DE60037911T2

DE60037911T2 - Verfahren zur produktion von adenovirus

Info

Publication number: DE60037911T2
Application number: DE60037911T
Authority: DE
Inventors: Lee-Cheng Columbia LIU; Shoupeng Burtonsville LAI
Original assignee: Genvec Inc
Current assignee: Genvec Inc
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2000-10-10
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2020-10-11
Also published as: CA2400746A1; WO2001077304A1; JP2003530104A; DE60037911D1; AU2001211944A1; EP1268748B1; JP4662525B2; ES2296653T3; EP1268748A1; DK1268748T3; ATE384784T1; US6168941B1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Herstellung viraler Vektorstocks.
Hintergrund der Erfindung
Modifizierte Viren, die auch als virale Vektoren bekannt sind, haben sich als geeignete Vektorsysteme für Gentransferanwendungen für Forschungszwecke und für therapeutische Gentransferanwendungen erwiesen, und adenovirale Vektorsysteme haben bei solchen Anwendungen verschiedene Vorteile. Aufgrund dieser Vorteile haben Forscher eine ganze Reihe von Gentherapieanwendungen entwickelt, die auf adenoviralen Vektoren basieren. Da solche auf adenoviralen Vektoren basierenden Anwendungen klinische Versuche durchlaufen und zu anerkannten medizinischen Anwendungen werden, wird steigender Bedarf an der effizienten Herstellung adenoviraler Vektorstocks in großem Maßstab bestehen.
Systeme zur Herstellung von Virusstocks in Zellkulturen sind auf dem Gebiet bekannt. Verschiedene Literaturstellen des Standes der Technik lehren allgemeine Verfahren zur Herstellung von Virusstocks in Zellkulturen (siehe z. B. US 4 055 466 , 4 072 565 und 4 080 258 ). Aufgrund der Unterschiede bei der Stock-Herstellung bei einer großen Vielzahl viraler Vektoren und Zelltypen, die für deren Wachstum permissiv sind, haben sich allgemeine Verfahren oft als ungeeignet für die Herstellung viraler Vektorstocks in großem Maßstab, insbesondere Stocks rekombinanter viraler Vektoren, erwiesen.
Kürzlich haben Forscher die Herstellung rekombinanter viraler Vektorstocks untersucht, indem sie sich auf spezielle Typen viraler Vektoren konzentriert haben. Beispielsweise wurden Systeme, die auf die Herstellung rekombinanter Baculovirus-Stocks in Insektenzellen gerichtet sind, intensiv untersucht (siehe z. B. Kamen et al., Biotechnology and Bioengineering, 50(1), 36–48 (1996)). Andere Forscher haben Systeme zur Herstellung rekombinanter Retroviren untersucht (siehe z. B. Le Doux et al., Biotechnology and Bio engineering, 63(6), 664–652 (1999)). Die Adsorptions- und Replikationsraten von Vaccinia-Virus in Batch-Kulturen wurden ebenfalls untersucht (siehe Chillakuru et al., Biotechnol. Prog., 7, 85–92 (1991)).
Im Vergleich zu den Verfahren, die für die Herstellung von Baculovirus- und anderer nicht-adenoviraler Vektorstocks verfügbar sind, sind für die Herstellung adenoviraler Vektorstocks relativ wenige Systeme bekannt. US 5 994 134 lehrt die Verwendung eines auf Mikrocarrier basierenden Bioreaktorverfahrens zur Herstellung von Viren in Zellen bei hohen Dichten, einschließlich Adenoviren, in einem Medium auf Serumbasis. Die Beschränkungen die mit Medien auf Serumbasis und mit Mikrocarrier-Bioreaktoren einhergehen, schränken die Anwendbarkeit dieses Verfahrens ein. Garnier et al., Cytotechnology, 15, 145–55 (1994), geben ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen rekombinanter Proteine in mit rekombinanten adenoviralen Vektoren infizierten 293-Zellen an, wobei die Zellen bei verschiedenen Konzentrationen infiziert werden (typischerweise während der mittleren bis späten Log-Phase oder zwischen der Log-Phase und der stationären Phase des Zellwachstums), in Kombination mit einfachem oder doppeltem Ersatz des Mediums nach der Infektion. Diese Arbeiten weiterführend, lehren Côté et al., Biotechnology and Bioengineering, 59(5), 567–75 (1998), die Herstellung rekombinanter Proteine in mit einem adenoviralen Vektor infizierten 293-Zellen bei Zelldichten bis zu 1 × 10⁷ Zellen/ml. Die WO 00/32754 ist auf die Herstellung rekombinanter Adenoviren gerichtet, wobei solche bekannten Techniken angewendet werden.
Die WO 98/22588 offenbart ein verbessertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung adenoviraler Vektoren, wobei das Verfahren das Wachsenlassen von Wirtszellen in Medien bei einer niedrigen Perfusionsrate, das Infizieren dieser Wirtszellen mit einem Adenovirus und das Ernten und Lysieren der Wirtszellen zur Herstellung eines Roh-Zelllysats umfasst. Es wird gezeigt, dass für ein Adenovirus die Verwendung niedriger Perfusionsraten des Mediums in einem Anheftungszellkultursystem zu verbesserten Ausbeuten führt.
In der WO 99/57297 sind verschiedene Verfahren zur Herstellung rekombinanter viraler Vektoren mit hohen Titern beschrieben. Beispielsweise wird die Herstellung eines rekombinanten Adenovirus in humanen 293-Zellen beschrieben, wobei die Zellen in einem 5-l-Bioreaktor kultiviert und mit dem Medium bei einem Durchsatz von ungefähr 0,5 l pro Tag pro 1 × 10⁶ Zellen vor der Infektion mit dem Adenovirus perfundiert werden.
Folglich besteht Bedarf an alternativen Verfahren zur Herstellung adenoviraler Vektorstocks. Die vorliegende Erfindung gibt solche Verfahren an. Dieser und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie weitere erfinderische Merkmale werden anhand der hier vorgelegten Beschreibung der Erfindung klar werden.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung eines adenoviralen Vektorstocks an. Die Schritte des Verfahrens beinhalten das Bereitstellen einer Kultur von Zellen, die für das Wachstum adenoviraler Vektoren permissiv sind, wobei sich die Zellen in einem Medium befinden, das Kultivieren der Kultur unter Bedingungen, die das Wachstum der Zellen erlauben, das Durchleiten von frischem Medium durch die Kultur in einer Menge von mindestens etwa dem zweifachen Volumen des Mediums in der Kultur, während die Zelldichte in dem Medium etwa 40 bis 70% derjenigen Zelldichte beträgt, die in dem Medium erhalten wird, wenn sich das Wachstum der Kultur in der stationären Phase befindet, das Inkontaktbringen der Kultur mit adenoviralen Vektoren unter Bedingungen, die für die Infektion der Zellen permissiv sind, das Kultivieren der infizierten Zellen, um die adenoviralen Vektoren zu replizieren, und das Ernten der infizierten Zellen, um einen adenoviralen Vektorstock zu erhalten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung eines adenoviralen Vektorstocks an. Die Schritte des Verfahrens beinhalten (a) Bereitstellen einer Kultur von Zellen, die für das Wachstum adenoviraler Vektoren permissiv sind, wobei sich die Zellen in einem Medium befinden, (b) Kultivieren der Kultur unter Bedingungen, die das Wachstum der Zellen erlauben, (c) Durchleiten von frischem Medium durch die Kultur für einen Zeitraum von etwa 1 bis 6 Stunden in einer Menge von mindestens etwa dem zweifachen Volumen des Mediums in der Kultur, während die Zelldichte in dem Medium etwa 40 bis 70% derjenigen Zelldichte beträgt, die in dem Medium erhalten wird, wenn sich das Wachstum der Kultur in der stationären Phase befindet (auch als „Dichte in der stationären Phase" bezeichnet), (d) Inkontaktbringen der Kultur mit adenoviralen Vektoren unter Bedingungen, die für die Infektion der Zellen permissiv sind (vorzugsweise nachdem das Durchleiten von frischem Medium im Schritt (c) im Wesentlichen abgeschlossen ist, bevorzugter wenn es vollständig abgeschlossen ist), (e) Kultivieren der infizierten Zellen, um die adenoviralen Vektoren zu replizieren und (f) Ernten der infizierten Zellen, um einen adenoviralen Vektorstock zu erhalten.
Die Zellen können jeder zur Herstellung eines adenoviralen Vektorstocks geeignete Zelltyp sein. Es sind somit alle Zellen geeignet, die in der Lage sind, als adenoviralen Vektor produzierende Zellen zu fungieren. Beispiele für geeignete Zellen schließen Zellen primärer Zelllinien ein, wie humane embryonale Nierenzellen (human embryonic kidney, HEK), humane embryonale Lungenzellen (human embryonic lung, HEL) oder humane embryonale Retinoblasten (human embryonic retinoblast, HER), obwohl andere Zellen (z. B. HELA-Zellen oder kultivierte Gewebezellen) geeignet sein können. Vorzugsweise sind die Zellen verankerungsabhängige Zellen oder von verankerungsabhängigen Zellen abgeleitet, haben aber die Fähigkeit, in Suspensionskulturen zu wachsen. Bevorzugte HEK-Zellen sind 293-Zellen und Zellen von Zelllinien, welche von 293-Zellen abgeleitet sind. Bevorzugte HEL-Zellen sind A549-Zellen und Zellen von davon abgeleiteten Zelllinien.
Vorzugsweise sind die Zellen so modifiziert, dass sie DNA enthalten, welche einem Abschnitt (z. B. einer oder mehreren Nucleotidsequenzen) des adenoviralen Genoms entspricht oder davon abgeleitet ist, sodass sie in der Lage sind, einen adenoviralen Vektor zu komplementieren, der an solchen Sequenzen defizient ist, insbesondere einen replikationsdefizienten adenoviralen Vektor, wie sie allgemein in US 5 994 106 und WO 95/34671 beschrieben sind. Bevorzugter ist die Zelle zu solcher Komplementierung des adenoviralen Vektors in der Lage, während homologe Rekombination zwischen dem adenoviralen Vektor und der komplementierenden Zelle verhindert wird.
Vorzugsweise sind die modifizierten Zellen 293-, A549- oder modifizierte HER-Zellen oder von diesen abgeleitet. Insbesondere modifizierte HER-Zellen bieten verschiedene Vorteile gegenüber anderen Zellen, die zur Herstellung adenoviraler Vektorstocks befähigt sind. Es ist also wünschenswert, dass z. B. solche modifizierten HER-Zellen in hohem Maße transfizierbar sind, wesentlich niedrigere Frequenzen homologer Rekombination als 293-Zellen zeigen und bei Infektion mit adenoviralen Vektoren mit dem Auftreten von Plaques in Monolayern der Zellen in etwa 3–4 Tagen (versus z. B. 6–10 Tage im Zusammenhang mit 293-Zellen) in Zusammenhang stehen. Wenn sie mit adenoviralen Vektoren infiziert werden, ermöglichen solche modifizierten HER-Zellen also die schnellere Durchführung von Plaque-Assays als z. B. 293-Zellen. Zweckmäßigerweise sind die HER-Zellen mit Ausbeuten adenoviraler Vektoren in höheren Raten als in anderen Zelltypen verbunden, bevorzugter in Raten von etwa dem 2- bis 3-fachen dessen, was mit 293-Zellen erreicht wird, die mit ähnlichen adenoviralen Vektoren infiziert sind. Beispiele für geeignete modifizierte HER-Zellen schließen 911-Zellen ein, die in Fallaux et al., Human Gene Therapy, 7, 215–222 (1996), beschrieben sind. Besonders bevorzugte modifizierte HER-Zellen sind PER.C6-Zellen (Introgene, Inc.), die in der WO 97/00326 beschrieben sind.
