hergestellt von Pharmacia Co.) erhalten werden.
Die Peptidase, die vom Milchsäurebakterium Lactobacillus helveticus stammt, kann ohne andere Peptidasen zum Verdau des Zwischenpeptids zum Erhalt der Tripeptide Ile-Pro-Pro und/oder Val-Pro-Pro mit hoher Ausbeute verwendet werden. Jedoch kann die Peptidase, die vom Milchsäurebakterium Lactobacillus helveticus stammt, zusammen mit einer anderen Peptidase wie Aminopeptidase und/oder Carboxypeptidase verwendet werden.
Die Anordnung zum Inkontaktbringen der Proteinase und der Peptidase mit dem Material, das das Milchcasein enthält, ist nicht speziell eingeschränkt, so lang das Material, das das Milchcasein enthält, mit der Proteinase verdaut werden kann, um das Zwischenpeptid herzustellen, das mit der Peptidase verdaut werden kann, um das gewünschte Tripeptid zu erhalten. Beispiele der Verfahrensschritte zum Inkontaktbringen des Materials mit der Proteinase und der Peptidase können ein Verfahren (a), das die Schritte des Inkontaktbringens des Materials, das das Milchcasein enthält, mit der Proteinase, um das Zwischenpeptid zu erhalten, und anschließend des Inkontaktbringens des Zwischenpeptids mit der Peptidase zum Durchführen des gewünschten Verdaus, einschließen; und ein Verfahren (b), das den Schritt des Inkontaktbringens des Materials, das das Milchcasein enthält, mit der Proteinase und gleichzeitig mit der Peptidase zum Durchführen des gewünschten Verdaus mit jedem Enzym einschließt.
In dem Verfahren (a) kann das bevorzugte Verhältnis von Proteinase zum Material, das das Milchcasein enthält, 1/100 bis 1/10000 sein. Die Bedingung für den Verdau des Milchcaseins mit der Proteinase zur Herstellung des Zwischenpeptids kann für gewöhnlich bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und bevorzugt bei optimalem pH-Wert und optimaler Temperatur des Enzyms 3 bis 24 Stunden lang sein.
Nach dem Erhalt des Zwischenpeptids und vor Inkontaktbringen des Zwischenpeptids mit der Peptidase in Verfahren (a) können gegebenenfalls verschiedene Verfahrensschritte wie Inaktivierung der Proteinase, Entfernen des nicht-umgesetzten Proteins, Erhöhung der Konzentration an Zwischenpeptid und Entfernung des Lösungsmittels durchgeführt werden.
Die Inaktivierung der Proteinase kann für gewöhnlich durch Hitzebehandlung bei 60 bis 100°C erfolgen. Eine derartige Inaktivierung kann die Wirksamkeit des anschließenden Verdaus mit der Peptidase erhöhen.
Die Entfernung des nicht-umgesetzten Proteins kann zum Beispiel durch Zentrifugieren bei 5000 bis 20000 UpM für 3 bis 10 Minuten und Entfernen des Präzipitats erfolgen.
Die Erhöhung der Konzentration an Zwischenpeptid kann mit hydrophobem Harz erfolgen. Beispiele des hydrophobischen Harzes können Kieselsäureharz einschließen, an das eine Gruppe, die eine Cyanogruppe wie eine Propionitrilgruppe enthält, eine Phenylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatmen gebunden ist. Genauer gesagt kann das hydrophobe Harz „Amberlite XAD-7, Amberlite XAD-2 (Markenname, hergestellt durch Organo Corporation) und „Sep-Pak-Cartridge" (hergestellt von Waters Corporation) sein. Die Erhöhung der Konzentration an Zwischenpeptid kann dadurch erfolgen, dass das Harz das Zwischenpeptid gemäß einem Säulenverfahren oder einem Batchverfahren adsorbiert und anschließend das Zwischenpeptid mit einem Lösungsmittel wie einem polaren Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol und Acetonitril eluiert wird.
