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Hintergrund der Erfindung
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Die
Erfindung liegt auf dem technischen Gebiet der Rekonstruktion von
künstlichen
Organen durch Perfundieren von kultivierten Zellpopulationen in
dezellularisierte Gerüste,
die aus gewonnenen Tier- oder
Leichenorganen gebildet worden sind. Die Erfindung eignet sich insbesondere
zur Konstruktion von künstlichen
Nieren für
Implantationszwecke.
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Der
Ausdruck "akutes
Nierenversagen" bezieht
sich auf die Zerstörung
der normalen Nierenfunktion. Dieser klinische Zustand entsteht aufgrund einer
Vielzahl von Mechanismen, einschließlich Infektionen, Kreislaufversagen
(Schock), Gefäßblockaden,
Glomerulonephritis und Behinderung des Urinflusses. Ein akutes Nierenversagen
tritt häufig
als eine Komplikation bei Bauch- und Gefäßoperationen auf. Von besonderer
klinischer Bedeutung sind Fälle von
akutem Nierenversagen in Verbindung mit Traumata, Sepsis, postoperativen
Komplikationen oder Medikationen, insbesondere Antibiotika.
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Postoperative
Komplikationen, wie Infektionen, werden durch Verwendung von komplexen
Arzneistoffen, wie Antibiotika, überwunden.
Ungünstigerweise
können
diese Arzneistoffe für
die Nieren toxisch sein, insbesondere bei älteren Personen. Aufgrund des
zunehmenden Alters der Krankenhauspatienten und aufgrund der Fortschritte
in bezug auf komplizierte medizinische und chirurgische Techniken
ist zu erwarten, dass die Anzahl und Bedeutung der Fälle mit
akutem Nierenversagen zunimmt, wenn keine Fortschritte in der Behandlung
erzielt werden.
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Die
Behandlung von akutem Nierenversagen beinhaltet typischerweise eine
Dialyse, bei der Abfallprodukte und Chemikalien aus dem Blutsystem
entfernt werden. Trotz einiger Fortschritte hat sich seit vielen
Jahren die Sterblichkeitsrate in Verbindung mit Nierenkrankheiten
kaum geändert.
Während
eine Dialyse eine Möglichkeit
bietet, Abfallprodukte und Chemikalien herauszufiltern, bringt die
typische Behandlungsweise für
die meisten Patienten erhebliche Unannehmlichkeiten mit sich. Üblicherweise
sind mit der Behandlung lange Zeiträume verbunden, in denen der
Patient an die Dialyseanlage angeschlossen ist. Das Dialyseverfahren
wird mehrmals pro Woche wiederholt. In zahlreichen Fällen treten
bei den Patienten Nebenwirkungen auf, wie Muskelkrämpfe und Hochdruck
in Verbindung mit der raschen Veränderung der Körperflüssigkeiten
des Patienten.
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Eine
Nierentransplantation stellt eine Alternative zur Dialyse dar. Dies
beinhaltet das Ersetzen der Niere des Patienten durch eine gesunde
Niere eines Spenders, sofern diese verfügbar ist. Die implantierte
Niere erfüllt
dann die Funktionen wie die eigene Niere des Patienten, nämlich die
Filtration von Blut und die Bildung von Urin. Unglücklicherweise
stellt eine Nierenabstoßung
ein erhebliches Risiko bei einer Transplantation dar, selbst wenn
eine gute Übereinstimmung
in bezug auf die Histokompatibilität besteht. Immunosuppressiva,
wie Cyclosporin und FK506, werden üblicherweise dem Patienten
zur Verhinderung einer Abstoßung
verabreicht. Jedoch haben diese Immunosuppressiva ein geringes therapeutisches
Fenster zwischen angemessener Immunosuppression und Toxizität. Eine
längere
Immunosuppression kann die Immunsysteme schwächen, was eine Bedrohung in
bezug auf die Entwicklung von Infektionen darstellen kann. In einigen
Fällen reicht
selbst eine Immunosuppression nicht aus, um eine Nierenabstoßung zu
verhindern.
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In
dem Bestreben, die mit Dialyse und Nierentransplantation verbundenen
Probleme zu vermeiden, wurden verschiedene Verfahren beschrieben,
bei denen eigene Nierenzellen des Patienten in vitro gezüchtet werden.
Beispielsweise beschreibt das
US-Patent
5 429 938 (Humes) ein Verfahren zur Rekonstruktion von
renalen Tubuli unter Verwendung von gezüchteten Nierenzellen. Die rekonstruierten renalen
Tubuli können
dann dem Patienten implantiert werden.
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Naughton
et al. beschreiben ein dreidimensionales Gewebekultursystem, in
dem Stromazellen über
ein Polymer-Trägersystem
geschichtet werden (
US-Patent
5 863 531 ).
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Vacanti
et al. beschreiben Verfahren zum Züchten von Zellen in einer dreidimensionalen
Matrix, die aus einem biologisch abbaubaren Polymeren besteht. Organzellen
werden zunächst
innerhalb der Matrix gezüchtet
und sodann dem Patienten implantiert.
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Die
vorstehenden Verfahren stützen
sich auf die Formung der Trägerstruktur
zur gewünschten Konfiguration
des Organs. Die korrekte dreidimensionale Konfiguration ist wesentlich
dafür,
dass das rekonstruierte Organ in vivo einwandfrei funktioniert. Es
muss nicht nur die Gestalt zur Körperhöhle passen,
sondern die Gestalt schafft auch die nötige Mikroumgebung dafür, dass
die kultivierten Zellen wachsen und sich vermehren.
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Somit
besteht ein Bedürfnis
zur Rekonstruktion von künstlichen
Organen, die die gleiche dreidimensionale Infrastruktur wie das
native Organ aufweisen. Ferner besteht ein Bedürfnis zur Rekonstruktion eines
künstlichen
Organs zur Verwendung als dauerhaftes Ersatzprodukt für ein Organ.
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Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum
Rekonstruieren von künstlichen
Organen unter Verwendung eines dreidimensionalen Gerüstes, das
durch Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur erzeugt
worden ist, bereit. Das dreidimensionale Gerüst wird mit einer Population
von kultivierten Endothelzellen perfundiert, die an das dreidimensionale
Gerüst
binden und eine Endothelgewebeschicht bilden. Eine fortgesetzte Züchtung und
Differenzierung der Endothelzellen am dreidimensionalen Gerüst führt zur
Bildung eines primitiven Gefäßsystems
in der Endothelgewebeschicht. Das primitive Gefäßsystem kann sich zu einem
reifen Gefäßsystem
entwickeln und kann ferner das Wachstum und die Entwicklung von
zusätzlichen kultivierten
Zellpopulationen unterstützen.
Das dreidimensionale Gerüst
und die Endothelgewebeschicht mit dem primitiven Gefäßsystem
können
zum in vitro- und in vivo-Züchten
einer Vielzahl von verschiedenen Zellen verwendet werden.
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Demzufolge
betrifft die Erfindung gemäß einem
Aspekt ein Verfahren zum Rekonstruieren eines künstlichen Organkonstrukts,
welches umfasst:
Perfundieren einer Population von kultivierten
Endothelzellen in das durch Dezellularisieren einer natürlichen
Biostruktur gebildete dreidimensionale Gerüst, so dass Endothelzellen
an das dreidimensionale Gerüst
binden;
Kultivieren der Endothelzellen in dem dreidimensionalen
Gerüst,
bis die Endothelzellen eine Endothelgewebeschicht bilden, die ein
primitives Gefäßsystem
umfasst;
Einimpfen mindestens einer weiteren zweiten Population
von kultivierten Zellen in das dreidimensionale Gerüst, so dass
die zweite Zellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das
primitive Gefäßsystem enthält, bindet
und in eine neomorphe Organstruktur differenziert.
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Während des
in vitro-Wachstums kommt es bei den Endothelzellen zur Entwicklung
und zur Erzeugung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives
Gefäßsystem
umfasst, das das dreidimensionale Gerüst einhüllt. Das dreidimensionale Gerüst ist aus
einem biologisch verträglichen, nicht-abbaubaren
Material zusammengesetzt. Die Endothelgewebeschicht liefert auch
ein primitives Gefäßsystem, das
zur Entwicklung eines reifen Gefäßsystems
befähigt
ist, das das Wachstum und die Entwicklung von weiteren kultivierten
Zellpopulationen unterstützt.
Bei der Züchtung
in diesem dreidimensionalen Gerüst kommt
es dazu, dass die proliferierenden Zellen reifen und einer einwandfreien
Segregation unter Bildung von Geweben, die analog zu in vivo auftretenden
Gegenstücken
sind, unterliegen.
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Die
Erfindung beruht teilweise auf dem Befund, dass ein Wachstum von
Endothelzellen in dezellularisierten, dreidimensionalen Gerüsten die
aktive Proliferation von zusätzlichen
Zellpopulationen stützt.
Dies kann teilweise auf die vergrößerte Oberfläche des
natürlichen,
von der Biostruktur abgeleiteten Gerüstes zurückzuführen sein, was eine verlängerte Periode
der aktiven Proliferation von Endothelzellen ermöglicht. Die verlängerte Proliferation
macht es den Endothelzellen möglich,
ein primitives Gefäßsystem
zu entwickeln. Das primitive Gefäßsystem unterstützt anschließend das
Wachstum und die Entwicklung von zusätzlichen kultivierten Zellpopulationen.
Ferner ermöglicht
die dreidimensionale Beschaffenheit der dezellularisierten Biostruktur
eine räumliche
Verteilung, die der Verteilung unter in vivo-Bedingungen entspricht,
was die Bildung einer Mikroumgebung gestattet, die zu einer zellulären Reifung
und Wanderung führt.
Ein optimales Wachstum und Entwicklung von Zellen ergeben sich,
wenn die Infrastruktur der Mikroumgebung der Infrastruktur eines
natürlichen
Organs gleicht. Dies sorgt für
die richtigen räumlichen
Abstände,
die das Auftreten von Zell-Zell-Wechselwirkungen
ermöglichen.
Das Wachstum von Zellen in Gegenwart dieses Gerüstes kann ferner durch Zugabe
von Proteinen, Glycoproteinen, Glycosaminoglycanen und einer zellulären Matrix
verstärkt
werden.