Die Zellen bilden eine Kultur, die in einem geeigneten Medium gehalten wird. Die Zellkultur kann jede geeignete Kultur für die Herstellung adenoviraler Vektorstocks sein, bei der frisches Medium in einer Menge von mindestens etwa dem Zweifachen des Volumens des Mediums vor der Perfusion durch die Kultur durchgeleitet werden kann. Beispiele für geeignete Kulturen schließen Perfusionskulturen, Substrat-gestützte Kulturen, Mikroträger-gestützte Kulturen, Wirbelschichtkulturen oder Suspensionskulturen ein. Vorzugsweise ist die Kultur eine Perfusionszellkultur, wie eine Zellkultur mit kontinuierlicher Perfusion, oder eine Suspensionskultur, wie Suspensionskulturen, die in Rollflaschenkulturen verwendet werden, und Bioreaktor-Suspensionskulturen. Solche Kulturen sind gut bekannt und werden üblicherweise verwendet. Suspensionskulturen sind besonders bevorzugt, insbesondere wenn solche Kulturen vor und nach dem Durchleiten des frischen Mediums durch die Kultur in einem Batch- oder Fed-Batch-Modus gehalten werden.
Die Kultur ist in einem Medium. Das Medium kann jedes Medium sein, das zum Erhalten der Zellen geeignet ist und die Vermehrung der adenoviralen Vektoren darin erlaubt. Zahlreiche Beispiele für Medien, die zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, und die Prinzipien zur Erzeugung modifizierter oder neuer geeigneter Medien sind auf dem Gebiet bekannt. Im Allgemeinen wird das Medium eine Auswahl sezernierter zellulärer Proteine, diffusionsfähiger Nährstoffe, Aminosäuren, organischer und anorganischer Salze, Vitamine, Spurenmetalle, Zucker und Lipide sowie eventuell anderer Verbindungen, wie wachstumsfördernder Substanzen (z. B. Cytokine), enthalten. Das Medium sollte für das Wachstum des zur Herstellung des adenoviralen Vektorstocks verwendeten Zelltyps geeignet sein und wird daher physiologische Lösungen und Bedingungen (z. B. pH), unter denen solche Zellen natürlich gedeihen, nachahmen. Zahlreiche kommerzielle Kombinationen von Zellen und Medien sind verfügbar, und ein Durchschnittsfachmann ist leicht in der Lage, die gewünschten Bedingungen für die Kultur zu bestimmen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können sowohl undefinierte als auch definierte Medien geeignete Medien sein. Ein undefiniertes Medium ist ein Medium, in welchem die spezifischen Inhalte des Mediums (z. B. Art und Mengen an Proteinen und Nährstoffen) nicht bekannt oder durch ein festgesetztes Protokoll spezifiziert sind. Beispiele für geeignete undefinierte Medien schließen Medien ein, die auf Tierserum, wie (z. B.) fetalem Rinderserum (FBS), basieren oder die eine alternative Nährstoffquelle verwenden, z. B. enzymatische Verdaue von Fleisch, Organen oder Drüsen sowie Milch oder Hydrolysate von Weizengluten. Wenn ein undefiniertes Medium im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist es bevorzugt, dass das Medium ein serumfreies Medium (SFM) ist. Ein SFM enthält kein Serum, kann aber noch vom Tier stammende Komponenten enthalten, z. B. Albumin, Fetuin, Hormone, sowie „undefinierte" Komponenten, wie Organextrakte.
Bevorzugter ist das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Medium ein definiertes Medium. Ein definiertes Medium ist ein Medium, worin der Inhalt des Mediums bekannt und/oder auf ein spezielles Protokoll festgesetzt ist. Ein definiertes Medium wird typischerweise so formuliert, dass es den Anforderungen spezifischer Zelltypen genügt. Ein Beispiel für ein definiertes Medium ist ein Basalmedium. Ein Basalmedium besteht im Allgemeinen aus Vitaminen, Aminosäure, organischen und anorganischen Salzen und Puffern. Weitere „definierte" Komponenten, wie Rinderserumalbumin (BSA), können zugesetzt werden, um ein Basalmedium vollwertiger zu machen. Geeignete definierte Medien schließen proteinfreie und proteinhaltige Medien ein. Wenn ein definiertes Medium verwendet wird, wird vorzugsweise ein von tierischem Protein freies Medium verwendet. Ein von tierischem Protein freies Medium kann Proteine enthalten, enthält aber keine Proteine tierischen Ursprungs. Ein besonders bevorzugtes Medium ist ein von tierischem Protein freies Medium, das rekombinante Proteine und Wachstumsfaktoren (z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF)) sowie Lipide (z. B. Lebertranextrakte) und Cholesterin enthält. Ein Beispiel für ein handelsübliches bevorzugtes Medium ist Ex-Cell 525 (JRH Biosciences). Es ist auch wünschenswert, dass solche Medien mit Glutamin supplementiert werden.
Die Kultur kann auf jede geeignete Art bereitet werden, welche das Wachstum und die Aufrechterhaltung adenoviralen Vektor produzierender Zellen erlaubt. Um die Kultur herzustellen, wird das Medium typischerweise mit den Zellen inokuliert, die typischerweise in einer Lagerkultur enthalten sind, wie einer Kultur lebensfähiger, eingefrorener Zellen. Wenn die Zellen enthaltende Kultur in einer eingefrorenen Zellkultur enthalten ist, ist es wünschenswert, die Zellen dem Einfrieren unter Bedingungen auszusetzen, die geeignet sind, einen hohen Prozentsatz lebensfähiger Zellen für die zukünftige Verwendung in der Kultur aufrechtzuerhalten. Es sind mehrere Verfahren zum Einfrieren von Zellen für die spätere Verwendung bekannt. Die Fähigkeit solcher Verfahren, in der Kultur einen hohen Prozentsatz lebensfähiger Zellen für die Verwendung nach der Lagerung aufrechtzuerhalten, variiert jedoch in einem weiten Bereich. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Konservieren eines lebensfähige Zellen enthaltenden Mediums (z. B. einer Zellkultur) umfasst (a) Bereitstellen eines lebensfähige Zellen enthaltenden Mediums, (b) Senken der Temperatur des lebensfähige Zellen enthaltenden Mediums mit etwa 1,5°C/Minute von etwa 4°C oder höher bis etwa –40°C, (c) Halten der Temperatur des lebensfähige Zellen enthaltenden Mediums auf etwa –40°C für eine Dauer von etwa einer Minute oder länger, (d) Senken der Temperatur des lebensfähige Zellen enthaltenden Mediums auf eine Temperatur von etwa –150°C oder darunter (z. B. durch Eintauchen des lebensfähige Zellen enthaltenden Mediums in flüssigen Stickstoff (LN₂)) und (e) Halten des lebensfähige Zellen enthaltenden Mediums auf einer Temperatur von etwa –150°C oder darunter. Vorzugsweise wird die Temperatur der Kultur auf etwa –180°C oder darunter gesenkt, oder noch bevorzugter auf etwa –195°C oder darunter. Der Zeitraum, während dessen die Zellkultur auf etwa –40°C gehalten wird, kann irgendein Zeitraum von etwa einer Minute oder länger sein. Die Verwendung dieses Verfahrens zum Konservieren von Zellen führt zu einer verbesserten Beibehaltung des Prozentsatzes lebensfähiger Zellen während der Lagerung und nach dem Auftauen gegenüber anderen Protokollen, die auf dem Eintauchen in LN₂ zum Einfrieren der Zellen beruhen. Andere Vorteile des beschriebenen Verfahrens bestehen darin, dass die Zugabe potentiell kontaminierender oder vielleicht sogar toxischer Kryoprotektiva nicht erforderlich ist und auch nicht das Zuführen von Energie während der Gefriervorgangs, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewahren, oder die Anwendung von Vakuum.
Wenn die eingefrorene Zellkultur verwendet werden soll, wird sie auf eine geeignete Temperatur aufgetaut. Es kann jede geeignete Auftaumethode verwendet werden, und es sind mehrere auf dem Gebiet bekannt. Beispielsweise kann die Zellen enthaltende Kultur einem „Schnellauftauen" unterworfen werden, indem die Kultur in einen geeigneten Behälter und der Behälter (und die darin befindliche Kultur) in ein Wasserbad von 37°C gebracht wird, während der Behälter in dem Bad schnell geschüttelt wird, bis die Kultur zu etwa 3/4 aufgetaut ist, wobei ein kleiner Teil der Kultur noch gefroren ist. An diesem Punkt wird die Kultur aus dem Wasserbad entfernt, aber es wird weiter geschüttelt, bis die Kultur vollständig aufgetaut ist. Nach dem Auftauen ist die Kultur der eingefrorenen Zellen für die weitere Kultivierung bereit. Vorzugsweise werden solche eingefrorenen Zellkulturen als Inokulum für eine Kultur verwendet, die frisches Medium enthält oder daraus besteht.
Nach dem Inokulieren mit den Zellen wird die Kultur dann unter Bedingungen kultiviert, welche das Wachstum der Zellen erlauben. Jede geeignete Art des Kultivierens der Kultur, die das Wachstum der adenovirale Vektoren produzierenden Zellen erlaubt, ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet. Das Verfahren zum Kultivieren solcher Zellen hängt von der Art der gewählten adenoviralen Vektorzelle ab. Geeignete Kultivierungsmethoden sind auf dem Gebiet wohlbekannt, und sie beinhalten typischerweise, dass der pH-Wert und die Temperatur in Bereichen gehalten werden, die für das Wachstum der Zellen geeignet sind. Bevorzugte Temperaturen für das Kultivieren sind etwa 35–40°C, bevorzugter etwa 36–38°C und optimalerweise etwa 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert der Kultur auf etwa 6–8, bevorzugter etwa 6,7–7,8 und optimal auf etwa 6,9–7,5 gehalten.
Ab der Inokulation der Kultur und während des Kultivierens der Kultur folgt das Zellwachstum typischerweise einem charakteristischen Muster, das aus fünf Stufen besteht. Die erste Stufe oder Anlaufphase (Lag-Phase) tritt beim Einführen von Zellen oder Lagerkultur in das Medium zur Bildung der Kultur auf. Vorzugsweise bestehen die Zellen oder die Lagerkultur (i. e. das „Inokulum"), die zum Inokulieren des Mediums verwendet wird, aus einem hohen Prozentsatz lebensfähiger Zellen und einem relativ frischen Lagermedium, um die Dauer der Lag-Phase zu verkürzen.