Die Entfernung des Lösungsmittels kann durch Behandlung mit Vakuumkonzentration erfolgen.
In dem Verfahren (a) kann die Bedingung für die Durchführung des gewünschten Verdaus durch Inkontaktbringen des Zwischenpeptids mit der Peptidase bei einem pH-Wert von 4,0 bis 7,0 und bevorzugt bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,5 und einer Temperatur von 25 bis 40°C, bevorzugt 30 bis 45°C, liegen. Wenn eine Vielzahl von Enzymen als Peptidasen verwendet wird, kann eine Vielzahl der Reaktionen getrennt unter der optimalen Bedingung für das jeweilige Enzym erfolgen.
In dem Verfahren (b) kann die bevorzugte Bedingung für den gewünschten Verdau, wenn die Proteinase und die Peptidase gleichzeitig mit dem Material, das das Milchcasein enthält, in Kontakt gebracht werden, bei einem pH-Wert von 4,5 bis 7,0 und einer Temperatur von 25 bis 50°C liegen.
In dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann das Reaktionsgemisch nach Durchführung des Verdaus mit der Proteinase und der Peptidase gewöhnlich die Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro sowie andere Peptide enthalten. Das Reaktionsgemisch selbst kann das Produkt sein. Alternativ kann das Reaktionsgemisch einer Konzentration und Aufreinigung der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro unterworfen werden, um das Produkt zu erhalten. Die Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro können in Form eines gewerblich anwendbaren Salzes wie eines Salzes von Salzsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure und Weinsäure hergestellt werden.
Ein Produkt, das die Tripeptide enthält, die durch das vorliegende Herstellungsverfahren selbst erhältlich sind, oder das Produkt, das weiterhin mit anderen Nahrungsmittelmaterialien oder Medikamenten vermischt wurde, damit es in Form einer Flüssigkeit, von Pulvern, Granulaten oder Tabletten vorliegt, kann als ein Milchprodukt wie ein Joghurt und Milchgetränk, allgemeine Nahrungsmittel und Getränke, Nahrungsmittel für einen bestimmten gesundheitlichen Zweck, gesunde Nahrungsmittel und Medikamente mit blutdrucksenkender Wirkung und Antistresswirkung verwendet werden.
Mit dem vorliegenden Verfahren zur Herstellung des Tripeptids können die Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro, die als blutdrucksenkendes Mittel oder Antistressmittel von Nutzen sind, einfach und stabil mit hoher Ausbeute durch das enzymologische Verfahren hergestellt werden.
Daher hat das vorliegende Verfahren einen deutlichen gewerblichen Wert.
Das vorliegende Verfahren wird unter Bezugnahme auf die Versuche und die Beispiele detaillierter erklärt. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt.
Versuche 1-1 bis 1-21 (Studie über die Auswahl der optimalen Pegtidaseformulierung und die optimalen Reaktionsbedingungen für die Herstellung der Tripeptide Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro aus den Zwischenpeptiden)
Die in Tabelle 1 gezeigten Peptide wurden chemisch synthetisiert. Es sind synthetische Peptide, die auf der Aminosäuresequenz von beta-Casein basieren, die die Sequenz Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro in der Aminosequenz davon enthalten und kein Prolin in einem anderen Teil als diesen Sequenzen besitzen. Alle diese synthetischen Peptide wurden mit der automatischen Peptidsynthetisierungsmaschine PPSM-8 (hergestellt durch Shimadzu Corporation) synthetisiert.