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Gemäß einer
Ausführungsform
handelt es sich bei der natürlichen
Biostruktur um ein Organ, das aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter
und Harnröhre
besteht. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
handelt es sich bei der natürlichen Biostruktur
um einen Teil eines Organs, das aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter
und Harnröhre
besteht. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich beim künstlichen
Organkonstrukt um ein künstliches
Nierenkonstrukt. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
leitet sich das dreidimensionale Gerüst von einer dezellularisierten
Säugetierniere
ab. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei den Endothelzellen um humane Endothelzellen.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst die zweite Population humane Nierenzellen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein künstliches Organkonstrukt, das
folgendes umfasst: ein dreidimensionales Gerüst, gebildet durch Dezellularisieren
einer natürlichen
Biostruktur, die mit einer Population von kultivierten Endothelzellen
perfundiert worden ist, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale
Gerüst
unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, bindet, und mindestens eine weitere zweite Population von
kultivierten Zellen, so dass die zweite Zellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die
das primitive Gefäßsystem
umfasst, bindet und in eine neomorphe Organstruktur differenziert.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Rekonstruieren
einer künstlichen
Niere, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
Perfundieren
einer Population von kultivierten Endothelzellen in ein dreidimensionales
Gerüst,
das durch Dezellularisieren einer Säugetierniere gebildet worden
ist, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst binden;
Kultivieren
der Endothelzellen im dreidimensionalen Gerüst, bis die Endothelzellen
eine Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, bilden;
Einimpfen einer Population von kultivierten
Nierenzellen in das dreidimensionale Gerüst, so dass die Nierenzellpopulation
an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem
umfasst, bindet und in Nephronstrukturen differenziert.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung
eines Subjekts mit einer Nierenstörung, umfassend:
Implantieren
eines dreidimensionalen Gerüstes,
gebildet durch Dezellularisieren einer Säugetierniere, die mit einer
Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert ist, so dass
die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht,
die ein primitives Gefäßsystem umfasst,
binden, und einer Population von kultivierten Nierenzellen, so dass
die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive
Gefäßsystem
umfasst, bindet und zu Nephronstrukturen differenziert; und Überwachen
des Subjekts in bezug auf eine Modulation der Nierenstörung.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein künstliches Nierenkonstrukt,
das folgendes umfasst:
ein dreidimensionales Gerüst, gebildet
durch Dezellularisieren einer Säugetierniere,
die mit einer Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert
worden ist, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter
Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, bindet, und eine Population von kultivierten Nierenzellen,
so dass die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die
das primitive Gefäßsystem umfasst,
bindet und zu Nephronstrukturen differenziert.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screening
einer Verbindung, welche Nierenzellen moduliert, wobei das Verfahren
folgendes umfasst:
Bereitstellen eines künstlichen Nierenkonstrukts
mit einem dreidimensionalen Gerüst,
gebildet durch Dezellularisieren einer Säugetierniere, die mit einer
Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert worden ist,
so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter
Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, binden, und eine Population von gezüchteten Nierenzellen, so dass
die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive
Gefäßsystem
umfasst, bindet und zu Nephronstrukturen differenziert;
Kontaktieren
des künstlichen
Nierenkonstrukts mit einer Bibliothek von Testverbindungen; und
Selektieren
einer interessierenden Verbindung, die Nierenzellen moduliert, aus
der Bibliothek von Testverbindungen.
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Gemäß einer
Ausführungsform
ist der Modulator für
die Nierenzellen zytotoxisch. Gemäß einer weiteren Ausführungsform
wirkt der Modulator auf die Nierenzellen therapeutisch. Gemäß einer
Ausführungsform
handelt es sich bei der Verbindung um ein chemisches Mittel oder
um ein pharmazeutisches Mittel.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verarbeiten
einer wässrigen
Lösung, das
folgendes umfasst:
Bereitstellen eines künstlichen Nierenkonstrukts
mit einem dreidimensionalen Gerüst,
das durch Dezellularisieren einer Säugetierniere, die mit einer
Population von kultivierten Endothelzellen, so dass die Endothelzellen
an das dreidimensionale Nierengerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht,
die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, binden, und mit einer Population von kultivierten Nierenzellen
perfundiert worden ist, so dass die Nierenzellpopulation an die
Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, bindet und
in Nephronstrukturen differenziert;
Bereitstellen der wässrigen
Lösung
an der luminalen Seite des künstlichen
Nierenkonstrukts; und
Gewinnen einer verarbeiteten wässrigen
Lösung
aus der abluminalen Seite des künstlichen
Nierenkonstrukts.
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Gemäß einer
Ausführungsform
handelt es sich bei der wässrigen
Lösung
um unfiltriertes Blut und bei der verarbeiteten wässrigen
Lösung
um filtriertes Blut.
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Ausführliche
Beschreibung
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Zum
leichteren Verständnis
der Erfindung werden zunächst
bestimmte Ausdrücke
definiert.
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Die
hier verwendeten Ausdrücke "Bindung" oder "Binden" beziehen sich auf
Zellen, die direkt am dreidimensionalen Gerüst haften oder an Zellen, die selbst
an anderen Zellen haften.
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Die
hier verwendeten Ausdrücke "dezellularisiert" oder "Dezellularisierung" beziehen sich auf eine
Biostruktur (z. B. ein Organ oder Teil eines Organs), aus der der
Zell- und Gewebeinhalt entfernt worden ist, wobei eine intakte,
azelluläre
Infrastruktur zurückbleibt.
Organe, wie die Niere, sind aus verschiedenen spezialisierten Geweben
zusammengesetzt. Die spezialisierten Gewebestrukturen eines Organs
oder das Parenchym sorgen für
die spezifische Funktion, die mit dem Organ verbunden ist. Das stützende faserartige
Netzwerk des Organs ist das Stroms. Die meisten Organe weisen ein
stromales Gerüst
aus unspezialisiertem Bindegewebe auf, das das spezialisierte Gewebe
stützt.
Beim Vorgang der Dezellularisierung wird das spezialisierte Gewebe entfernt,
wobei das komplexe, dreidimensionale Netzwerk des Bindegewebes zurückbleibt.
Die Bindegewebe-Infrastruktur ist vorwiegend aus Kollagen zusammengesetzt.
Die dezellularisierte Struktur sorgt für ein biokompatibles Substrat,
auf das verschiedene Zellpopulationen infundiert werden können. Dezellularisierte
Biostrukturen können
starr oder halbstarr sein und die Fähigkeit besitzen, ihre Gestalt
zu verändern.
Zu Beispielen für
dezellularisierte Organe, die erfindungsgemäß geeignet sind, gehören (ohne
Beschränkung
hierauf) Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter und
Harnröhre.
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Der
hier verwendete Ausdruck "dreidimensionales
Gerüst" bezieht sich auf
die restliche Infrastruktur, die entsteht, wenn eine natürliche Biostruktur,
z. B. ein Organ, dezellularisiert wird. Dieses komplexe, dreidimensionale
Gerüst
liefert das Stützgerüst, das
es möglich
macht, dass Zellen daran binden und darauf wachsen. Kultivierte
Populationen von Zellen können
auf dem dreidimensionalen Gerüst
gezüchtet
werden, das die genauen Zwischenraumabstände bereitstellt, die für die Zell-Zell-Wechselwirkung erforderlich
sind. Dadurch ergibt sich ein rekonstruiertes Organ, das dem nativen
in vivo-Organ gleicht. Dieses dreidimensionale Gerüst wird
mit einer Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert,
die wachsen und sich entwickeln, wodurch sich eine Endothelgewebeschicht
ergibt, die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, das dazu in der Lage ist, sich zu einem reifen Gefäßsystem
zu entwickeln. Die Endothelgewebeschicht und das primitive Gefäßsystem
sind ferner dazu befähigt,
das Wachstum und die Entwicklung mindestens einer weiteren kultivierten
Zellpopulation zu unterstützen.
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Der
hier verwendete Ausdruck "primitives Gefäßsystem" bezieht sich auf
die frühen
Stadien der Entwicklung eines Gefäßsystems, das Blutgefäße umfasst,
die die Gewebestrukturen mit Blut versorgen.
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Der
hier verwendete Ausdruck "natürliche Biostruktur" bezieht sich auf
eine biologische Anordnung innerhalb eines Subjekts, z. B. auf Organe,
einschließlich
(ohne Beschränkung
hierauf) Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter und
Harnröhre.
Der Ausdruck "natürliche Biostruktur" soll auch Teile
von Biostrukturen umfassen, z. B. Teile von Organen, wie die renale
Arterie einer Niere.
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Der
hier verwendete Ausdruck "neomorphe Organstruktur" bezieht sich auf
eine Komponente des Parenchymalgewebes. Die neomorphe Organstruktur
entsteht, wenn Zellen, die das Parenchymgewebe bilden, einer Differenzierung
in verschiedene Verbände
unterliegen. Beispielsweise weist eine natürliche Niere die Medulla- und
Cortex-Regionen auf, die entstehen, wenn Nierenzellen unter Bildung
von Nephron-Strukturen differenzieren. Die Nephron-Struktur weist
die Bowman-Kapsel, das distale Tubuluskonvulut, die Henle-Schleife,
das proximale Tubuluskonvulut und Sammelleitungen auf.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Subjekt" ist so zu verstehen,
dass er lebende Organismen umfasst, in denen eine Immunantwort herbeigeführt wird.
Bevorzugte Subjekte sind Säuger.
Zu Beispielen für
Subjekte gehören
(ohne Beschränkung
hierauf), Menschen, Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Rinder, Pferde,
Schweine, Ziegen und Schafe.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum
Rekonstruieren von künstlichen
Organen bereit. Die Rekonstruktion von künstlichen Organen umfasst die
Perfusion einer Population von kultivierten Endothelzellen in das
Gerüst,
das durch Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur gebildet
worden ist, so dass Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst binden;
das
Kultivieren der Endothelzellen im dreidimensionalen Gerüst, bis
die Endothelzellen eine Endothelgewebeschicht bilden, die ein primitives
Gefäßsystem
umfasst;
das Einimpfen mindestens einer weiteren zweiten Population
von kultivierten Zellen in das dreidimensionale Gerüst, so dass
die zweite Zellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das
primitive Gefäßsystem
umfasst, bindet und in eine neomorphe Organstruktur differenziert.
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Das
künstliche
Organ wird rekonstruiert, indem man eine dezellularisierte natürliche Biostruktur als
das dreidimensionale Gerüst
verwendet, auf das eine kultivierte endotheliale Zellpopulation
perfundiert wird. Bei der natürlichen
Biostruktur kann es sich um eine beliebige biologische Anordnung
handeln, die innerhalb eines Subjekts auftritt, z. B. um ein Organ,
wie Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter
und Harnröhre,
oder um einen Teil des Organs.