Auf die Lag-Phase folgt typischerweise eine Log-(oder exponentielle)Phase, in der sich Zellen mit der maximal möglichen Wachstumsrate teilen, wodurch die Zahl der gesamten lebensfähigen Zellen in der Kultur steigt. Die Wachstumsrate der Zellen hängt vom Wachstumsmedium und den Wachstumsbedingungen (z. B. Belüftung, pH-Wert etc.) ab, die vorzugsweise so optimiert werden, dass das Zellwachstum während der Log-Phase gefördert wird. Die Zellwachstumsrate wird jedoch unter keinen Umständen die maximale Verdopplungszeit übertreffen, die ihrerseits vom Zelltyp abhängt. Die Zellwachstumsrate während der exponentiellen Phase ist konstant, da sich aber jede Zelle zu ei nem etwas anderen Zeitpunkt teilt, steigt die Wachstumskurve graduell an. Auf die Log-Phase folgt eine Verlangsamungsphase, wo die Rate des Anstiegs lebensfähiger Zellen in der Kultur abnimmt. Auf die Verlangsamungsphase folgt eine stationäre Phase, wo die Gesamtzahl lebensfähiger Zellen in der Kultur nicht mehr ansteigt, wobei dieser Effekt entweder durch ein Fehlen der Zellteilung oder durch ein ausgeglichenes Verhältnis von Zellteilung und Zelltod bewirkt wird. Wenn die Zellkultur nicht vor oder während der stationären Phase geerntet wird, durchläuft die Kultur eine zweite Verlangsamungsphase, wo die Gesamtzahl lebensfähiger Zellen abnimmt, gefolgt von einer exponentiellen Absterbephase. Die Zelldichte steigt während des Wachstumszyklus der Kultur. Die Konzentration der Zellen in dem Medium kann während des Kultivierens der Kultur verfolgt werden.
Zellwachstumsraten, und somit der oben beschriebene Wachstumszyklus, können nach zahlreichen, auf dem Gebiet bekannten Verfahren bestimmt werden. Verfahren, die auf die Gesamtzahl der Zellen in der Kultur fokussieren, schließen die Bestimmung des Gewichts der Kultur, die Bestimmung der Trübung der Kultur, die Bestimmung der metabolischen Aktivität in der Kultur, elektronische Zellzählung, mikroskopische Zählung der Zellen in Kulturproben, Plattenausstrich-Zählung unter Verwendung serieller Verdünnungen, Membranfilterzählung und Radioisotopen-Assays ein. Über mechanische Systeme zur Messung der Zelldichte, die auf diesen und anderen Prinzipien basieren und insbesondere zur Verwendung in Bioreaktoren geeignet sind, findet sich ein Überblick in z. B. Junker et al., Bioprocess Engineering, 10, 195–207 (1994). In letzter Zeit werden Massenspektrometrie und andere fortgeschrittene Analysemethoden auf ähnliche Art und Weise verwendet (siehe z. B. Behrendt et al., Cytotechnology, 14, 157–65 (1994)). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist jede Methode geeignet, welche die Bestimmung der Zelldichte erlaubt. Die Zelldichte einer Kultur kann spektrophotometrisch oder unter Verwendung einer Zählkammer, wie eines Hämocytometers, bestimmt werden. Vorzugsweise wird ein Hämocytometer verwendet. Kurz gesagt, beinhalten Verfahren, die auf einem Hämocytometer basieren, die Entnahme einer Probe der Kultur, das Zählen (und eventuell auch Untersuchen) einer statistisch signifikanten Zahl von Zellen in einem gegebenen Raum in dem Hämocytometer und die Bestimmung der Zelldichte in der Kultur unter Verwendung einfacher mathematischer Formeln.
Die Zelllebensfähigkeit kann auch nach einer Reihe von Verfahren bestimmt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind. Ein bevorzugtes Verfahren ist das Farbstoffausschluss verfahren, das einen Indikatorfarbstoff verwendet, um Zellmembranschäden zu identifizieren. Zellen, die den Farbstoff absorbieren, werden angefärbt und werden als nicht lebensfähig betrachtet. Üblicherweise werden Farbstoffe wie Trypanblau, Erythrosin und Nigrosin verwendet. Vorzugsweise werden Assays auf der Basis von Trypanblau verwendet. Weitere Einzelheiten zur Durchführung solcher Verfahren und anderer Verfahren zur Zellkultivierung und -analyse finden sich beispielsweise in Lubiniecki, Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology (Marcel Dekker, Inc., New York, 1990), Kostaninov et al., Trends in Biotechnol., 12, 324–33 (1994), Mather, „Making Informed Choices: Medium, Serum, and Serum-Free Medium", Kapitel 2, in Methods in Cell Biology, 57, 19–30 (1998), Freshney, Culture of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc., 1987), Harrison, General Techniques of Cell Culture (Cambridge Univ. Press 1997), Animal Cell Culture Methods, Barnes und Mather (eds.) (1998), und Bonarius et al., Biotechnology and Bioengineering, 45, 524–35 (1995).
Die Kultur wird kultiviert, bis die Zelldichte in dem Medium etwa 40–70% (z. B. etwa 45–70% oder sogar etwa 50–70%) der Zelldichte ist, die in dem Medium erhalten würde (oder erhalten wird), wenn das Wachstum der Kultur in der stationären Phase ist. Während sich die Kultur innerhalb dieses Bereichs der Zelldichte befindet, wird frisches Medium etwa 1–6 Stunden in einer Menge von mindestens etwa dem Zweifachen des Volumens des Mediums in der Kultur zu diesem Zeitpunkt (i. e. unmittelbar vor der Perfusion) durch die Kultur durchgeleitet. Diese Perfusion mit hohem Volumen über kurze Zeit kann man als „intensive Perfusion" bezeichnen, und sie dient sowohl dazu, frisches Medium bereitzustellen, als auch dazu, substantielle Mengen an verbrauchtem Medium, das sich vor dem Einsetzen der intensiven Perfusion in der Kultur angesammelt hat, zu entfernen. Bevorzugter wird frisches Medium in einer Menge von etwa dem 3- bis 4-fachen Volumen der Kultur durch die Kultur durchgeleitet. Es kann sogar mehr frisches Medium durch die Kultur durchgeleitet werden, aber eine Menge von etwa dem 3- bis 4-fachen des Volumens des Mediums in der Kultur ist am meisten bevorzugt, insbesondere im Hinblick auf die mit der Perfusion mit frischem Medium verbundenen Kosten und den Mangel an signifikanter Zunahme an adenoviralen Vektoren, die durch die Perfusion mit zusätzlichem Medium produziert werden.
Perfusion/Durchleiten durch die Kultur bedeutet, dass ein bestimmtes Volumen an Medium zu der Kultur hinzugefügt und eine im Wesentlichen gleiche Menge an Medium aus der Kultur entfernt wird, ohne dass ein signifikanter Prozentsatz der Zellen in der Kultur entfernt wird. Die intensive Perfusion kann nach jedem geeigneten Verfahren durchgeführt werden. Typischerweise wird ein Bioreaktor mit Perfusionsmöglichkeit verwendet, um eine solche Perfusion durchzuführen. Für kontinuierliche Perfusionskulturen erfolgt das Durchleiten von frischem Medium während des gesamten Kultivierens; die Rate des kontinuierlichen Durchleitens wird jedoch nach Bedarf geändert um sicherzustellen, dass frisches Medium in einer Menge von mindestens etwa dem 2-fachen des Volumens des Mediums in der Kultur durch die Kultur durchgeleitet wird, wenn die Zelldichte in der Kultur die hier beschriebenen Werte hat. Typischerweise erfolgt bei kontinuierlichen Perfusionskulturen die Perfusion durch die Kultur bei einer Rate von etwa 1–4 Volumina Medium in der Kultur pro Tag. Während das kontinuierliche Kultivieren ein geeignetes Mittel zum Zusetzen von frischem Medium zu der Kultur ist, um die Zellen während des Kultivierens zu unterhalten, ist es beim Entfernen großer Mengen (z. B. über etwa 20%, 50%, 65% oder sogar höherer Prozentsätze) an verbrauchtem Medium aus der Kultur nicht effizient.
Das Durchleiten des mindestens etwa Zweifachen des Volumens des Mediums in der Kultur kann bei jeder geeigneten Rate erfolgen, sodass die intensive Perfusion in etwa 1–6 Stunden beendet ist. Insbesondere sind geeignete Raten solche, bei denen frisches Medium ausreichend schnell zugesetzt wird, um der Kultur frisches Medium über kurze Zeit bereitzustellen, aber langsam genug, dass die Scherrate in der Kultur nicht zu einem Verlust eines großen Prozentsatzes lebensfähiger Zellen in der Kultur aufgrund der Scherung führt. Die Perfusionsraten während der intensiven Perfusion hängen von der Art des Systems ab, das verwendet wird, um Medium durch die Kultur durchzuleiten (z. B. von der Art der zum Durchleiten des Mediums verwendeten Pumpe). Es sind verschiedene geeignete Perfusionssystems bekannt, und der Durchschnittsfachmann wird leicht in der Lage sein, eine passende Rate für das spezielle verwendete System zu bestimmen. Vorzugsweise wird die intensive Perfusion bei einer solchen Rate erfolgen, dass die intensive Perfusion etwa 2–4 Stunden dauert, und noch bevorzugter etwa 2–3 Stunden. Das Durchleiten durch die Kultur während der intensiven Perfusion erfolgt bei einer Rate von etwa 70–200% des Volumens des Mediums in der Kultur pro Stunde. Bevorzugter ist die Rate etwa 80–150% des Volumens des Mediums in der Kultur pro Stunde. Perfusionsraten von etwa 1,3 Volumina des Mediums in der Kultur pro Stunde während des Schrittes der intensiven Perfusion in einem 10-Liter-Bioreaktor sind besonders bevorzugt.
Durch das Durchleiten von frischem Medium durch die Kultur in einer Menge von mindestens etwa dem Zweifachen des Volumens der Kultur werden etwa 66% oder mehr des verbrauchten Mediums vor dem Kontakt mit den adenoviralen Vektoren aus der Kultur entfernt (und durch frisches Medium ersetzt). Beispielsweise führt das intensive Durchleiten von frischem Medium in einer Menge, die etwa gleich dem Drei- bis Vierfachen des Volumens der Kultur ist, dazu, dass etwa 95% oder mehr des verbrauchten Mediums in der Kultur entfernt werden (und somit durch frisches Medium ersetzt werden). Ein Vorteil der Zugabe von mindestens etwa 66% frischem Medium zu der Kultur durch Durchleiten von mindestens etwa dem Zweifachen des Volumens des Mediums der Kultur durch die Kultur besteht darin, dass das „Hungern" der Zellen nach Nährstoffen in der Kultur und folglich ein niedrigerer Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur vermieden werden. Folglich werden solche Level des Mediumaustauschs bevorzugt. Obwohl etwas verbrauchtes Medium in der Kultur bleibt, beeinträchtigen so niedrige Gehalte an verbrauchtem Medium in der Kultur während und nach der Infektion mit den adenoviralen Vektoren die Ausbeute an adenoviralem Vektor nicht signifikant. Daher sind Verfahren der kontinuierlichen Perfusion oder der Perfusion von frischem Medium bei höheren Levels vor dem Inkontaktbringen der Kultur mit den adenoviralen Vektoren weniger wünschenswert.