Die enzymologische Reaktivität verschiedener im Handel erhältlicher Peptidaseformulierungen gegen die in Tabelle 1 gezeigten Peptide wurden anschließend untersucht. Jedes synthetische Peptid wurde bei der Konzentration von 10 μg/ml in 100 mM Phosphatpuffer, pH 5,3, für die Versuche 1-1 bis 1-4, 1-10 bis 1-12, 1-16 und 1-21 bzw. in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, für die anderen Versuche aufgelöst. Jede der verschiedenen, in Tabelle 1 gezeigten Peptidaseformulierungen wurde anschließend so zugegeben, dass die Konzentration davon 0,01 μg/ml betrug, und die Umsetzung erfolgte bei 37°C für 3 Stunden. Nach der Enzymumsetzung wurde das Gemisch durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Ein Peak bei der Retentionszeit von 11,0 min, die dem Tripeptid Val-Pro-Pro zugeordnet wird, und ein Peak bei der Retentionszeit von 13,7 min, die dem Tripeptid Ile-Pro-Pro zugeordnet wird, wurden nachgewiesen. Die Fraktionen der nachgewiesenen Peaks wurden gesammelt und eine Aminosäuresequenzanalyse wurde mit dem automatischen Peptidanalysegerät Modell PPSQ-10 (hergestellt von Shimadzu Corporation) durchgeführt. Die Analyse zeigte, dass die Aminosäuresequenzen der Peptide in den gesammelten Peaks Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro waren. Die Bedingungen der HPLC-Analyse sind nachstehend gezeigt:
Pumpe: L6200 Intelligent-Pumpe und L6000-Pumpe (hergestellt von Hitachi, Ltd.).
Detektor: L4000-UV-Nachweisgerät (hergestellt von Hitachi, Ltd.)
Säule: Microbondasphere 5μC18 (ø 3,9 × 150 mm, hergestellt von Waters Corporation)
Eluierungsmittel: Eluierungsmittel A: wässrige Lösung, die 0,1 Gew.-% Trifluoressigsäure (TFA) enthält
Eluierungsmittel B.: Acetonitril, das 0,1 Gew.-% Trifluoressigsäure enthält
Eluierungsbedingungen: lineare Gradienteneluierung (40 Minuten) von Eluierungsmittel B 0% (Eluierungsmittel A 100%) bis Eluierungsmittel B 40% (Eluierungsmittel A 60%).
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Tabelle 1
Acronyme der Enzyme in Tabelle 1 beziehen sich auf die folgenden Enzyme:
<Aminopeptidasen>

A: Aminopeptidase (hergestellt von Sigma Chemical Co.)
LC: Leucinaminopeptidase, Cytosol (Aminopeptidase, die vom Cytoplasma von Schweinenieren stammt, hergestellt von Sigma Chemical Co.)
LM: Leucinaminopeptidase, mikrosomal (Aminopeptidase, die vom endoplasmatischen Retikulum einer Schweineniere stammt, hergestellt von Sigma Chemical Co.)
I: Aminopeptidase I (hergestellt von Sigma Chemical Co.)

<Carboxypeptidasen>

Y: Carboxypeptidase Y (hergestellt von Sigma Chemical Co.)
B: Carboxypeptidase A (hergestellt von Sigma Chemical Co.)
A: Carboxypeptidase A (hergestellt von Sigma Chemical Co.)
G: Cathepsin G (hergestellt von Sigma Chemical Co.)

Wie in Tabelle 1 gezeigt, entfernt jede Aminopeptidase Aminosäuren am Aminoterminus, wobei eine Aminosäure erhalten wird, die sich an der Aminoterminusseite des Pro-Restes befindet. Wenn Carboxypeptidase Y bei einem pH-Wert von 5,3 in Reaktion gebracht wird, wurde erkannt, dass das Enzym die Bindung zwischen Pro und Leu in Pro-Pro-Leu und die Bindung zwischen Pro und Phe in Pro-Pro-Phe wirksam spalten kann.
Wenn das längere Peptid Gln-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr und Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln der Enzymbehandlung mit Aminopeptidase und Carboxypeptidase Y (Versuche 1-11 und 1-21) unterzogen wurden, wurde die Herstellung der Tripeptide Ile-Pro-Pro oder Val-Pro-Pro ebenfalls erkannt. Das heißt, dass bestätigt wurde, dass die Tripeptide Ile-Pro-Pro und/oder Val-Pro-Pro durch gemeinsames Reagieren einer Aminopeptidase und einer Carboxypeptidase mit einem Peptid hergestellt werden können, das eine Sequenz besitzt, die mit einem Teil der Caseinsequenz identisch ist und die Sequenz Ile-Pro-Pro oder Val-Pro-Pro darin enthält, jedoch keine anderen Pro als die in dieser Sequenzen enthält.