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I. Natürliche
Biostrukturen
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Die
natürliche
Biostruktur, z. B. ein Organ, lässt
sich von einem Spender der gleichen Spezies als Subjekt erhalten,
z. B. eine humane Niere eines Verstorbenen für einen humanen Nierenempfänger. Die
natürliche
Biostruktur kann auch von einer unterschiedlichen Spezies erhalten
werden, wozu (ohne Beschränkung
hierauf) Affen, Hunde, Katzen, Mäuse,
Ratten, Rinder, Pferde, Schweine, Ziegen und Schafe gehören. Die
natürliche
Biostruktur kann auch von dem Subjekt erhalten werden, das ein rekonstruiertes
Organ benötigt,
z. B. kann bei einem Subjekt mit einer funktionsgestörten Niere
und einer funktionierenden Niere die funktionsgestörte Niere entfernt
und unter Anwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens dezellularisiert
werden. Die dezellularisierte Niere des Subjekts kann als dreidimensionales
Gerüst
zum Rekonstruieren einer künstlichen
Niere verwendet werden, wobei man kultivierte Endothelzellen und
Nierenzellen, die vom Subjekt isoliert worden sind, verwendet. Die
künstliche
rekonstruierte Niere kann dem Subjekt für eine weitere Entwicklung
reimplantiert werden.
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II. Dezellularisierung von Biostrukturen
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Biostrukturen,
z. B. vollständige
Organe oder Teile von Organen, können
dezellularisiert werden, indem man den gesamten Zell- und Gewebeanteil aus
dem Organ gemäß den Angaben
in Beispiel 1 entfernt. Das Dezellularisierungsverfahren umfasst eine
Reihe von sequenziellen Extraktionen. Ein Schlüsselmerkmal dieses Extraktionsverfahrens
besteht darin, dass eine schroffe Extraktion, die die komplexe Infrastruktur
der Biostruktur beeinträchtigen
oder zerstören
kann, vermieden wird. Die erste Stufe beinhaltet die Entfernung
von zellulären
Bruchstücken
und die Solubilisierung der Zellmembran. Daran schließt sich
eine Solubilisierung der nuklearen zytoplasmatischen Komponenten
und der nuklearen Komponenten an.
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Vorzugsweise
wird die Biostruktur, z. B. ein Organ, dezellularisiert, indem man
die Zellmembran und das Organ umgebende zelluläre Bruchstücke unter Anwendung milder
mechanischer Aufbrechverfahren entfernt. Die milden mechanischen
Aufbrechverfahren müssen
ausreichen, die zelluläre
Membran aufzubrechen. Jedoch sollte das Verfahren der Dezellularisierung
eine Schädigung
oder Störung
der komplexen Infrastruktur der Biostruktur vermeiden. Milde mechanische
Aufbrechverfahren umfassen das Abschaben der Oberfläche des
Organs, das Bewegen des Organs oder das Rühren des Organs in einem geeigneten
Volumen eines Fluids, z. B. in destilliertem Wasser. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
umfasst das milde mechanische Aufbrechverfahren ein magnetisches
Rühren
(z. B. unter Verwendung eines magnetischen Rührstabs und einer Magnetrührerplatte)
des Organs in einem geeigneten Volumen an destilliertem Wasser,
bis die Zellmembran aufgebrochen ist und die zellulären Bruchstücke aus
dem Organ entfernt worden sind.
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Nachdem
die Zellmembran entfernt worden ist, werden die nuklearen und zytoplasmatischen
Bestandteile der Biostruktur entfernt. Dies kann durchgeführt werden,
indem man die zellulären
und nuklearen Komponenten ohne Aufbrechen der Infrastruktur solubilisiert.
Zur Solubilisierung der nuklearen Komponenten können nicht-ionische Detergentien oder
oberflächenaktive
Mittel verwendet werden. Zu Beispielen für nicht-ionische Detergentien oder oberflächenaktive
Mittel gehören
(ohne Beschränkung hierauf)
Produkte der Triton-Reihe der Firma Rohm und Haas, Philadelphia,
Pa., wozu Triton X-100, Triton N-101, Triton X-114, Triton X-405,
Triton X-705 und Triton DF-16 gehören, die von zahlreichen Vertreibern
bezogen werden können;
Produkte der Tween-Reihe, wie Monolaurat (Tween 20), Monopalmitat
(Tween 40), Monooleat (Tween 80) und Polyoxyethylen-23-laurylether
(Brij. 35), Polyoxyethylenether W-1 (Polyox) und dergl., Natriumcholat,
Desoxycholate, CHAPS, Saponin, n-Decyl-β-D-glucopyranosid,
n-Heptyl-β-D-glucopyranosid,
n-Octyl-α-D-glucopyranosid und
Nonidet P-40.
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Für den Fachmann
ist es ersichtlich, dass sich eine Beschreibung von Verbindungen,
die unter die vorstehenden Klassifikationen fallen, und die entsprechenden
Lieferanten sich in folgenden Literaturstellen finden: "Chemical Classification,
Emulsifiers and Detergents",
McCutcheon's Emulsifiers
and Detergents, 1986, North American and International Editions,
McCutcheon Division, MC Publishing Co., Glen Rock, N. J., USA und
Judith Neugebauer, "A Guide
to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry", Calbiochem, Hoechst
Celanese Corp., 1987. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
beim nicht-ionischen oberflächenaktiven
Mittel um ein Produkt der Triton-Reihe, vorzugsweise um Triton X-100.
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Die
Konzentration des nicht-ionischen Detergens kann je nach dem Typ
der der Dezellularisation zu unterziehenden Biostruktur verändert werden. Beispielsweise
sollte für
empfindliche Gewebe, wie Blutgefäße, die
Konzentration des Detergens verringert werden. Bevorzugte Konzentrationsbereiche
für nicht-ionische
Detergentien können
etwa 0,001 bis etwa 2,0% (Gew./Vol.), insbesondere 0,05 bis etwa 1,0%
(Gew./Vol.) und ganz besonders etwa 0,1 bis etwa 0,8% (Gew./Vol.)
betragen. Ganz besonders bevorzugt ist ein Bereich von etwa 0,001
bis etwa 0,2% (Gew./Vol.) und am meisten bevorzugt ein Bereich von
etwa 0,05 bis etwa 0,1% (Gew./Vol.).
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Die
zytoskelettale Komponente, die dichte zytoplasmatische Filament-Netzwerke, interzelluläre Komplexe
und apikale mikrozelluläre
Strukturen umfasst, kann unter Verwendung einer alkalischen Lösung, wie
Ammoniumhydroxid, solubilisiert werden. Weitere Alkalilösungen,
die aus Ammoniumsalzen oder deren Derivaten bestehen, können ebenfalls
zur Solubilisierung der zytoskelettalen Komponenten verwendet werden.
Zu Beispielen für
weitere geeignete Ammoniumlösungen
gehören
Lösungen
von Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumhydroxid. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
wird Ammoniumhydroxid verwendet.
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Die
Konzentration der alkalischen Lösungen, z.
B. Ammoniumhydroxid, kann je nach dem Typ der zu dezellularisierenden
Biostruktur verändert
werden. Beispielsweise sollte bei empfindlichen Geweben, wie Blutgefäßen, die
Konzentration des Detergens verringert werden. Bevorzugte Konzentrationsbereiche
können
etwa 0,001 bis etwa 2,0% (Gew./Vol.), insbesondere etwa 0,005 bis
etwa 0,1% (Gew./Vol.) und ganz besonders etwa 0,01 bis etwa 0,08%
(Gew./Vol.) betragen.
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Die
dezellularisierte, lyophilisierte Struktur kann bei einer geeigneten
Temperatur gelagert werden, bis sie benötigt wird. Vor der Verwendung
kann die dezellularisierte Struktur in einem geeigneten isotonischen
Puffer oder einem Zellkulturmedium äquilibriert werden. Zu geeigneten
Puffern gehören
(ohne Beschränkung
hierauf) phosphatgepufferte Kochsalzlösungen (PBS), Kochsalzlösung, MOPS,
HEPES, ausgewogene Hank-Salzlösung und
dergl. Zu geeigneten Zellkulturmedien gehören (ohne Beschränkung hierauf)
RPMI 1640, Fisher-Medium, Iscove-Medium, McCoy-Medium, Dulbecco-Medium und dergl.
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III. Kultivieren von Zellen
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Beim
rekonstruierten künstlichen
Organ kann es sich um ein allogenes Organ handeln, wobei sich die
Zellpopulationen vom eigenen Gewebe des Subjekts ableiten. Beispielsweise
können
Endothelzellen sich von Haut-, Leber-, Bauchspeicheldrüse-, Arterien-,
Venen-, Nabelschnur- oder Plazentageweben des Subjekts ableiten.
Nierenzellen können
sich auch von einer funktionsgestörten Niere des Subjekts ableiten
und in vitro kultiviert werden.
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Das
rekonstruierte künstliche
Organ kann auch xenogen sein, wobei sich die Zellpopulationen von
einer Säugetierspezies,
die sich von der des Subjekts unterscheiden, ableiten. Beispielsweise können die
verschiedenen Zellen von Organen von Säugern, wie Affen, Hunden, Katzen,
Mäusen,
Ratten, Rindern, Pferden, Schweinen, Ziegen und Schafen, abgeleitet
sein.
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Derartige
Organe lassen sich durch entsprechende Biopsie oder bei der Autopsie
erhalten. Organe aus Leichen können
zur Bereitstellung einer Quelle für Endothelzellen und Elemente
verwendet werden. Bei den isolierten Zellen handelt es sich vorzugsweise
um autologe Zellen, die durch Biopsie vom Subjekt erhalten worden
sind. Beispielsweise kann es sich um eine Biopsie von Skelettmuskel
aus dem Arm, dem Unterarm oder den unteren Extremitäten oder
aus glattem Muskel aus dem behandelten Bereich handeln, wobei eine
lokale Anästhesie
mit einer geringen Menge an subkutan injiziertem Lidocain vorgenommen
wird. Anschließend
werden die Zellen in Kultur expandiert. Die Biopsieprobe kann unter Verwendung
einer Biopsienadel, einer rasch wirkenden Nadel, durch die das Verfahren
rasch und einfach gestaltet wird, erhalten werden. Der kleine Biopsiekern
von Skelettmuskel oder glatter Muskulatur kann sodann expandiert
und kultiviert werden. Zellen von Verwandten oder anderen Spendern
der gleichen Spezies können
ebenfalls bei geeigneter Immunosuppression verwendet werden.
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Verfahren
zum Isolieren und Kultivieren von Zellen werden von Freshney, Culture
of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, A. R.