Vorzugsweise wird das frische Medium durch die Kultur durchgeleitet, während die Zelldichte etwa 44% bis etwa 70% (z. B. etwa 44–63%), bevorzugter etwa 55–70% (z. B. etwa 60–70%) der Dichte der Kultur in der stationären Phase beträgt, noch bevorzugter während die Zelldichte etwa 62–69% (z. B. etwa 65%) der Dichte der Kultur in der stationären Phase beträgt. Typischerweise werden solche Dichten während der mittleren bis späten exponentiellen Phase der Kultur erreicht.
Die tatsächliche Zelldichte in dem Medium in der stationären Phase kann jede geeignete Dichte sein. Die spezifische Dichte in der stationären Phase für irgendeine Kultur hängt von den spezifischen Komponenten der Kultur (z. B. Art der Zellen und des Mediums, die verwendet werden) ab und hängt signifikant von der Art und Größe der Kultur ab. Eine typische Dichte in der stationären Phase kann 1 – 9 × 10⁶ Zellen/ml sein. Beispielsweise ist für einen 10-Liter-Fed-Batch- oder -Batch-Bioreaktor einer HER-Zellkultur die Dichte in der stationären Phase typischerweise etwa 1,5 × 10⁶ – 2,6 × 10⁶ Zellen/ml, typischer etwa 1,5 × 10⁶ – 2 × 10⁶ Zellen/ml. Für 10-Liter-Bioreaktoren mit kontinuierlicher Perfusion ist die Dichte in der stationären Phase oft höher, wie 5 – 6 × 10⁶ Zellen/ml für A549-Zellen in einem 10-Liter-Bioreaktor mit kontinuierlicher Perfusion. Demgegenüber ist die typische Dichte in der stationären Phase für 293-Zellen und Zellen von 293-abgeleiteten Zelllinien sowie HER-Zelllinien, die in einem 10-Liter-Bioreaktor mit kontinuierlicher Perfusion wachsen, etwa 7 – 9 × 10⁶ Zellen/ml. Da 10-Liter-Fed-Batch-, -Batch- und kontinuierliche Perfusionskulturen bevorzugt sind, stellen diese Zelldichten bei der Durchführung der Erfindung bevorzugte Zelldichten in der stationären Phase dar. Die Zahl der Zellen in dem Medium, wenn die Kultur in der stationären Phase ist, kann bestimmt werden, indem man einen Teil der Kultur zur stationären Phase gehen lässt oder indem man im Wesentlichen ähnliche Kulturen untersucht, bei denen die Dichte der Kultur in der stationären Phase bestimmt wird.
Die Zelldichte in dem Medium während der intensiven Perfusion ist typischerweise etwa 0,8 – 4,2 × 10⁶ Zellen/ml. Insbesondere ist die Zelldichte in dem Medium während der intensiven Perfusion typischerweise 0,8 × 10⁶ – 1,1 × 10⁶ Zellen/ml, spezieller etwa 1,0 × 10⁶ – 1,1 × 10⁶ Zellen/ml, in 10-Liter-Fed-Batch- und -Batch-Bioreaktoren. In einem 10-Liter-Fed-Batch-Bioreaktor können die Zelldichten, während frisches Medium durch die Kultur durchgeleitet wird, etwa 0,8 × 10⁶ – 1,4 × 10⁶ Zellen/ml, spezieller etwa 1,1 × 10⁶ – 1,3 × 10⁶ Zellen/ml, sein. Für einen 10-Liter-Bioreaktor mit kontinuierlicher Perfusion können solche Dichten etwa 2,4 × 10⁶ – 4,2 × 10⁶ Zellen/ml sein. Solche Dichten repräsentieren bevorzugte Dichten, bei denen frisches Medium in einer Menge von mindestens etwa dem zweifachen Volumen des Mediums in der Kultur durch die Kultur durchgeleitet werden sollte.
Die Zeit zum Erreichen der Zelldichte, bei der frisches Medium in einer Menge von mindestens dem Zweifachen des Volumens des Mediums in der Kultur durch die Kultur durchgeleitet wird, variiert in Abhängigkeit vom Vektor, dem Zelltyp und der Art der Kultur, die während des Zellwachstumszyklus verwendet werden. Beispielsweise kann ausgehend von eingefrorenen Zellen mit einer Dichte von weniger als 3 × 10⁵ Zellen/ml ein Zeitraum von etwa 6–10 Tagen erforderlich sein, um die oben genannten Zelldichten zu erreichen. Die Kultur kann in einem einzelnen Behälter oder in mehreren Behältern kultiviert werden. Beispielsweise kann die Kultur anfangs in mehreren Rollflaschen kultiviert werden, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist, dann können die separaten Kulturen in einem einzigen Behälter, wie einem Bioreaktor, oder in verschiedenen Bioreaktoren vereinigt werden.
Neben der direkten Messung oder Überwachung der Zelldichte ist ein Durchschnittsfachmann in der Lage, Zeiten oder andere Angaben, die den zuvor genannten Zelldichten entsprechen, für die Zellen und die Kultur zu bestimmen, die zur Herstellung der adenoviralen Vektorstocks verwendet werden. Es kann z. B. eine Zeit, die der Zelldichte entspricht, die mit der optimalen Stock-Herstellung assoziiert ist, für einen speziellen Stock bestimmt und als Hinweis darauf verwendet werden, wann die Kultur mit den adenoviralen Vektoren in Kontakt gebracht werden sollte, wenn die Erfindung mit einem im Wesentlichen ähnlichen Stock (z. B. gleicher Zelltyp und gleiches Medium) durchgeführt wird. Eine andere verfügbare Methode ist die Verwendung mathematischer Wachstumsformeln, die auf einem oder mehreren Probenpunkten während des Wachstums der Kultur basieren, wie das Monrod-Modell. Jede dieser Techniken oder andere, ähnliche Techniken können mit mechanischen Überwachsungstechniken oder anderen Techniken zur Durchführung der Erfindung unter solchen bestimmten Parametern kombiniert werden.
Wenn die zuvor genannten Zelldichten oder andere geeignete Angaben erreicht werden und die intensive Perfusion von frischem Medium durch die Kultur im Wesentlichen abgeschlossen, vorzugsweise ganz abgeschlossen ist, wird die Kultur mit adenoviralen Vektoren unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die für die Infektion der Zellen permissiv sind. Vorzugsweise erfolgt ein solches Inkontaktbringen der Kultur mit den adenoviralen Vektoren sehr nahe dem Abschluss des Durchleitens von frischem Medium durch die Kultur, und idealerweise erfolgt der Kontakt gleichzeitig mit dem Abschluss der Perfusion. Da frisches Medium durch die Kultur durchgeleitet wird, bleibt die Dichte der Kultur durch die intensive Perfusion mit frischem Medium signifikant unverändert (idealerweise sind die Zelldichten in der Kultur vor und nach einer solchen Perfusion gleich). Daher sind die zuvor genannten Zelldichten, die verwendet werden um anzuzeigen, wann die Perfusion von frischem Medium durch die Kultur geeignet ist, auch ein Hinweis auf die Zelldichten, wenn die Kultur mit den adenoviralen Vektoren in Kontakt gebracht werden sollte. Jede geeignete Zelldichte innerhalb von etwa 40–70% der Dichte in der stationären Phase ist geeignet, und bevorzugte Bereiche für das Inkontaktbringen und Infizieren der Zellen mit den adenoviralen Vektoren sind im Wesentlichen identisch mit den vorgenannten bevorzugten Bereichen für die Durchführung der intensiven Perfusion. Bevorzugte Zelldichten für einen speziellen Zelltyp, die geeignet sind für die Herstellung eines adenoviralen Vektorstocks, können im Bereich von 40–70% der Dichte in der stationären Phase, bezogen auf den speziellen Zelltyp, etwas variieren. Geeignete Dichten erlauben die Herstellung hoher Ausbeuten assemblierter adenoviraler Vektoren, insbesondere aktiver/lebensfähiger adenoviraler Vektoren, im Gegensatz zur bloßen Herstellung von Proteinen durch die infizierten Zellen, die typischerweise mit dem Infizieren von Zellen bei Zelldichten deutlich über 70% der Dichte in der stationären Phase verbunden ist.
Der adenovirale Vektor kann jeder zum Vermehren in einer Zelle befähigte adenovirale Vektor sein, der zu einem signifikanten Teil (wenn auch nicht notwendigerweise substantiell) vom Genom eines Adenovirus abgeleitet ist oder darauf basiert. Adenovirale Vektoren sind auf dem Gebiet gut bekannt und z. B. in US 5 559 099 , 5 712 136 , 5 731 190 , 5 837 511 , 5 846 782 , 5 962 311 , 5 965 541 , 5 981 225 , 5 994 106 , 6 020 191 und Thomas Shenk, „Adenoviridae and their Replication", und M. S. Horwitz, „Adenoviruses", Kap. 67 bzw. 68, in Virology, B. N. Fields et al., eds., (3. Aufl.), Raven Press, Ltd., New York, 1996, charakterisiert. Die adenoviralen Vektoren können auf dem Genom irgendeines geeigneten Wildtyp-Adenovirus basieren. Vorzugsweise sind die adenoviralen Vektoren vom Genom eines Wildtyp-Adenovirus der Untergruppe C abgeleitet, insbesondere vom Serotyp 5 (Ad5).
Die adenoviralen Vektoren können replikationsdefizient sein. Replikationsdefiziente adenovirale Vektoren sind auf dem Gebiet gut bekannt und beschrieben, z. B. in US 5 994 106 sowie in den zuvor genannten Literaturstellen. Der adenovirale Vektor kann ein mehrfach defizienter adenoviraler Vektor sein, wie in US 5 851 806 und in WO 95/34671 beschrieben. Replikationsdefiziente adenovirale Vektoren erfordern die Vermehrung in einer komplementierenden Zelllinie oder in Gegenwart eines Helfervirus, das in trans die essentiellen Funktionen bereitstellt, die in dem defizienten Vektor nicht vorhanden sind (Berker et al., J. Virol., 61, 1213–1220 (1987); Davidson et al., J. Virol., 61, 1226–1239 (1987); Mansour et al., Mol. Cell Biol., 6: 2684–2694 (1986)). Vorzugsweise sind, wie oben erwähnt, die Zellen, die zum Vermehren replikationsdefizienter adenoviraler Vektoren verwendet werden, komplementierende Zelllinien und solche, welche die Replikation des adenoviralen Vektors aufgrund der Fähigkeit solcher Zellen zum Exprimieren von Genprodukten, die in dem replikationsdefizienten adenoviralen Vektor fehlen, ermöglichen.