Versuch 2 (Herstellung der Zwischenpeptide mit Proteinase)
Ein Peptid, das aus 28 Aminosäuren besteht und eine Sequenz besitzt, die mit einem Teil der Caseinsequenz identisch ist und die Sequenz Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro darin besitzt, wurde mit einem automatischen Peptidsynthesegerät Modell PPSQ-10 chemisch synthetisiert. Die Sequenz des synthetisierten Peptids lautet wie folgt: Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys (SEQ ID NO: 28).
Dieses synthetische Peptid wurde mit verschiedenen, im Handel erhältlichen Proteinaseformulierungen umgesetzt, wobei nach einer Proteinase gesucht wurde, die ein Peptid herstellen kann, das die Sequenz Ile-Pro-Pro oder Val-Pro-Pro darin enthält, das aber darin kein anderes Pro außer das in diesen Sequenzen enthält.
Das bedeutet, dass 0,1 μl/ml von jedem Enzym zu 10 μg/ml des synthetischen Peptids (in 100 mM Phosphatpuffer, pH6,1) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde bei 37°C 5 Stunden lang umgesetzt, um eine umgesetzte Flüssigkeit zu erhalten. Die umgesetzte Flüssigkeit wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Die Fraktionen der nachgewiesenen Peptidpeaks wurden gesammelt und eine Aminosäuresequenzanalyse wurde mit dem automatischen Peptidanalysegerät Modell PPSQ-10 durchgeführt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, dass ein Peptid Val-Pro-Pro-Phe-Leu als Peptid, das die Sequenz Val-Pro-Pro enthält, und die Peptide Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr und Ile-Pro-Pro-Leu-Thr als Peptid, das die Sequenz Ile-Pro-Pro enthält, in dem Reaktionsgemisch hergestellt wurden, wenn Papain (hergestellt von Sigma Chemical Co.) verwendet wurde.
Versuch 3 (Behandlung des Zwischenpeptids mit der Peptidase)
Die umgesetzte Flüssigkeit, die mit Papain als Proteinase in Versuch 2 hergestellt wurde, wurde bei 100°C 5 Minuten lang erhitzt, um die Proteinase zu inaktivieren. Aminopeptidase A (hergestellt von Sigma Chemical Co.) wurde dem Gemisch zu 0,1 μg/ml zugegeben und die Umsetzung erfolgte bei 37°C 3 Stunden. Nach Abschluss der Umsetzung wurde 1 N Salzsäure zum Einstellen des pH-Werts auf 5,3 zugegeben. Carboxypeptidase Y wurde dem Gemisch bei 0,1 μg/ml zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C 10 Stunden lang weiterhin umgesetzt. Die resultierende umgesetzte Flüssigkeit wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter den gleichen Bedingungen wie in Versuch 1 analysiert. Als Ergebnis wurden Peptidpeaks, die von den Tripeptiden Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro zu stammen scheinen, nachgewiesen. Die Fraktionen der nachgewiesenen Peaks wurden gesammelt und eine Aminosequenzanalyse wurde mit dem automatischen Peptidanalysegerät Modell PPSQ-10 durchgeführt. Es wurde bestätigt, dass diese Peaks von den Tripeptiden Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro stammen.