Liss, Inc., New York, 1987, Kapitel 9, S. 107–126, erörtert. Zellen können unter
Anwendung von dem Fachmann geläufigen
Verfahren isoliert warden. Beispielsweise kann das Gewebe oder das
Organ mechanisch disaggregiert und/oder mit Verdauungsenzymen und/oder
chelatbildenden Mitteln, die die Verbindungen zwischen benachbarten
Zellen schwächen,
behandelt werden, was es ermöglicht,
das Gewebe zu einer Suspension von individuellen Zellen ohne ein merkliches
Aufbrechen von Zellen zu dispergieren. Eine enzymatische Dissoziation
kann durch Zerkleinern des Gewebes und Behandeln des zerkleinerten Gewebes
mit einer Reihe von Verdauungsenzymen entweder allein oder in Kombination
erreicht werden. Hierzu gehören
(ohne Beschränkung
hierauf) Trypsin, Chymotrypsin, Collagenase, Elastase und/oder Hyaluronidase,
DNase, Pronase und Dispase. Ein mechanisches Aufbrechen kann auch
durch eine Anzahl von Verfahren erreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf)
ein Abschaben der Oberfläche des
Organs, die Verwendung von Schleifvorrichtungen, Mischern, Sieben,
Homogenisatoren, Druckzellen oder Ultraschallvorrichtungen gehören, um
nur einige aufzuführen.
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Zu
bevorzugten Zelltypen gehören
(ohne Beschränkung
hierauf), Nierenzellen, Urothelialzellen, mesenchymale Zellen, insbesondere
Zellen von glatter Muskulatur oder Skelettmuskeln, Myozyten (Muskelstammzellen),
Fibroblasten, Chondrozyten, Adipozyten, Fibromyoblasten und ektodermale
Zellen, einschließlich
duktile und Hautzellen, Hepatozyten, Inselzellen, im Darm vorliegende
Zellen und andere parenchymale Zellen, Nervenzellen, Osteoblasten und
andere Zellen, die Knochen oder Knorpel bilden. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
werden humane Endothelzellen isoliert. Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
werden humane Nierenzellen isoliert. Nierenzellen sämtlicher
Entwicklungsstadien, wie fötale,
neonatale, juvenile bis adulte Zellen, können verwendet werden.
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Nachdem
das Gewebe zu einer Suspension von individuellen Zellen zerkleinert
worden ist, kann die Suspension zu Subpopulationen fraktioniert
werden, aus denen die Zellelemente erhalten werden können. Dies
kann ebenfalls unter Anwendung üblicher
Techniken für
die Zellseparation erfolgen, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf)
Klonierung und Selektion von spezifischen Zelltypen, selektive Zerstörung von
unerwünschten
Zellen (negative Selektion), Trennung auf der Grundlage der differenziellen
Zellagglutinierbarkeit in der Mischpopulation, Einfrier-Auftau-Verfahren,
differenzielle Hafteigenschaften der Zellen in der Mischpopulation,
Filtration, herkömmliche
und zonale Zentrifugation, zentrifugale Elutriation (Gegenstrom-Zentrifugation),
Schwerkrafttrennung, Gegenstromverteilung, Elektrophorese und fluoreszenzaktivierte
Zellsortierung (vergl. z. B. Freshney, Culture of Animal Cells,
A Manual of Basic Techniques, 2. Auflage, A. R. Liss, Inc., New York,
Kapitel 11 und 12 (1987), S. 137–168). Beispielsweise können Endothelzellen
durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung angereichert werden. Gleichermaßen können auch
Nierenzellen angereichert werden.
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Eine
Zellfraktionierung kann beispielsweise auch wünschenswert sein, wenn der
Spender Krankheiten hat, wie Nierenkrebs oder Metastasen anderer Tumoren
in der Niere. Eine Nierenzellpopulation kann sortiert werden, um
maligne Nierenzellen oder andere Tumorzellen von normalen nicht-krebsartigen Nierenzellen
abzutrennen. Die normalen, nicht-krebsartigen Nierenzellen, die
durch eine oder mehrere Sortierungstechniken isoliert worden sind, können sodann
für die
Nierenrekonstruktion verwendet werden.
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Isolierte
Zellen können
in vitro gezüchtet werden,
um die Anzahl an Zellen, die für
die Infusion in das dreidimensionale Gerüst zur Verfügung stehen, zu erhöhen. Die
Verwendung von allogenen Zellen und insbesondere von autologen Zellen
wird bevorzugt, um eine Gewebeabstoßung zu verhindern. Wenn es
jedoch beim Subjekt nach der Implantation des rekonstruierten künstlichen
Organs zu einer immunologischen Reaktion kommt, kann das Subjekt mit
immunosuppressiven Mitteln, z. B. Cyclosporin oder FK506, behandelt
werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Abstoßung zu verringern. Bei bestimmten
Ausführungsformen
können
chimäre
Zellen oder Zellen eines transgenen Tieres in das dreidimensionale
Gerüst
perfundiert werden.
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Isolierte
Zellen können
sodann vor Beschichtung mit dem genetischen Material transfiziert
werden. Bei einem geeigneten genetischen Material kann es sich beispielsweise
um genetische Sequenzen handeln, die dazu befähigt sind, eine Immunreaktion
im Wirt zu verringern oder zu beseitigen. Beispielsweise kann die
Expression von Zelloberflächenantigenen,
wie der Histokompatibilitäts-Antigene
der Klasse I und der Klasse II, unterdrückt werden. Dies ermöglicht es,
dass die transplantierten Zellen einer verringerten Gefahr der Abstoßung durch
den Wirt unterliegen. Ferner kann eine Transfektion auch für die Genabgabe
herangezogen werden. Endotheliale und/oder Nierenzellen können mit
spezifischen Genen transfiziert werden, bevor sie in das dreidimensionale
Gerüst
infundiert werden. Das künstliche rekonstruierte
Organ kann genetische Informationen tragen, die für das Langzeitüberleben
des Wirts oder des rekonstruierten künstlichen Organs erforderlich sind.
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Die
auf dem Gerüst
gezüchteten
endothelialen Zellen können
gentechnisch so manipuliert sein, dass sie Genprodukte erzeugen,
die für
die Transplantation günstig
sind, z. B. entzündungshemmende Faktoren,
wie anti-GM-CSF, anti-TNF, anti-IL-1 und anti-IL-2. Alternativ können die
endothelialen Zellen gentechnisch so manipuliert sein, dass sie
die Expression der nativen Genprodukte ausschalten, die eine Entzündung fördern, z.
B. GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, oder die Expression von MHC ausschalten,
um die Gefahr einer Abstoßung
zu vermindern. Ferner können
die endothelialen Zellen gentechnisch zur Verwendung bei der Gentherapie
manipuliert werden, um den Grad der Genaktivität in einem Patienten einzustellen,
um die Ergebnisse der Gewebetransplantation zu unterstützen oder
diese zu verbessern.
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Verfahren
zur gentechnischen Manipulation von Zellen mit retroviralen Vektoren,
Polyethylenglycol oder anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt
sind, können
herangezogen werden. Hierzu gehört
die Verwendung von Expressionsvektoren, die Nucleinsäuremoleküle in den
Zellen transportieren und exprimieren (vergl. Goeddel, Gene Expression
Technology, Methods in Enzymology, Bd. 185, Academic Press, San
Diego, CA (1990)
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Vektor-DNA
wird in prokaryontische oder eukaryontische Zellen über herkömmliche
Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt. Geeignete
Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen finden
sich bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), und in anderen
Laboratoriumshandbüchern.
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Zellen,
die erfindungsgemäß auf dem
dreidimensionalen Gerüst
und der endothelialen Gewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, gezüchtet
worden sind, wachsen in mehrfachen Schichten und bilden eine zelluläre Matrix,
die dem in vivo auftretenden physiologischen Zuständen ähnlich ist. Das
dreidimensionale Gerüst
und die endotheliale Gewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem
umfasst, können
die Proliferation verschiedener Typen von Zellen und die Bildung
einer Anzahl von verschiedenen Geweben unterstützen. Zu Beispielen gehören (ohne
Beschränkung
hierauf) Knochenmark-, Haut-, Leber-, Bauchspeicheldrüse-, Nieren-, Nebennieren-
und neurologische Gewebe sowie Gewebe des gastrointestinalen und
urogenitalen Trakts und des Kreislaufsystems.
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Wenn
das künstliche
rekonstruierte Organ für
in vivo-Transplantationen
oder Implantationen verwendet werden soll, kann es bevorzugt sein,
die endothelialen Zellen oder parenchymalen Zellen von dem Individuum,
das das Transplantat oder Implantat erhalten soll, zu gewinnen.
Diese Vorgehensweise kann sich als besonders vorteilhaft in den
Fällen
erweisen, bei denen eine immunologische Abstoßung des Transplantats und/oder
eine Graft-versus-Host-Krankheit wahrscheinlich sind.
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Nach
der Perfusion auf das dreidimensionale Gerüst kommt es zu einer Vermehrung
und Entwicklung der Endothelzellen auf dem Gerüst unter Bildung einer endothelialen
Gewebeschicht. Während der
in vitro-Züchtung
kommt es zu einer Entwicklung und Differenzierung der Endothelzellen
unter Erzeugung eines primitiven Gefäßsystems, das dazu in der Lage
ist, sich zu einem reifen Gefäßsystem
zu entwickeln, und auch dazu befähigt
ist, das Wachstum von Parenchymzellen, die in das dreidimensionale
Gerüst
perfundiert werden, zu unterstützen.
Wichtig ist, dass aufgrund der Tatsache, dass das dreidimensionale
Gerüst
eine Infrastruktur aufweist, die es dem Kulturmedium ermöglicht,
die Endothelgewebeschicht und die Parenchymzellen zu erreichen,
die verschiedenen Zellpopulationen weiter wachsen, sich teilen und
funktionell aktiv bleiben. Die Parenchymzellen unterliegen einer
Vermehrung und Differenzierung zu neomorphen Organstrukturen, die
eine Morphologie aufweisen, die der analogen in vivo-Struktur ähnlich ist.
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Es
ist wichtig, in der Kultur die zelluläre Mikroumgebung, die in vivo
für das
spezielle zu rekonstruierende Organ vorliegt, zu schaffen. Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren bereitgestellt, bei dem ein dezellularisiertes Organ zur
Rekonstruktion eines künstlichen
Organs verwendet wird. Unter Verwendung eines dezellularisierten
Organs bleibt die komplexe Infrastruktur erhalten, die es den perfundierten, kultivierten
Zellpopulationen ermöglicht,
an das dreidimensionale Gerüst
zu binden. Die Aufrechterhaltung einer Infrastruktur, die ähnlich oder
gleich wie bei einem in vivo-Organ ist, schafft die optimale Umgebung
für Zell-Zell-Wechselwirkungen
und die Entwicklung und Differenzierung von Zellpopulationen. Das
Ausmaß,
in dem die Endothelzellen und Parenchymzellen vor der in vivo-Verwendung
wachsen, kann je nach dem Typ des zu rekonstruierenden Organs variieren.