Einige der adenoviralen Vektoren können adenovirale Gentransfervektoren sein. Vorzugsweise bestehen die adenoviralen Vektoren im Wesentlichen aus adenoviralen Gentransfervektoren und bevorzugter sind alle adenoviralen Vektoren adenovirale Gentrans fervektoren. Ein adenoviraler Gentransfervektor ist ein adenoviraler Vektor, der in der Lage ist, ein oder mehrere exogene Gene in eine Zellumgebung einzuführen, und ist bevorzugter ein Vektor, der in der Lage ist, ein oder mehrere solche exogene Gene zu exprimieren. Die Herstellung adenoviraler Gentransfervektoren ist auf dem Gebiet gut bekannt und beinhaltet die Verwendung molekularbiologischer Standardmethoden wie jener, die z. B. in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, (2. Aufl.), Cold Spring Harbor Press (1992), Watson et al., Recombinant DNA, (2. Aufl.), Scientific American Books (1992), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987), und in verschiedenen der zuvor genannten Literaturstellen beschrieben sind. Vorzugsweise ist das exogene Gen eine Komponente einer Expressionskassette, einschließlich einer oder mehrerer Regulationssequenzen (z. B. einer Promotor- und/oder Enhancer-Sequenz, wie einem Cytomegalovirus(CMV)-Promotor), und Terminations- und/oder mRNA-Polyadenylierungs(polyA)-Codierungssequenz, und codiert für ein exprimierbares Polypeptid oder mRNA (z. B. ein therapeutisches Protein).
Beim oder nach dem Kontakt der Kultur mit den adenoviralen Vektoren dürfen die adenoviralen Vektoren die Zellen infizieren. Bedingungen für die Infektion durch die adenoviralen Vektoren sind auf dem Gebiet bekannt und in mehreren der zuvor genannten Literaturstellen beschrieben. Die Temperatur der Kultur während des Kontakts der Kultur mit den adenoviralen Vektoren ist vorzugsweise etwa 35–40°C, bevorzugter etwa 36–38°C, und optimal etwa 37°C. Der pH-Wert während des Kontakts der Kultur mit den adenoviralen Vektoren ist vorzugsweise etwa 6,7–7,8, bevorzugter etwa 6,9–7,5. Während der Kontakt zwischen den adenoviralen Vektoren und der Kultur bei jeder geeigneten Konzentration (wie durch Konzentrieren des Mediums bis zu 5 × 10⁶ Zellen/ml oder sogar höher) möglich ist, kann die Kultur- und vorzugsweise wird sie – mit den adenoviralen Vektoren kontaktiert werden, ohne dass die Zellen vor einem solchen Kontakt konzentriert werden. Das Verhältnis der die Kultur kontaktierenden adenoviralen Vektoren zu den Zellen in der Kultur (ansonsten bekannt als die Infektionsmultiplizität oder MOI) ist zweckmäßigerweise größer als eins und bevorzugter etwa fünf oder höher.
Der Kontakt der adenoviralen Vektoren unter für die Infektion permissiven Bedingungen kann während einer geeigneten Dauer durchgeführt werden, die ein gewünschtes Ausmaß an Infektion der Zellen mit den adenoviralen Vektoren ermöglicht. Die Zeit für die Infektion hängt mindestens vom Titer des Virus und dem spezifischen Zelltyp, der verwendet wird (da einige Zelltypen eine größere Dichte der Rezeptoren, die vom Adeno virus zum Anheften an Zellen verwendet werden, aufweisen können), und der für die adenoviralen Vektoren verfügbaren Oberfläche (die eine Funktion des verwendeten Kulturtyps und/oder Zelltyps ist) ab. Ferner kann die gewünschte Dauer durch die Art des verwendeten adenoviralen Vektors (z. B. kann das Virus ein verändertes Hüllprotein (Coat-Protein) durch rekombinationstechnische Veränderung haben oder mit einer chemischen Einheit konjugiert sein, die seine Fähigkeit zur Bindung an Zellen beeinflusst) beeinflusst sein. Ein Durchschnittsfachmann kann leicht eine entsprechende Kontaktzeit der Kultur mit den adenoviralen Vektoren bestimmen, indem er solche Variablen berücksichtigt. Typischerweise ist eine Dauer von etwa einer Stunde unter den meisten Bedingungen für die Infektion durch adenovirale Vektoren auf Basis des Serotyp 5 ausreichend, obwohl eine längere Dauer (z. B. mindestens etwa 2, 3, 5, 10, 15 oder 24 Stunden oder sogar länger) verwendet werden kann. Typischerweise sind die Kontaktdauer der Zellen mit dem adenoviralen Vektor und die Dauer der Kultur der Zellen nach einem solchen Kontakt zeitgleich, da die Kultur nicht konzentriert wird und kein Austausch von Medium oder eine andere signifikante Modifizierung an der Kultur nach dem Inkontaktbringen der Kultur mit den adenoviralen Vektoren erfolgt.
Der Austausch von Medium während des Kontakts der Kultur mit den adenoviralen Vektoren ist nicht erforderlich und vorzugsweise ist die Perfusion von frischem Medium durch die Kultur vor der Infektion der einzige Austausch von Medium, der während des Verfahrens zur Herstellung des adenoviralen Vektorstocks verwendet wird. Ebenso wird es vorgezogen, dass andere Nährstoffergänzungen (z. B. Glucose) nicht nach der Infektion zugesetzt werden. Der Austausch von Medium während des Inkontaktbringens der Kultur mit dem adenoviralen Vektor oder bald danach kann zu einer unerwünschten Entfernung lebensfähiger adenoviraler Vektoren aus dem Medium nach ihrem Einführen in die Kultur führen. Wenn jedoch der Austausch von Medium nach der Infektion erfolgt, werden vorzugsweise weniger als 100% des Mediums ausgetauscht, bevorzugter werden etwa 50% des Mediums oder weniger ausgetauscht. Ferner können, wie oben festgestellt, die Zellen mit den adenoviralen Vektoren in Kontakt gebracht werden, ohne dass die Zellen vor und/oder während eines solchen Kontakts konzentriert werden. Vorzugsweise wird, insbesondere bei der Herstellung adenoviraler Vektorstocks in großem Maßstab, die Kultur vor der Perfusion von frischem Medium oder während des Kontakts der Kultur mit den adenoviralen Vektoren nicht signifikant konzentriert, und am bevorzugtesten wird sie gar nicht konzentriert. Dass das Konzentrieren der Kultur während der Herstellung der adenoviralen Vektoren vermieden wird, ist insofern wünschenswert, als der Konzentrationsprozess große und teure Ausstattung (z. B. eine Zentrifuge, die zum Konzentrieren einer 10-Liter-Kultur in der Lage ist) und hohen Arbeitsaufwand erfordern kann.
Nach dem Inkontaktbringen der Kultur mit den adenoviralen Vektoren unter für die Infektion der Zellen permissiven Bedingungen werden die infizierten Zellen für die vollständige Herstellung des adenoviralen Vektorstocks kultiviert. Ähnlich wie beim Kultivieren der Zellen vor dem Kontakt kann die infizierte Kultur unter jedweden geeigneten Bedingungen kultiviert werden, die für die Vermehrung der adenoviralen Vektoren in den Zellen permissiv sind. Vorzugsweise wird der pH-Wert der Kultur auf etwa 6,5–7,5, bevorzugter auf etwa 6,9–7,3, gehalten. Vorzugsweise werden pH-Wert und/oder andere Bedingungen so aufrechterhalten, dass der Glucosemetabolismus durch die Zellen optimiert wird, während tierische Zellen, während die Produktion von Milchsäure in der Kultur reduziert wird. Der pH-Wert einer Zellkultur kann nach jedem geeigneten Verfahren geregelt werden, vorzugsweise auf eine Art und Weise, welche die Herstellung des adenoviralen Vektorstocks nicht signifikant hemmt. Es sind mehrere geeignete Methoden zum Modifizieren des pH-Werts auf dem Gebiet bekannt, darunter die Zugabe von Puffern (z. B. Bicarbonat- oder Tris-Puffer). Die Temperatur ist ein weiterer Faktor, der die Herstellung des adenoviralen Vektorstocks nach der Infektion beeinflusst. Es kann jede für die Herstellung des adenoviralen Vektorstocks geeignete Temperatur verwendet werden, vorzugsweise eine Temperatur von etwa 35–40°C, bevorzugter etwa 36–38°C (z. B. etwa 37°C). Das ordentliche Mischen der Kultur ist eine weitere Bedingungen, die für das Zellwachstum und die Herstellung adenoviraler Vektoren von Bedeutung sein kann. Andere Faktoren, die in Betracht gezogen werden können, schließen ein: Sauerstoffkonzentration, CO₂-Perfusionsrate, Konzentration, Absetzen und Durchsatz von Zellen in der Kultur und Gehalte an speziellen Nährstoffen und/oder Zwischenprodukten, welche das Zellwachstum und die Stoffwechselrate beeinflussen (z. B. Glutamin) (siehe z. B. Ho et al., CRC Critical Reviews in Biotechnology, 4(2), 185–252 (1986); Kyung et al., Cytotechnology, 14, 183–90 (1994); Yoon et al., Biotechnology and Bioengineering, 44, 983–990 (1994); und Oeggerli et al., Biotechnology and Bioengineering, 45, 54–62 (1995)). Die oben genannten Grundlagen und Methoden sind, obwohl sie im Zusammenhang mit dem Kultivieren der Kultur nach der Infektion erörtert wurden, auch auf das hier beschriebene Kultivieren vor der Infektion anwendbar.
Wenn die Zellen in der Kultur eine Zelldichte von etwa 40–70% der Dichte in der stationären Phase erreichen, ist die Kultur in einem Zustand, in dem die Gehalte an Nährstoffen ausreichend hoch sind, um hohe Prozentsätze lebensfähiger Zellen in der Kultur (z. B. etwa 85% oder höher) aufrechtzuerhalten, aber ausreichend niedrig, um zu bewirken, dass eine substantielle Anzahl der Zellen in der Kultur (z. B. mindestens etwa 50%, mindestens etwa 60% oder mindestens etwa 75% der Zellen in der Kultur) einer G₁-Suppression unterliegt (insbesondere wenn man die Kultur eine solche Dichte ohne Zugabe von Medium vor der intensiven Perfusion erreichen lässt). Während der G₁-Suppression ist der normale Zellzyklus ausgesetzt, und die Kultur wird im Wesentlichen eine synchrone Kultur (i. e. ein substantieller Anteil der Zellen in der Kultur tritt zur selben Zeit in den Zellzyklus ein und unterliegt den Wachstumsstufen zu ähnlichen Zeiten und mit ähnlichen Raten). Synchrone Kulturen sind für die Herstellung von Produkten durch Zellkultur, einschließlich viraler Vektoren, vorteilhaft. Dieses Verfahren, eine synchrone Kultur zu erhalten, unterscheidet sich von anderen, derzeit praktizierten Verfahren (z. B. Erhalt einer synchronen Kultur durch Inkontaktbringen der Zellen mit Chemikalien oder durch Infektion mit RNA-basierten Viren). Ferner wird angenommen, dass durch die intensive Perfusion und den begleitenden Austausch von Medium die Nährstoffe in dem frischen Medium die Zellen in die Lage versetzen, die G₁-Suppression zu überwinden und eine synchrone Kultur während und nach der Infektion mit den adenoviralen Vektoren bereitzustellen. Diese Annahme beruht beispielsweise auf der Beobachtung, dass der Austausch von Medium nach der Infektion innerhalb der hier angegebenen Bereiche mit einem kurzen und unüblich schnellen Wachstum bei der Zellpopulation in der Kultur verbunden ist, bevor solche Raten auf vorhersagbare Wachstumsniveaus absinken. Auf Wunsch können andere auf dem Gebiet bekannte Verfahren verwendet werden um sicherzustellen, dass die Kultur eine synchrone Kultur ist. Die Verwendung solcher Verfahren ist jedoch nicht wünschenswert, wenn sie andere Viren involvieren oder wenn die synchronisierenden Agenzien für die Zellen schädlich sind.