Versuch 4 (Durchmustern von Milchsäurebakterien-Peptidasen, die die Tripeptide Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro von dem Zwischenpeptid herstellen)
Peptidasen, die von dem Milchsäurebakterium Lactobacillus helveticus stammen, wurden gemäß dem folgenden Verfahren durchmustert, um nach einer Peptidase zu suchen, die für die vorliegende Erfindung angewendet werden kann. (Extraktion und Fraktionierung der Enzyme von Lactobacillus helveticus) Ein Milchmedium, das 9 Gew.-% fettarme Milch enthielt, wurde mit dem Milchsäurebakteriumstamm CM4 von Lactobacillus helveticus (hinterlegt beim National Institute of Bioscience and Human Technology (1-3, Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6060 am 15. August 1997) (hierin nachfolgend als CM4-Stamm bezeichnet) beimpft. Die Bakterien wurden bei 37°C 24 Stunden lang gezüchtet. Dem CM4-Stamm wurde die vorstehend genannte Zugangsnummer unter dem Budapester Vertrag zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentierungsverfahrens zugewiesen. Jegliche Beschränkungen hinsichtlich der Zugänglichkeit dieses Stammes für die Öffentlichkeit werden durch Erteilung des Patents unwiderruflich aufgehoben. Das Kulturgemisch wurde mit 5 Gew.-% zu 500 ml eines frischen Milchmediums mit 9 Gew.-% zugegeben. Die pH-Stat-Züchtung erfolgte bei 37°C und bei einem pH-Wert von 6,5. Fünf Stunden nach Beginn der pH-Stat-Züchtung wurde Natriumcitrat zugegeben, so dass die Endkonzentration davon 2 Gew.-% betrug. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur gerührt. Nach der Bestätigung, dass die Kulturflüssigkeit klar wurde, wurden die Zellkörper durch Zentrifugieren bei 5000 g für 10 Minuten gesammelt. Die Zellkörper wurden zweimal mit 50 mM Phosphatpuffer gewaschen, der 150 mM NaCl, pH 6,8, enthielt, und in 20 ml 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, suspendiert und anschließend mit einem Ultraschallbrecher (Modell 5203, hergestellt von Ohtake Works Co.) aufgebrochen. Eine Zentrifugation wurde bei 15.000 g für 10 Minuten zum Entfernen des Niederschlags durchgeführt, und der Überstand wurde als Rohextrakt gesammelt. 5 ml des Rohextrakts wurden durch 1 ml einer DEAE-Sepharosesäule (hergestellt von Pharmacia Corporation) geschickt, die zuvor mit dem Tris-Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 5 ml des Tris-Puffers gewaschen und anschließend aufeinanderfolgend zur Fraktionierung mit 3 ml Tris-Puffer gewaschen, der 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM und 500 mM NaCl enthielten. Als Ergebnis wurden 6 Fraktionen (Fraktionen 1 bis 6), wie in Tabelle 2 gezeigt, erhalten.
(Verdau des Zwischenpeptids)
Ein Zwischenpeptid Val-Pro-Pro-Phe-Leu wurde chemisch synthetisiert. Das synthetisierte Peptid wurde bei 10 μg/ml in 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,1) aufgelöst. Diese Lösung und eine der Fraktionen 1 bis 6 wurden bei dem Volumenverhältnis von 9:1 vermischt und bei 37°C 30 Minuten lang umgesetzt. Nach Beenden der Umsetzung wurde die umgesetzte Flüssigkeit mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatoraphie (HPLC) analysiert, um die Erzeugung des Tripeptids Val-Pro-Pro zu bestätigen. Die Menge des erzeugten Tripeptids Val-Pro-Pro wurde als eine relative Menge durch Multiplizieren der Höhe des Peaks (mm) des Tripeptids Val-Pro-Pro, die bei der HPLC-Retentionszeit von 11,0 min nachgewiesen wurde, mit dem Volumen des Eluierungsmittels (ml) errechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Als Ergebnis wurde bei der Analyse einer Flüssigkeit, die mit den Fraktionen 2 bis 5 umgesetzt wurde, ein Peptidpeak, der die Peptidaseaktivität zeigt, die das Tripeptid Val-Pro-Pro erzeugt, erkannt Diese Fraktionen enthielten eine Endopeptidase, die an der Umsetzung für die Herstellung des Tripeptids Val-Pro-Pro von dem Peptid Val-Pro-Pro-Phe-Leu beteiligt war. Insbesondere enthielt Fraktion 4 etwa 0,01 μg der Endopeptidase.