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren zum Rekonstruieren eines künstlichen Organs bereitgestellt,
wobei man ein dreidimensionales Gerüst mit einer Endothelgewebeschicht,
die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, verwendet. Dieses Gerüst
stützt die
Reifung, Entwicklung und Differenzierung von zusätzlichen, in vitro-gezüchteten
Zellen unter Bildung von Komponenten von erwachsenen Geweben, die zu
ihren in vivo-Gegenstücken analog
sind. Das dreidimensionale Gerüst
ermöglicht
optimale Zell-Zell-Wechselwirkungen, wobei es eine natürlichere
Bildung von zellulären
Phänotypen
und einer Gewebemikroumgebung ermöglicht. Das dreidimensionale
Gerüst
ermöglicht
ferner den Endothelzellen, ihr Wachstum in aktiver Weise fortzusetzen,
sich zu vermehren und sich unter Bildung eines primitiven Gefäßsystems
zu differenzieren. Dieses primitive Gefäßsystem ist zu einer weiteren
Entwicklung befähigt
und auch dazu befähigt,
das Wachstum, die Vermehrung und die Differenzierung von zusätzlichen gezüchteten
Zellpopulationen zu unterstützen,
beispielsweise von gezüchteten
Parenchym-Gewebezellpopulationen, wodurch eine lokalisierte Mikroumgebung
geschaffen wird, die für
ein in vivo-Gewebe förderlicher
ist.
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IV. Schaffung des dreidimensionalen Endothelgewebes
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Das
dreidimensionale Gerüst
wird durch den Vorgang der in Abschnitt II beschriebenen Dezellularisierung
erzeugt. Das dezellularisierte, dreidimensionale Gerüst behält die Gestalt
der dezellularisierten Biostruktur und ermöglicht den kultivierten Zellen, sich
daran anzuheften und im oder am Gerüst zu wachsen. Das dezellularisierte
dreidimensionale Gerüst
kann vor der Perfusion mit kultivierten Endothelzellen beispielsweise
mit Kollagen vorbehandelt werden, um die Haftung von Endothelzellen
am dreidimensionalen Gerüst
zu verstärken.
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Endothelzellen
werden in das Gerüst
perfundiert, indem man Nadeln verwendet, die an lokalisierten Positionen
im dreidimensionalen Gerüst
platziert werden. Diese Endothelzellen können sich von Organen, wie
Haut, Leber und Bauchspeicheldrüse,
die durch Biopsie (sofern zutreffend) oder bei einer Autopsie erhältlich sind,
ableiten. Endothelzellen können auch
aus einem beliebigen Organ einer Leiche erhalten werden. Die Endothelzellen
können
durch in vitro-Kultivieren bis zur erwünschten Zelldichte expandiert
werden, bevor die Infusion in das dreidimensionale Gerüst vorgenommen
wird.
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Endothelzellen
lassen sich leicht isolieren, indem man ein entsprechendes Organ
oder Gewebe, das als Quelle für
die Zellen dienen soll, disaggregiert. Dies kann unter Anwendung
von dem Fachmann geläufigen
Techniken erfolgen. Beispielsweise kann das Gewebe oder Organ mechanisch
disaggregiert werden und/oder mit Verdauungsenzymen behandelt werden
und/oder mit chelatbildenden Mitteln behandelt werden, die die Verbindungen
zwischen benachbarten Zellen lockern, was es ermöglicht, das Gewebe zu einer
Suspension von individuellen Zellen zu dispergieren, ohne dass es
zu einer nennenswerten Zerstörung
von Zellen kommt. Eine enzymatische Dissoziation kann erreicht werden,
indem man das Gewebe zerkleinert und das zerkleinerte Gewebe mit
einem aus einer Anzahl aus Verdauungsenzymen ausgewählten Enzym
entweder allein oder in Kombination behandelt. Zu diesen Enzymen
gehören (ohne
Beschränkung
hierauf) Trypsin, Chymotrypsin, Collagenase, Elastase und/oder Hyaluronidase, DNase,
Pronase und Dispase. Ein mechanisches Aufbrechen kann auch durch
eine Anzahl von Verfahren erreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf)
die Verwendung von Schleifvorrichtungen, Mischvorrichtungen, Sieben,
Homogenisatoren, Druckzellen oder Ultraschallvorrichtungen gehören, um
nur einige aufzuzählen
(vergl. z. B. Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic
Technique, 2. Auflage, A. R. Liss, Inc., New York, Kapitel 9 (1987),
S. 107–126).
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Nach
Zerlegen des Gewebes zu einer Suspension von individuellen Zellen
kann die Suspension zu Unterpopulationen fraktioniert werden, aus
denen sich die Endothelzellen erhalten lassen. Dies kann auch durch übliche Techniken
zur Zellseparation erfolgen, wozu (ohne Beschränkung hierauf) das Klonieren
und die Auswahl von spezifischen Zelltypen, die selektive Zerstörung von
unerwünschten Zellen
(negative Selektion), die Trennung auf der Grundlage der differenziellen
Zellagglutinierbarkeit in der gemischten Population, Einfrier-Auftau-Verfahren,
die Ausnutzung von differenziellen Hafteigenschaften der Zellen
in der gemischten Population, die Filtration, eine herkömmliche
und zonale Zentrifugation, die zentrifugale Elutriation (Gegenstrom-Zentrifugation),
die Schwerkrafttrennung, die Gegenstromverteilung, die Elektrophorese
und die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gehören (vergl. z. B. Freshney, Culture
of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, A. R.
Liss, Inc., New York, Kapitel 11 und 12 (1987), S. 137–168).
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Das
Wachstum von Zellen im dreidimensionalen Gerüst kann verstärkt werden,
indem man das dreidimensionale Gerüst mit Proteinen (z. B. Collagenen,
elastischen Fasern, retikulären
Fasern), Glycoproteinen, Glycosaminoglycanen (z. B. Heparansulfat,
Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Keratinsulfat
und dergl.), einer zellulären
Matrix und/oder anderen Materialien versetzt oder beschichtet.
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Nach
Perfusion der Endothelzellen sollte das dreidimensionale Gerüst in einem
geeigneten Nährmedium
inkubiert werden. Für
die Verwendung eignen sich zahlreiche handelsübliche Medien, wie RPMI 1640,
Fisher-Medium, Iscove-Medium,
McCoy-Medium, Dulbecco-Medium und dergl. Das Kulturmedium soll periodisch
ausgetauscht werden, um verbrauchtes Medium zu entfernen, eine Depopulation
von freigesetzten Zellen vorzunehmen und frisches Medium zuzusetzen.
Es ist wichtig, die Endothelzellen bis zu einem Stadium zu züchten, bei
dem eine Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem
umfasst, sich entwickelt hat, bevor eine Perfusion der Endothelgewebeschicht
mit den Parenchymzellen vorgenommen wird.
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V. Perfusion von Parenchymzellen auf ein
dreidimensionales endotheliales Gerüst
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Nachdem
die dreidimensionale Endothelgewebeschicht den geeigneten Wachstumsgrad
erreicht hat und ein primitives Gefäßsystem entwickelt hat, können zusätzliche
Populationen von kultivierten Zellen, wie Parenchymzellen auf die
Endothelgewebeschicht perfundiert werden. Parenchymzellen, die auf
das Endothelgewebe perfundiert worden sind, können inkubiert werden, um den
Zellen die Haftung an der Endothelgewebeschicht zu ermöglichen.
Die Parenchymzellen können
in vitro in Kulturmedium kultiviert werden, um den Zellen das Wachstum
und die Entwicklung zu ermöglichen,
bis die Zellen in Bezug auf Morphologie und Struktur den Zellen
des nativen Gewebes ähnlich
geworden sind. Das Wachstum von Parenchymzellen auf der Endothelgewebeschicht
führt zur
Differenzierung von Parenchymzellen in geeignete neomorphe Organstrukturen.
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Alternativ
kann nach der Perfusion der dreidimensionalen Parenchymzellen das
Gerüst
in vivo implantiert werden, ohne dass in vitro die Parenchymzellen
kultiviert werden. Die für
die Perfusion gewählten
Parenchymzellen hängen
vom zu rekonstruierenden Organ ab. Beispielsweise beinhaltet die Rekonstruktion
einer Niere die Infusion von kultivierten Endothelzellen in das
dezellularisierte, dreidimensionale Nierengerüst, das kultiviert wird, bis
sich eine Entwicklung zu einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives
Gefäßsystem
umfasst, ergeben hat. Das Endothelgewebe kann sodann mit kultivierten Nierenzellen
perfundiert werden und in vitro kultiviert werden, bis die Nierenzellen
mit ihrer Differenzierung unter Bildung von Nephronstrukturen beginnen.
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Die
Parenchymzellen können
aus Zellsuspensionen erhalten werden, die durch Disaggregation des
erwünschten
Gewebes unter Anwendung von Standardtechniken, wie sie vorstehend
beschrieben wurden, erhalten worden sind. Die Zellen können sodann
in vitro bis zur gewünschten
Dichte kultiviert werden. Nach Erreichen der gewünschten Dichte können die
kultivierten Zellen zur Perfusion des dreidimensionalen Gerüstes mit
der Endothelgewebeschicht verwendet werden. Die Zellen unterliegen
auf der Endothelgewebeschicht einer Vermehrung, Reifung und Differenzierung.
Die Wahl der Parenchymzellen hängt
von dem zu rekonstruierenden Organ ab. Beispielsweise werden bei
Rekonstruktion einer künstlichen
Niere das dreidimensionale Nierengerüst und die Endothelgewebeschicht
mit kultivierten Nierenzellen perfundiert. Bei der Rekonstruktion
einer künstlichen
Leber werden das dreidimensionale Lebergerüst und die Endothelgewebeschicht
mit kultivierten Hepatozyten perfundiert. Bei der Rekonstruktion
einer künstlichen
Bauchspeicheldrüse
werden das dreidimensionale Bauchspeicheldrüsengerüst und die Endothelgewebeschicht
mit kultivierten pankreatischen, endokrinen Zellen perfundiert.
Bezüglich
eines Überblicks über Verfahren,
die zur Bildung von Parenchymzellen aus verschiedenen Geweben verwendet
werden können,
wird verwiesen auf Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of
Basic Technique, 2. Auflg., A. R. Liss, Inc., New York, (1987),
Kapitel 20, S. 257–288.
Zellen werden kultiviert, bis sie unter Bildung von neomorphen Organstrukturen,
deren Morphologie Ähnlichkeit
mit dem nativen in vivo-Gewebe
hat, differenzieren.