Obwohl die Zellen nach jedem für die Herstellung adenoviraler Vektoren in infizierten Zellen unter den genannten Bedingungen geeigneten Verfahren kultiviert werden können, wird es bevorzugt, die infizierte Zellkultur in einem Bioreaktor (manchmal auch als Fermenter bezeichnet) zu kultivieren, um adenovirale Vektorstocks in großem Maßstab herzustellen. Es kann jeder geeignete Bioreaktor verwendet werden, der geeignetes Mischen und vorzugsweise optimale pH- und Temperaturbedingungen für das Kultivieren der Kultur sicherstellt und der die Perfusion von frischem Medium durch die Kultur in ei ner Menge, die mindestens etwa zweimal das Volumen der Kultur ist, vor der Infektion ermöglicht. Beispiele für geeignete Bioreaktoren schließen Rührtank-Bioreaktoren, Blasensäulenbioreaktoren, Airlift-Bioreaktoren, Wirbelschicht-Bioreaktoren, Festbett-Bioreaktoren, Wave-Bioreaktoren und Bioreaktoren mit ausgeflockten Zellen ein. Vorzugsweise ist der Bioreaktor kein Bioreaktor auf Mikroprojektil-Basis. Zweckmäßigerweise ist der Bioreaktor ein Rührtank-Bioreaktor, der Zellschädigung durch Scherung und Wirbel während des Kultivierens vermeidet. Der Bioreaktor kann ein Batch-, kontinuierlicher oder Fed-Batch-Bioreaktor mit Perfusionsvermögen sein, und die Kultur wird vorzugsweise unter Batch-, Fed-Batch- oder kontinuierlichen Kulturbedingungen gehalten, mit Vorbehalt der Perfusion von frischer Kultur durch das Medium vor der Infektion bei einem Volumen, das mindestens etwa das Zweifache des Volumens des Mediums vor der Infektion mit den adenoviralen Vektoren ist. Vorzugsweise werden zur Perfusionskultur befähigte Bioreaktoren mit Fed-Batch-Verfahren mit variablem Volumen (auf dem Gebiet auch als wiederholtes Fed-Batch-Verfahren oder zyklische Fed-Batch-Kultur bezeichnet) oder Batch-Verfahren während des Kultivierens der Zellen vor und nach der Perfusion von frischem Medium durch die Kultur verwendet. Nach einer solchen Perfusion und Infektion werden die Batch-Bedingungen vorzugsweise bis zur Ernte aufrechterhalten. Alternativ können die Bedingungen einer Zellkultur mit kontinuierlicher Perfusion anstelle der Batch-Bedingungen während des anfänglichen Zellwachstums und/oder nach der Infektion verwendet werden, vorzugsweise wo die Perfusion von frischem Medium durch die Kultur in einer Menge auftritt, die signifikant niedriger ist als die Perfusion von mindestens dem zweifachen Volumen des Mediums in der Kultur, die vor dem Kontakt der Kultur mit den adenoviralen Vektoren erfolgt.
Ein Bioreaktor kann von jeder geeigneten Größe für die Herstellung eines adenoviralen Vektorstocks geeigneter Größe sein. Für die Herstellung in großem Maßstab werden handelsübliche 10-Liter-Bioreaktoren oder größere Bioreaktoren bevorzugt. In Aspekten der Erfindung, wo Rollflaschen oder andere Kulturtechniken vor oder während der Infektion verwendet werden, können Zellen nach jedem geeigneten Verfahren, wie eine Peristaltikpumpe, in den Bioreaktor transferiert werden.
Nach dem Kultivieren der infizierten Zellen werden die Zellen geerntet, und der adenovirale Vektorstock wird produziert. Jedes Verfahren zum Ernten von Zellen, welches zur Gewinnung adenoviraler Vektoren führt, kann im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und auf dem Gebiet sind verschiedene Methoden zum Ernten von Zellen bekannt, wie mechanisch/physikalische und chemische Verfahren. Beim chemischen Ernten werden Chemikalien, üblicherweise Detergentien, zu der Kultur zugegeben, um die Zellen zu lysieren und Zellkomponenten und die adenoviralen Vektoren freizusetzen. Chemische Verfahren schließen die Verwendung von Zelllyselösungen oder Lysepuffern ein, wofür Triton X-100 in PBS-Lösung, auf Tris-HCl basierende Lyselösungen und Polysorbat 80/Bicain-Puffer Beispiele sind. Physikalische Verfahren schließen das „Einfrier-Auftau"-Standardverfahren ein, wobei Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung behandelt, in einer Ca²⁺- und Mg² ⁺-freien gepufferten Salzlösung (wie TEN (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl)) inkubiert, pelletiert, in Tris-Puffer resuspendiert und dann drei Gefrier/Auftau-Zyklen zur Lyse der Zellmembranen unterworfen werden. Andere Gefrier/Auftau-Verfahren verwenden Proteaseinhibitoren vor der Durchführung der Gefrier/Auftau-Zyklen, z. B. Leupeptin, Pepstatin und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Mechanische Verfahren schließen z. B. kontinuierliche Zentrifugation, French Press, Mühle, Cross-Flow-Filtration und Ultraschallbehandlungsverfahren (vorzugsweise in Kombination mit Cross-Flow-Filtration durchgeführt) ein. Vorzugsweise werden chemische Verfahren, wenn sie verwendet werden, mit mechanischen Verfahren kombiniert. Nach dem Ernten der Zellen folgen vorzugsweise weitere Schritte zum Abtrennen des adenoviralen Vektors von den lysierten Zellkomponenten. Beispiele für solche Schritte schließen die Entfernung von Lipiden (beispielsweise durch Freonzugabe, Zentrifugation und Entfernung der die adenoviralen Vektoren enthaltenden wässrigen Phase), Tangentialstrom-Diafiltration zur Entfernung von Zelldetritus und Entfernung löslicher Antigene durch eine Trennung auf chromatographischer Basis, wie Cäsiumchlorid-Chromatographie, ein. Vorzugsweise schließt das Verfahren mehrere Chromatographieschritte ein, darunter eine Capture Column, eine Reinigungssäule und eine Größenausschluss-/Pufferaustauschsäule. Es sind zahlreiche andere Beispiele für solche Verfahren und deren Modifizierungen auf dem Gebiet bekannt, und der Durchschnittsfachmann ist leicht in der Lage, das geeignete Verfahren zum Ernten der adenoviralen Vektoren auszuwählen.
Das Ernten der Zellen kann zu jedem geeigneten Zeitpunkt zum Erhalt des gewünschten Stocks adenoviraler Vektoren erfolgen. Vorzugsweise wird eine Erntezeit gewählt, die optimale Herstellung adenoviraler Vektoren in dem Stock sicherstellt, abgewogen gegenüber der Effizienz der Herstellung durch die Zellen in der Kultur. Der Durchschnittsfachmann kann leicht solche Bestimmungen machen. Typischerweise erfolgt das Ernten etwa 24–48 Stunden oder später nach der Infektion (h. p. i.), und vorzugsweise erfolgt die Ernte zwischen etwa 24 Stunden und 48 Stunden nach der Infektion.
Die Qualität der Herstellung adenoviraler Vektorstocks hängt von der Lebensfähigkeit der Zellen zum Zeitpunkt der Infektion ab. Folglich wird die Kultur zweckmäßigerweise mit den adenoviralen Vektoren in Kontakt gebracht, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur so ist, dass ein Verlust beim Prozentsatz lebensfähiger Zellen von 10% zu etwa 80% oder mehr Verlust an fokusbildenden Einheiten pro Zelle (FFU/Zelle) führen würde, wenn die Zellen geerntet werden. Ebenso wird die Kultur zweckmäßigerweise mit den adenoviralen Vektoren in Kontakt gebracht, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur so ist, dass ein Verlust beim Prozentsatz lebensfähiger Zellen von 20% zu etwa 90% oder mehr Verlust an FFU/Zelle führen würde, wenn die Zellen geerntet werden.
Vorzugsweise wird der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur vor der Infektion (insbesondere während und unmittelbar nach der intensiven Perfusion) auf etwa 75% oder mehr der gesamten Zellen in der Kultur gehalten. Bevorzugter ist der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur vor der Infektion etwa 80% oder höher, bevorzugter etwa 85% oder höher. Typischerweise ist in großen Kulturen der maximal aufrechtzuerhaltende Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur etwa 95%. Die Lebensfähigkeit von Zellen kann durch jede geeignete Methode überwacht und/oder bestimmt werden, einschließlich jener, die hier an anderer Stelle erörtert sind.
Alternativ oder zusätzlich kann die Kultur mit den adenoviralen Vektoren in Kontakt gebracht werden, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur so ist, dass ein Verlust beim Prozentsatz lebensfähiger Zellen von 10% zu etwa 80% oder mehr Anstieg beim Verhältnis adenoviraler Partikeleinheiten (PU) (gesamte virale Vektorpartikel) pro Zelle zu den fokusbildenden Einheiten (FFU) oder plaquebildenden Einheiten (PFU) pro Zelle beim Ernten führen würde. PU kann durch Gesamtvirustiter-Methoden oder andere Methoden, die für die Bestimmung der Gesamtzahl viraler Vektorpartikel geeignet sind, bestimmt werden. FFU repräsentiert die Zahl der Fokusse, die von infizierten Zellen gebildet werden, und wird mit einem optischen Mikroskop unter Verwendung von Standardprotokollen bestimmt. PFU kann durch Standard-Plaque-Assays bestimmt werden, z. B. durch Anfärben infizierter Zellen, die mit Formalin fixiert sind, mit Methylenblau-Lösung. Andere (immuno)histochemische Anfärbemethoden und Fixierungsmetho den können ebenfalls verwendet werden. Das Verhältnis PU/FFU ist ein wichtiger Indikator für die Effizienz der Herstellung aktiver viraler Vektoren. Niedrigere Verhältnisse PU/FFU zeigen hohe Verhältnisse von aktiven Vektoren zur gesamten Vektorherstellung an, was anzeigt, das die in die Vektorherstellung eingebrachte Energie effizient zu Stocks aktiver Vektoren führt. Vorzugsweise ist PU/FFU etwa 100 oder weniger, bevorzugter etwa 80 oder weniger (z. B. 70 oder weniger), noch bevorzugter etwa 60 oder weniger.