Anschließend wurde Fraktion 4, die die stärkste Peptidaseaktivität besaß, mit anderen chemisch synthetisierten Zwischenpeptiden als Substrate umgesetzt, und die umgesetzte Flüssigkeit wurde mittels HPLC zum Nachweis der Erzeugung des Tripeptids Ile-Pro-Pro oder Val-Pro-Pro, wie vorstehend beschrieben, analysiert. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass das Tripeptid Val-Pro-Pro von den Peptiden Val-Pro-Pro-Phe-Leu und Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln hergestellt wurde. Weiterhin wurde bestätigt, dass das Tripeptid Ile-Pro-Pro von den Peptiden Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr und Ile-Pro-Pro-Leu-Thr erzeugt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Versuch 5 (Herstellung der Tripeptide Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro mit der Kombination aus der Proteinase und des von L. helveticus stammenden Peptidaseenzyms
Zu 10 μg/ml des synthetischen Peptids, das aus 28 Aminosäuren besteht und das das gleiche wie das in Versuch 2 verwendete Peptid (in 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,1) ist, wurde jedes der im Handel erhältlichen Proteinaseenzyme für die Herstellung von Lebensmitteln, wie in Tabelle 4 gezeigt, zu 0,1 μg/ml zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C 5 Stunden lang umgesetzt. Nach Beenden der Reaktion wurde die umgesetzte Flüssigkeit bei 100°C 5 Minuten lang erhitzt, um die Proteinase zu inaktivieren, und anschließend mit der in Versuch 4 erhaltenen Fraktion 4 umgesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde anschließend mittels HPLC zum Nachweis der Herstellung der Tripeptide Ile-Pro-Pro oder Val-Pro-Pro analysiert. Die Existenz der Tripeptide in jeder der umgesetzten Flüssigkeiten ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

1) hergestellt von Sigma Chemical Co.
2) hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.
3) hergestellt von Hankyu Kyoi Bussan Co., Ltd.

Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Zwei-Schritt-Reaktion der Proteinase und die in Versuch 4 erhaltene Fraktion 4 die Tripeptide Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro herstellen können, wenn Protease A (die von Aspergillus oryzae stammt, hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), Protease M (die von Aspergillus oryzae stammt, hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) und Protease P (die von Aspergillus melleus stammt, hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) sowie Papain als Proteinase verwendet wurden. Die Tripeptide Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro wurden nicht erhalten, wenn andere Proteinasen verwendet wurden.
Beispiel 1
(Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro aus Casein -1)
50 mg Casein (Produktname „Sunlact S", hergestellt von Taiyo Kagaku Co., Ltd.) wurden in 10 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gelöst und mit 0,2 mg Papain (hergestellt von Sigma Chemical Co.) vermischt. Das Gemisch wurde bei 37°C 12 Stunden lang umgesetzt. Nach Beenden der Umsetzung wurde die Flüssigkeit bei 100°C 3 Minuten lang erhitzt und anschließend schnell abgekühlt, um das Enzym zu inaktivieren. 10 ml der umgesetzten Flüssigkeit wurden anschließend durch eine Seppak-C18-Patrone (hergestellt von Waters Corporation) geschickt. Die adsorbierten Peptide wurden mit 5 ml 30 Volumenprozent Aceotnitril eluiert. Acetonitril wurde von den Fraktionen des eluierten Peptids abdestilliert. Die Fraktion wurde anschließend in 1 ml 50 mM Tris-Cl (pH 8,0) gelöst, mit jeweils 0,1 μg/ml der Aminopeptidase I (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) und Carboxypeptidase Y (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) vermischt und bei 37°C 12 Stunden lang umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde die Flüssigkeit mit dem folgenden HPLC-Verfahren zur Quantifizierung der Menge der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro analysiert.