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Wachstumsfaktoren
und regulatorische Faktoren können
dem Medium zugesetzt werden, um die Vermehrung und Zellreifung und
die Differenzierung in den Kulturen zu verstärken oder zu modulieren. Das
Wachstum und die Aktivität
von Zellen in der Kultur kann durch verschiedene Wachstumsfaktoren
beeinflusst werden, z. B. durch Insulin, Wachstumshormon, Somatomedine,
kolonienstimulierende Faktoren, Erythropoietin, epidermaler Wachstumsfaktor, hepatischer erythropoietischer
Faktor (Hepatopoietin) und Leberzellen-Wachstumsfaktor. Zu weiteren Faktoren,
die die Vermehrung und/oder Differenzierung regulieren, gehören, Prostaglandine,
Interleukine und in der Natur auftretende Chalone.
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VI. Verwendung der rekonstruierten künstlichen
Organe
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Die
erfindungsgemäßen rekonstruierten künstlichen
Organe können
für eine
Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten
eingesetzt werden. Die rekonstruierten künstlichen Organe können z.
B. einem Subjekt implantiert werden. Erfindungsgemäße Implantate
können
als Ersatz oder als Ergänzung
von vorhandenem Gewebe verwendet werden. Beispielsweise kann ein
Subjekt, das an einer Nierenstörung leidet,
behandelt werden, indem man die funktionsgestörte Niere des Subjekts durch
eine künstliche
rekonstruierte Niere ersetzt. Das Subjekt kann nach der Implantation
der künstlichen
Niere in Bezug auf die Besserung der Nierenstörung überwacht werden.
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Die
rekonstruierten künstlichen
Organe können
in vitro verwendet werden, um ein Screening auf eine Vielzahl von
Verbindungen in Bezug auf Wirksamkeit und Zytotoxizität von pharmazeutischen
Mitteln, chemischen Mitteln, Wachstums- und Regulationsfaktoren
vorzunehmen. Die Kulturen können
in vitro gehalten werden und der zu testenden Verbindung ausgesetzt
werden. Die Aktivität
einer zytotoxischen Verbindung kann aufgrund ihrer Fähigkeit
zur Schädigung
oder Abtötung
von Zellen in Kultur gemessen werden. Dies kann leicht durch vitale
Färbetechniken
vorgenommen werden. Der Einfluss von Wachstums/Regulationsfaktoren
kann durch Analyse des zellulären
Gehalts der Matrix bestimmt werden, z. B. aufgrund der gesamten
Zellzahl und der differenziellen Zellzahlen. Dies kann unter Anwendung üblicher
zytologischer und/oder histologischer Techniken erfolgen, unter
Einschluss der Anwendung immunozytochemischer Techniken unter Verwendung von
Antikörpern,
die typspezifische zelluläre
Antigene definieren. Der Einfluss verschiedener Arzneistoffe auf
normale Zellen, die in den rekonstruierten künstlichen Organen kultiviert
werden, kann bestimmt werden.
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Die
rekonstruierten künstlichen
Organe können
in vitro verwendet werden, um wässrige
Lösungen
zu filtrieren. Beispielsweise kann eine rekonstruierte künstliche
Niere zur Filtration von Blut verwendet werden. Die Verwendung der
rekonstruierten Niere liefert ein System mit morphologischen Merkmalen,
die den in vivo-Nierenprodukten ähnlich
sind. Dieses System kann sich für
die Hämodialyse
eignen und kann daher bei der Entfernung von gelösten Bestandteilen im Blut
von mittlerem Molekulargewicht, die durch übliche Hämodialysesysteme nicht entfernt werden
können,
wirksam sein. Das System kann sich auch zur Hämofiltration zur Entfernung
von Wasser und niedermolekularen gelösten Bestandteilen aus Blut
eignen. Die künstliche
Niere kann in vitro gehalten werden und dem Blut ausgesetzt werden,
das in die luminale Seite der künstlichen
Niere infundiert werden kann. Die bearbeitete wässrige Lösung kann auf der abluminalen
Seite der künstlichen
Niere gesammelt werden. Die Wirksamkeit der Filtration kann durch
Messung des Gehalts an Ionen oder an Stoffwechselabfallprodukten
des filtrierten und des unfiltrierten Bluts bestimmt werden.
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Die
erfindungsgemäßen rekonstruierten künstlichen
Organe können
als Träger
zur Einführung
von Genen und Genprodukten in vivo verwendet werden, um die Ergebnisse
der Transplantation zu unterstützen
oder zu verbessern, und/oder sie können in der Gentherapie eingesetzt
werden. Beispielsweise können
die kultivierten Endothelzellen gentechnisch so manipuliert werden,
dass sie Genprodukte exprimieren. Die Zellen können gentechnisch so manipuliert
werden, dass sie Genprodukte vorübergehend
und/oder unter induzierbarer Kontrolle oder als ein chimäres Fusionsprotein,
das mit den Endothelzellen verankert ist, exprimieren, z. B. ein chimäres Molekül, das aus
einer intrazellulären und/oder
Transmembrandomäne
eines Rezeptors oder rezeptorartigen Moleküls zusammengesetzt ist und
mit dem Genprodukt als extrazellulärer Domäne fusioniert ist. Bei einer
weiteren Ausführungsform können die
Endothelzellen gentechnisch so manipuliert werden, dass sie ein
Gen exprimieren, das beim Patienten fehlt oder das eine therapeutische
Wirkung ausübt.
Die Gene von Interesse, die durch genetische Techniken in die Endothelzellen
oder Parenchymzellen eingeführt
worden sind, müssen
im Zusammenhang mit der zu behandelnden Krankheit stehen. Beispielsweise
können
für eine
Nierenstörung
die Endothelzellen oder kultivierten Nierenzellen gentechnisch so
manipuliert werden, dass sie Genprodukte exprimieren, die zu einer
Besserung der Nierenstörung
führen.
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Die
Endothel- oder Parenchymzellen können gentechnisch
manipuliert werden, indem man ein rekombinantes DNA-Konstrukt mit
einem Gehalt an dem Gen von Interesse, das zur Transformation oder Transfektion
von Endothel- oder
Parenchymzellen verwendet wird, einsetzt. Das dreidimensionale Gerüst und die
ein primitives Gefäßsystem
umfassende Endothelgewebeschicht, die das aktive Genprodukt exprimiert,
können
einem Individuum, das einen Mangel an diesem Produkt aufweist, implantiert werden.
Beispielsweise können
Gene, die Symptome verschiedener Typen von Gefäßkrankheiten, Krankheiten des
urogenitalen Trakts, Hernie-Krankheiten, gastrointestinalen
Krankheiten oder Nierenkrankheiten verhindern oder bessern, unter
diesen Krankheitsbedingungen unterexprimiert oder herunterreguliert
werden. Der Grad der Genaktivität
kann erhöht werden,
indem man entweder die Konzentration des vorhandenen Genprodukts
steigert oder die Konzentration des aktiven Genprodukts, das im
dreidimensionalen Gerüst
und Endothelgewebe vorhanden ist, steigert. Die dreidimensionale
Kultur, die das aktive Zielgenprodukt exprimiert, kann sodann dem
Patienten, der einen Mangel an diesem Produkt aufweist, implantiert
werden.
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Die
dreidimensionalen Kulturen, die derartige, gentechnisch manipulierte
Endothel- oder Parenchymzellen enthalten, werden sodann dem Subjekt implantiert,
um eine Besserung der Symptome der Krankheit zu ermöglichen.
Die Genexpression kann unter der Kontrolle eines nicht-induzierbaren (d.
h. konstitutiven) oder induzierbaren Promotors stehen. Der Grad
der Genexpression und der Typ des regulierten Gens können je
nach den Behandlungsmodalitäten,
die bei einem individuellen Patienten eingehalten werden, gesteuert
werden.
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Unter
den Umfang der Erfindung fallen auch Zusammensetzungen und Verfahren
zum Rekonstruieren von künstlichen
Organen, die eine Population von kultivierten Zellen umfassen. Alternativ
können die
rekonstruierten künstlichen
Konstrukte mehrfache Schichten von kultivierten Zellpopulationen
umfassen. Zu Organen, die rekonstruiert werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf)
Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter
und Harnröhre.
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Durch
Aufnahme und Aufrechterhaltung der Parenchymgewebe im dreidimensionalen
Gerüst
und in der Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem
umfasst, können
die Parenchymgewebe zu neomorphen Organstrukturen differenzieren,
die spezielle Struktur- und Funktionseigenschaften aufweisen, die
für eine
einwandfreie physiologische in vivo-Funktionsweise erforderlich
sind. Die rekonstruierten künstlichen
Organe simulieren die entsprechende biologische in vivo-Struktur
und können
als Ersatz für
das geschädigte
oder erkrankte in vivo-Organ dienen.
-
Beispiele
-
Beispiel 1: Herstellung einer dezellularisierten
Niere
-
Das
folgende Verfahren beschreibt den Vorgang der Entfernung des gesamten
zellulären
Inhalts eines Organs oder Gewebes ohne Zerstörung der komplexen dreidimensionalen
Infrastruktur des Organs oder Gewebes. Eine Niere wurde auf chirurgischem
Wege einer schwarzen C7-Maus unter Anwendung üblicher Techniken zur Gewebeentfernung entfernt.
Die Niere wurde in einen Kolben gebracht, der ein geeignetes Volumen
an destilliertem Wasser enthielt, um die isolierte Niere zu bedecken.
Eine magnetische Rührplatte
und ein Magnetrührer
wurden dazu verwendet, die isolierte Niere in destilliertem Wasser
bei einer geeigneten Drehzahl 24 bis 48 Stunden bei 4°C zu rotieren.
Durch dieses Verfahren werden Zellbruchstücke und Zellmembranen, die
die isolierte Niere umgeben, entfernt.
-
Nach
diesem ersten Entfernungsschritt wurde das destillierte Wasser durch
eine 0,05%ige Ammoniumhydroxidlösung
mit einem Gehalt an 0,5% Triton X-100 ersetzt. Die Niere wurde 72
Stunden bei 4°C
unter Verwendung einer magnetischen Rührplatte und eines Magnetrührers rotiert.
Diese alkalische Lösung
bewirkte eine Solubilisierung der nuklearen und zytoplasmatischen
Komponenten der isolierten Niere. Das Detergens Triton X-100 wurde
zur Entfernung der nuklearen Komponenten der Niere verwendet, während die
Ammoniumhydroxidlösung
zur Lysis der Zellmembran und der zytoplasmatischen Proteine der
isolierten Niere verwendet wurde.