Die Bestimmung, wann ein Verlust bei den aktiven adenoviralen Vektoren bei der Ernte aufgrund solcher Abfälle beim Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit zur Zeit der Infektion auftritt, kann durch das Studium einer Probekultur oder einer früheren Kultur, die unter im Wesentlichen ähnlichen Bedingungen durchgeführt wurde, erfolgen, um den Punkt zu bestimmen, wo die Kultur mit den adenoviralen Vektoren in Kontakt gebracht werden sollte. Der Prozentsatz an aktivem adenoviralem Vektor kann nach jedem geeigneten Verfahren bestimmt werden. Beispiele für solche Verfahren schließen Standard-Plaque-Assays ein. Wenn der adenovirale Vektor ein adenoviraler Gentransfervektor ist, können Assays, die auf die Expression oder Gegenwart des exogenen Gens gerichtet sind, verwendet werden, um den Prozentsatz aktiver adenoviraler Vektoren zu bestimmen. Gesamtvirentiter können nach jedem dem Fachmann bekannten Verfahren gemessen werden, wofür in US 4 861 719 und 4 868 116 Beispiele angeführt sind.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter, sollen aber natürlich in keiner Weise als Einschränkung ihres Umfangs gesehen werden.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die volumetrischen Ausbeuten adenoviraler Vektoren, die erhalten werden können, wenn Kulturen mit adenoviralen Vektoren bei verschiedenen Zelldichten infiziert werden.
PER.C6-Zellen (Introgene, Inc.) wurden in Ex-Cell 525 (JRH Biosciences, Inc.) kultiviert, wobei der Kultur 4 mM Glutamin zugesetzt wurden. Zwei Liter PER.C6-Zellkultur wurden in einen 3,5-Liter-Bioreaktor zu 5 × 10⁵ Zellen/ml mit einem mittleren Prozentsatz an Zelllebensfähigkeit von über 90% am Tag 0 ausgesät. 750 ml frisches Medium wurden am Tag 1 und am Tag 2 in den Bioreaktor eingeführt. Am Tag 3 wurde die Kultur in einen 10- Liter-Bioreaktor transferiert, wobei 6,5 Liter frisches Medium zugesetzt wurden. Es wurde eingeschätzt, dass die stationäre Phase für eine ähnliche Kultur mit einer Zelldichte von etwa 1,6 × 10⁶ Zellen/ml koinzidiert. 300-ml-Proben der Zellkultur wurden bei verschiedenen Dichten im Bereich von unter 6 × 10⁵ Zellen/ml bis über 1 × 10⁶ Zellen/ml (von weniger als 37% bis mehr als 62% der Dichte der Kultur in der stationären Phase) genommen.
Jede Probe wurde 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Verbrauchtes Medium wurde entfernt, und Zellen wurde in 30 ml frischem Medium resuspendiert. Es wurde bestimmt, dass der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in jeder Probe im Bereich zwischen 89 und 95% war. Die Zellen wurden dann mit adenoviralen Vektoren auf Basis des Serotyp 5 (MOI = 5) eine Stunde bei 37°C in Kontakt gebracht. Nach einstündiger Inkubation wurden die Zellen in frischem Medium auf ein Endvolumen von 300 ml für jede Probe resuspendiert. Jede Probe wurde in 100-ml-Subproben unterteilt, und jede Subprobe wurde in einer Rollflaschenkultur bei 37°C kultiviert. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet, und PU/ml, PU/Zelle und FU/ml wurden bestimmt und die mittleren PU/FFU-Verhältnisse (und bis zu 1 Standardabweichung (s. d.) unter oder über dem Mittel) berechnet. Analysierte Kulturen wurden in acht Gruppen unterteilt, basierend auf dem Prozentsatz der Zelldichte der Kultur in der stationären Phase der Kultur zur Zeit der Infektion (< 38%, 38–43%, 44–49%, 50–55%, 56–62%, 63%, 75% und 100%). Die Versuche wurden 20 Mal bei < 38%, 63%, 75% und 100% der Zelldichte in der stationären Phase wiederholt, 23 Mal bei 44–49%, 50–55% und 56–62% der Zelldichte in der stationären Phase und 48 Mal bei 37–43% der Zelldichte in der stationären Phase. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt.
Die in der Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse der Versuche zeigen, dass die Infektion mit adenoviralen Vektoren, wenn die Zelldichte der Kultur etwa 60–70%, insbesondere 63% der Zelldichte in der stationären Phase ist, zu den höchsten Levels an PU/ml und PU/Zelle führte, während die höchsten Level an FFU/Zelle in Kulturen erhalten wurden, die bei etwa 50–55% der Zelldichte in der stationären Phase infiziert wurde. Kulturen, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden, wenn die Zelldichten unter 40%, insbesondere unter 38% der Dichte in der stationären Phase waren, zeigten wesentlich niedrigere Ausbeuten an fokusbildenden Einheiten und Partikeleinheiten pro Zelle (z. B. nur 7,1% bzw. 12,1% der Level, die bei Kulturen erhalten werden, die infiziert wurden, wenn die Dichte 63% der Dichte in der stationären Phase war). Kulturen, die infiziert wurden, wenn die Zelldichte unter etwa 40%, insbesondere unter etwa 38% der Zelldichte in der stationären Phase war, zeigten auch PU/FFU von etwa 120, im Wesentlichen das Doppelte oder mehr als die PU/FFU-Verhältnisse, die mit Kulturen erhalten werden, die bei höheren Dichten infiziert wurden. Kulturen, die infiziert wurden, wenn die Zelldichte über 70%, insbesondere 75% der Dichte in der stationären Phase war, führten zu signifikant weniger Herstellung an FFU/Zelle und PU/Zelle im Vergleich zu Kulturen, die bei etwa 70% oder weniger, insbesondere 63% der Zelldichte in der stationären Phase infiziert wurden (75% bzw. 73% Abnahme). Diese Ergebnisse zeigen, dass Kulturen, die bei Dichten von weniger als 40%, insbesondere weniger als 38%, oder mehr als etwa 70%, insbesondere bei oder bei mehr als etwa 75% der Zelldichte in der stationären Phase infiziert wurden, eine signifikante Reduktion ihrer Fähigkeit zur Herstellung adenoviraler Vektoren zeigen, verglichen mit Kulturen, die infiziert wurden, wenn die Zelldichte etwa 40–70% der Dichte in der stationären Phase ist.
Ausbeuten an FFU/Zelle waren in Kulturen am höchsten, die bei etwa 50–55% der Zelldichte in der stationären Phase infiziert wurden, blieben aber im Allgemeinen auf hohem Level (i. e. etwa 600 oder mehr) in allen Kulturen, die bei etwa 40–70%, insbesondere 44–63% der Dichte in der stationären Phase infiziert wurden (i. e. über 440). Niedrigere FFU/Zelle-Ausbeuten in Kulturen, die bei Prozentsätzen der Dichte in der stationären Phase über 40% der stationären Phase infiziert wurden, insbesondere im Bereich von 44–49% und im Bereich von 50–55%, aber bei oder unterhalb von etwa 70%, insbesondere 63% der Dichte in der stationären Phase, wurden durch die erhöhte Anzahl an Zellen, die fokusbildende Einheiten bildeten, in solchen Kulturen aufgewogen. Beispielsweise ergibt das Multiplizieren der FFU/Zelle für Kulturen in diesem Bereich mit dem medianen Prozentsatz der Dichte in der stationären Phase (z. B. 0,47 für den Bereich von 44–49%) einen Hinweis auf die Anzahl der fokusbildenden Einheiten, die bei einer gegebenen Zelldichte gebildet werden. Die Anzahl der fokusbildenden Einheiten, die für Kulturen produziert wird, die bei etwa 60–70%, insbesondere 63% der Dichte in der stationären Phase infiziert wurden, ist ungefähr gleich der Anzahl, die in Kulturen produziert wird, die bei etwa 40–50%, insbesondere 44–49% der Zelldichte in der stationären Phase infiziert wurden (FFU/Zelle × Prozent der Zelldichte in der stationären Phase von 328 bis 330). Außerdem ist die Anzahl der fokusbildenden Einheiten pro Zelle für Kulturen, die bei etwa 40–70%, insbesondere bei 44% und 63% der Dichte in der stationären Phase infiziert wurden, 442 oder höher, verglichen mit 37 für Kulturen, die bei weniger als 38% der Dichte in der stationären Phase infiziert wurden, und 128 für Kulturen, die bei 75% der Zelldichte in der stationären Phase infiziert wurden (92% bzw. 71% Abnahme). Die Ergebnisse dieser Berechnungen zeigen die Effizienz von Kulturen, die bei etwa 40–70%, insbesondere bei 44–63% der Dichte in der stationären Phase infiziert wurden, um lebensfähige adenovirale Vektoren zu produzieren, verglichen mit Kulturen, die bei Zelldichten über oder unter diesem Bereich infiziert wurden.
Während PU/FFU-Verhältnisse für Kulturen mit einer Zelldichte über 40%, insbesondere 44% der Dichte in der stationären Phase bis etwa 70%, insbesondere 63% der Dichte in der stationären Phase relativ stabil waren (zwischen 52 und 61), waren die Ausbeuten an Partikeleinheiten pro Zelle und pro Milliliter etwas höher in Kulturen, die infiziert wurden, wenn die Zelldichte näher bei etwa 70%, insbesondere 63% der Zelldichte in der stationären Phase war, wie auch die gesamte Produktion fokusbildender Einheiten. Spätere Versuche, die mit Kulturen durchgeführt wurden, die mit adenoviralen Vektoren bei 65% infiziert wurden, und für Kulturen, die mit adenoviralen Vektoren bei 69% der Dichte in der stationären Phase infiziert wurden, zeigten ähnliche Ausbeuten an PU/FFU im Vergleich zu jenen, die mit Kulturen beobachtet wurden, die bei 63% der Dichte in der stationären Phase infiziert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass verbesserte Ausbeuten an adenoviralen Vektoren erhalten werden, wenn Zellen zu einer Zeit infiziert werden, zu der die Zelldichte in der Kultur innerhalb der Prozentsätze der Dichte in der stationären Phase ist, die durch die vorliegende Erfindung angegeben werden.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt den Effekt des Prozentsatzes lebensfähiger Zellen in der Kultur bei der Infektion auf die Herstellung adenoviraler Vektoren.