(Quantifizierung von Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro mittels HPLC)
Die Probe wurde nacheinander mit dem HPLC-Eluierungsmittel (wässrige Lösung, enthaltend 0,3 M NaCl und 0,05 Gew.-% TFA) verdünnt. Die quantitative Analyse erfolgte durch Messen der Höhe des Peaks der Tripeptide Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro unter Verwendung synthetischer Peptide als Standardproben. Die HPLC-Bedingungen für die quantitative Analyse lauteten wie folgt:
Verwendetes Gerät: Hitachi L4000 UV-Nachweisgerät (215 nm)
L6200 Intelligent-Pumpe
L5030-Säulenofen (35°C)
Trennungsbedingung: Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min
Eluierungsmittel: Wässrige Lösung, enthaltend 0,3 M NaCl und 0,05 Gew.-% TFA
Säule: Asahipak GS320 (ø 3,9 × 600 mm) (hergestellt von Showa Denko K.K.)
Als Ergebnis fand man heraus, dass die umgesetzte Flüssigkeit 50 μg des Tripeptids Val-Pro-Pro und 50 g des Tripeptids Ile-Pro-Pro pro 50 mg Casein enthielt. Casein, insbesondere beta-Casein, schließt jede der Sequenzen Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro ein. Wenn die Tripeptide Ile-Pro-Pro und Val-Pro-Pro von 100% dieser Sequenzen hergestellt werden, beträgt die theoretische Menge der Tripeptidherstellung etwa 4 mg pro 1 g Casein. Somit wurde die Ausbeute dieses Versuchs mit 25% für beide Tripeptide gemäß der folgenden Gleichung errechnet: Ausbeute = (gemessene Menge/theoretische Menge) × 100 (%) Val Pro Pro = 0,05 mg/(4 mg × 50 mg/1000 mg) × 100 (%) = 25% Ile Pro Pro = 0,05 mg/(4 mg × 50 mg/1000 mg) × 100 (%) = 25%
Beispiel 2
(Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro von Casein -2)
50 mg Casein (Produktname „Sunlact S", hergestellt von Taiyo Kagaku Co., Ltd.) wurden in 10 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gelöst und mit 0,2 mg Papain (hergestellt von Sigma Chemical Co.) vermischt. Das Gemisch wurden bei 37°C 12 Stunden lang umgesetzt. Nach Beenden der Umsetzung wurde die Flüssigkeit bei 100°C 3 Minuten lang erhitzt und anschließend schnell abgekühlt, um das Enzym zu inaktivieren. 10 ml der umgesetzten Flüssigkeit wurden anschließend durch eine Seppak-C18-Patrone (hergestellt von Waters Corporation) geschickt. Die adsorbierten Peptide wurden mit 5 ml 30 Vol.-% Acetonitril eluiert. Acetonitril wurde von den Fraktionen des eluierten Peptids abdestilliert. Die Fraktion wurde anschließend mit 1 ml der gereinigten Enzymfraktion, die von in Versuch 4 erhaltenen Lactobacillus helveticus (Fraktion 4) extrahiert wurde, vermischt und bei 37°C 12 Stunden lang umgesetzt. Die umgesetzte Flüssigkeit enthielt 50 μg des Tripeptids Val-Pro-Pro (Ausbeute 25%) und 195 μg des Tripeptids Ile-Pro-Pro (Ausbeute 97,5%) pro 50 mg Casein.
Beispiel 3
(Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro von Casein -3)
50 mg Casein (Produktname „Sunlact S", hergestellt von Taiyo Kagaku Co., Ltd.) wurden in 10 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gelöst und mit 0,2 mg Papain (hergestellt von Sigma Chemical Co.) vermischt. Das Gemisch wurde bei 37°C 12 Stunden lang umgesetzt. Nach Beenden der Umsetzung wurde die Flüssigkeit bei 100°C 3 Minuten lang erhitzt und anschließend schnell abgekühlt, um das Enzym zu inaktivieren. Die Flüssigkeit wurde anschließend mit 1 ml der gereinigten Enzymfraktion vermischt, die von Lactobacillus helveticus extrahiert wurde, das in Versuch 4 (Fraktion 4) erhalten wurde, und bei 37°C 12 Stunden lang umgesetzt. Die umgesetzte Flüssigkeit enthielt 50 μg des Tripeptids Val-Pro-Pro (Ausbeute 25%) und 50 μg des Tripeptids Ile-Pro-Pro (Ausbeute 25%) pro 50 mg Casein.