-
Die
isolierte Niere wurde sodann 24 bis 48 Stunden bei 4°C mit destilliertem
Wasser unter Verwendung einer magnetischen Rührplatte und eines Magnetrührers gewaschen.
Nach diesem Waschschritt wurde die Entfernung von zellulären Komponenten
aus dem Isolat durch histologische Analyse eines kleinen Nierenstückes bestätigt. Gegebenenfalls
wurde die isolierte Niere erneut mit der Ammoniumhydroxidlösung mit
einem Gehalt an Triton X-100 behandelt, bis der gesamte zelluläre Inhalt
der isolierten Niere entfernt war. Nach Entfernung der solubilisierten
Komponenten entstand ein kollagenöses, dreidimensionales Gerüst in Gestalt
der isolierten Niere.
-
Diese
dezellularisierte Niere wurde mit 1 × Phosphatpufferlösung (PBS) äquilibriert,
wobei die dezellularisierte Niere über Nacht bei 4°C unter Verwendung
einer Magnetrührplatte
und eines Magnetrührers
rotiert wurde. Nach der Äquilibration
wurde die dezellularisierte Niere über Nacht unter Vakuum lyophilisiert.
Die lyophilisierte Niere wurde 72 Stunden unter Verwendung von Ethylenoxidgas
sterilisiert. Nach der Sterilisation wurde die dezellularisierte
Niere entweder sofort verwendet oder bei 4°C oder bei Raumtemperatur aufbewahrt,
bis sie benötigt
wurde. Gelagerte Organe wurden in Gewebekulturmedium über Nacht
bei 4°C äquilibriert,
bevor sie mit gezüchteten
Zellen beimpft wurden.
-
Beispiel 2: Isolierung von Nierenzellen
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Kleine
Nieren, z. B. von schwarzen C7-Mäusen
mit einem Alter von 1 Woche, wurden entkapselt, zerschnitten, zerkleinert
und in Dulbecco-modifiziertem
Eagle-Medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) mit einem Gehalt an 15
mM Hepes, pH-Wert 7,4, 0,5 μg/ml
Insulin, 1,0 mg/ml Collagenase und 0,5 mg/ml Dispase, einer neutralen
Protease aus Bacillus polymyxa (Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN), suspendiert.
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Große Nieren,
z. B. Schweinenieren, wurden arteriell 10 Minuten bei 37°C mit calciumfreiem
Eagle-Minimalessentialmedium während
einer 3-stündigen Extraktion
perfundiert. Die Nieren wurden sodann mit 0,5 mg/ml Collagenase
(Typ IV, Sigma, St. Louis, MO) im gleichen Puffer, der mit 1,5 mM
MgCl2 und 1,5 mM CaCl2 ergänzt war,
perfundiert. Anschließend
wurden die Nieren entkapselt, zerschnitten, zerkleinert und in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium
(DMEM, Sigma, St. Louis, MO) mit einem Gehalt an 15 mM Hepes, pH-Wert
7,4 und 0,5 μg/ml
Insulin, 1,0 mg/ml Collagenase und 0,5 mg/ml Dispase, einer neutralen
Protease aus Bacillus polymyxa (Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN), suspendiert.
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Die
Nierenzellsuspension (entweder aus großen oder kleinen Nieren) wurde
30 Minuten bei 37°C
in einem Wasserbad mäßig bewegt.
Die Zellen und Fragmente wurden durch 5-minütige Zentrifugation mit 50
g gewonnen. Die Pellets wurden in DMEM mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum
(Biowhittaker, Walkersville, Maryland) resuspendiert, um die Proteolyse
zu stoppen. Die trübe
Lösung
wurde durch ein steriles Nylon-Sieb mit 80 mesh geleitet, um große Fragmente
zu beseitigen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und
2-mal mit calciumfreiem Dulbecco-modifiziertem
Eagle-Medium gewaschen.
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Beispiel 3: In vitro-Züchtung von Nierenzellen
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(i) Isolierung von Rattenschwanz-Kollagen
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Sehnen
wurden aus Rattenschwänzen
gezogen und in 0,12 M Essigsäure
in entionisiertem Wasser in 50 ml fassenden Röhrchen 16 Stunden über Nacht
bei 4°C
aufbewahrt.
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Dialysebeutel
wurden vorbehandelt, um eine gleichmäßige Porengröße und die
Entfernung von Schwermetallen zu gewährleisten. Kurz zusammengefasst,
der Dialysebeutel wurde in eine Lösung von 2% Natriumbicarbonat
und 0,05% EDTA getaucht und 10 Minuten einer Siedebehandlung unterzogen. Mehrfache
Spülungen
mit destilliertem Wasser wurden durchgeführt, um das Natriumbicarbonat
und die 0,05% EDTA zu entfernen.
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Die
0,12 M Essigsäurelösung mit
den Rattensehnen wurde in die behandelten Dialysebeutel gebracht
und 2 oder 3 Tage dialysiert, um die Essigsäure zu entfernen. Die Dialyselösung wurde
alle 3 bis 4 Stunden ausgetauscht.
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(ii) Beschichtung von Gewebekulturplatten
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Die
Kulturkolben (75 cm2) wurden mit einer Lösung mit
einem Gehalt an etwa 30 μg/ml
Kollagen (Vitrogen- oder Rattenschwanz-Kollagen), etwa 10 μg/ml humanem
Fibronectin (Sigma, St. Louis, MO) und etwa 10 μg/ml Rinderserumalbumin (Sigma,
St. Louis, MO) in einem Gesamtvolumen von etwa 2 ml des ergänzten Mediums
unter 3-stündiger
Inkubation bei 37°C
beschichtet.
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(iii) Zellkultur
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Verdaute,
suspendierte, renale Einzelzellen wurden auf eine modifizierte Kollagenmatrix
in einer Konzentration von etwa 1 × 106 Zellen/ml
ausgestrichen und in DMEM, das mit etwa 10% fötalem Kälberserum, etwa 5 μg/ml Rinderinsulin,
etwa 10 μg/ml Transferrin,
etwa 10 μg/ml
Natriumselenit, etwa 0,5 μM
Hydrocortison, etwa 10 ng/ml Prostaglandin E2, etwa
100 Einheiten/ml Penicillin G und etwa 100 μg/ml Streptomycin (Sigma, St.
Louis, MO) ergänzt war,
in einem 5%-CO2-Inkubator bei etwa 37°C gezüchtet.
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Konfluente
Monolayers wurden einer Subkultur unterzogen, indem sie mit etwa
0,05% Trypsin, etwa 0,53 mM EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) in
calciumionenfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (etwa 1,51 mM KH2PO4, etwa 155,17 mM
NaCl, etwa 2,8 mM Na2HPO4·7H2O) behandelt wurden. Die Zellen können jederzeit
nach der ersten Passage durch Suspension in etwa 10% DMSO in Kulturmedium
gezüchtet
werden, um sie einzufrieren und in flüssigem Medium zu lagern.
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(iv) Behandlung von dezellularisierten
Nieren mit Kollagen
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Die
dezellularisierte Nierenstruktur wurde mit einer Lösung mit
einem Gehalt an etwa 30 μg/ml
Kollagen (Vitrogen- oder Rattenschwanz-Kollagen), etwa 10 μg/ml humanem Fibronectin (Sigma,
St. Louis, MO) und etwa 10 μg/ml
Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO) in ergänztem Medium perfundiert. Die
mit Kollagen perfundierte dezellularisierte Nierenstruktur wurde
30 Minuten zusammen mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid (etwa
28% bis etwa 30% NH4OH, Sigma, St. Louis,
MO) in einen Inkubator gebracht, um den pH-Wert zu erhöhen und die
Gelbildung des Kollagens zu fördern.
Nach der Behandlung mit Ammoniumhydroxid wurde die dezellularisierte
Nierenstruktur gründlich
mit isotonem Medium gewaschen, um den pH-Wert der dezellularisierten
Nierenstruktur vor der Verwendung zu neutralisieren.
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Beispiel 4: In vitro-Züchtung von Endothelzellen
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Endothelzellen
wurden aus einer präparierten
Vene isoliert. Eine perivenöse
Heparin/Papaverin-Lösung
(3 mg Papaverin-HCl, verdünnt
in 25 ml ausgewogener Hank-Salzlösung
(HBSS) mit einem Gehalt an 100 Einheiten Heparin (Endkonzentration, 4
U/ml)) wurde zur Verbesserung der Konservierung der Endothelzellen
verwendet. Eine proximale Seidenschlinge wurde um die Vene gelegt
und befestigt. Eine kleine Venotomie wurde proximal zur Schlinge vorgenommen
und die Spitze einer Venenkanüle wurde
eingeführt
und mit einer zweiten Schlinge befestigt. Eine kleine Venotomie
wurde oberhalb der proximalen Schlinge vorgenommen und die Vene wurde
vorsichtig mit Medium 199/Heparinlösung im Medium 199 (M-199),
ergänzt
mit 20% fötalem
Kälberserum,
ECGF (100 μg/ml),
L-Glutamin, Heparin (Sigma, 17,5 U/ml) und Antibiotikum-Antimycotikum) gespült, um Blut
und Blutgerinnsel zu entfernen. Etwa 1 ml einer Collagenase-Lösung (0,2%
Worthington-Typ I-Collagenase, gelöst in 98 ml M-199, 1 ml FBS,
1 ml PSF, 15 bis 30 Minuten bei 37°C und steril filtriert) wurde
dazu verwendet, die präparierte Vene
zu durchspülen.
Die Collagenase-Lösung
wurde ferner dazu verwendet, die Vene aufzuweiten. Die aufgeweitete
Vene wurde in ein 50 ml fassendes Röhrchen mit einem Gehalt an
ausgewogener Hank-Salzlösung
(HBSS) gebracht. Das Röhrchen mit
der mit Collagenase aufgeweiteten Vene wurde 12 Minuten bei 37°C inkubiert,
um die innere Auskleidung der Vene zu verdauen. Nach dem Verdau
wurde der Inhalt der Vene, der Endothelzellen enthält, in ein
steriles, 15 ml fassendes Röhrchen
gebracht. Die Endothelzellsuspension wurde 10 Minuten mit 125 × g zentrifugiert.
Sodann wurden die Endothelzellen mit 2 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium
mit einem Gehalt an 10% FBS und Penicillin/Streptomycin (DMEM/10%
FBS) resuspendiert und auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die
mit 1% Difco-Gelatine beschichtet war, ausgestrichen. Die Endothelzellen wurden über Nacht
bei 37°C
inkubiert.