PER.C6-Zellen wurden in von tierischem Protein freiem Ex-Cell 525 Medium mit 4 mM Glutamin in Rollflaschen kultiviert. Während jedes Durchgangs wurde die Zelllebensfähigkeit bestimmt. Man ließ die Zellen zu einer ungefähren Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml und einem Prozentsatz lebensfähiger Zellen von etwa 90% wachsen. Die Zellen wurden 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert, und verbrauchtes Medium wurde entfernt. Die Kulturen wurden dann in verschiedenen Mengen an verbrauchtem Medium resuspendiert, um durch „Aushungern" der Kulturen verschiedene Lebensfähigkeit zu erhalten. Die Zelllebensfähigkeit wurde dann untersucht. Die Kulturen wurden mit adenoviralen Vektoren vom Serotyp 5 unter für die Infektion permissiven Bedingungen für eine Stunde in Kulturen mit verschiedenen Prozentsätzen lebensfähiger Zellen in Kontakt gebracht. Der maximale Prozentsatz lebensfähiger Zellen in jeder der Kulturen war ungefähr 95%. Die Zellen wurden dann geerntet, und die adenoviralen Vektoren wurden mittels Chromatographie gereinigt. Es wurden Assays durchgeführt, um Partikeleinheiten und fokusbildende Einheiten zu bestimmen, die in den verschiedenen Kulturen produziert wurden. Analysierte Zellen wurden in 6 Gruppen unterteilt, basierend auf dem Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur bei der Infektion (i. e. 70–74%, 75–79%, 80–84%, 85–90% und mehr als 90% lebensfähige Zellen). Das mittlere Verhältnis von Partikeleinheiten zu fokusbildenden Einheiten ist für jede Kategorie in der Tabelle 2a dargestellt. Tabelle 2a – Effekt der Zelllebensfähigkeit zur Zeit der Infektion auf das Verhältnis adenoviraler Vektorpartikeleinheiten/fokusbildende Einheiten, das beim Ernten der Zellen erhalten wird

Prozentsatz lebensfähiger Zellen zur Zeit der Infektion

> 90 85–90 80–84 75–79 70–74

PU/FFU 36 45 37 55 286
Diese Versuche wurden wiederholt, außer dass in dem zweiten Satz von Versuchen analysierte Zellen in 8 Gruppen statt in 6 Gruppen unterteilt wurden. Insbesondere wurden Zellen infiziert, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zeilen 60–64% und 65–69% war sowie bei den anderen Prozentsätzen lebensfähiger Zellen, die oben angeführt sind. Die Ergebnisse dieses zweiten Satzes von Versuchen sind in der Tabelle 2b angeführt. Tabelle 2b – Effekt der Zelllebensfähigkeit zur Zeit der Infektion auf das Verhältnis adenoviraler Vektorpartikeleinheiten/fokusbildende Einheiten, das beim Ernten der Zellen erhalten wird

Prozentsatz lebensfähiger Zellen zur Zeit der Infektion

> 90 85–90 80–84 75–79 70–74 65–69 60–64

PU/FFU 49 38 49 58 99 78 105
Wie man anhand der Tabellen 2a und 2b sehen kann, führte das Infizieren der Kultur mit den adenoviralen Vektoren, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur 70–74% oder niedriger war, zu signifikanten Zunahmen beim PU/FFU-Verhältnis für solche Kulturen. Beispielsweise war die mittlere Zunahme bei PU/FFU für Kulturen, die im zweiten Satz von Versuchen gemessen wurden (dessen Ergebnisse in der Tabelle 2b dargelegt sind), 74% von Kulturen, die infiziert wurden, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur zwischen 75 und 79% war, während für Kulturen im ersten Satz von Versuchen die Änderung beim PU/FFU von Kulturen, die infiziert wurden, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zellen 75–79% war, verglichen mit 70–74%, mehr als 500% Zunahme war. Im Gegensatz dazu bleibt PU/FFU für Kulturen, die infiziert wurden, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der Kultur über 75% war, relativ konstant (55-36). Mittlere FFU/Zelle sanken ebenfalls signifikant in Kulturen mit niedrigeren Prozentsätzen lebensfähiger Zellen. Speziell für die in der Tabelle 2a dargestellten Versuche waren mittlere FFU/Zelle in Kulturen, die mit 70–74% lebensfähiger Zellen in der Kultur infiziert wurden, nur 4,3, verglichen mit 22, 60, 244 bzw. 716 für die anderen Kulturen (über 80% Abfall bei FFU/Zelle für Kulturen, die infiziert wurden, wenn der Prozentsatz lebensfähiger Zellen 75–59% war, und über 90% Abfall von Kulturen, die infiziert wurden, wenn der Prozentsatz 80–84% war). Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur effizienten Herstellung viraler Vektorstocks angibt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt den Effekt der Verfügbarkeit von frischem Medium in der Kultur auf die Herstellung adenoviraler Vektoren.
PER.C6-Zellen wurden in Rollflaschen bei einem Volumen von 100 ml/Rollflasche kultiviert, auf 1/10 des ursprünglichen Volumens zentrifugiert und mit adenoviralen Vektoren (Serotyp-5-basierte adenovirale Gentransfervektoren) unter Bedingungen, die für die Infektion permissiv waren, eine Stunde (MOI = 5) infiziert. Die Infektion erfolgte in einer Mischung von 50% frischem Medium/50% verbrauchtem Medium für eine Stunde. Nach der Infektion wurden die Zellen in 100% frischem Medium, 100% verbrauchtem Medium oder einem gemischten Medium von 90%, 70%, 50% oder 30% frischem Medium zum ursprünglichen Volumen resuspendiert. Die Zellen wurden kultiviert und 48 h. p. i. geerntet, und PU/ml wurde bestimmt. Die Versuche wurden dreifach ausgeführt, außer für den Fall, dass 30% frisches Medium zugesetzt wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Tabelle 3 dargelegt. Tabelle 3 – Effekt des Austauschs von Medium auf die Produktion adenoviraler Vektorpartikeleinheiten

Prozentsatz nach der Infektion zugesetztes frisches Medium

100 90 70 50 30 0

PU/FFU 1,0 × 10¹⁰ 1,0 × 10¹⁰ 8,5 × 10⁹ 6,9 × 10⁹ 4,9 × 10⁹ 2,6 × 10⁹
Wie in der Tabelle 3 gezeigt, beeinflusst der Austausch von Medium nach der Infektion die Produktion von Partikeleinheiten in Kulturen bei der Ernte signifikant. Im Durchschnitt gab es keine signifikante Änderung bei der Zugabe von 90% versus 100% frischem Medium. Die Zugabe von 70% frischem Medium nach der Infektion führte zu einer Ausbeute von ungefähr 85% des mit der Zugabe von 100% frischem Medium erhaltenen PU/ml. Die Zugabe von 50% frischem Medium nach der Infektion führte zu einer Ausbeute von ungefähr 69% des mit der Zugabe von 100% frischem Medium erhaltenen PU/ml. Bei niedrigeren Prozentsätzen an zugesetztem frischem Medium sanken die PU/ml-Werte im Vergleich zu 100% zugesetztem frischem Medium signifikant. Wenn beispielsweise kein frisches Medium zugesetzt wurde, wurde nur etwa 1/4 des PU/ml erreicht, verglichen mit PU/ml für 100% zugesetztes frisches Medium.
Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigen, dass mit höheren Konzentrationen an frischem Medium in der Kultur gemäß der vorliegenden Erfindung höhere Ausbeuten an adenoviralen Vektoren erhalten werden können.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines adenoviralen Vektorstocks, umfassend: (a) Bereitstellen einer Kultur von Zellen, die für das Wachstum adenoviraler Vektoren permissiv sind, wobei sich die Zellen in einem Medium befinden; (b) Kultivieren der Kultur unter Bedingungen, die das Wachstum der Zellen erlauben; (c) Durchleiten von frischem Medium durch die Kultur für einen Zeitraum von 1 bis 6 Stunden in einer Menge von mindestens dem zweifachen Volumen des Mediums in der Kultur, während die Zelldichte in dem Medium 40% bis 70% derjenigen Zelldichte beträgt, die in dem Medium erhalten wird, wenn sich das Wachstum der Kultur in der stationären Phase befindet; (d) Inkontaktbringen der Kultur mit adenoviralen Vektoren unter Bedingungen, die für die Infektion der Zellen permissiv sind; (e) Kultivieren der infizierten Zellen, um die adenoviralen Vektoren zu replizieren; und (f) Ernten der infizierten Zellen, um einen adenoviralen Vektorstock zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kultur vor dem Durchleiten des frischen Mediums oder während des Kontakts der Kultur mit den adenoviralen Vektoren nicht konzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kultur vor und nach dem Durchleiten von frischem Medium in Schritt (c) unter Batch- oder Fed-Batch-Bedingungen kultiviert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei kein Medium zu der Kultur hinzugefügt oder ausgetauscht wird, nachdem das Durchleiten von frischem Medium in Schritt (c) abgeschlossen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das frische Medium in eine Menge von mindestens dem zweifachen Volumen des Mediums in der Kultur durch die Kultur durchgeleitet wird, während die Zelldichte in dem Medium 60% bis 70% derjenigen Zelldichte beträgt, die in dem Medium erhalten wird, wenn sich das Wachstum der Kultur in der stationären Phase befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verhältnis der beim Ernten der Zellen gebildeten adenoviralen Partikeleinheiten (PU) zu adenoviralen fokusbildenden Einheiten (FFU) 70 oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das frische Medium in einer Menge des drei- bis vierfachen Volumens des Mediums in der Kultur durch die Kultur durchgeleitet wird, während die Zelldichte in dem Medium 40% bis 70% derjenigen Zelldichte beträgt, die in dem Medium erhalten wird, wenn sich das Wachstum der Kultur in der stationären Phase befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zellen in einer Suspensionskultur kultiviert werden, die keinen Mikroträger enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die adenoviralen Vektoren replikationsdefiziente adenovirale Vektoren sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zellen entweder humane embryonale Nierenzellen, humane embryonale Lungenzellen oder humane embryonale Retinoblasten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zelldichte in dem Medium in der stationären Phase 1,5 bis 9 × 10⁶ Zellen/ml beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zelldichte in dem Medium zum Zeitpunkt der Infektion 0,8 bis 4,2 × 10⁶ Zellen/ml beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Verfahren das Ersetzen von 95% oder mehr des Mediums durch frisches Medium mittels Durchleiten von Medium durch die Kultur umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Verfahren ferner das Halten des pH-Wertes des Mediums bei 6,9 bis 7,5 während und/oder nach dem Inkontaktbringen der Kultur mit den adenoviralen Vektoren umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei mindestens 75% der Zellen in der Kultur lebensfähig sind, wenn die Kultur mit den adenoviralen Vektoren in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die adenoviralen Vektoren adenovirale Gentransfervektoren umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Medium ein von tierischen Proteinen freies Medium ist.
Verfahren zur Gewinnung einer synchronen Zellkultur, umfassend: (a) Bereitstellen einer Zellkultur, wobei sich die Zellen in einem Medium befinden; (b) Kultivieren der Kultur unter Bedingungen, die das Wachstum der Zellen erlauben, bis die Zelldichte in dem Medium 40% bis 70% derjenigen Zelldichte beträgt, die in dem Medium erhalten wird, wenn sich das Wachstum der Kultur in der stationären Phase befindet, ohne dass der Kultur Medium hinzugefügt wird, sodass eine erhebliche Anzahl von Zellen in dem Medium einer G₁-Suppression unterliegen; und (c) Durchleiten von frischem Medium durch die Kultur für einen Zeitraum von 1 bis 6 Stunden in einer Menge von mindestens dem zweifachen Volumen des Mediums in der Kultur, um eine synchrone Zellkultur zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Verfahren durchgeführt wird ohne die Zugabe von synchronisierenden Agenzien oder Viren während oder vor der Durchführung von Schritt (c) des Verfahrens.