Beispiele 4-6
(Herstellung der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro von Casein -4)
150 mg Casein (Produktname „Sunlact S", hergestellt von Taiyo Kagaku Co., Ltd.) wurden in 30 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gelöst. Das Gemisch wurde in 10 ml-Aliquote aufgeteilt. Jedes Aliquot wurde mit jeweils 0,2 mg von Protease A (Beispiel 4), Protease M (Beispiel 5) oder Protease P (Beispiel 6) (Produktnamen, hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd) vermischt. Das Gemisch wurde bei 37°C 12 Stunden lang umgesetzt. Nach Beenden der Umsetzung wurde die Flüssigkeit bei 100°C 3 Minuten lang erhitzt und anschließend schnell abgekühlt, um das Enzym zu inaktivieren. Die Flüssigkeit wurde mit 1 ml der gereinigten Enzymfraktion vermischt, die von Lactobacillus helveticus extrahiert wurde, das in Versuch 4 (Fraktion 4) erhalten wurde, und bei 37°C 12 Stunden lang umgesetzt. Der Gehalt an den Tripeptiden Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro pro 50 mg Casein in der umgesetzten Flüssigkeit betrug 40 μg (Ausbeute 20%) bzw. 45 μg (Ausbeute 22,5%) in Beispiel 4, 37 μg (Ausbeute 18,5%) bzw. 50 μg (Ausbeute 25%) in Beispiel 5 und 42 μg (Ausbeute 21%) bzw. 45 μg (Ausbeute 22,5%) in Beispiel 6.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro-Verfahren zur Herstellung eines Tripeptids durch Verdau von Material, das Milchcasein enthält, mit einer isolierten Proteinase und einer isolierten Peptidase, um mindestens eines der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro zu erhalten, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Verdau des Materials, das das Milchcasein enthält, mit der Proteinase, um ein Zwischenpeptid herzustellen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Peptid, das eine Sequenz Val-Pro-Pro enthält, jedoch keine anderen Proline als die in dieser Sequenz enthält, einem Peptid, das eine Sequenz Ile-Pro-Pro enthält, jedoch keine anderen Proline als die in dieser Sequenz enthält, und Gemischen davon, und Verdau des Zwischenpeptids mit der Peptidase zur Herstellung von mindestens einem der Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro, wobei die Peptidase a) eine Aminopeptidase und eine Carboxypeptidase; b) eine Endopeptidase; oder c) ein Gemisch aus a) und b) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Papain, Protease A, hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Protease M, hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Protease P, hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd., und Gemischen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zwischenpeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus denen, die durch SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 27 dargestellt werden, und Gemischen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Carboxypeptidase in der Lage ist, eine Bindung zwischen Pro und Xaa in mindestens einer der Sequenzen Val-Pro-Pro-Xaa und Ile-Pro-Pro-Xaa zu schneiden (wobei Xaa jede beliebige Aminosäure bedeutet).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Peptidase aus dem lebenden Organismus des Milchsäurebakteriums Lactobacillus helveticus stammt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Milchsäurebakterium Lactobacillus helveticus als CM4-Stamm identifiziert ist, der am National Institute of Bioscience and Human-Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6060 hinterlegt wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren des Weiteren den Schritt der Erhöhung der Konzentration des Zwischenpeptids umfasst, unter Verwendung eines hydrophoben Harzes nach dem Verdau des Materials, das Milchcasein enthält, mit der Protease zur Herstellung des Zwischenpeptids und vor Durchführung des Verdaus mit der Peptidase.