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Nach
der Inkubation über
Nacht wurden die Zellen mit HBSS gespült und in 1 ml frisches DMEM/10%
FBS gebracht. Das Medium wurde 3-mal wöchentlich ausgetauscht. Nachdem
die Kulturen den konfluenten Zustand erreicht hatten (etwa 3–7 Tage)
wurden die konfluenten Monolayers durch Behandlung mit 0,05% Trypsin,
0,53 mM EDTA, 3–5
Minuten einer Subkultur unterzogen, bis die Zellen dispergiert waren.
Die dispergierten Zellen wurden auf mit 0,1% Difco-Gelatine beschichtete
Kulturplatten in einem Aufteilverhältnis von 1:4–1:6 ausgestrichen. Die
Endothelzellen wurden expandiert, bis ausreichende Zellmengen zur
Verfügung
standen. Die Zellen wurden für
die Überimpfung
trypsiniert, gewonnen, gewaschen und gezählt.
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Beispiel 5: Rekonstruktion einer künstlichen
Niere
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Eine
Niere wurde auf chirurgischem Wege entfernt und gemäß Beispiel
1 dezellularisiert. Die dezellularisierte Nierenstruktur wurde als
ein Gerüst zur
Rekonstruktion einer künstlichen
Niere verwendet. Endothelzellen wurden in vitro gemäß den Angaben
in Beispiel 4 kultiviert und expandiert. Die Endothelzellensuspension
wurde vorsichtig unter Verwendung von Nadeln, die in die dezellularisierte
Nierenstruktur eingeführt
worden waren, perfundiert. Die dezellularisierte Nierenstruktur
wurde mit etwa 10 × 106 Zellen pro cm3 perfundiert
und bei 37°C
unter 5% CO2 inkubiert, bis die Zellen an
der Matrix hafteten und wuchsen. Die Struktur wurde etwa 3 Tage
bei 37°C
unter 5% CO2 inkubiert, bis eine Schicht
von Endothelzellen mit einem primitiven Gefäßsystem entstanden war. Das
Medium wurde häufig
ausgetauscht, beispielsweise etwa täglich, etwa alle 2 Tage oder
etwa alle 3 Tage.
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Nierenzellen
wurden gemäß den Angaben
in Beispiel 3 zehn Tage in vitro kultiviert und expandiert. Die
Zellen wurden durch Trypsinverdau unter Verwendung von 0,05% Trypsin,
etwa 0,53 mM EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) in calciumionenfreier, phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) (etwa 1,51 mM KH2PO4,
etwa 155,17 mM NaCl, etwa 2,8 mM Na2HPO4·7H2O) geerntet. Nach 10-minütigem Verdau bei 37°C wurden
die Zellen in DMEM-Medium in einer Konzentration von etwa 5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Die Nierenzellsuspension
wurde anschließend
vorsichtig über
die Endothelzellschicht unter Verwendung von Nadeln, die in die
dezellularisierte Struktur eingeführt worden waren, perfundiert. Die
dezellularisierte Nierenstruktur, die mit etwa 10 × 106 Zellen/cm3 perfundiert
war, wurde bei 37°C
unter 5% CO2 inkubiert, bis die Zellen hafteten
und wuchsen. Die Struktur wurde etwa 3 Tage bis etwa 10 Tage bei
37°C unter
5% CO2 inkubiert, bis die Nierenzellen begannen,
sich zu Nieren-Tubulizellen zu differenzieren.
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Eine
künstliche
Niere kann auch unter Verwendung eines Bioreaktorsystems rekonstruiert
werden. Einzelne, suspendierte Nierenzellen wurden auf eine dezellularisierte
Nierenmatrix überimpft.
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Man
ließ die
Zellen 2 Stunden bei 37°C
an der Matrixwand haften. Nach beendeter Inkubation wurde langsam
Medium in den Kolben gegeben, um die gesamte Matrix zu bedecken,
wobei darauf geachtet wurde, dass die Zellen innerhalb der Matrix nicht
gestört
wurden. Das Medium wurde täglich
oder häufiger
ausgetauscht, und zwar in Abhängigkeit
von der Milchsäurekonzentration.
Am 4. Tag nach der ursprünglichen
Beimpfung wurde das Zellmatrixsystem in ein zirkulierendes Bioreaktorsystem
gebracht. Der Infusionsschlauch wurde mit der Nieren-Hauptarterie verbunden
und der Rückleitungsschlauch
wurde mit der Nieren-Hauptvene verbunden. Zusätzliche einzelne Nierenzellen
wurden durch die Nieren-Hauptarterien-Matrix überimpft.
Nach Infusion der zusätzlichen
Zellen wurde der Bioreaktor 2 Stunden abgestellt, um den Zellen
die Haftung an der Matrix zu ermöglichen.
Die Infusion mit dem Medium wurde bei einer niedrigen Infusionsgeschwindigkeit begonnen,
um ein Aufbrechen von Zellen zu vermeiden. Die Zellen ließ man 3
oder 4 Tage fest an der Matrix haften.
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Nachdem
die Nierenzellen in die dezellularisierte Niere überimpft worden waren, wurden
glatte Muskelzellen überimpft.
Die äußere Nieren-Hauptarterie und
-vene wurden direkt auf der Oberfläche der Gefäße beimpft. Die internen Gefäßstrukturen
wurden durch die Nieren-Hauptarterie
unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Infusionstechniken beimpft.
Nach Infusion der glatten Muskelzellen wurde der Kreislauf durch
den Bioreaktor 2 Stunden unterbrochen, um ein Anhaften der glatten
Muskelzellen zu ermöglichen.
Nach 2 Stunden wurde das Medium langsam durch das zirkulierende
Bioreaktorsystem mit geringer Geschwindigkeit infundiert, um eine Bewegung
der anhaftenden glatten Muskelzellen zu verhindern. Die glatten
Muskelzellen brauchten mindestens 2 Tage, um sich an der Gefäßmatrix
zu organisieren.
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Nach
der Organisation der glatten Muskelzellen wurden vaskuläre Endothelzellen
auf die luminale Oberfläche
von Blutgefäßen durch
die Nieren-Hauptarterie überimpft.
Der Kreislauf im Bioreaktor wurde 2 Stunden unterbrochen, um den
Zellen ein Absetzen und ein Anhaften an der luminalen Gefäßwand zu
ermöglichen.
Sodann wurde das Kulturmedium durch das zirkulierende Bioreaktorsystem
mit niedriger Geschwindigkeit infundiert, um eine Bewegung der Zellen
zu vermeiden. Die Zellen brauchten mindestens 2 Tage, um sich an
der Gefäßmatrix
zu organisieren.
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Urothelialzellen
und glatte Muskelzellen, die das Sammelsystem bilden, wurden unter
Anwendung einer Rückwärtsimpftechnik überimpft.
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Einzelne
suspendierte Urothelialzellen wurden durch den Harnleiter überimpft
und glatte Muskelzellen wurden von der Serosaseite aus überimpft. Das
Medium wurde in regelmäßigen Abständen während des
Züchtungsvorgangs
ausgetauscht und es sollte die gesamte Zellmatrix bedecken. Das
künstliche
Nierenkonstrukt ist für
die Implantation bereit, wenn das infundierte Medium aufhört, aus
dem Bioreaktor zu entweichen.
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Beispiel 6: Implantation der rekonstruierten
Niere in einen Empfänger
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Die
rekonstruierte Niere, die ein primitives Gefäßsystem und Nierenzellen, die
zu Nieren-Tubulizellen differenziert waren, umfasste, wurde einer athymischen
Maus implantiert. Athymische Mäuse sind
im Handel erhältlich,
beispielsweise von Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Die Tiere
wurden auf die in vivo-Funktion der rekonstruierten Niere durch
Beobachtung des Urinausstoßes überwacht. Die
rekonstruierte Niere zeigte ein anhaltendes Wachstum und Vermehrung
der Nierenzellen nach der in vivo-Implantation. Die Tiere wurden
etwa 2, etwa 4 und etwa 8 Wochen nach der Implantation getötet. Die
rekonstruierte Niere wurde gewonnen und analysiert.
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Die
gewonnenen Proben wurden grob und histologisch mit Hämatoxylin
und Eosin untersucht. Immunohistochemische Färbungen auf Osteopontin, Fibronectin
und alkalische Phosphatase wurden durchgeführt, um die Zelltypen und deren
in vivo-Architektur zu bestimmen. Humaner, monoklonaler Fibronectin-Antikörper (Sigma,
St. Louis, MO) wurde gegen die Fibronectin-Matrix verwendet. Mit
Rhodamin konjugierter Ziegen-anti-Maus-Antikörper (Boehringer Mannheim,
Indianapolis, IN) wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Eine immunozytochemische
Färbung
auf Osteopontin wurde mit einem polyklonalen Antikörper durchgeführt. Antikörper wurden in
Weißen
Neuseeland-Kaninchen unter Anwendung üblicher Verfahren erzeugt (Harlow
und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, 1988) und in einem Verdünnungsverhältnis von 1:5000 verwendet.
Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert
mit FITC, (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde als sekundärer Antikörper verwendet.
Eine immunohistochemische Färbung
auf alkalische Phosphatase unter Verwendung von Nitroblautetrazolium
und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (Sigma, St. Louis, MO) wurde
durchgeführt.
Aus der Nierenprothese gewonnenes Filtrat zeigte eine strohgelbe
Farbe. Eine Analyse des Filtrats auf die Harnsäurekonzentration wurde unter
Verwendung eines Harnsäure-Nachweiskits (Sigma
Diagnostics, St. Louis, MO) durchgeführt.
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Das
Fluid in der rekonstruierten Niere wurde gewonnen. Eine histologische
Untersuchung der implantierten rekonstruierten Niere ergab eine
ausgedehnte Gefäßbildung,
Bildung von Glomeruli und von hochgradig organisierten, tubuliartigen
Strukturen mit einer analogen Morphologie wie bei einer nativen Niere.
Die Nierenzellen in der rekonstruierten Niere blieben nach der Implantation
lebensfähig,
was durch ihre Fähigkeit
zur Bindung an den fluoreszierenden Marker DIL festgestellt wurde.
Eine immunozytochemische Färbung
mit anti-Osteopontin-Antikörper,
der vorwiegend durch die proximalen und distalen Tubulizellen sezerniert
wird, färbte
die tubulären
Schnitte positiv. Eine immunohistochemische Färbung auf alkalische Phosphatase
färbte
die proximalen tubuliartigen Strukturen positiv. Die gelbe Flüssigkeit,
die aus der neu gebildeten Niereneinheit gesammelt wurde, enthielt
66 mg/dl Harnsäure,
verglichen mit 2 mg/dl im Plasma, was darauf schließen lässt, dass
diese Tubuli zu einer unidirektionalen Ausscheidung und Konzentration
von Harnsäure
befähigt
sind.